UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS

FACULTAD DE INGENIERA
ESCUELA REGIONAL DE INGENIERIA SANITARIA
Y RECURSOS HIDRULICOS
LABORATORIO DE QUMICA Y MICROBIOLOGA
SANITARIA

MANUAL DE PRACTICAS DE
LABORATORIO

MICROBIOLOGIA DEL AGUA

CATEDRTICO:
ING. M. SC. ZENON MUCH SANTOS

PRACTIC A No.1
O BJETIVO S
1

Observar e iden tificar el equipo ms utilizado en el Laboratorio de Microbiolo ga.

2.

Discu tir cada u na de las partes c on que co nsta el microscopio, sus cuid ados y
funci onamiento.

E QUIPO MS UTILI ZADO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOG A:

T ubo de e nsayo con

T apn de Rosca

Caja de Petr

As as de Ino culacin

Balanzas grana tarias

A gitadores de Vidri o

Balanzas analticas

Este rilizador de Aire C aliente

Autoclav e

Botella d e Van Dorn (para recoleccin de muestras de a gua en lagos)

Incubad ora

Esptul a

Papel Filtro

Ca mpana de Absorcin

Pin zas de La boratorio

bomba de Vacio

Membrana de Filtracin

Mechero b unsen

Mechero de Alcoh ol

Agujas de Inocula cin

MICROSCOPIO
USO DEL MICROSCOPIO
1.

El microscopio deber estar colocado sobre un escritorio o una mesa apropiada.

2.

Con su base hacia adelante. La plataforma o platina debe estar en posicin horizontal.

3.

Los oculares y los objetivos debern ser cuidadosamente limpiados antes de empezar a
usar el microscopio. Este tipo de operacin se har con un tipo de papel especial (lens
paper). Los lentes objetivos no deben ser removidos de la pieza llamada revolver, a menos
que sea necesario hacer una limpia ms efectiva. Lo cual la realizar un experto.

4.

Para limpiar el lente de inmersin, con objeto de remover el aceite de inmersin se frota
con papel de lentes humedecidos con xilol.

5.

Para empezar a hacer uso del microscopio, coloque el tubo con los oculares y objetivos,
empleando en esta operacin el tornillo macro-mtricos, a una distancia normal correcta
(ms o menos 160mm) de la plataforma.

6.

La iluminacin del objeto a observar, se lleva a cabo por ajustes del espejo con respecto a
la naturaleza de la fuente de luz (sea natural o artificial), esta operacin debe hacerse de
manera cuidadosa para la obtencin de buenos resultados.

7.

Si el condensador se encuentra equipado al microscopio, debe usarse siempre el espejo

plano, si el microscopio no posee condensador deber usarse el espejo cncavo con el
objeto de obtener una iluminacin ms intensa.

8.

Coloque antes de proceder a enfocar el microscopio, una lamina con el objetivo de4 menor
potencia, mueva cuidadosamente el tornillo macro-mtrico y baje el objetivo a una distancia
de de pulgada del objeto de observacin, por medio del lente ocular realice una
observacin efectuando un movimiento ascendente del tubo del microscopio por medio del
tornillo macro-mtrico hasta que la imagen aparezca, el enfoque del microscopio es afinado
por medio del tornillo micromtrico el cual nos dar una imagen clara y definida.

9.

Con el objeto de obtener una imagen ms grande y con mayores detalles se usan objetivos
de mayor potencia, se mueve el revolver con objeto e cambiar el de menor potencia, con el
cual se enfoc el microscopio. Afinar con el micromtrico.

10.

el lente de inmersin es que suministra mayor potencia en las observaciones

microscpicas, este lente para su uso con cuidado especial.
Para efectuar la observacin, coloque sobre la lmina con el material a observar, una
gota de aceite de inmersin.
Por medio del tornillo macro- mtrico proceda a bajar el lente de inmersin con todo
cuidado y despacio hasta que se ponga en contacto con el aceite de la lamina, se afina
pro medio del micromtrico (No se baje rpidamente este lente porque se corre el
riesgo de quebrar la lamina con el material). Las preparaciones teidas generalmente
se hacen por medio de este lente.
Para la observacin por inmersin, se usa siempre el aceite de inmersin por poseer
un ndice refraccin casi igual al del vidrio.

11.

El microscopio siempre esta provisto de un diafragma generalmente se encuentra por

debajo de la plataforma, se usa con el objeto de incrementar el contraste y mejorar la
definicin de la imagen puede ser usado para controlar la intensidad de la luz, pero no es
recomendable para este propsito, puesto que el mejor el uso de filtros neutros para
reducir la intensidad de luz.

12.

Nunca sierre un solo ojo para usar el microscopio, frmese el hbito de mantener los dos
ojos abiertos, esto al principio parece difcil pero pronto se adquiere el hbito.

CUIDADO DEL MICROSCOPIO

1.

Cuando se efectu preparaciones en fresco proteja los lentes del microscopio con
laminillas o cubre objetos, colocndolas sobre el material que esta en la lamina.

2.

Cuando termine sus observaciones microscpicas, proceda a la limpieza de los lentes,

tanto oculares como objetivos, por medio de papel para lentes. El lente de inmersin
lmpielo con papel de lentes humedecido con xilol.

3.

Cuando guarde o transporte el microscopio de un lugar a otro srgetelo con las dos manos,
una en el brazo del microscopio y la otra en la unin de la base o de ser posible
transprtelo en su caja.

4.

Guarde el microscopio siempre libre de polvo.

5.

Nunca use alcohol para limpiar las partes laqueadas del microscopio, pues este acta
como solvente de lacas.

6.

Si se realizan observaciones con los objetivos secos, usar el espejo cncavo y bajar el
condensador.

7.

Cuando se hagan observaciones con los objetivos de inmersin, asegurarse de que el

objetivo sea el correcto. Si se emplea otro, el aceite puede desprender el lente. En las
observaciones por inmersin utilice el espejo plano y suba el condensador hasta tocar la
parte inferior del portaobjetos.

PRACTICA No. 2
EXAMEN MICROSCOPICO DE UNA PREPARACIN EN FRESCO
OBJETIVOS
1.

Hacer uso del microscopio en forma correcta y como lo indica la practica No. 1.

2.

Hacer observaciones sobre el arreglo, forma, tamao, movilidad de varias clases

de microorganismos que se encuentran tanto en la parte superficial como en el
sedimento de la infusin que hay.

MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Laminas de microscopio (portaobjetos)

Cubreobjetos de microscopio.
Micro pipeta.
Agua estancada.
Microscopio.
Xilol.
Lens Paper.

PROCEDIMIENTO
1.

Caliente ligeramente un lado de la lmina por medio de una llama de lmpara de

alcohol o mechero bunsen, con objeto de remover grasa si sta estuviera presente.

2.

Coloque la lmina con el lado flameado para arriba, sobre la mesa limpia.

3.

Por medio de una micro pipeta, recoger una pequea cantidad de la superficie de
la sustancia liquida de la infusin que hay y coloque una gota con todo cuidado en
una lmina limpia de microscopio.

4.

Enfoque con el objetivo de menor potencia.

5.

Despus de enfocado, por medio del revolver observe con un objetivo de mayor
potencia.

6.

Examine el material con objeto de encontrar microorganismos tales como

bacterias, infusorios, algas etc.

7.

Repita los pasos anteriores, usando una gota de sedimento de la infusin que hay.

8.

Proceda a dibujar los microorganismos que observo tanto en el sedimento como en

la superficie, ponga atencin en al forma, movilidad y tamao.

SUPERFICIE
NOMBRE DEL MICROORGANISMO:
LENTE UTILIZADO:
AUMENTO:

SEDIMENTO
NOMBRE DEL MICROORGANISMO:
LENTE UTILIZADO:
AUMENTO:

PRACTICA No. 3
TINCIONES BACTERIANAS
GENERALIDADES
Tres caractersticas bsicas de los microorganismos hacen necesarios el empleo de tcnicas
especiales en al investigacin microbiolgica.
a) Su tamao diminuto.
b) La aparente ausencia de diferencias individuales.
c) Su amplia distribucin en la naturaleza.
Durante el procedimiento se usan siempre tcnicas aspticas (ausencia de microorganismos),
estos mtodos son adecuados para prevenir la contaminacin del medio de los microorganismos.
El procedimiento ms corriente para estudiar la morfologa bacteriana consiste en el examen de un
frotis que, previa fijacin se tie con algn colorante y se examina despus microscpicamente con
el objetivo de inmersin.
Debe extenderse el material con objeto de formar una pelcula delgada y obtener as una sola capa
de bacterias perfectamente separadas sobre el portaobjetos. Con esta preparacin previa, pueden
distinguirse perfectamente clulas aisladas ya que, de otra forma los microorganismos se
aglomeran en masas slidas impenetrables a la luz.
Es vital la tincin pues, de lo contrario, la diminuta clula bacteriana en su estado natural permitir
el paso de cantidad excesiva de luz y apenas se distinguira en un campo brillantemente iluminado,
si se redujera la luz, se apreciara como una espcula griscea sobre fondo gris.
Las clulas toman la tincin total o parcialmente, de acuerdo con una reaccin qumica entre
alguna sustancia celular y el colorante o bien, su superficie queda teida por un mecanismo e
atraccin. Entre otras palabras, las propiedades tinto-riales de una clula depende de su
composicin qumica y las diferencias en sus reacciones de coloracin constituyen ndices
importantes para diferenciar unas bacterias de otras.
La coloracin simple de un frotis o tcnica de tincin simple nos revela la forma, tamao y arreglo
de las clulas teidas por la aplicacin directa de un solo colorante. Sin embargo, es posible
conseguir mayor informacin a cerca de la morfologa y composicin qumica de las bacterias a
travs del uso de tcnicas de tincin diferenciales. Estas tcnicas llevan consigo el tratamiento del
frotis con una serie de reactivos. La apariencia de las clulas despus de este tratamiento nos
permite distinguir entre dos tipos diferentes de bacterias como base en el colorante que retienen.
OBJETIVOS
1.

Mostrar la manera de preparar un frote bacteriano y su tincin por medio de la

tcnica de coloraciones simples, utilizando fucsina fenificada y azul de metileno.

2.

Determinar las caractersticas morfolgicas de las bacterias.

TINCION DE CARBOLFUCHINA

MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Un tubo de cultivo con agar nutritivo de 24 horas de incubacin de escherichia Coli.

Un tubo de cultivo con agar nutritivo de 24 horas de incubacin de Bacillus Subtilis.
Un tubo de cultivo con agar nutritivo de 24 horas de incubacin de Staphylococcus
pyogenes.
Laminas de Microscopio.
Asa bacteriolgica.
Solucin diluida decarbolfuchina.
Microscopio.

PROCEDIMIENTO
1.

Caliente ligeramente un lado de la lmina por medio de una llama de lmpara de

alcohol o mechero bunsen, con objeto de remover grasa si esta estuviera presente.

2.

Coloque la lmina con el lado flameado para arriba, sobre la mesa limpia.

3.

Caliente el asa bacteriolgica al rojo vivo para destruir los microorganismos

contaminantes que se encuentren adheridos a la superficie.

4.

Por medio de un gotero coloque una gota de agua destilada estril, en el centro de
la lmina.

5.

Con la mano izquierda tome un tubo de cultivo de escherichia Coli, remueva el

tapn de algodn por medio del dedo pequeo de la mano derecho y con los dedos
pulgar e ndice, sostenga el asa bacteriolgica la cual fue previamente esterilizada.

7.

Flamee la boca del tuvo de cultivo, rtelo y recoja una cantidad mnima del
crecimiento bacteriano.

6.

Flamee nuevamente la boca del tubo, cirrelo con el tapn de algodn y colquelo
en la gradilla.

8.

Por medio del asa bacteriolgica mezcle y emulsifique el material con la gota de
agua colocada en la lamina.

9.

Extienda esta suspensin en un rea de ms o menos pulgada por una pulgada.

10.

Flamee el asa bacteriolgica de acuerdo con la tcnica del inciso No. 3 y colquela
en su sitio.

11.

Proceda a fijar el brote bacteriolgico por calor, pasando la lmina rpidamente de

cinco a seis veces sobre la parte superior de la llama. Esta operacin tiene por
objeto que no se lave el frote durante el proceso de tincin.

12.

De la misma manera preprense frotes de los tubos de cultivo de B. Subtilis,

variedad de aureus y Staphylococcus.

13.

Cubra los tres frotes con la solucin de carbolfuchina, use la cantidad suficiente
para cubrir el frote y no la lamina entera.

14.

Deje el colorante actu durante1/2 minuto.

15.

Lave las laminas con agua de grifo, seque al aire.

16.

Examine el frote al microscopio usando el procedimiento del lente de inmersin. (*)

17.

Proceda hacer dibujos de lo que observe en el microscopio, poniendo particular

atencin al tamao y forma.

escherichia Coli

Staphylococcus Aureus

Bacillus Subtilis

Procedimiento de Aceite de Inversin.

1.
2.
3.
4.
5.

Aplique una gota de aceite en la preparacin.

Coloque la preparacin en la platina.
Suba el condensador.
Coloque el objetivo de inmersin en su posicin.
Usando el tornillo macro mtrico, mueva el objetivo de inmersin lentamente
hasta que el lente toque el aceite de la preparacin. En ese momento brillara la
luz y se distinguir el espcimen.
Utilizando el tornillo micromtrico haga el ajuste fino para observar ntidamente
el espcimen.

6.

TINCION DE AZUL DE METILENO

MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.

Tubo de cultivo con agar nutritivo de Escherichia Coli.

Tubo de cultivo con agar nutritivo de Bacillus Subtilis.
Laminas de microscopio.
Asa Bacteriolgica.
Solucin colorante de azul de metileno.

PROCEDIMIENTO:
1.
2.
3.
4.
5.

Siga las mismas instrucciones empleadas en la prctica anterior, en lo que se

refiere a la preparacin de frotes y fijacin de los mismos.
Cubra el frote previamente fijado con solucin azul de metileno, por 5 minutos.
Lave la lamina con agua del grifo y djela secar al aire.
Observe al microscopio por el mtodo de inmersin.
Procede a dibujar lo observado.

Escherichia Coli

Bacillus Subtilis

TINCIN DE GRAM
La coloracin de gran es probablemente la tincin ms importante en Bacteriologa,
es una coloracin compuesta y deferencial, dividiendo a las bacterias en dos grandes
grupos, dependiendo de que retengan el colorante original (solucin de cristal violeta) o lo
pierda cuando este colorante es tratado con solucin de lugol y lavado con alcohol acetona
o alcohol a 95o.
Los organismos que retienen el cristal violeta se denominan bacterias *gram
positivas* y las que pierden el colorante original pero se tien con el colorante de contraste
(fucsina o safranina). Son llamadas bacterias *gramnegativas*.
Este colorante es un valor considerable en la identificacin de las bacterias y su
clasificacin.
Existen microorganismos variables al gram, conviene por lo tanto hacer el frote con
cultivos jvenes. Si apareciera dentro de la clula una parte sin teir, puede tratarse de
endosporas que no toman fcilmente los colores.
MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Un tubo de cultivo con agar nutritivo de 24 horas, de incubacin de Escherichia Coli.

Un tubo de cultivo con agar nutritivo de 24 horas, de incubacin de Bacillus Subtilis.
Lminas limpias y desengrasadas de microscopio.
Asa Bacteriolgica.
Lmpara de alcohol mechero bunsen.
Solucin de cristal violeta.
Solucin de Lugol.
Alcohol-acetona o alcohol a 95.
Solucin de safranina.

PROCEDIMIENTO:
1. Prepare un frote de cultivo que contiene E. Coli, de a cuerdo a la tcnica seguida en las
prcticas anteriores.
2. Fjelo por calor.
3. Cubra el frote con la solucin de cristal violeta, durante un minuto.
4. Lave la lmina con agua del grifo para quitar el exceso de colorante.
5. Aplique solucin de lugol, djelo durante un minuto.
6. Agregue el alcohol-acetona gota a gota hasta que salga el color violeta.
7. Lave rpidamente, con agua del grifo, evitando en lo posible la remocin completa del
colorante de la solucin de cristal violeta.
8. Agregue al colorante de contraste fucsina o safranina, durante un minuto.
9. Lave con agua del grifo y seque por aire.
10. Examine el frote bacteriolgico por medio del objetivo de inmersin.
11. Repita el mismo procedimiento, usando un tubo de B. Subtilis.
12. Anote los resultados en el siguiente cuadro.
Organismo
Escherichia Coli
Bacillus Subtilis

Color

MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS

PRACTICA No.4
TAMAO DE LAS BACTERIAS
(PENDIENTE)

Reaccin de gran

PRACTICA No. 5
MORFOLOGA DE LEVADURA EN CRECIMIENTO
GENERALIDADES:
Las levaduras lo mismo que los mohos, son hongos, pero se distinguen de los dems
porqu su forma dominante es unicelular. Son diferentes de las algas porque no realizan
fotosntesis; tampoco son protozoos, puesto que no tienen una pared celular rgida. Con facilidad
se diferencian de la mayor parte de las bacterias por su tamao relativamente grande y su
morfologa.
La mayor parte de las levaduras de uso industrial son miembros de gnero
Saccharomyces. Las clulas son redondas, ovales o alargadas. Este gnero incluye a
Saccharomyces Cerevisiae, conocida generalmente como levadura de panadero o del cervecero.
Algunas de la misma especie son empleadas en medicina y otros para fermentacin del azcar
para obtener alcoholes.
Saccharomyces Cerevisiae se produce por gemacin, fisin, combinacin de gemacin y
fisin y por formacin de esporas asexuales. La reproduccin sexual no se ha observado. La
ascospora (saco de esporas) contiene una a cuatro esporas redondeadas.
Las levaduras estn compuestas por: Capsulas, pared celular, membrana citoplasmtica,
componentes del protoplasma, ncleo, mitocondrias y vacuolas.
MATERIAL REQUERIDO:
1. Un tubo de caldo glucosado con S. Cervisiae.
2. Portaobjetos.
3. Cubreobjetos.
PROCEDIMIENTO:
1. Coloque dos o tres lupas de caldo glucosado con S. Cervisiae en un portaobjetos y
cbralo cuidadosamente.
2. Enfoque con el objetivo de menor potencia, mueva el revolver y enfoque con el objetivo
seco de mayor potencia.
3. Examine las clulas de levaduras cuidadosamente.
4. Note la presencia de nuclolos, vacuolas, grnulos, pared celular, etc.

PRACTICA No. 6
MORFOLOGA DE LOS MOHOS MS COMUNES
GENERALIDADES:
Los mohos que comnmente se encentran son del genero Mucur, Rhizopus Geotrichum,
Cepahlothecium condida, Aspergillus, Penicillum, cladosporium y Alternaria.
Las especies de mohos son difciles de remover del medio de cultivo sin causar dao a la
forma de estos, de tal manera que se debe de tener cuidado extremo, para un montaje cuidadoso
al observarlos al microscopio.
El agua no debe usarse para el montaje fluido microscopio, porque esta se evapora
prontamente produciendo deformaciones de las hifas por el efecto de osmosis y causa que arias
partes del hongo se adhieren y se observen como una masa uniforme. Tales preparaciones no son
satisfactorias para observaciones microscpicas.
Una tcnica de montaje, fluido satisfactoria es conocida como montaje en lactofenol, esta
solucin no causa deformacin celular y no se evapora, permitiendo que las preparaciones sean
permanentes, un colorante como el azul de algodn puede ser agregado al lactofenol para colorear
las estructuras del moho.
En una preparacin hecha de esta manera las hifas deben ser examinadas para ver si hay
tabiques, estructuras de las esporas y otras partes de los mohos que son determinantes.

MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Mohos procedentes de diferentes materiales, frutas, vegetales, madera, pan etc.

Lminas limpias de microscopio.
Cubreobjetos.
Solucin de Lactofenol.
Mechero.
Microscopio.

PROCEDIMIENTO:
1. Coloque dos o tres lupas de una solucin de lactofenol en el centro de una lmina de
microscopio limpia.
2. Remueva una pequea porcin del moho del material contaminado y colquela en la
solucin de lactofenol colocada en la lmina.
3. Cuidadosamente por medio de unas agujas de diseccin extienda y separe el material
humedecindolo en la solucin de lactofenol.
4. Cubra la preparacin con el cubreobjetos teniendo cuidado que al hacerlo no quede
burbujas de aire.
5. Enfoque con el objetivo de menor aumento y traspase al de mayor aumento.

PRACTICA No. 7
ESPORAS EN LAS BACTERIAS
Las esporas son cuerpos que se producen en el interior de algunos gneros de bacterias,
son formas de resistencia cuando el medio que se desarrolla la bacteria es adverso. La formacin
de esporas se presenta solamente en las bacterias en forma de bacilo.
El proceso de esporulacin se efecta despus de la de la fase de crecimiento logartmico.
MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Cultivo de Bacillus subtilis de 72 horas de incubacin.

Solucin de Hucker, cristal violeta con oxalato de amonio.
Solucin acuosa de verde malaquita al 5%.
Solucin acuosa de safranina al 0.5%
Lminas limpias.
Microscopio.

PROCEDIMIENTO:
Mtodo de Hucker:
1. Prepare un frote de bacillus subtilis de 72 horas de incubacin.
2. Seque el frote colocando la lmina a una distancia prudencial arriba de la llama del
mechero y fjelo por el calor.
3. Cubra el frote con la solucin de cristal de violeta y oxalato de amonio durante un (1)
minuto.
4. Lave la preparacin con agua de grifo y squela al aire.
5. Examine por medio del objetivo de inmersin.
6. Las clulas vegetativas aparecen prpuras y las esporas no se colorean.

Mtodo de Schaeffer y Fulton:

1. Prepare un frote de bacillus subtilis de 72 horas de incubacin.
2. Seque el frote colocando la lmina a una distancia prudencial arriba de la llama del
mechero y fjelo por el calor.
3. Cubra el frote con una solucin acuosa al 5% de verde malaquita, djela actuar de 30 a
60 segundos; caliente la preparacin en la llama del mechero durante 30 segundos.
4. Lave la preparacin con agua de grifo durante 30 segundos.
5. Cubra el frote con una solucin acuosa de safranina al 0.5% durante 30 segundos.
6. Lave la preparacin con agua de grifo, squela al aire.
7. Las esporas se tien de verde y las clulas bacterianas de rojo.

PRACTICA No. 8
SIEMBRA EN TUBOS DE CULTIVO
CULTIVOS AEROBIOS
Varios mtodos se han empleado para el cultivo de microorganismos aerobios o
anaerobios facultativos. Generalmente se emplean dos medios bsicos: el caldo nutritivo y el agar
nutritivo.
La tcnica para la siembra de los medios mencionados anteriormente se efectan por tres
procedimientos:
Siembra en profundidad en agar nutritivo.
Siembra en agar inclinado.
Siembra en caldo nutritivo.
MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Un tubo de Bacillus subtilis, uno de S. Cervisiae y uno de Aspergillus.

Una aguja y asa de Inoculacin.
3 tubos de agar nutritivo.
3 tubos de agar nutritivo inclinado.
3 tubos de caldo nutritivo.
Mechero.

P ROCEDI MIENTO:
T cnicas d e siembr a en profu ndidad o por picad ura:
1. Esterilice la aguja de inoculacin a la lla ma y enfre la en uno s segundos.
2. Tome el tubo de cultivo de B. Subtilis, c erca de la llama del mechero, remueva el tapn
de algodn, rote la boc a del tubo en la llam a para evitar contaminaciones.
3. Introduzca la aguja de inocula cin y extr ayendo un poco de material de cultivo.
4. Rote nuevamente la boca de l tubo y colquele el tapn de algodn y pngase en la
gradilla.
5. Tome el t ubo de ag ar nutritivo, remueva el tapn, rote la bo ca del tub o en la lla ma para
evi tar contaminaciones.
6. Introduzc a la aguja de inocula cin directamente y atravesan do el agar hasta to car casi
el fondo del t ubo, squ elo lentam ente.
7. Flamee nu evamente el tubo e n movimie nto de rota cin, col quele tapn.
8. Flamee al rojo vivo a todo lo largo de la aguja de in oculacin y colquela en su lugar.
9. Con un crayn gras o o etiqu eta, marq ue el tubo con el n ombre del microorg anismo,
grupo y fecha .
10. Proceda en la mism a forma con los tubos de S. Cerevisiae y Aspergillus.
11. Proceda a incubar los cultiv os a 35 oC el B. Su btilis dura nte 48 ho ras, a 20 oC el S. Ce
rvisiae durante 5 das y a temperatura a mbiente el Aspergilus durante u na semana.

T cnica de siembra en agar i nclinado:

1. Esterilice el asa de i noculacin a la llama y enfrela en unos segundos.
2. Tome el tubo de cultivo de B. Subtilis, c erca de la llama del mechero, remueva el tapn
de algodn, rote la boc a del tubo en la llam a para evitar contaminaciones.
3. Introduzca el asa de inoculaci n y extrayendo un poco de ma terial de cultivo.
4. Flamee n uevament e la boca del tubo y colquele el tapn d e algodn y pngas e en
la gradilla.
5. Tome el tu bo de aga r nutritivo inclinado, remueva el tapn, flamee la boca del tu bo en la

lla ma y proce da a sembrar en la superficie del agar, por medio del frotamiento suave del
asa con el m aterial sigu iendo un movimiento de zig z ag del fond o del tubo hacia la boca
de este y saque el asa del tubo.
6. Con tcnic as de asepsia, colo que nuevamente el t apn de algodn en el tubo.
7. Flamee al rojo vivo a todo lo largo del asa de inocu lacin y c olquela en su lugar.
8. Con un crayn gras o o etiqu eta, marq ue el tubo con el n ombre del microorg anismo,
grupo y fecha .
9. Proceda en la mism a forma con los tubos de S. Ce revisiae y Aspergillus.
10. Proceda a incubar los cultivos a 35oC los B. Su btilis dura nte 48 horas, a 20o C el S.
Ce rvisiae durante 5 das y a temperatura a mbiente el Aspergillus durante una sema na.

T cnica de cultivo en caldo nutritivo:

1. Siga los m ismos procedimient os que se describen en las tc nicas anteriores.
2. De cultivos en agar inclinado de B. S ubtillis, S. Cervisiae y Asperg illus, realice una
sie mbra en c aldo nutritivo.
3. Como el agar nutriti vo se encu entra en u n medio slido, teng a la preca ucin de agitar el
asa vigorosamente en el medio de cultivo lquido para desp render el material
con los
mic roorganis mos adheridos a la l upa del asa.
4. Proceda nuevamente a incu barlos a las mismas temper aturas durante los
mismos
periodos de i ncubacin, que en las anterior es siembra s.
5.
Observar si hubo c recimiento o no, por la forma cin de precipitado en el caso de la
lev adura y en las bacterias turbid ez.

R ESULTA DOS:
1. Examinar y observa r el tipo y caracters ticas de crecimiento de cada una de la s cepas
en los diferentes modos de siembra en las p lacas y tubos.
2. Consignar las obser vaciones en forma tabular.
CEP A
A
B
C

FORMA

ELEVAC ION

COLOR

FO RMAS Y ELEVACI ONES DE COLONIA S BACTE RIANAS

CONSIST ENCIA

PRACTICA No. 9
CULTIVOS EN AGAR PARA OBSERVACIN DE COLONIAS GIGANTES
DE LEVADURAS Y MOHOS

GENERALIDADES:
El cultivo de colonias gigantes es un medio de informacin muy til en la identificacin de
levaduras y mohos.
Se observar la forma de la colonia, el color, el aspecto, levantamiento, desarrollo, etc.
MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.

Un erlenmeyer estril de 150 a 200 ml. provisto de tapn de algodn.

Un tubo de agar maltosado o dextrosado.
Un tubo de cultivo de levadura.
Un tubo de cultivo e moho.
Asa bacteriolgica.

PROCEDIMIENTO:
1. Se licua el tubo de cultivo de agar maltosado o dextrosado.
2. En esta forma se agrega a u erlenmeyer estril siguiendo una tcnica asptica.
3. Se deja que se solidifique formando una capa horizontal en el fondo del erlenmeyer, se
espera 20 minutos o se coloca en una refrigeradora para un enfriamiento rpido
4. Se toma el tubo con un cultivo de levadura, se flamea la boca y se extrae el tapn de
algodn.
5. Siguiendo una tcnica asptica por medio del asa previamente flameada, se extrae un
poco de material del tubo de cultivo, se flamea nuevamente la boca del tubo, se tapa y se
coloca en la gradilla.
6. Se toma el erlenmeyer, se flamea la boca del frasco quitando previamente el tapn de
algodn, se introduce el asa con el material y se siembra tocando con el asa el centro del
erleneyer a manera de depositar el material.
7. Se saca el asa, se flamea la boca del erlenmeyer, se tapa y se cubre con un cuadro de
papel kraft y se anuda el cuello del frasco con un cordel.
8. Las levaduras se incuban durante 5 das de 20 oC a 25oC y los mohos se mantienen a
temperatura ambiente.
9. Se observar los cambios que se operaron en el crecimiento de las colonias durante 5
das.
10. En la tabla anote los resultados.

PRACTICA No. 10
COEFICIENTE FENOLICO
GENERALIDADES:
El coeficiente fenolico, se define como la expresin aritmtica de la capacidad de un
agente qumico para destruir microorganismos identificados, tales como Salmonella, typhosa o
Staphylococcus aureus, estableciendo comparaciones con el efecto producido por el fenol puro
(cido fenico), actuando bajo las mismas condiciones normales. Suele abreviarse este trmino con
las inciales CF.
Cuando se hace mencin del coeficiente fenolico, deber nombrarse el microorganismo
que se uso en la prueba, por ejemplo, si en la prueba se uso S. Aureus, el resultado final debe de
expresarse, como el coeficiente fenolico del Staphylococcus aureus.
El coeficiente fenolico de un desinfectante comercial se establece a menudo en su mismo
envase.
CF debe usarse en pruebas qumicas similares a las del fenol y bajo circunstancias
idnticas.

OBJETIVO:
1. Aplicar el procedimiento del CF a un desinfectante dado y as establecer el CF de esta
sustancias problemas.
MATERIAL REQUERIDO:
1. Un tubo de cultivo de caldo nutritivo de 24 horas de incubacin de Staphylococcus
aureus.
2. 26 tubos de caldo nutritivo estril.
3. 13 tubos de cultivo estril.
4. Un frasco conteniendo agua estril.
5. Pipetas estriles de 1 cm3.
6. Pipetas estriles de 10 cm3.
7. Lupa de inoculacin de 4 mm de dimetro. .
8. Solucin patrn de fenol al 5%.
9. Solucin patrn de cresol al 5%.
PROCEDIMIENTO:
1. Coloque seis tubos estriles en una gradilla y enumrelos de izquierda a derecha.
2. Prepare las siguientes diluciones de fenol.
Dilucin

1:20 fenol
Cm3

1:50
1:60
1:70
1:80
1:90
1:100

2
2
2
2
2
2

Agua
destilada
Cm3
3
4
5
6
7
8

Volumen
Cm3

Descartar
Cm3

5
6
7
8
9
10

0
1
2
3
4
5

Volumen
Final
Cm3
5
5
5
5
5
5

3. Pipetee 2 cm3 de la solucin al 5% de fenol en cada uno de los seis tubos estriles.
4. Agregue a cada tubo la cantidad de agua destilada, especificada en el cuadro anterior.
5. Mezcle.
6. Remueva de cada tubo la cantidad que exceda de 5cm 3.
7. Con el objeto de evitar el uso de mucho material estril use pipetas de 10cm 3 para medir
las porciones de 2 cm3 de fenol y otra pipeta para preparar las diluciones.
8. Coloque otra serie de tubos estriles y prepare las siguientes diluciones de solucin de
cresol.
Dilucin

1:20 cresol
Cm3

1:150
1:175
1:200
1:225
1:250
1:275
1:300

1
1
1
1
1
1
1

Agua
destilada
Cm3
5
6
7
8
9
10
11

Volumen
Cm3

Descartar
Cm3

6
7
8
9
10
11
12

1
2
3
4
5
6
7

Volumen
Final
Cm3
5
5
5
5
5
5
5

9. Sigua el mismo procedimiento que empleo en las diluciones de fenol.

10. Coloque dos series de tubos de cultivo conteniendo caldo nutritivo y mrquelos con el
mismo nmero que tiene los tubos con la dilucin de fenol.
11. Coloque otras dos series de tubos de cultivo conteniendo caldo nutritivo, mrquelos
con el mismo nmero que tienen los tubos con las diluciones de la solucin de cresol.
12. A intervalos de 30 segundos, pipetee 0.5cm 3 de un cultivo de caldo nutritivo de 24
horas de S. aureus, colquelo en cada tubo de las diluciones de fenol. Use una pipeta de
1 cm3 y sea cuidadoso de no contaminar los lados del tubo con el cultivo.
13. Despus de un periodo de 5 minutos, remueva una lupa de la mezcla de la primera
dilucin y transfirala a un tubo de cultivo con caldo nutritivo.
14. A intervalos de 30 segundos, remueva una lupa de los tubos restantes y transfirala a
los tubos con caldo nutritivo.
15. Despus de un perodo de otros 5 minutos, repita el procedimiento, usando la segunda
serie de tubos de caldo nutritivo.
16. Repita el mismo procedimiento que se efectu con el fenol, pero esta vez use las
diluciones de cresol.
17. Finalizadas todas estas operaciones, incube todos los tubos a 35C durante 48 horas.
18. Examine los tubos, observe la presencia de turbidez.

19. Anote las observaciones en los siguientes cuadros, informe sobre la presencia de
crecimiento por medio del signo (+) y la ausencia por medio del signo (-).

Dilucin
1:50
1:60
1:70
1:80
1:90
1:100

Dilucin
1:150
1:175
1:200
1:225
1:250
1:275
1:300

5 minutos

5 minutos

10 minutos

10 minutos

20. Determine el coeficiente fenolico con respecto al Staphylocuccus aureus, de una

solucin de cresol, dividiendo la dilucin ms alta del desinfectante en que destruy el
microorganismo de prueba en 10 minutos, pero no en 5 por la dilucin de fenol que en
iguales condiciones destruy el S. aureus.

PRACTICA No. 11
ACCIN BACTERICIDA DEL CLORO Y SUS DERIVADOS
GENERALIDADES:
El cloro y sus derivados, de concentraciones y tiempos de contacto adecuados, destruyen
caso todas las bacterias presentes en el agua, por lo que tiene un amplio uso de purificacin del
agua, tanto en la forma de cloro gaseoso o lquido, as como en la de sus derivados tales como los
hipocloritos y cloroaminas, los cuales son de amplio uso en esta campo de Ingeniera Sanitaria.
MATERIAL REQUERIDO:
1. Una muestra de agua cruda muy contaminada.
2. Diez tubos de cultivo grandes.
3. Diez frascos conteniendo diferente concentraciones de cloro: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6,
0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mg/l. ppm.
4. Once tubos de caldo lactosado.
5. Once cajas Petri, estriles.
6. Once tubos de agar nutritivo.
7. Pipetas estriles de 1cm3.
8. Pipetas estriles de 10 cm3.
PROCEDIMIENTO:
1. Por medio de una pipeta, coloque 10 cm 3 de la muestra, en cada uno de los diez tubos
grandes de cultivo.
2. Coloque en cada uno de los tubos de cultivo 1 cm 3 de las diferentes concentraciones de
cloro. Mezcle y marque los tubos con las diluciones respectivas.
3. Deje actuar el cloro durante un tiempo de contacto de 30 minutos.
4. Despus de este periodo de contacto coloque 1cm 3. En cada uno de los 10 tubos de
caldo lactosado y 1cm3. En cada uno de las cajas de Petri.
5. El tubo sobrante de caldo lactosado, as como la caja de Petri servirn de control,
marque con las diluciones tanto los tubos como las cajas.
6. Agregue a cada caja de Petri un tubo de agar nutritivo previamente licuado, homogenice
el medio con el liquido de la caja, haciendo un movimiento de rotacin.
7. Cuando se solidifique el agar invierta las cajas.

8. Los tubos de caldo lactosado y cajas de Petri se incuban a 35C durante 48 horas.
9. Despus de este perodo, anote los resultados en el cuadro siguiente. De los tubos de
presencia o ausencia de crecimiento, en las cajas de ser posible un recuento de colonias.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Tubos de caldo
lactosado
Cajas de Petr
con agar
nutritivo

MICROBIOLOGA SANITARIA
PRACTICA No. 12
PREPARACIN DE MATERIAL PARA EL ANALISIS
BACTERIOLOGICO DEL AGUA
MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Papel Kraft.
Un pedazo de algodn.
Cordel.
Un palillo de fosforo un clip.
Frascos de Pirex de 125 cm3 de capacidad.
Pipetas graduadas de 10 cm3.
Pipetas graduadas de 1cm3.
Cajas de vidrio tipo Petri.
Tijeras.

PROCEDIMIENTO:
Preparacin para esterilizacin de los frascos que se emplearn en el anlisis
bacteriolgico.
1. Los frascos deben llenar las siguientes condiciones:
En Perfectas condiciones de limpieza.
Boca ancha.
Tapn esmerilado.
De vidrio transparente, pirex.
De 125 cm3 de capacidad.
2. Recrtese una tira de papel kraft de 17cm. de largo por 2cm. de ancho.
3. Recrtese un cuadro de papel kraft de aproximadamente 15cm.
4. Coloque la tira de papel entre la boca y el tapn del frasco, esta operacin tiene por
objeto facilitar abrir el frasco en el momento de captar la muestra.
5. Coloque sobre el tapn y cubriendo parte del frasco el cuadrado de papel recortado
anteriormente, a manera de formar una capucha protectora, y con un cordel amarre el
cuello del frasco, haciendo un lazo fcil de deshacer al momento de la captacin de la
muestra. Esta operacin tiene por objeto preservar el frasco de contaminaciones ajenas a
la muestra despus de haber sido esterilizado.
Preparacin para la esterilizacin de las pipetas de 10 cm 3 y 1cm3.
1. Las pipetas deben encontrarse en perfectas condiciones de limpieza.
2. Con el palillo de fosforo clip, se inserta una pequea porcin de algodn en la boquilla
de las pipetas, esto tiene por objeto que, al operar la muestra eviten contaminaciones
procedentes de la boca del operador a la muestra o bien de la muestra al operador.
3. Recortar tiras de papel kraft de 60cm. de largo por 6cm. de ancho para pipetas de
10cm3 y 45cm. de largo por 4cm. de ancho para pipetas de 1cm3.
4. Con estas tiras se procede a envolver las pipetas de acuerdo a las indicaciones del
instructor, esta operacin se hace con el objeto de protegerlas de cualquier contaminacin
despus de esterilizarlas.

Preparacin para la esterilizacin de las cajas Petri:

1. Las cajas Petri deben encontrarse en perfectas condiciones de limpieza.
2. Se recortan cuadrados de papel kraft de 30cm.
3. Se procede a envolverlas cajas de acuerdo a las indicaciones del instructor, esta
operacin tiene por objeto conservar las cajas en condiciones de esterilidad.
Procedimiento para la esterilizacin para el material de vidrio:
Todo el material preparado de acuerdo a las indicaciones anteriores, se procede a
esterilizar de la siguiente manera:
Por el mtodo de calor seco, el cual se efecta en hornos elctricos a una temperatura de
170C por una (1) hora.
PREGUNTAS:
1. Qu otro material se puede usar en lugar de papel kraft y qu caractersticas deben
reunir?
2. Actualmente Cmo se esterilizan las cajas de petri y las pipetas?
3. De los procedimientos de esterilizacin cual resulta ms eficaz?

PRACTICA No. 13
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA EL ANALISIS
BACTERIOLOGICO DEL AGUA

GENERALIDADES:
Los medios de cultivo poseen una composicin qumica definida, diseada para el cultivo
de tipos especficos de bacterias conocidas. En la mayora de los laboratorios, los medios de
cultivo son sintticos, actualmente se estn usando ciertos materiales crudos como peptonas,
extracto de carne y extracto de levadura, haciendo posible obtener un medio de cultivo que hace
posible el desarrollo de gran variedad de bacterias y otros microorganismos de manera rpida y
eficaz.
Los medios de cultivo ms conocidos son el caldo lactosado y el agar nutritivo.
Generalmente se usa el agar nutritivo cuando se desea un agente solidificante.
MATERIAL REQUERIDO:
1. 15 tubos sin reborde de vidrio pyrex de 22 x 175 mm.
2. 30 tubos pequeos, del tipo Durham o fermentacin.
3. 30 tubos sin borde, de vidrio pyrex de 18 x 150 mm.
4. 4 vasos de precipitar o frascos Erlenmeyer, de vidrio pyrex de 500 ml. de capacidad.
5. 5 pipetas de 10cm3.
6. 2 gradillas de metal, para tubos de cultivo.
7. 1 varilla de vidrio.
8. 6 onzas de algodn.
9. 1 tijera.
10. Caldo lactosado (medio de cultivo), en forma deshidratada.
11. Verde Brillante (medio de cultivo), con bilis de buey al 2% deshidratada.
12. Eosina azul de metileno (medio de cultivo)
13. Agar nutritivo deshidratado.
14. Agua destilada.

PROCEDIMIENTO:
Preparacin del medio de cultivo de caldo lactosado doble y simple:
1. Pese las cantidades en gramos de caldo lactosado deshidratado, en doble y simple
concentracin, de acuerdo a las indicaciones del instructor, colqueles tanto la
concentracin doble como la simple en vasos de precipitar.
2. Agregue la cantidad de agua destilada que seale el instructor, mezcle el medio y agite
con una varilla hasta completar la disolucin.
3. Por medio de una pipeta de 10cm3. Coloque cantidades de 10cm3 de caldo lactosado doble
en cada uno de los 5 tubos de vidrio de (22x175mm), sealados para este propsito.
3
3
4. Por medio de una pipeta de 10cm . Coloque cantidades de 10cm de caldo lactosado

simple en cada uno de los tubos restantes de vidrio de (22x175mm), sealados para este
propsito.
5. Coloque un tubo Durham o fermentacin en posicin invertida (con la boca hacia abajo)
en cada uno de los 15 tubos de caldo lactosado.
6. Recorte un pedazo de algodn y enrllelo de acuerdo a las indicaciones del instructor y
colquelo a manera de tapn al tubo que contiene medio de cultivo.
Preparacin del medio de cultivo de verde brillante con bilis de buey:
1. Pese la cantidad en gramos de caldo verde brillante deshidratado de acuerdo a las
indicaciones del instructor y colquelo en un vaso de precipitar de 500cm 3.
2. Agrguele agua destilada de acuerdo a la cantidad que indique el instructor, mezcle y
agite con una varilla, hasta la disolucin del medio.
3. Con una pipeta de 10cm3 coloque cantidades de 10cm3 de verde brillante en cada uno
de los 15 tubos de vidrio de (18x150mm), colocados en la gradilla.
4. Coloque a cada tubo, de manera invertida un tubo Durham o fermentacin.
5. Proceda a confeccionar tapones de algodn.
Preparacin del medio de cultivo de eosina azul de metileno:
1. Pese la cantidad en gramos de eosina azul de metileno y colquelo en un vaso de
precipitar de 500cm3.
2. Agrguele agua destilada de acuerdo a la cantidad que indique el instructor, mezcle y
agite con una varilla, hasta la disolucin del medio.
3. Con una pipeta de 10cm 3 coloque cantidades de 10cm 3 de eosina azul de metileno en
cada uno de los 3 tubos de vidrio de (18x150mm), sealados para este propsito.
4. Proceda a confeccionar tapones de algodn.
Preparacin del medio de cultivo de agar nutritivo:
1. Pese la cantidad en gramos de agar nutritivo y colquelo en un vaso de precipitar de
500cm3.
2. Agrguele agua destilada de acuerdo a la cantidad que indique el instructor, mezcle y
agite con una varilla, hasta la disolucin del medio.
3. Colocar en una hornilla hasta lograr la ebullicin.
4. Con una Con una pipeta de 10cm3 coloque cantidades de 10cm3 de agar nutritivo en
cada uno de los tubos de vidrio de (18x150mm), sealados para este propsito.
5. Proceda a confeccionar tapones de algodn.
Procedimiento para la esterilizacin:
Se procede a esterilizar por el mtodo de calor hmedo, el cual se efecta en autoclave a
una temperatura de 121C, a una presin de 15 libras por un tiempo de 30 a 45 minutos.
INVESTIGACIN:
Investigue y realice un procedimiento grfico de cmo se lleva a cabo la esterilizacin
por mtodo de calor hmedo; para los tubos de ensayo.

PRACTICA No. 14
CAPTACIN DE MUESTRAS DE AGUA, PARA EL ANALISIS
BACTERIOLGICO DE AGUA CRUDA TRATADA

GENERALIDADES:
Se debe obrar con el mejor criterio en la seleccin de un mtodo de muestreo, y tal
seleccin depende primordialmente de las instalaciones disponibles en el laboratorio. Unos cuantos
factores que deben tomare en consideracin para la toma de muestras son:
a) El carcter de los exmenes de laboratorio que se tiene que verificar.
b) El uso aplicacin que se haga de los resultados de las pruebas o anlisis.
c) La naturaleza del agua muestreada y variacin de sus caractersticas durante el periodo de
muestreo.
d) La variacin de gasto hidrulico durante el periodo de muestreo.
Para los exmenes ordinarios de aguas qumicos o fsicos, la muestra debe recolectarse en un
frasco limpio de cristal (preferentemente esterilizado), con tapn de cristal, o en un frasco de
plstico. El volumen de la muestra depende de las pruebas que se deban verificar.
Para tomar una muestra de un pozo, se debe bombear por un tiempo suficiente para que la
muestra que se tome sea representativa del agua profunda que alimenta el pozo.
Las aguas de lagunas, lagos y embalses se encuentran con frecuencia, expuestas a
condiciones variables, resultantes de causas naturales, como los cambios estacionales lluvias,
vientos y las corrientes internas. Por lo general, las variaciones no son tan rpidas ni tan amplias
como las que se observan en las aguas corrientes. En general una sola muestra puede ser
representativa pero si existen condiciones cambiantes, se debe tomar varias muestras en lugares
diferentes. Se debe tomar en cuenta que en los lagos la composicin del agua puede variar con la
profundidad.
Gran parte de los muestreos se realizan en la misma planta potabilizadora. Este es el punto
lgico para el muestreo, en particular si el agua cruda se tiene que tratar y almacenar para su
distribucin. La frecuencia del muestreo depende del tipo de planta y del tratamiento que se aplica.
Para la recoleccin de muestras bacteriolgicas deben seleccionarse en zonas exteriormente
limpias y en condiciones sanitarias. Sea que la muestra se destine para exmenes bacteriolgicos
o qumicos, debe ejercerse particular cuidado para asegurarse que es representativa del caudal de
distribucin y que se excluyan del frasco a las sustancias extraas.
Si se necesita hacer un anlisis fsico-qumico es suficiente una muestra de un galn de vidrio
o polietileno (materiales bacteriolgicamente inertes). Si es un anlisis microbiolgico debe
contarse con frascos de vidrio, previamente esterilizado con un mnimo de capacidad de 100cm 3 de
capacidad ms un pequeo espacio para aire.
OBJETIVOS:
Proporcionar las recomendaciones necesarias para la captacin de muestras, ya que el
buen resultado del anlisis qumico y microbiolgico, depende mucho de ello.
MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.

Frascos pyrex de 125cm3.

Galones de vidrio o de polietileno.
Hielera para transportar muestras.
Etiquetas.
Termmetro.

PROCEDIMIENTO:
Captacin de muestras de agua de un grifo:
1. La muestra se captar de uno de los grifos de los filtros de la planta.
2. Encienda el mechero de alcohol.
3. Proceda a flamear alrededor de la boca del grifo para destruir las bacterias del grifo, las
cuales seran ajenas al contenido bacteriano de la muestra.
4. Abra el grifo y deje correr el agua hasta que su temperatura llegue a ser constante e igual a
la que se sabe existe en los acueductos de distribucin de una zona geogrfica particular.
5. Mientras el agua corre, deshaga el lazo que sujeta la capucha del papel al frasco, retrelo
con todo y tapn, elimine la trilla de papel colocada entre el tapn y la boca del frasco,
flamee con la llama del mechero, todo reborde de la boca del frasco haciendo girar el
frasco tal como lo indica el instructor.
6. Tome la muestra de agua dejando un amplio espacio de aire en el frasco para facilitar la
homogenizacin.
7. Flamee nuevamente la boca del frasco y las superficies de contacto del tapn y cirrelo.
8. Sujete con el cordel nuevamente la capucha de papel al cuello del frasco haciendo un lazo
fcil de deshacer.
9. Cierre el grifo.
10. Anote el anlisis deseado, lugar de captacin, hora, fecha, temperatura, persona que capto
la muestra, municipio y departamento en al etiqueta que se proporcionar.
Captacin de muestras de agua de un rio:
1. Preparar un Frascos pyrex de 125cm3.
2. Tomar la muestra en contracorriente, buscando un salto de agua a una profundidad
aproximada de 10cm.
3. Recubrimiento del frasco.
4. Etiquetado.
5. Colocar en la hielera entre 4 y 10C.
Captacin de muestras de agua en un lago:
1. Preparar la botella de Van Dorn.
2. El muestreo se realizar de la manera que indique el instructor.
3. Luego que se ha tomado la muestra se etiqueta y se coloca en la hielera a una
temperatura entre 4 y 10C
PREGUNTAS:
1. Cul debe ser el intervalo de tiempo entre la captacin de la muestra y el anlisis fsico,
qumico y microbiolgico? De que variables dependen?
2. Mencione los aspectos ms importantes a considerar para un buen muestreo.
3. Cules deben ser las frecuencias de muestreo? De qu depende?
4. Cules son los parmetros fsicos y qumicos que son necesarios efectuar en le lugar de
muestreo, y porqu?
INVESTIGACIN:
Deber investigar:
Cuales son los parmetros fsicos, qumicos y microbiolgicos que debe cumplir
EMPAGUA, para la distribucin y abastecimiento de agua a las diferentes zonas de la
ciudad capital.
Qu indican las normas de la ISO y los reglamentos nacionales sobre el diseo de
programas de muestreo y la frecuencia de la toma de muestras.

PRACTICA No. 15
MICROBIOLOGIA DEL AGUA
TECNICA DE LOS TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACION
OBJETIVOS:
1. Determinacin de bacterias intestinales que indiquen contaminacin con aguas negras y el
consiguiente peligro de la desimanacin de enfermedades entricas, para establecer la
calidad sanitaria del agua.
2. Identificacin de bacterias del grupo coliforme fecal: Escherichia coli y Enterobarcter
Aerogenes.
GENERALIDADES:
El grupo coliformes incluye todas las bacterias aerobias o anaerobias facultativas,
gramnegativas, no esporagenas que fermentan la lactosa con formacin de gas dentro de las 48
horas a una temperatura de 35C.
Las pruebas normales para la demostracin del grupo coliforme se puede llevar a cabo por
la tcnica de tubos mltiples
de fermentacin que incluye la prueba presuntiva, prueba
confirmativa y prueba completa
o por el mtodo de membranas de filtracin. Cada tcnica se
aplica dentro de sus limitaciones especficas.
Se ha demostrado que an despus de la agitacin de la muestra es muy irregular la
distribucin de las bacterias en el agua; es perfectamente posible dividir un volumen de agua en
porciones y encontrar, despus del ensayo, que es nulo el nmero de organismos en una porcin
o, cuando menos, inferior a la media aritmtica que se basa en el examen del volumen total de
agua. Tambin es bastante probable que la proliferacin de un tubo de fermentacin sea el
resultado de la multiplicacin, no de uno, sino de varios organismos. A pesar de esto es ms
conveniente considerar que el desarrollo se debe a un individuo aislado.
Los resultados del examen de tubos y diluciones mltiples se expresan en trminos del
nmero ms probable. Este trmino es una estimacin que se basa en ciertas formulas de
probabilidad.
La exactitud de una prueba aislada depende del nmero de tubos que se empleen. Se
consiguen datos ms satisfactorios cuando en la porcin ms grande que se estudie se tiene gas
en algunos o en todos los tubos y cuando en la menor, no hay gas en ninguno o lo hay en muy
poco de ellos.
El valor numrico de la estimacin del contenido bacteriano se fija principalmente, por
aquella dilucin que muestre tanto tubos positivos como negativos. La exactitud que se puede
esperar de los resultados depende en especial, del nmero de porciones de la dilucin crtica.
No se debe permitir que se confunda con un mero ejercicio estadstico el inters creciente
en la precisin de la tcnica de tubos mltiples y la expresin de los resultados como NMP pues
son un medio para estimar la densidad coliforme de un agua y por lo tanto para establecer su
calidad sanitaria. La mejor valoracin de tal calidad depende de la interpretacin de los resultados
de la tcnica de tubos mltiples o de otros mtodos, posiblemente ms precisos, as como de todos
los informes que se hayan obtenido por reconocimientos previos o practicas similares.
Cuando se examinan aguas de calidad potable es necesario usar un mnimo de cinco
tubos de fermentacin del medio presuntivo que se escoja y que cada tubo contenga 10cm 3 o
100cm3 de la muestra de agua.
En el examen de otras aguas que se presuma que son de calidad potable es bsico la
inoculacin de cuando menos cinco tubos de cada dilucin para conseguir una precisin aceptable
y un informe razonablemente satisfactorio, en ningn caso se debe emplear menos de tres tubos
de cada dilucin.
PRUEBA PRESUNTIVA:
MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.

Muestra de agua.
Mechero de alcohol.
Pipetas graduadas estriles de 10cm3 y 1cm3.
Tubos estriles con agua peptonada para dilucin.
Tubos con caldo lactosado.

PROCEDIMIENTO:
1. Anote en la hoja de informe de datos, tales como: fecha, hora, sitio, etc.
2. Observe y anote los caracteres generales de aspecto y substancias en suspensin, el
sabor y el olor que se observar al final de la siembra de la muestra.
3. Coloque los tubos de caldo lactosado en la gradilla, en el orden siguiente.
1a. Fila: 5 tubos de caldo lactosado doble.
2a. Fila: 5 tubos de caldo lactosado simple.
3. Fila: 5 tubos de caldo lactosado simple.

4.
5.
6.
7.
8.
9.

10.

11.
12.
13.

14.
15.
16.

Encienda el mechero de alcohol.

Agite vigorosamente el frasco de muestra por 25 veces.
Elimine el cordel y capucha de papel del frasco que contiene la muestra.
Observe cuidadosamente las indicaciones que dar el instructor, sobre la manera de
manipular el frasco de la muestra y la correcta posicin de la pipeta de 10cm 3 en la mano
del operador.
Proceda a flamear la boca y tapn del frasco, segn indicaciones del instructor.
Con la pipeta proceda a colocar porciones de 10cm 3 de la muestra en cada tubo de los 5
tubos de caldo lactosado doble, que se encuentran colocados en la primera fila de la
gradilla, teniendo la precaucin de flamear antes y despus de la toma de material, los
bordes de la boca del tubo, dando un movimiento circular, el mismo cuidado debe
observarse con el tapn y bordes de la boca del frasco de muestras.
Coloque por medio de la pipeta porciones de 1cm 3 de la muestra en cada uno de los 5
tubos de caldo lactosado simple, que se encuentran colocados en la 2 fila de la gradilla,
coloque 1cm3 en un tubo que contiene el agua peptonada para dilucin, al colocar este
ultimo cm3 en el tubo, homogenice por medio de agitacin con la pipeta por 25 veces, siga
la tcnica de flameado al tapar y destapar los tubos y el fresco de la muestra.
Al agregarle a los 9cm 3 de agua
peptonada para dilucin 1cm 3 de la muestra la dilucin
quedar al dcimo (0,1) por cm3.
Con esta dilucin se procede a sembrar los ltimos cinco tubos de caldo lactosado simple.
Con la misma dilucin coloque 1cm3 en cada tubo de cultivo marcado con 0,1cm3, se
procede inmediatamente a hacer otra dilucin de la siguiente manera: coloque 1cm3 de la
dilucin anterior en un que contiene 9cm3 de agua peptonada para dilucin; agite y
homogenice por medio de la pipeta obteniendo por consiguiente al centsimo (0,01).
Los tubos de caldo lactosado doble y simple se incuban a 35C.
Observar la presencia de gas a las 24 y 48 horas, los tubos que presentaron gas son
considerados como positivos, estos tubos sealan que la prueba es presuntiva, pero no
confirmativa.
Proceda de la misma manera para el agua cruda, solamente que empleando diluciones
indicadas por el instructor.

PRUEBA CONFIRMATIVA:
COMPUTO Y REGISTRO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
MATERIAL REQUERIDO:
1. Tubos de fermentacin con caldo lactosado positivo de la prueba anterior. (prueba
presuntiva)
2. Tubos de fermentacin con caldo E.C.
3. Tubos de fermentacin con caldo bilis-lactosa- verde brillante.
4. Mechero.
5. Asa de siembra.
PROCEDIMIENTO:
1. Deben someterse a la prueba confirmativa todos los tubos de caldo lactosado que
mostraron fermentacin, que hayan presentado gas al cabo de 48 horas de incubacin.
2. Encienda el mechero de alcohol.
3. Prepare el asa de siembra, con una lupa de no menos de 3mm de dimetro.
4. De cada tubo que presente fermentacin se toma material y se traspasa a los todos de
caldo E.C., siguiendo siempre la tcnica de flameo al abrir y cerrar los tubos, en cada
traspaso el asa debe flamearse hasta rojo, para evitar de esta manera la contaminacin
inexacta de los tubos al confirmar.
5. Despus de la siembra de E.C., se incuban todos los tubos a confirmar en la incubadora a
una temperatura de 44.5C durante 24 horas.

6. De cada tubo que presente fermentacin se toma material y se traspasa a los todos de
caldo de verde brillante, siguiendo siempre la tcnica de flameo al abrir y cerrar los tubos,
en cada traspaso el asa debe flamearse hasta rojo, para evitar de esta manera la
contaminacin inexacta de los tubos al confirmar.
7. Despus de la siembra del verde brillante, se incuban todos los tubos a confirmar en la
incubadora a una temperatura de 35,0C durante 48 horas.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Computo del E.C. y del verde brillante por el nmero ms probable:
1. Los tubos de E.C. Verde Brillante que presenten fermentacin (desprendimiento gaseoso),
despus de 24 a 48 horas, son considerados confirmativos positivos.
2. Se anotar el nmero de tubos confirmativos positivos procedentes de las siguientes
siembras 10, 1, 0.1cm3 en su respectivo orden y se busca en la tabla adjunta el nmero
ms probable que corresponda a la serie del nmero anotado. Ejemplo: Se obtuvieron los
siguientes resultados confirmativos:
En la siembra de 10,0cm3
En la siembra de 1,0cm3
En la siembra de 0,1cm3

3 tubos +
4 tubos +
5 tubos +

El nmero a buscar sera 345 que al buscar en la tabla nos dar un resultado de 40
NMP por 100cm3 de la muestra.
3. Anote su respectivo resultado, en la hoja de informe proporcionada por el instructor.
PRUEBA COMPLETA:
MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Tubos de fermentacin de E.C. y Verde Brillante positivos.

Tubos con medio de agar nutritivo inclinado.
Mechero.
Asa de siembra.
Colorantes y reactivos para coloracin de Gram.
Microscopio.

PROCEDIMIENTO:
1. Por medio de el asa de, se toma una lupa de los tubos de fermentacin y siembra en el tubo
conteniendo el medio de agar nutritivo inclinado (ver practica No. 8 Tcnica de siembra en
agar inclinado).
2. Incubar los tubos de agar nutritivo en la incubadora a 35C durante 24 horas.
3. Luego de las 24 horas de incubacin observar el crecimiento de bacterias en los tubos de
agar inclinado.
4. Realizar una tincin de Gram.
PREGUNTAS:
1. Por qu se considera a la Escherichia Coli como un indicador de contaminacin? y
Qu son los coliformes?
2. La presencia de E. Coli, prueba la fermentacin de la lactosa con produccin de acido y
gas. Explique este proceso.
3. Cmo se pueden diferenciar los miembros del grupo coliforme?
4. Mencione varias razones por los cuales los procedimientos rutinarios de laboratorio paa
determinar la potabilidad del agua se hacen en presencia o ausencia de coliformes mas
que de algunos microorganismos patgenos especficos, como salmonella typhimurium.

INVESTIGACIN:
Explique estadstica y microbiolgicamente como el NMP proporciona informacin sobre la
calidad del agua, indicando el lmite de confianza que se tiene y la curva caracterstica.

PRACTICA No. 15
MEMBRANAS DE FILTRACION EN EL CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DE
PLANTAS INDUSTRIALES

MATERIAL REQUERIDO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.

Membrana de filtracin, cuadriculadas, tipo HA y de 47mm. de dimetro.

Almohadillas y cojinetes estriles.
Cajas de petri plsticas y estriles.
Unidad de filtracin.
Bomba elctrica, para fuente de vacio.
Pipetas estriles, graduadas de 10cm3.
Pipetas estriles, graduadas de 1cm3.
Pinzas.
Vasos de precipitar de 50cm3.
Mechero de gas o lmpara de alcohol.
Microscopio.
Lupa de aumento con iluminacin.
Medio de cultivo tipo Endo (M-caldo para coliforme N. 0.1-494 Baltimore.
Alcohol de quemar.
Frascos con agua para dilucin.

PROCEDIMIENTO:
1. Coloque una serie de cajas de cultivo estriles.
2. Usando un crayn graso de marcar cristalera, marque las de cultivo con el nmero
correspondiente a cada muestra y los volmenes que se desean emplear.
3. Coloque la almohadilla absorbente en cada caja de cultivo, por medio de pinzas
esterilizadas previamente.
Nota: Deben usarse siempre pinzas esterilizadas para trasladar de un lugar a otro, tanto
las membranas como las almohadillas. Cuando las pinzas no se estn usando, sus
extremos debern permanecer sumergidos una pulgada ms o menos en el vaso de
precipitar con alcohol de quemar.
4. Con una pipeta estril coloque 2.2cm 3 de medio de cultivo para saturar cada almohadilla
absorbente.
5. Con las pinzas estriles coloque una membrana sobre el receptculo de la unidad de
filtracin, coloque el embudo sobre el receptculo con la membrana y fjelo por medio del
anillo de rosca o con las pinzas esterilizadas en las unidades de vidrio.
6. Agite el recipiente con la muestra y colquela en la unidad de filtracin. (s la muestra es
menor de 10cm3 diluya con 20cm3 de agua destilada, si la muestra es mayor de 10cm 3, no
necesita dilucin.)
7. Proceda a filtrar, utilizando par el efecto una bomba de vacio, ya que la filtracin debe ser
rpida y homognea.
8. Despus que toda la muestra ha pasado a travs de la membrana, lave las paredes del
filtro con agua destilada, para este lavado es conveniente usar ms o menos 20cm 3. De
agua estril, vuelva a repetir este lavado y desconecte la fuente de vacio.
9. Coloque la membrana por medio de las pinzas, sobre la almohadilla absorbente saturada
de medio de cultivo. Esta operacin debe hacer cuidadosamente para evitar la penetracin
de burbujas de aire entre la membrana y el medio.
10. Despus de haber completado todas las filtraciones, invierta las cajas de cultivo y
colquelas en la incubadora a 35C, en una atmosfera saturada de humedad, durante un
periodo de 15 a 18 horas. Si la incubadora no tiene una humedad adecuada, pngase los
medios sobre una bandeja conteniendo un pao o papel-toalla humedecido.
11. Terminado el periodo de incubacin, remueva los cultivos de la incubadora y haga un
recuento de colonias coliformes y no coliformes de la siguiente manera.
a. Haga el recuento dos veces, primero utilizando el microscopio con un aumento de
10 x 15 y seguido con la ayuda de un lente de aumento.
b. Para la iluminacin use una fuente de luz perpendicular al plano de la membrana.
Una pequea lmpara fluorescente, es ideal para este propsito.
c. Colonias coliformes son rojas o rosadas y tienen una superficie metlica brillante
bajo la luz reflejad. La cual puede cubrir la colonia entera o puede aparecer
solamente localizada rodado plido pero no tiene brillo caracterstico.
d. Efecte el recuento de bacterias, squese un promedio de las colonias de
bacterias contadas con el microscopio y las contadas con lente de aumento.
e. Compute las colonias coliformes por 100cm3 como sigue:
No. De coliformes por 100cm3 = colonias coliformes contadas x 100
cm3 de la muestra filtrada.

12. Prueba verificada (o comprobada)

a. Seleccionar la membrana de filtracin que tenga varias colonias coliformes, tpicas
aisladas y no coliformes.
b. Usando una tcnica asptica, con ayuda de la aguja de inoculacin asle una colonia
coliforme tpica y otra que no sea tpica y transfirala a un tubo de rojo fenol o caldo
lactosado.
c. Incbese los tubos de caldo a 35C durante 24 horas.
d. Lea y apunte los resultados de la siguiente forma :
Clave

Resultados

0
A

Crecimiento nulo, no hubo cambio de cloracin en el medio.

Acido (el medio se torna amarillo) pero hay ausencia de gas en el
tubo de fermentacin.
Acido (el medio se torna amarillo) y presencia de gas en tubos de
fermentacin.

AB

13. Anote los resultados en la siguiente hoja:

EXAMEN BACTERIOLOGICO POR EL METODO DE MEMBRANAS

DE FILTRACION

Muestra de:_____________________________________________________________________
Fecha en que fue captada la muestra:_______________________________________________
Hora:__________________________________________________________________________
Lugar:_________________________________________________________________________
Fuente:________________________________________________________________________
Persona que capto la muestra:_____________________________________________________
Fecha que dio principio el examen:_________________________________________________
CARACTERISTICAS ORIGINALES
Color:___________________________ Aspecto:______________________________________
Sustancias en suspensin:________________________________________________________
INVESTIGACIN DEL GRUPO COLIFORME:
Incubacin a 35C.
No. de
membrana
Filtrante

Medio
Selectivo

Vol. de la
Muestra

Colonias no
Coliformes

Coliformes
por 100cm3

Tiempo de
Incubacin

Observaciones:_________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
Conclusiones:___________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
Fecha:________________________
Nombre:________________________________________