MACROMOLCULAS DE LA LEVADURA

Concha Alarcn
Hctor hector-concha@hotmail.com , Lucero Huertas Adriana
ailuceroh@gmail.com , Martnez Richard Andrs richmart1996@gmail.com
RESUMEN
Para la realizacin de la prctica de laboratorio, se tuvieron muy en cuenta las
fichas de seguridad de sustancias qumicas utilizadas tales como el orcinol, el
yodo o lugol y acido tricloroacetico, entre los ms txicos e irritantes, portando
el equipo de seguridad. Se utiliz levadura seca de tipo panadera y arena fina
con el fin de romper la membrana se sigui el procedimiento indicado en la
gua.
INTRODUCCIN
Las levaduras son los microorganismos ms importantes desde el punto de
vista industrial porque muchas de las especies pueden convertir los azucares
en alcohol etlico y dixido de carbono. Participan en la elaboracin de cerveza,
vino, alcohol industrial, glicerol y vinagre, las clulas de levadura se utilizan
tambin en la industria de panificacin y como alimento animal y humano
debido a su alto contenido de protenas (1).
Composicin qumica
Las levaduras contienen un 75% de agua y un 25% de materia seca
aproximadamente. Las sustancias minerales de las levaduras presentan por lo
general un 5-9% del peso seco. Los componentes principales son acido
fosfrico alrededor del 50% y potasio del 30%. Las sustancias nitrogenadas de
la levadura representan unas dos terceras partes de su peso seco 30-75%
contienen entre 5 y 12% de nitrgeno. Estas sustancias se reparten en un 64%
de protena 10% de peptonas y aminocidos y 8% de amonio, 10% de purina y
el resto consiste en pirimidinas y vitaminas. (2)
Entre los principales objetivos de la prctica est separar el glucgeno, las
protenas y los cidos nucleicos contenidas en la levadura seca.

Figura 1. Tubo del lado izquierda: Precipitado de glucgeno con yodo. Tubo de
lado derecho (tubo control): tubo de ensayo con agua destilada y yodo.

Figura 2: precipitado de cidos nucleicos y protenas en solucin con 15 ml de

cloruro de sodio.

Figura 3: tubo de lado izquierdo (tubo control): reactivo de orcinol y

amortiguador salino, tubo del lado derecho precipitado de cidos nucleicos en
solucin con reactivo de orcinol y amortiguador salino.

Figura 4: tubo del lado izquierdo precipitado de protenas coaguladas en

solucin salina. Tubo del lado derecho (tubo control) solucin salina.

Figura 5. Tubo de ensayo con precipitado de protenas coaguladas en solucin

salina, sulfato de cobre e hidrxido de sodio
MATERIALES Y MTODO
Se Empez este laboratorio identificando cada uno de los reactivos a utilizar y
la ficha de seguridad, despus se identific la levadura y arena fina. Se agreg
en un mortero una cucharada de levadura y una cucharada de arena fina, se
macera durante 5 minutos, seguido se le agrega 15 ml de cido tricloroactico
a 5%, se vuelve a macerar durante 3 minutos. Dejamos que la arena de la
mezcla se asiente y se decant el lquido lechoso en un tubo de ensayo con
cuidado de no tener exceso de arena en la mezcla y se centrifugo a 3000
revoluciones por minuto (r.p.m) durante 5 minutos(la centrifugadora se nos
ense las tcnicas de uso y como deban estar ubicados los tubos de
centrifugado para que la centrifugadora funcionara en ptimas condiciones), se

obtuvo en el tubo de centrifugado dos partes, una parte slida(cidos

nucleicos) y un sobrenadante(glucgeno).
Se pasa el sobrenadante(centrifugacin anterior) a un tubo de ensayo se
coloc en un bao fro durante unos minutos, se le agreg dos volmenes de
alcohol etlico, se agit y se prosigui a colocarse en un bao fro, esto se pas
a un tubo de centrifugado y se centrifug a 3000 r.p.m durante 5 minutos, se
descart el sobrenadante y el precipitado se le adiciono 1 ml de agua
destilada, seguido en otro tubo de ensayo se agrega 1 ml de agua
destilada(este va a servir de control) y a los dos tubos de ensayo se le adiciono
1 ml de reactivo de yodo.
Proseguimos con el precipitado solido(primer centrifugado) se le vierten 15 ml
de cloruro de sodio al 10% y se agito cuidadosamente, se paso a un tubo de
ensayo y se coloc en agua hirviendo durante 10 minutos( el agua se calent
primero, cuando estaba hirviendo se apag y se prosigui a colocar el tubo de
ensayo)
pasado los 10 minutos se enfri y se coloc en un tubo de
centrifugado y se centrifug a 3000 r.p.m durante 3 minutos, el sobrenadante
se pasa a un tubo de ensayo mientras que el precipitado se pasa a un bao de
hielo, se toma el tubo de ensayo y se le adiciona 2 volmenes de etanol fro, se
agito lentamente y se coloc en un bao de hielo durante 3 minutos, se verti
en un tubo de precipitado y se centrifug a 3000 r.p.m durante 3 minutos, se
descart el sobrenadante y se adiciono 2 ml de amortiguador salino, se coloca
un tubo con 2 ml de amortiguador salino como blanco y a ambos se le agreg 3
ml de reactivo de orcinol; se coloc los tubos en bao de agua hirviendo hasta
que el tubo con el precipitado tome un color verde.
Tomamos el precipitado que dejamos en el bao de hielo y lo se disolvi en 2
ml de solucin salina 0.15M, se agreg a otro tubo de ensayo 2 ml de solucin
salina como blanco, se le aadi 1 ml de solucin de sulfato de cobre, luego 2
ml de hidrxido de sodio a 10M en el tubo del precipitado debi tornarse de
color violeta.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Para este laboratorio se encuentra 4 pasos importantes cada uno con sus
propios reactivos.

PASOS

COLOR

COLOR DADO

CAF CLARO

CUANDO SE MACERO CON EL CIDO

TRICLOROACTICO AL 5% NOS DIO EL
COLOR CAF CLARO(TEXTURA LECHOSA)

PARDO ROJIZO

EMPEZ CON UN COLOR VERDE FUERTE O

MARRN DESPUS SE SEPAR EN DOS
CAPAS UNA VERDE Y LA OTRA PARDO

ROJIZO(NO COMO EL PARDO ROJIZO DE LA

MUESTRA BLANCO)
3

VERDE

CUANDO SE EMPEZ A CALENTAR SE FUE

TORNANDO VERDE FUERTE

VIOLETA

NOS DIO EL COLOR INDICADO EN EL

LABORATORIO

El primer macerado se realiz con la finalidad de romper la estructura celular

de la levadura seca y as separar ms fcilmente los componentes de la
misma, de tal forma que la membrana no interfiera con la reaccin del
tricloroactico y el proceso se lleve a cabo ms rpido; la segunda maceracin
con el cido tricloroactico permite una mejor separacin al momento de
centrifugar, puesto que no se disocia en iones de hidrogeno H +, se disocia de
sus radicales de cloro, formando iones de acetato acido, el cloro se enlaza con
la protena y cidos nucleicos, por medio de enlaces covalentes, cuya base
zona aminocidos al igual que las protenas, hacindolos ms pesados, de lo
contrario las molculas a separar no se obtendran con una mayor pureza
dificultando los procesos posteriores.(..5)
El glucgeno se precipito con etanol frio, solubilizando posibles monosacridos
de la solucin, y los polisacridos mucho menos solubles quedaran intactos; el
etanol debi estar frio evitando cambios del pH por temperatura de
naturalizando los polisacridos en la solucin, cambiando su estructura y los
resultados de los posteriores procesos no fueran sido concluyentes (). El
centrifugado separo el alcohol etlico con monosacridos de los polisacridos o
glucgeno resultante. La reaccin con la solucin de yodo (figura 1) permiti
determinar la presencia de polisacridos, donde el yodo reacciona con el
glucgeno produciendo un color pardo o castao rojizo, como en el caso de la
figura 1 el color castao no se obtuvo, pero hubo una clara reaccin, dada su
diferencia con la prueba de control, las causas, posible contaminacin del
precipitado de procesos anteriores con polisacridos, diferentes al glucgeno,
por la presencia de almidn en la levadura; despus de dos horas de haberse
preparado hubo una separacin de fases en el tubo 1 (figura 1), donde la fase
superior presentaba un color pardo rojizo ms intenso que la prueba de control,
demostrando la presencia de glucgeno, la fase inferior aun presentaba un
color marrn claro, mostrando contaminacin por el precipitado de la solucin
anterior.
La separacin de los cidos nucleicos de las protenas se llev a cabo gracias
al cloruro de sodio al 10%, una sal que hace ms soluble a las protenas de

baja fuerza inica o no solubles en agua ( Mancilla, C.G., et al. Campus Chapultepec.
2014), como las obtenidas en el precipitado de la primera parte del laboratorio
(figura 2), se realiz a un 10% de concentracin de otra forma no ocurrira una
correcta solubilizaran. Se logr separar completamente las dos fases, donde la
primera fase que contena los cidos nucleicos se le agrego el alcohol quitando
vestigios de sales. Despus de la separacin y l amortiguacin de los cidos, el
reactivo de orcinol permite la identificacin de pentosas en una solucin, en
nuestro caso de ARN, el calentamiento desnaturaliza el ARN que ocurre entre
90 a 120, veinte grados ms que el ADN, permitiendo que el orcinol
reaccione ms rpido con las molculas de ARN, donde la pentosa separada
del grupo fosfato y su radical reacciona con el orcinol produciendo un 3,5
dioxio-metil-fenil-furfuril-metano (.), que tiene una coloracin
verdosa (figura 3), a diferencia de la prueba de control que no tiene los cidos
nucleicos.
Las protenas se mantuvieron en una temperatura baja para evitar posibles
desnaturalizaciones o cambios de la estructuras de las mismas, la solucin
salina evita cambios abruptos o grandes del pH, se realiz la prueba sobre
toda el precipitado de las protenas, el cambio fue mnimo debido a la cantidad
de precipitado obtenido, solo una pequea coloracin a violeta, se repiti el
experimento con una muestra efectuando el mismo proceso dando positivo a
protenas, donde el sulfato de cobre se deshidrata con el hidrxido de sodio
quedando una molcula de Cu2, que se une a los grupos aminos de las
protenas, por lo que solo sera positivo si hubiera dos o ms enlaces
peptdicos.
Conclusiones
La pentosa por su estructura puede ser cambiada

ANEXOS

Cules son los fundamentos de las tcnicas de extraccin (cul es la utilidad de

cada uno de los pasos que se sigue y cada uno de los reactivos que se utiliza
para purificar las macromolculas y de las pruebas de identificacin empleados
en esta prctica?

Rt/ La separacin y la caracterizacin de especies qumicas son

fundamentales en procesos de produccin tecnolgica tan variados como la
industria farmacutica, agroalimenticia, biotecnolgica y biomdica. Un
mtodo de separacin utilizado en la prctica de laboratorio fue la
centrifugacin. Cuando una partcula se desplaza en un lquido en reposo o
en movimiento y dicho lquido ejerce presiones y esfuerzos sobre la
superficie de la partcula, la hidrodinmica entra en accin. As, la
separacin de dos tipos de partcula es posible cuando dichos esfuerzos son
diferentes para cada una. En la centrifugacin, la velocidad de
sedimentacin Us de una partcula en un lquido viscoso est dada por la
ecuacin:
Us = Gd 2 /18
Donde es la diferencia entre la densidad de la partcula o de una clula
sangunea, por ejemplo, y el lquido que la suspende. G es la aceleracin del
campo gravitacional, centrfugo, magntico, etc. Esta ecuacin se obtiene
considerando los esfuerzos sobre la partcula y el resultado muestra una
funcin del cuadrado del dimetro de la misma. Dos partculas de tamao
diferente sedimentan a velocidad diferente y podrn ser separadas. En una
suspensin bidispersa, es decir, compuesta de partculas de diferente dimetro
o densidad, la separacin se puede hacer por simple sedimentacin o
centrifugacin. (3)

Bibliografa

1 Pearanda, A. H. Microbiologia

. Industrial; EUNED, 2003.

2 Haehn, H. Bioquimica de las
. fermentaciones; Editorial Aguilar:
Espaa, 1991.
3 Hoyos, M. Separacion
. hidrodinamica de
macromoleculas. Acta biologica
colombiana 2003, 8 (1), 16.
4 Bejarano, L. D. C. Guia de
. laboratorio de Bioquimica;
Editorial Usc: Cali, 2013.

5Stephan Kemp, Ph.D., Cyntia Amorosi, M.Sc.,

And Paul Watkins, M.D., Ph.D. 2010
Jess Diez Dapena et. Al , Aislamiento y cuantificacin de glucgeno,
Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba
Qumica Biolgica I TP 10 DNA: extraccin, identificacin y reconocimiento