Determination de coliformes totals y fecales

Objetivo general: detrminar la presencia y numero de colonias de coliforms fecales

y totals mediante una serie bioquimica

Objetivo especifico:

Fundamento teorico: Debido a que un gran nmero de enfermedades son

transmitidas por va fecal-oral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es
necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de
contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la
materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales
y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme
constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal para la
mayora de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la
materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicacin fuera del intestino
tambin se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como
indicador de contaminacin fecal en agua; encontrandose que mientras mayor sea el
nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una
contaminacin reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo
sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme
adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos
alimenticios han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin,
etc.), estos microorganismos se utilizan como indicadores de malas prcticas
sanitarias. Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes
totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios
facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un
lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros
principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de
coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de
fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de incubacin a 44.5 0.1C.
Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es
Escherichia coli. La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede
realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con
caractersticas selectivas y diferenciales. Escherichia coli es un bacilo corto Gram
negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae
(bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y
animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patgenas que provocan
enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las caractersticas que
presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca enfermedad mediante
un mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las clulas

epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en
plsmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos. Este
grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli enterohemorrgica
(EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli
enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente
caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en
intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados.
Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal de la
diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este
tipo de infecciones es muy frecuente en pases subdesarrollados y afecta
principalmente a los nios. Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos
tipos de toxina. Una toxina termolbil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia,
antigenicidad y funcin es similar a la toxina del clera, la otra toxina que produce es
termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas
de ebullicin hasta por 30 minutos. La infeccin puede ser adquirida por el consumo
de alimentos tales como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis
infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra
parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser ms baja. Escherichia coli
enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente
en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la mucosa del
intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones
penetra a las clulas mucosas. La infeccin por ECEP provoca diarrea acuosa
generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crnica. Patognesis. El
microorganismo produce dos protenas: la intimina que es codificada por el gen eae y
un factor de adherencia que es codificado por un plsmido, ambas protenas permiten
su unin a los enterocitos y la destruccin de las microvellosidades intestinales. Las
epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua
contaminada y productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la
dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con
mltiples serotipos especficos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante
la tipificacin del antgeno O (somtico) y en ocasiones del antgeno H (flagelar).
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra
estrechamente relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a
la shigelosis. La enfermedad se presenta comnmente en nios de pases
subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la
enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas epiteliales de la
mucosa intestinal. A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100
microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106
bacterias. Algunas caractersticas importantes de este microorganismo que permiten
diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de
carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y anaerognicas. La patogenicidad de
este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon
debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli

enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as por su efecto citotxico

sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de mono verde africano. Existen al
menos dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis
hemorrgica, una variedad grave de diarrea; y con el sndrome urmico hemoltico,
enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemoltica
microangioptica y trombocitopenia. La verotoxina tiene propiedades similares a la
toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los
serotipos de E. coli que producen la verotoxina el ms comn y el nico que puede
identificarse en muestras clnicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol
y es negativa a la prueba de MUG. La causa ms comn de esta infeccin es el
consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada
procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrgica y sus
complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa de la
carne.
Materiales y Metodos:
5 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo
lactosado concentracin doble o triple con campana de Durhama .
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con
campana de Durhamb .
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o
caldo EC MUG con campana de Durham b
2 cajas Petri con agar para mtodos estndar d
Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodna .
Asa bacteriolgicab,c,d,
Autoclavea
NOTAS a Material necesario al inicio de la prctica. b Material necesario a las 48 h.
de iniciada la prctica. c Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica. d
Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica. e Material necesario a las 144
h. de iniciada la prctica.
Procedimiento
1 Prueba presuntiva
Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno
de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los
tubos para homogeneizar la muestra.

 Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay
formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms. 1.2 Prueba confirmativa de
microorganismos coliformes totales
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva, a tubos que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana
de Durham.
Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h..
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez
(crecimiento) y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48
h..
Consultar la tabla NMP para conocer el nmero ms probable de organismos
coliformes totales/100 mL. 1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes
fecales.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva a tubos con caldo EC.
Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua con circulacin durante
24 a 48 h.