METODO DE CONSERVACION ACUOSA DEL MICELIO DE HONGOS

Janette Lpez Alcal, Jos Mara Adolfo Barba Chvez, ngel Eduardo Mrquez Ortega, Mara Cristina
Snchez Gmez y Javier Isidoro Lpez-Cruz
Laboratorio de Biotecnologa de Hongos Comestibles, Universidad Autnoma Metropolitana Unidad
Iztapalapa, Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina C.P. 09340, Iztapalapa Mxico D.F.
<jilc@xanum.uam.mx>
RESUMEN
Para la industria del cultivo de los hongos comestibles, es indispensable implementar el almacenamiento a
largo plazo de cepas de inters. Debido a ello, se han desarrollado diversos mtodos de preservacin, con
el fin de conservar las propiedades morfolgicas y fisiolgicas del micelio, tales como los mtodos
criognicos, N2 lquido, soluciones de preservacin como el dimetilsulfxido (DMSO), mezclas orgnicas
(etanol, formaldehido, acido actico), congelacin y ultracongelacin, que son los ms adecuados. Sin
embargo, estos procesos deben manejarse cuidadosamente para que el micelio sea congelado y recuperado
con xito, sin que se formen cristales de hielo o se cause un dao celular, adems de que la mayora de
estos procedimientos son costosos. Por ello, se investig el efecto de la conservacin del micelio de cepas
de Pleurotus ostreatus, Trametes sp y Lycoperdaceae spp, en un soporte de papel filtro en condiciones
acuosas estriles y a diferentes tiempos de almacenamiento. Para evaluar el efecto de la conservacin, se
cuantific la velocidad de crecimiento micelial diametral () sobre caja de Petri con agar extracto de malta
y medio Kirk a uno y cinco meses. La velocidad , fue afectada favorablemente y con mayor notoriedad
en la cepa de Trametes, contrastando en las cepas de Pleurotus y Lycoperdaceae, donde no es afectada a
cinco meses de almacenamiento. Esto hace que sea un mtodo de conservacin atractivo.
Palabras claves: agua, papel filtro, almacenamiento, Pleurotus spp, Tramentes sp., Lycoperdaceae spp
1998), congelacin y ultracongelacin, ya que
detienen el crecimiento celular y garantizan la
estabilidad
gentica,
conservando
las
caractersticas genotpicas y fenotpicas del
micelio (Voyron, S. y col. 2009). Otros mtodos
usan soluciones de preservacin, como el dimetil
sulfxido (DMSO), mezclas orgnicas (etanolformaldehdo-cido actico), aceite mineral
(Panizo, M. y col. 2005), polietilenglicol, agua
(Hartung de Capriles, C. y col. 1989) y diversos
aditivos (Hublek, Z. 2003). El manejo
cuidadoso de los mtodos criognicos, evita la
formacin de cristales en el micelio y previene el
dao celular considerable e irreversible (Mata,
G. y col. 2005).

INTRODUCCION
Los hongos comestibles han intervenido de una
manera
importante
en
los
procesos
biotecnolgicos,
como
productores
de
metabolitos secundarios de inters. Siendo un
producto alimenticio, sus aplicaciones se han
extendido a las reas cosmtica, teraputica, etc
(Raimbault, M.1998). En el rea industrial y de
investigacin, son importantes las fuentes
fngicas en todo momento. Aunado a esto es
primordial la biodisponibilidad a travs un
almacn y un mtodo efectivo de conservacin
de inoculo micelico para la elaboracin de cepas,
as mismo se debe de hacer nfasis en que estos
mtodos mantengan la estabilidad gentica
(Bueno, L. 1998). Por ello, es necesario
desarrollar diversos mtodos de conservacin a
corto y lago plazo.

Por ello se investig el efecto de la conservacin

acuosa, con el fin de disear un mtodo sencillo,
econmico, seguro y capaz de garantizar la
integridad y crecimiento del micelio por
periodos prolongados, evitando el dao micelial
a travs de un soporte de papel filtro sumergido
en agua. Este proceso fue aplicado a cepas de

Los mtodos ms utilizados son la liofilizacin,

mtodos criognicos (Lara, I. y col. 1998), como
el nitrgeno lquido (Lara-Herrera I. y col.

silvestre de Trametes sp. Cada cepa se inoculo

por triplicado. Las cepas de Pleurotus fueron
incubadas por 21 das, a temperatura ambiente,
mientras que a 30 C se mantuvieron las de
Lycoperdaceae y Trametes por 30 y 15 das,
respectivamente. Para el proceso de adaptacin
se coloc el inoculo micelial en el centro de cada
caja con agar, adecundose lateralmente dos tiras
de papel filtro estril. El micelio fue incubado a
las mismas condiciones detalladas anteriormente.
A continuacin, el papel filtro invadido fue
retirado para su almacenamiento.

hongos como: Pleurotus spp., Trametes sp y

Lycoperdaceae spp. El efecto sobre crecimiento
fue determinado por la medicin diametral ()
del micelio en caja Petri, evaluando el efecto de
almacenaje por la estimacin de la velocidad de
crecimiento micelial adaptando los resultados a
travs de la ecuacin logstica de crecimiento
(ecuacin 1).
METODOLOGA
Adaptacin: Se prepararon cajas de Petri con
agar extracto de malta (EMA, 33.6 g/L), que
fueron inoculadas en condiciones aspticas con
micelio de hongos: seis cepas de Pleurotus spp.
(BJZ832, BZ497, BSHA, BJZMAXLL638,
R904 y BC905), diez cepas de Lycoperdaceae
spp. (Lyc6, Lyc7, Lyc9, Lyc10, Lyc12, Lyc13,
Lyc14, Lyc16, Lyc17 y Lyc18) y una cepa

Almacenamiento: Las tiras de papel filtro

invadidas con micelio se trasladaron a viales con
3mL de agua desionizada estril. Los viales
fueron incubados a uno y cinco meses a las
temperaturas correspondientes para cada cepa.

Medicin de la velocidad de crecimiento micelial diametral (): De cada vial se extrajo, un cuadro de
papel filtro que fue colocado al centro de las cajas de Petri con agar EMA y medio Kirk. (Tabla 1)
Tabla 1. Formulacin del medio lquido Kirk
Macroelementos (1 L)
Elementos traza (1 L)
Compuesto
Cantidad (g)
Compuesto
Cantidad (g)
Glucosa
40.00
cido nitriloactico
1.50
MgSO4*7H2O
0.50
NaCl
1.00
CaCl2
0.10
MnSO4*H2O
0.50
KH2PO4
2.00
FeSO4* 7H2O
0.10
Elementos traza
10.00 mL
ZnSO4* 7H2O
0.10
CuSO4 * 5H2O
0.01
(Mrquez-Ortega, A. 2006)

Las cajas fueron reincubadas por triplicado a las

temperaturas adecuadas. La medicin diametral
de las cepas de Pleurotus, se realizo cada 3 das,
durante 18 das; para las cepas de Lycoperdaceae
en lapsos de 7 das por 28 das y en Trametes las
mediciones cada 3 das, en un tiempo de 14 das.
La velocidad de crecimiento diametral
experimental, fue modelada por la ecuacin
logstica de crecimiento tipo Okasaky (Ecuacin
1) (Quintero, R. 1990), resuelto por el mtodo de
aproximacin matemtica de solver (Excel 2003)

X=

K
K X 0 t
1 +

* e
X

(Ecuacin 1)

Donde:
X0
= Invasin diametral inicial al da de
inoculacin (cm)
X
= Invasin diametral calculada con el
modelo matemtico (cm)
K
= Dimetro mxim al ultimo da de
incubacin (cm)
= Velocidad especifica de crecimiento (d-1)
t
= tiempo de crecimiento (d)

Para
establecer
si
hubo
efecto
del
almacenamiento a un mes y a cinco meses sobre
la velocidad promedio, se emple la prueba
estadstica de Tukey.

cortos (Mrquez-Ortega, A. 2006). Por ello, los

resultados del crecimiento en este estudio,
muestran una variabilidad de acuerdo al
dimetro temporal de cada hongo (Figuras 2 a 4).
El comportamiento de la invasin es tipo
Monod, donde la etapa estacionaria de
crecimiento es especfica, logrndose esta etapa
en 12 das para las variedades de Pleurotus
(Figura 2), a 24 das de invasin en
Lycoperdaceae (Figura 3) y a los ocho das de
crecimiento en la cepa de Trametes (Figura 4).

RESULTADOS Y DISCUSIN
En esta investigacin se utilizaron tres gneros
distintos de hongos, caracterizados por sus
periodos de crecimiento, con el fin de observar el
efecto del almacenamiento del micelio sobre un
soporte inerte de papel filtro, usando como
vehculo, viales con en agua estril (Figura 1).
Las cepas de Lycoperdaceae se caracterizaron
por periodos largos de invasin micelial en caja
de Petri (Hernndez-Jimnez, G. y col. 2008),
difiriendo para las cepas de Pleurotus y
Trametes, que poseen periodos de invasin

Figura 1. A) Crecimiento micelial en caja de Petri con agar. Se observa el crecimiento sobre las tiras de papel filtro
estril. B) Viales con agua estril, usando como vehiculo de almacenamiento micelial las tiras de papel filtro
invadidas. C) Medicin de la invasin diametral micelial en caja de Petri.

A
10.0

10.0
x cal

8.0

x exp

6.0

X (cm)

X (cm)

8.0

4.0
2.0

x cal

6.0

x exp

4.0
2.0

0.0

0.0

12

16

20

8 12 16 20 24 28

t (d)

t (d)

D
10.0

10.0
x cal

8.0

x exp

6.0

X (cm)

X (cm)

8.0

4.0

6.0

2.0

2.0

0.0

0.0
0

12

16

x cal

4.0

x exp

20

t (d)

12 16 20 24 28
t (d)

Figura 2. Crecimiento diametral de la cepa de Pleurotus R904. A) a un mes de almacenamiento B) a 5 meses de

almacenamiento y de la cepa BC905. C) a un mes y D) 5 meses de almacenamiento en papel filtro en agua destilada.

10.0

10.0
x cal

8.0

8.0

x exp
X (cm)

X (cm)

6.0
4.0

4.0
2.0

0.0

0.0
4

12

16

20

24

x exp

6.0

2.0

x cal

28

12

20

24

t (d)

t (d)

16

H
10.0

10.0
x cal

8.0
6.0

X (cm)

X (cm)

x exp

4.0

4.0
2.0

0.0

0.0
4

x exp

6.0

2.0

x cal

8.0

12 16 20 24 28
t (d)

12

16

20

24

t (d)

Figura 3. Crecimiento diametral de las cepas Lyc13. E) a un mes de almacenamiento F) a 5 meses de

almacenamiento y de la cepa Lyc14. G) a un mes y H) 5 meses de almacenamiento en papel filtro en agua destilada.
J
10.0

10.0

8.0

8.0

x cal

6.0

x exp

X (cm)

X (cm)

6.0
x cal

4.0

x exp

4.0

2.0

2.0

0.0

0.0
0

10 12 14

t (d)

8 10 12 14
t (d)

Figura 4. Crecimiento diametral de la cepa de Trametes. I) a un mes de almacenamiento J) a 5 meses de meses de

almacenamiento en papel filtro sumergido en agua destilada.

la velocidad promedio en las cepas cultivadas

se muestran en la tabla 1.

El efecto global del crecimiento fue adjudicado a

la estimacin de la velocidad promedio, donde
los datos experimentales de invasin diametral
micelial en caja de Petri, fueron parametrizados
usando la ecuacin 1. Los resultados totales para

Tabla 1. Velocidad de crecimiento diametral promedio ()a

Cepa

1 mes

5 mes

Cepa

1 mes

5 mes

Pleurotus

Lycoperdaceae

0.19
1.50
0.33
1.30
0.25
1.30
0.49
1.70
Lyc6
BJZ832
0.34
1.10
0.49
1.40
0.37
2.80
0.55
58.00
Lyc7
BZ497
0.13
1.50
0.39
2.60
0.32
3.50
0.60
20.00
Lyc9
BSHA
0.21
5.00
0.32
0.01
0.26
6.00
0.31
1.60
Lyc10
BC905
0.23
1.40
0.47
0.01
0.44
6.10
0.47
9.40
Lyc12
BJZMAXLL638
0.20
8.80
0.74
16.00
0.23
0.03
0.80
4.10
R904
Lyc13
0.24
0.61
0.37
4.00
Lyc14
0.31
4.20
0.37
6.80
Lyc16
0.17
1.60
0.31
2.40
1.95
8.80
0.53
4.10
Lyc17
Trametes
0.31
2.20
0.55
5.50
Lyc18
a
Determinacin es por triplicado, se uso la prueba de Tukey, =0.05, para establecer las diferencias. Para las cepas
de Pleurotus spp (P>9.5x10-4), Lycoperdaceae spp (P>6.9x10-2) y para Trametes sp. (P>1.1x10-5). b Los datos de la
desviacin estndar x 10-5

La velocidad promedio, mostr que no existen

diferencias estadsticas en la velocidad de
crecimiento del micelio de la mayora de las
cepas estudiadas, con tratamientos a un mes y
cinco meses de almacenamiento en tiras de papel
filtro sumergido en agua estril, excepto en las
cepas Lyc13, R904 y Trametes, en las que se
presentaron diferencias significativas respecto de
las dems cepas estudiadas. Concerniente al
efecto sobre el almacenamiento, R904 y Lyc13
disminuyeron su velocidad aproximadamente
27 %, mientras que en la cepa Trametes aument
3 veces ms su velocidad (ver tabla 2). No se
exhibieron efectos del almacenamiento sobre la
viabilidad de las cepas, con el mtodo de
conservacin miceliar en papel filtro, en la
mayora de las cepas hubo un 100% de
regeneracin. El efecto sobre la viabilidad de
muestras biolgicas. La viabilidad diminuye
acentuadamente en bacterias y hongos
microscpicos, solamente almacenados en agua
estril (tabla 2), donde el efecto del
almacenamiento a temperatura ambiente y en
refrigeracin provocan una disminucin del 50 al
75% en la mayora de las cepas (Perez, J. y col.
2006). La recuperacin de las cepas es menor,
cuando se someten al almacenamiento por
congelacin durante dos aos, como es el caso

de la variedad Azospirillum spp. Y6 y USA5b, y

Xanthomonas albicans sp. 35 (tabla 2). La
formacin de cristales de hielo internamente en
el micelio, impide una buena recuperacin, ya
que aumenta la presin de turgencia y puede
daar organelos internos.
CONCLUSIN
El mtodo de almacenamiento en agua estril, ha
sido un mtodo modestamente utilizado,
comparado con otros mtodos como las tcnicas
criognicas, de liofilizacin, soluciones de
preservacin etc, debido al acelerado avance
tecnologico actual, ya que aseguran la
supervivencia de los inculos y cultivos. Aunque
las ventajas tanto econmicas, sencillez y
seguridad, hacen al mtodo de conservacin en
agua, ms atractivo y que actualmente atesora
cierta atencin. En esta investigacin se utiliz
una variante al mtodo de conservacin en agua
establecido por Castellani (1939), Urdaneta
(1965) y modificado por Bueno y colaboradores
(1998). La invasin micelial en un soporte de
papel filtro estril sumergido en agua,
proporciona una mayor estabilidad, integridad y
proteccin, ya que impide al micelio modificar
considerablemente su estructura en solucin
(estructura micelial rgida) y permite que el rea

Lyc6
Lyc7
Lyc8
Lyc9
Lyc10
Lyc12
Lyc13
Lyc14
Lyc16
Lyc17
Lyc18

VB (%)
100.0
100.0
100.0
100.0
72.9
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
71.4
100.0
100.0
100.0
100.0

Xanthomonas
albilineas

Cepa
BJZ832
BZ947
BSHA
BJMAXLL638
R904
BC905

Cepas a
Afr
Xa2
Xa3
Xa4
Xa8

VB (%) a
100.0
100.0
100.0
25.0
75.0

Bradyrhozobium
japonicum

Lycoperdaceae spp.

Pleurotus spp

Tabla 2. Comparacin de la viabilidad porcentual de diversas cepas con diferentes mtodos de conservacin.

USDA110
SMH12
HH
SMH13
HH103

75.0
100.0
100.0
50.0
75.0

Azospirillum
spp.

Sp7
100.0
USA5b
0.0
Y6
25.0
Br17
50.0
366.0
8-INICA
100.0
Trametes sp
KG3
60.4
a
Datos reportados por Perez, J. y col. (2006). VB. Viabilidad porcentual

sencillo de realizar y atractivo para muestras

biodisponibles en cualquier momento. La
perspectiva ser investigar el efecto a un plazo
prolongado, que ser prometedoramente
favorable.

de contacto entre la interfase micelio-papel-agua

sea mayor, permitiendo humectar el micelio.
El almacenamiento se realizo a temperatura
correspondiente para cada cepa, esto reduce los
costos por conservacin a temperatura baja a
largo plazo, por ejemplo ultra congelacin o
nitrgeno lquido.

REFERENCIAS
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aspects of solid substrate fermentation. J. Biotechnol.
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El mtodo de conservacin utilizado, no muestra

afecta la velocidad de crecimiento (), sin
contaminaciones, ni cambios visibles en la
morfologa, que en el campo microbiolgico y
de produccin fngica es requisito prioritario, si
se desea obtener cepas o poseer colecciones
almacenadas a largo plazo. El efecto sobre la
velocidad se ve afectado, favorablemente si la
especie micelial, es de rpido crecimiento como
se obtuvo en Trametes sp, donde los periodos de
invasin total en caja no exceden los 10 das
(Mrquez-Ortega, A. 2006). La temperatura
ptima de crecimiento de las cepas es otro factor,
que modifica la reproducibilidad micelial; esto
porque las muestras biolgicas que provienen de
conservacin a baja temperatura, comprometen
un paso previo de adaptacin, antes de ser
reproducidas. El mtodo investigado es barato,

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