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DEPARTAMENTO DE FISIOLOGA
DR. MAURICIO RUSSEK BERMAN
MANUAL DE LABORATORIO DE
FISIOLOGA GENERAL (QFI)
8 EDICIN
AGOSTO DE 2013
AUTORES
Dra. Alva Snchez Claudia
Bil. Avila Velarde Gerardo
Dra. Barrera Segovia Julia
Dr. Chuc Meza Elizer
Dr. De la Cruz Lpez Fidel
M. en C. Escalona Cardoso Gerardo Norberto
Dra. Franco Coln Margarita
Dra. Garcs Ramrez Linda
Dra. Garca Ramrez Martha
Bil. Guarneros Bauelos Elizabeth
M. en C. Gutirrez Lozano Ana Lilia
Dra. Ortiz Butrn Mara del Roco Elizabeth
Dr. Pacheco Rosado Jorge
Dra. Paniagua Castro Norma
Dr. Ramrez San Juan Eduardo
Dr. Villanueva Becerril Ivn
Dr. Zamudio Hernndez Sergio Roberto
NDICE
Pgina
NDICE .. 3
PROGRAMA DE FISIOLOGA GENERAL, QFI .... 4
NORMAS DE LABORATORIO ..... 9
Prctica 1. Aspectos generales del manejo de animales de laboratorio y vas
de administracin .. 10
Prctica 2. Conceptos bsicos en homeostasis 14
Prctica 3. Estudio de la penetracin de sustancias a las clulas normales 19
Prctica 4. Potencial de difusin y potencial de lesin .. 23
Prctica 5. Potencial de accin, simulacin por computadora . 31
Prctica 6. Potencial de accin compuesto 37
Prcticas 7. Transmisin sinptica y 8. Msculo esqueltico .. 45
Prctica 9. Modulacin de una funcin celular por funciones qumicas 52
Prctica 10. Propiedades del msculo cardiaco 58
Prctica 11. Propiedades del msculo liso . 64
APNDICE ... 70
a) Manejo de animales de laboratorio . 70
b) Distribucin de animales de laboratorio . 72
c) Marcaje de animales de laboratorio .... 73
d) Vas de administracin usadas en el curso ... 74
e) Soluciones fisiolgicas .. 75
f) Soluciones empleadas en las prcticas .. 76
g) Calibracin del BIOPAC ... 79
3.1 Primario
3.2 Secundario
BIBLIOGRAFA
Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K. y P. Walter. (2010). Biologa
molecular de la clula. 5 edicin. Editorial Omega. Espaa.
7
desorden en la vida. Coleccin Ciencia que ladra Siglo XXI editores. Argentina.
Interamericana. Mxico.
Espaa.
Lodish, H.; Berk, A.; Matsudaira, P.; Kaiser, C.; Krieger, M.; Scott, M.; Zipursky, S. y
IPN. Mxico.
NORMAS DE LABORATORIO
1. En la medida de lo posible, los equipos NO debern exceder un mximo de 6
personas.
2. Cada equipo ocupar una mesa que ser la misma durante todo el curso.
3. Los alumnos debern usar bata, de preferencia blanca, en las sesiones prcticas.
4. Cada equipo deber tener: a) dos franelas de 50 x 50 centmetros, b) equipo de
diseccin: pinzas de diseccin y presin, bistur con hoja, tijeras de punta fina, aguja de
diseccin e hilo de algodn, c) marcador indeleble, d) cinta adhesiva (masking tape).
5. Cuando se utilice el equipo BIOPAC, los alumnos debern guardar los archivos de sus
prcticas en un CD, no se permite el uso de memorias USB.
6. No se permite la ingesta de alimentos durante la estancia en el laboratorio.
7. El laboratorio deber quedar limpio al terminar la sesin prctica: mesa limpia, bancos
sobre las mesas, cadveres de animales en una bolsa de plstico y sin papeles sucios
en el piso.
8. El material roto, extraviado o descompuesto deber reponerse a la mayor brevedad,
de lo contrario no tendr derecho a presentar exmenes y prcticas.
9. Los resultados de las prcticas sern reportados por escrito. El reporte deber
contener: a) Portada, b) Introduccin (no ms de 2 cuartillas), c) Objetivos, d)
Metodologa (diagrama de flujo), e) Resultados (cuadros, grficas y su descripcin
correspondiente), f) Anlisis de resultados (o discusin), g) Conclusiones, h) Bibliografa.
Los reportes debern estar preparados, por lo menos en calidad de borrador, para el da
de la presentacin del seminario.
10. Los alumnos que no cumplan con un mnimo de 80% de asistencias al curso, no
podrn acreditar la materia. Se tomar como retardo, la llegada dentro de los 15 minutos
despus de la hora de entrada establecida. Tres retardos constituyen una falta.
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PRCTICA 1
ASPECTOS GENERALES DEL MANEJO DE ANIMALES DE
LABORATORIO Y VAS DE ADMINISTRACIN
INTRODUCCIN
Actualmente, muchos de los experimentos de las ciencias biomdicas se realizan
en animales de fcil manejo, los cuales se han denominado animales de laboratorio y la
rata es uno de los ms usados.
La legislacin en Mxico y en muchos pases exige tratos bioticos a los animales
destinados a la experimentacin, de tal forma que se reduzca su utilizacin a lo
absolutamente necesario y se minimice su sufrimiento.
Cuando la experimentacin se realiza con los mtodos apropiados, el investigador
obtiene buenos resultados con el uso de animales y mejoran la calidad y reproducibilidad
de los datos.
Las vas de administracin de sustancias deben seleccionarse con base en la naturaleza
fisicoqumica de la sustancia a aplicar y el animal de laboratorio que se emplear.
En esta prctica se practicarn los principales mtodos para el manejo, marcado y
distribucin aleatoria de animales de laboratorio, as como las vas ms usuales para la
administracin de sustancias o frmacos.
OBJETIVOS
- Manipular correctamente ratas de laboratorio.
- Distribuir aleatoriamente a las ratas utilizando un mtodo adecuado.
- Determinar la importancia de la distribucin aleatoria de los animales.
- Aprender el marcado adecuado de animales para la realizacin de cualquier tipo de
experimento.
- Aprender a administrar, a los animales ms usados en el laboratorio, sustancias o
frmacos por distintas vas.
- Calcular las dosis de las sustancias que se van a administrar.
10
MATERIAL
- 3 ratas macho de 250 a 300 gramos.
- 1 caja de plstico para rata con tapa.
- 1 balanza granataria y canasta con tapa.
- 3 termmetros digitales o industriales.
- 3 jeringas de 1 ml con aguja.
- 1 cnula para administracin intragstrica en rata.
- 1 vaso de precipitados de 50 ml.
- 1 cronmetro.
- vaselina.
- cinta adhesiva (masking tape).
- pentobarbital sdico (nembutal).
- cido pcrico (o marcador indeleble).
DESARROLLO
1. Practicar, durante toda la sesin, las tcnicas bsicas para el manejo de la rata (ver
apndice).
2. Distribuir aleatoriamente las 18 ratas en los 6 equipos (ver apndice)
3. Marcar y pesar a las ratas (ver apndice).
4. Calcular, para cada rata, el volumen de anestsico (pentobarbital sdico) que se
requiere administrar, si la concentracin de la solucin de pentobarbital es 63 mg/ml y la
dosis para estos animales es de 35 mg/kg.
5. Medir la temperatura colonal y determinar la presencia o ausencia de los reflejos flexor
y de enderezamiento en las ratas. Estos se considerarn los valores basales.
a) Para medir la temperatura colonal de las ratas: introducir por el recto el bulbo del
termmetro untado con vaselina (si el termmetro es industrial, debe introducirse
aproximadamente 5 centmetros y mantenerse as durante 1 minuto y medio para realizar
la lectura).
b) Observar y registrar la presencia o ausencia de los reflejos flexor y de
enderezamiento. Para el reflejo flexor, aplicar un estmulo doloroso en alguna de las
patas de la rata, se registra como presente si la rata retira la pata. Para el reflejo de
11
enderezamiento, colocar la rata boca arriba (posicin supina dorsal) sobre la mesa de
trabajo, si la rata se endereza y se posa sobre sus 4 pata, se considera que el reflejo
est presente.
6. Determinar qu va de administracin se utilizar con cada una de las 3 ratas
(intragstrica, intraperitoneal o subcutnea) y administrarles adecuadamente el volumen
de pentobarbital calculado (ver apndice).
7. Medir la temperatura colonal y determinar la presencia o ausencia de los reflejos flexor
y de enderezamiento en las ratas despus de haber realizado la administracin de
pentobarbital por las diferentes vas, esto se har cada 5 minutos durante 25 minutos.
DATOS
a) Temperatura colonal (C)
TIEMPO
(minutos)
0 (basal)
VA
INTRAGSTRICA
VA
INTRAPERITONEAL
VA
SUBCUTNEA
5
10
15
20
25
b) Reflejos flexor (F) y de enderezamiento (E). Marcar presencia (+) o ausencia (-).
TIEMPO
(minutos)
VA
INTRAGSTRICA
F
E
VA
INTRAPERITONEAL
F
E
0 (basal)
5
10
15
20
25
12
VA
SUBCUTNEA
F
E
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Agrupar los resultados de todos los equipos y utilizar los programas SigmaStat 3.5 y
GraphPad Prism 5 (o cualquier otro programa de grficos), para:
* Obtener la media y el error estndar de los datos de temperatura colonal de las ratas
administradas con cada va en cada uno de los tiempos considerados.
* Realizar el anlisis estadstico (ANOVA bifactorial de medidas repetidas), y
* Elaborar la grfica de temperatura colonal contra tiempo.
* Elaborar las grficas de porcentaje de ausencia de los reflejos, tanto flexor como de
enderezamiento, contra tiempo.
BIBLIOGRAFA
Archiga, H. (1999). El uso de animales en el laboratorio de experimentacin. Elementos,
BUAP. (36):13-17.
Baker, J. H.; Lindsey, J. R. and S. H. Weisbroth, Eds. (1980). The laboratory rat. Vol II.
Academic Press. London and N.Y. Pp: 3.28.
Barastegui, A. C. (1976). Esquemas de prcticas de farmacologa. Espaxs. Pp. 26-27.
Daniel, W. W. (2010). Bioestadstica. Base para el anlisis de las ciencias de la salud. 4
edicin. Limusa-Wiley. Mxico.
Fox, G. J.; Anderson; C. L.; Loew, M. F. and F. W. Quimby, Eds. (2002). Laboratory animal
medicine. 2nd edition. American College of Laboratory Animal Medicine Series. Academic
Press. U.S.A.
Norma Oficial Mexicana sobre especificaciones tcnicas para la produccin, cuidado y
uso de los animales de laboratorio (NOM-062-ZOO-1999). Diario Oficial de la
Federacin, 22 de agosto de 2001.
Academia Nacional de Medicina, Academia Mexicana de Ciencias y Universidad
Nacional Autnoma de Mxico. (1999). Gua para el cuidado y uso de los animales de
laboratorio. Mxico.
13
PRCTICA 2
CONCEPTOS BSICOS EN HOMEOSTASIS
INTRODUCCIN
Todos los organismos vivos estn continuamente sujetos a cambios ambientales,
afectndolos a todos sus niveles: rganos, tejidos, clulas y vas metablicas (sistemas).
Los organismos responden a los cambios energticos del medio (estmulos),
manteniendo constante su medio interno (variables reguladas) mediante el control de su
entrada y salida de energa. Es esta, la ciberntica aplicada a la fisiologa, la base
esencial para una mejor comprensin del funcionamiento de los seres vivos.
OBJETIVOS
- Identificar y analizar los distintos estados de un sistema.
- Manejar e integrar los conceptos de regulacin y control.
- Demostrar algunos aspectos de la homeostasis.
MATERIAL
- 1 balanza para pesar ratas y canasta con tapa.
- 2 cajas de plstico para rata con tapa
- 2 termmetros con escala de 0-50 C.
- 2 termmetros clnicos digitales.
- 2 termmetros clnicos para humano.
- 3 cronmetros
- vaselina, cubos de hielo.
- 1 bao Mara.
- 1 resistencia con termostato.
- 1 termmetro de cartula.
- 1 vaso de precipitado de 50 ml
- 4 jeringas de 1 ml.
- 5 ratas adultas.
- pentobarbital sdico (nembutal)
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DESARROLLO
A. Coloque en un bao Mara 2 litros de agua a temperatura ambiente. Por medio del
DATOS
* Experimento A
Tiempo
(minutos)
Temperatura
del agua
(C)
* Experimentos B y C
* Cuarto a 40 C
Tiempo
(minutos)
Temperatura
colonal, rata
control (C)
Temperatura
colonal, rata
anestesiada
(C)
Temperatura
oral, humano
(C)
Basal
(0)
(10)
(20)
16
(30)
Fuera del
cuarto (40)
* Cuarto a 8 C
Tiempo
(minutos)
Temperatura
colonal, rata
control (C)
Temperatura
colonal, rata
anestesiada
(C)
Temperatura
oral, humano
(C)
Basal
(0)
(10)
(20)
(30)
Fuera del
cuarto (40)
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Agrupar los resultados (de todos los equipos) obtenidos en cada una de las condiciones
experimentales para realizar el anlisis estadstico y las grficas correspondientes,
sealando en las mismas el error estndar de cada media.
Con los datos del experimento B, determinar si existe diferencia estadstica en los
registros de temperatura de las ratas control y de las anestesiadas para cada una de las
temperaturas ambientales (fro y calor). Explique.
Qu tipo de sistema se considera a las ratas control y que tipo de sistema a las ratas
anestesiadas? En este sistema (rata) indique:
- La variable regulada.
- El estmulo y el receptor.
- Las vas aferentes y las eferentes.
- El centro integrador.
- Los efectores.
Con los datos de los experimentos B y C, determinar si existe diferencia estadstica en
los registros de temperatura de las ratas control y de los humanos para cada una de las
temperaturas ambientales (fro y calor). Explique.
17
BIBLIOGRAFA
Russek M. y M. Cabanac, 1983. Regulacin y Control en Biologa Instituto Politcnico
Nacional. Mxico, D.F.
Daniel, W.W. Bioestadstica. Base para el anlisis de las ciencias de la salud. 1995.
Noriega Eds. 5a Edicin.
Steel, R.G.D. y Torrie, J.H. Bioestadstica. Principios y Procedimientos. 1988. McGrawHill.
Mainetti, J. A., Cdigo de Nremberg, Tribunal Internacional de Nremberg, 1947.
Traduccin adaptada de Mainetti J. A. (1989), tica Mdica, Quirn, La Plata, Argentina.
Declaracin de Helsinki de la Asociacin Mdica Mundial. Pautas ticas Internacionales
para la Investigacin y Experimentacin Biomdica en Seres Humanos. ISBN 92 9036
0569. Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Mdicas (CIOMS),
1993, Ginebra, pp. 53-56.
NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones Tcnicas para la
produccin, cuidado y uso de los animales de laboratorio.
18
PRCTICA 3
ESTUDIO DE LA PENETRACIN DE SUSTANCIAS A
CLULAS NORMALES
INTRODUCCIN
Continuamente se realiza entre los seres vivos y su medio un intercambio de iones
y sustancias. A nivel celular, ste depende de varias propiedades fisiolgicas conocidas
colectivamente como permeabilidad celular. En este fenmeno participan dos grupos de
factores: a) las propiedades de las membranas celulares y b) las fuerzas impulsoras. Las
membranas celulares no slo son diferencialmente permeables a varias sustancias, sino
que tambin, presentan alteraciones en su permeabilidad bajo diferentes situaciones
fisiolgicas y ambientales. Las fuerzas impulsoras son de dos tipos: a) fuerzas fsicas,
que dependen de gradientes de concentracin o difusin en soluciones acuosas y b)
propiedades celulares especiales de difusin, facilitada (transportadora) y de transporte
activo.
OBJETIVO
- Determinar los distintos factores que intervienen en la penetracin de algunas
sustancias a travs de la membrana celular por difusin simple.
MATERIAL Y SOLUCIONES
Por equipo:
Lanceta
4 pipetas graduadas de 1 ml
4 pipetas graduadas de 5 ml
Gradilla
20 tubos grandes
4 vasos de precipitados de 50 ml
Algodn
19
Soluciones:
Sacarosa 1 M
KCl 1 M
BaCl2 1 M
DESARROLLO
I.- Preparacin de la suspensin de glbulos rojos.
a) Obtngase sangre de la yema de un dedo con una lanceta estril (previamente limpie
con alcohol etlico 96%).
b) En un tubo de ensayo que contenga 5 ml de solucin salina isotnica (NaCl 0.2 M),
agregue 5 gotas de sangre.
NOTA: Si la muestra de sangre, se toma por puncin venosa:
a)
hemolizante.
DATOS
SOLUCIN
DILUCIN
HEMOLIZANTE
NaCl
Sacarosa
KCl
BaCl2
SOLUCIN
TIEMPO DE HEMLISIS
Alcohol metlico
Alcohol etlico
Alcohol proplico
Alcohol butlico
21
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Realice para las experiencias 2 y 3, una grfica que relacione la concentracin
hemolizante con el factor estudiado.
Para la experiencia 4 realice la grfica correspondiente que relacione el tiempo de
hemlisis con el factor estudiado.
BIBLIOGRAFA
1. Eckert R., D. Randall y G. Augustine. Fisiologa Animal. Mecanismos y Adaptaciones.
4a edicin.1998. Editorial Interamericana-McGraw-Hill. Espaa. p: 101 -135.
2. Ganong F.W. Fisiologa Mdica. 17 Edicin. 2000. Editorial Manual Moderno. Mxico,
D.F. p. 6 - 9; 32 - 40.
3. Berne R. y M. Levy. Fisiologa. 3. Edicin. 2002. Editorial. Harcourt. Mosby. Espaa.
p: 4 -17.
22
PRCTICA 4
POTENCIAL DE DIFUSIN Y POTENCIAL DE LESIN
INTRODUCCIN
La diferencia en la concentracin de iones a ambos lados de una membrana con
permeabilidad selectiva, a travs de la cual slo puede moverse una especie inica (el
catin o el anin), genera un flujo de iones desde el lado en que la concentracin es
mayor hacia el lado en que la concentracin es menor. Este movimiento de partculas
con carga elctrica, al no acompaarse de partculas con carga de signo opuesto, genera
una diferencia de potencial elctrico a travs de la membrana (potencial de difusin), el
cual se opone al paso de nuevos iones hacia el lado de menor concentracin.
Al cabo de cierto tiempo, el flujo dado por la diferencia de concentraciones (gradiente
qumico) llega a ser compensado por el flujo de repulsin, dado por la diferencia de
potencial elctrico (gradiente elctrico).
En estas condiciones, se dice que el ion est en equilibrio electroqumico a travs de la
membrana. La diferencia de potencial de la membrana tiene un valor que se denomina
potencial de equilibrio (Eion). Este potencial est definido por la ecuacin de Nernst:
clula haba aniones a los cuales la clula no era permeable, por lo que postul que el
potencial de reposo era consecuencia de una distribucin desigual de iones de potasio,
como predeca la ecuacin de Nernst. Como en aquella poca no poda medirse con
precisin el potencial de reposo de una clula, Berstein cort varias fibras musculares e
insert un electrodo en el rea cortada, haciendo contacto eficaz con el lquido interno de
las fibras musculares, a este registro se le llam potencial de lesin. Los datos que
encontr mostraron que el potencial de membrana segua de manera muy cercana el
potencial de equilibrio predicho por la ecuacin de Nernst para el ion potasio.
La diferencia de potencial que existe a travs de las membranas biolgicas depende de
los gradientes de concentracin y de la permeabilidad relativa para cada especie inica.
La ecuacin de Goldman, Hodgkin y Katz define el potencial de membrana en funcin de
estos dos importantes factores:
24
OBJETIVOS
- Demostrar que la difusin de un electrolito a travs de una membrana artificial con
permeabilidad selectiva genera una diferencia de potencial (potencial de difusin).
- Determinar el potencial de lesin de un msculo esqueltico de rana y establecer si
existe una relacin entre la diferencia de potencial obtenida con diferentes
concentraciones de potasio y el predicho por la ecuacin de Nernst.
MATERIAL
Por equipo:
1 multmetro digital.
1 par de electrodos de plata clorurados
2 celdas de calomel con puente salino.
2 alambres de plata.
2 soportes de media luna.
2 tubos de vidrio.
1 cmara de Ussing.
1 huevo de gallina
Soluciones:
Solucin de Ringer.
Vaselina slida.
Solucin de LIC.
Soluciones de K2SO4: 0.005, 0.01, 0.025, 0.05 y 0.1 M (para el potencial de lesin)
Soluciones de Na2HPO4: 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 y 2.0 M (Cmara de Ussing)
Soluciones de KCl: 400, 100, 50, 20 10, 5, 2.5, 1 mM (para el potencial de difusin en
el huevo)
25
DESARROLLO
Potencial de difusin con la cmara de Ussing y membrana artificial
1.- Recortar la membrana de dilisis al dimetro de la cmara de Ussing.
2.- Aplicar vaselina a los bordes de cada compartimiento de la cmara de Ussing, colocar
sobre uno de ellos la membrana exactamente centrada y unir ambos compartimientos.
3.- Sujetar la cmara a su soporte.
4.- Llenar los dos compartimientos de la cmara con la solucin de Na 2HPO4 0.05 M y
medir la diferencia de potencial, introduciendo un puente salino del electrodo de calomel
en cada compartimiento y conectando los dos electrodos al multmetro (figura 1). En caso
de contar con electrodos de plata, introducir stos en cada compartimento.
5.- Vaciar uno de los compartimientos, enjuagarlo con la solucin de Na 2HPO4 0.1 M y
llenarlo con esta solucin. El otro compartimiento servir como referencia fija.
6.- Medir los cambios en la diferencia de potencial
7.- Repetir los puntos 5 y 6 usando soluciones sucesivamente ms concentradas. A partir
de esta experiencia tambin se debe enjuagar y reponer la solucin 0.05 M del
compartimiento de referencia, ya que la difusin de los iones modifica su concentracin.
5. Sin vaciar el contenido del huevo cmbielo ahora a un vaso que contenga una
solucin 2.5 mM de KCl y mida el potencial desarrollado.
6. Continu como en el inciso 5 pero probando las siguientes concentraciones: 5, 10, 20,
50 y 100 mM (observe que ir midiendo de una menor a una mayor concentracin de
KCl).
7. Al terminar de probar todas concentraciones y sin mover los electrodos de su sitio
pruebe que pasa con la lectura del multmetro si levanta el cascarn de huevo a fin de
que no tenga contacto con la solucin de KCl.
Potencial de lesin
1.- Descerebrar y desmedular una rana; cortar la piel de una pata, exponer el msculo
gastrocnemio y separarlo cortando los tendones que lo unen al hueso
2.- Pasar el msculo por el anillo de goma hasta la mitad, cortar la mitad restante y jalarlo
un poco para que la parte seccionada quede dentro del anillo de goma.
3.- Introducir el tubo de vidrio en el anillo de goma, llenarlo con solucin LIC y sujetarlo a
un soporte con la pinza de tres dedos. Introducir el msculo en un vaso de precipitados
conteniendo solucin de Ringer. As, la solucin LIC est en continuidad con la parte
lesionada, y la solucin de Ringer est en continuidad con la parte sana del msculo
(figura 3).
Figura 3.
28
4.- Medir el potencial de lesin del msculo tratado, colocando un puente salino del
electrodo de calomel (rojo) en la solucin LIC y el otro electrodo (negro) en la solucin de
Ringer; o bien, los electrodos de plata en vez de los puentes salinos. Conectar los dos
electrodos al multmetro y anotar la lectura.
5.- Sustituir la solucin de Ringer por solucin de K 2SO4 0.025 M y leer la diferencia de
potencial en el multmetro.
7.- Repetir el punto anterior con cada una de las soluciones de K 2SO4, en orden
creciente de concentracin.
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Potencial de difusin usando cmara de Ussing.
Elabore un cuadro con los siguientes datos:
+
BIBLIOGRAFA
Aidley D. J., 1989. The Physiology of Excitable Cells. Ed. Cambridge University Press,
Cambridge, Inglaterra.
Eckert R., Randall D. y Augustine G., 1990. Fisiologa Animal. Mecanismos y
Adaptaciones. 3a ed. Ed. Interamericana-McGraw-Hill, Madrid, Espaa.
Kuffler S. y Nicholls J., 1982. De la Neurona al cerebro. 1 Edicin, Ed. Revert,
Barcelona, Espaa, pp. 89-131.
30
PRCTICA 5
POTENCIAL DE ACCIN, SIMULACIN POR COMPUTADORA
INTRODUCCIN
Una de las vas de la transmisin de la informacin en los organismos, utiliza seales
elctricas generadas en el sistema nervioso. Estos impulsos nerviosos en general, estn
asociados con respuestas rpidas de las clulas excitables a los estmulos del medio. Al
aplicarles el estmulo adecuado muestran un cambio de potencial: el potencial de accin
(llamado tambin espiga o impulso nervioso), el cual es conducido a lo largo de la regin
axnica de una neurona o a lo largo de la membrana plasmtica de una clula muscular.
De manera inicial el estmulo produce una despolarizacin de la membrana del axn, la
+
conductancia del Na .
OBJETIVO GENERAL
+
OBJETIVOS PARTICULARES
Determinar el efecto que tienen los estmulos elctricos de diferentes intensidades y
duraciones sobre el potencial de accin y la excitabilidad de una neurona.
Determinar el efecto que tiene la aplicacin de estmulos repetidos a diferentes intervalos
sobre el potencial de accin y la excitabilidad de una neurona.
31
MATERIAL
Programa de simulacin por computadora, basado en el modelo propuesto por Hodgkin y
Huxley, para la generacin del potencial de accin creado por Dave Touretzky HHsim,
Computadora PC.
DESARROLLO
El dispositivo empleado para desarrollar este simulador es similar al que muestra la
figura 4. Identificar sus partes.
32
- Activar Membrane en el control 3. Esto despliega una ventana donde debe establecer
la temperatura en 20C. Ocultar la ventana con el botn Hide que aparece en la misma.
Figura 5. Pantalla principal del programa HHsim. Los nmeros 1 al 4 indican los controles
que se emplean durante esta prctica.
Potencial umbral
- Activar Stimuli en el control 3. Esto despliega una ventana donde se pueden cambiar
los parmetros de dos estimuladores capaces de aplicar dos estmulos cada uno. Para
este caso solo se usar el primer estmulo del estimulador 1.
- Cada estmulo tiene tres parmetros: (Ti) Tiempo de inicio (ms), (Int) Intensidad (nA) y
(Dur) Duracin (ms). Establecer Ti= 0.0 ms, Int= 10 nA y Dur=0.1 ms. El segundo
estmulo debe marcar cero en todos los parmetros.
- Activar el estimulador usando el botn Stim1 del control 4 y observar la respuesta en
el potencial de membrana.
33
BIBLIOGRAFA
Aidley, D. J. The Physiology of Excitable Cells. 1989. Edit. Cambridge University Press,
Cambridge, Inglaterra.
35
Berne R. y M. Levy, Fisiologa. 2 Ed. 1992. Edit. Mosby Year Book. Espaa, Madrid. p.
34-39.
Carpenter S.H.R., Neurofisiologa. 1986. Edit. Manuel Moderno, Mxico, D.F.
Darnell J., H. Lodish y D. Baltimore, Biologa Celular y Molecular. 2 Ed. 1993. Edit.
Omega S.A. Espaa, Barcelona p. 844-858.
Eckert, Randall D., Burgreen W., y K. French, Fisiologa Animal, Mecanismos y
Adaptaciones. 4 Ed. 1998. Edit. Interamericana-McGraw-Hill. Madrid, Espaa.
Ganong F.W., Fisiologa Mdica. 17a Ed. 2000. Edit. Manual Moderno Mxico.
Schmidt F.R. y G. Thews, Fisiologa Humana. 1993. Edit. Mc Graw Hill-Interamericana.
Espaa Madrid p. 23-34.
36
PRCTICA 6
POTENCIAL DE ACCIN COMPUESTO
INTRODUCCIN
La funcin primaria del sistema nervioso es la transmisin de informacin entre los
rganos sensoriales y los tejidos de respuesta (msculos y glndulas), pasando por un
centro de integracin. Para ello, el tejido nervioso est dispuesto en forma de un
cableado que corre de los rganos sensoriales a alguna estructura del sistema nervioso
central y de ah a las clulas musculares. Este cableado est formado esencialmente por
los axones de las neuronas perifricas, que pueden ser muy largos. Los axones que se
proyectan hacia regiones contiguas del cuerpo (por ejemplo, los que van a diferentes
clulas musculares en la pierna) viajan en forma de grupos compactos junto con los que
vienen en sentido aferente desde estructuras receptoras (por ejemplo, de la piel) de la
misma regin. Este conjunto de axones forma un nervio perifrico. Una fibra individual
(un axn) tiene un dimetro de alrededor de 20 m (0.002 cm) y no se distingue a simple
vista; un nervio es mucho ms grueso y se le observa con facilidad.
Medir la respuesta elctrica de una fibra individual requiere de equipo muy sofisticado y
adiestramiento especial. En comparacin, medir la respuesta elctrica de un nervio
completo (potencial de accin compuesto) es sencillo, pero requiere hacer algunas
consideraciones: los cambios de voltaje que se registran son extracelulares (tanto el
electrodo de registro como el de referencia estn fuera de la clula), por lo que el trazo
del potencial de accin tiene una forma diferente al del potencial clsico, y recibe el
nombre de potencial bifsico. En segundo lugar, puesto que las neuronas pueden tener
umbrales distintos, el potencial de accin compuesto no cumple estrictamente la ley de
todo o nada del potencial de accin. Por lo dems, la preparacin de nervio completo
reproduce las principales caractersticas de la actividad elctrica de las clulas nerviosas.
37
OBJETIVO
Las actividades que se describen tienen como propsito medir la respuesta elctrica de
un nervio completo, y determinar las propiedades de conduccin de estas fibras.
MATERIAL
- Estuche de diseccin
- Disectores de vidrio
- Cmara para nervio aislado
- Unidad de adquisicin Biopac MP36.
- Electrodo SS2L
- Cable DB9H
- Gotero
- Hilo
- Rana grande
DESARROLLO
I. Montaje de la preparacin
En esta preparacin se utiliza el nervio citico de rana, que por su grosor es el ms fcil
de obtener y manejar. El nervio se coloca en una cmara provista de bandas metlicas
que funcionan como electrodos de estimulacin o de registro. Al mismo tiempo, la
cmara asla al nervio de los lquidos conductores.
1. Con ayuda de unas tijeras grandes y un estilete, descerebre y desmedule la rana
(figura 6).
2. Corte la piel de una de las patas posteriores y remuvala hasta descubrir
completamente la extremidad.
3. Separe cuidadosamente los msculos en la cara posterior del muslo y localice el
nervio citico.
4. Sin tocar el nervio, descbralo en ambos sentidos hasta la mdula espinal por un lado
y hasta la rodilla por el otro. Corte los msculos que sea necesario (figura 6).
5. Amarre un trozo de hilo alrededor del nervio tan cerca de la mdula espinal como sea
posible.
38
6. Con unas tijeras finas separe el nervio de la mdula, de manera que la fibra quede
sujeta con el hilo.
7. Con ayuda de los manipuladores de vidrio, separe cuidadosamente el nervio, hasta
liberar una porcin de 8 a 10 cm.
8. Coloque el nervio extendido sobre los electrodos de la cmara para nervio aislado.
39
1. Guindose con la figura 7, verifique que las conexiones del equipo estn en las
posiciones siguientes:
- ESTMULO: Conectar el cable DB9H a Analog out del MP36.
- REGISTRO DEL PAC: Conecte el electrodo de registro SS2L al CH2.
Nota el CH1 no debe estar conectado.
2. Conecte el cable rojo St(+) del DB9H en el pin del extremo de la cmara de nervio
aislado.
3. Una el cable negro St(-) del DB9H al cable negro (GND) del SS2L y conctelo al pin
siguiente de la cmara del nervio.
4. El cable blanco Vin(-) y el cable rojo Vin(+) del SS2L se conectan a los pines del otro
extremo, estos cables pueden moverse de acuerdo con la longitud del nervio. Nota el
cable rojo Vin(+) siempre debe ser el ms alejado del estmulo.
41
e) Curva de intensidad-duracin
1. Cierre el archivo anterior y abra PAC-Ciatico-03.
2. Ajuste la intensidad del estmulo ligeramente arriba del valor umbral, de modo que el
potencial de accin tenga una amplitud bien definida.
3. En estas condiciones, mida sobre la pantalla la duracin de la respuesta.
4. Reduzca la intensidad del estmulo en una dcima parte. Con el control de duracin,
aumente su duracin hasta que la respuesta del nervio regrese al tamao exacto al que
se ajust en el inciso 2.
5. Mida y registre nuevamente la duracin y la intensidad del estmulo.
6. Reduzca nuevamente la intensidad del estmulo y ajuste la duracin para tener
siempre el mismo tamao de respuesta. Registre el nuevo par de valores.
7. Repita el proceso hasta que el estmulo se haya reducido a un punto en el que no
logre generar un PAC aun aumentando la duracin (o hasta valor mximo permitido por
el equipo).
8.- Repita el proceso ahora aumentando la intensidad del estmulo y reduciendo la
duracin.
PRESENTACIN DE RESULTADOS
En su reporte incluya los valores calculados en cada experiencia: estmulos umbral y
mximo (V), velocidad de conduccin del nervio (m/s), tiempo necesario para la
sumacin de los estmulos subumbrales (ms) y duracin de los periodos refractarios
absoluto y relativo (ms). Para la ltima experiencia trace una grfica (abscisas: duracin;
ordenadas: intensidad) con los pares de valores obtenidos.
Incluya para cada experiencia un diagrama del trazo observado en la pantalla del
BIOPAC. Recuerde incluir los pies de figura para cada una.
BIBLIOGRAFA
Carpenter S.H. Neurofisiologa. 1986. El Manual Moderno, Mxico, D.F.
Eckert, R.D., Burgreen W., y French K. Fisiologa Animal, Mecanismos y Adaptaciones. 4
ed., 1998. Interamericana-McGraw-Hill, Madrid.
43
44
PRCTICAS
7. TRASMISIN SINPTICA Y 8. MSCULO ESQUELTICO
INTRODUCCIN (Transmisin sinptica)
La comunicacin neuronal se realiza principalmente a travs de sustancias
liberadas por una neurona, denominadas neurotransmisores, aunque existen otros
medios de comunicacin, como es la elctrica. La comunicacin entre las clulas
nerviosas se lleva a cabo en regiones especializadas denominadas sinapsis. Las
sinapsis pueden clasificarse con base en sus diferencias funcionales o morfolgicas.
Las sinapsis elctricas prcticamente carecen de un espacio entre las regiones pre- y
postsinpticas y por lo tanto no existe un retardo sinptico en ellas. En cambio en las
sinapsis qumicas la separacin es de unos 20 a 50 nm (hendidura sinptica), por lo que
en stas s existe un retardo sinptico. En las sinapsis qumicas, los mensajeros que se
liberan de las terminales presinpticas se unen a los receptores especficos ubicados en
las membranas de las neuronas que reciben el mensaje.
En los mamferos, las fibras musculares son inervadas por el axn de una sola
motoneurona. El axn se une con la fibra muscular en la llamada placa neuromuscular,
una regin especializada cuya funcin es similar a las sinapsis neuronales: cuando un
potencial de accin es generado en las neuronas motoras, provoca la liberacin de
acetilcolina en las terminales presinpticas, que se une con receptores colinrgicos
localizados en la fibra muscular (membrana postsinptica). La interaccin de la
acetilcolina (ACh) con su receptor provoca la despolarizacin de la fibra muscular en la
regin de la placa motora. Esta despolarizacin es suficientemente grande para provocar
la activacin de canales dependientes de voltaje y provocar un potencial de accin que
viaja a lo largo de la fibra muscular. El efecto de la ACh termina cuando sta es
degradada por la enzima acetilcolinesterasa (AChE), presente en la hendidura sinptica.
Normalmente, la cantidad liberada de acetilcolina es suficiente para asegurar que cada
potencial de accin de la neurona motora provoque un potencial de accin en la fibra
muscular.
45
OBJETIVOS
Transmisin sinptica:
- Demostrar la funcin de la acetilcolina en la transmisin sinptica.
Msculo esqueltico:
- Describir la respuesta contrctil del msculo esqueltico ante estmulos elctricos de
diferentes caractersticas.
- Determinar la importancia del aporte sanguneo en la contraccin muscular.
MATERIAL
1 estuche de diseccin (personal)
Soluciones:
1 vaso de precipitados de 50 ml
2 pinzas dobles
1 ligadura de hule
1 perilla de hule
1 tabla para diseccin
1 polea
2 disectores de vidrio
1 cable DB9H para estimulador
1 Unidad de adquisicin Biopac MP36
1 juego de electrodos con funda
1 cronmetro
1 Transductor de fuerza
Algodn
Hilo delgado
Material biolgico:
1 Rana previamente descerebrada y desmedulada
47
DESARROLLO
Sujete la rana fuertemente en posicin de decbito dorsal a una tabla de diseccin y
proceda a realizar una preparacin citico-gastrocnemio (figura 8). Fije la pata de la rana
de modo que slo se registre el movimiento del gastrocnemio.
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Todas las respuestas musculares obtenidas de la preparacin citico-gastrocnemio
debern reportarse en valores de fuerza expresada en gramos.
Para la experiencia 2b, construya una grfica de la relacin entre intensidad del estmulo
y la respuesta contrctil. As mismo, para las experiencias 10b y 11a haga grficas de la
respuesta contrctil vs el tiempo o la concentracin de la d-tubocurarina respectivamente.
50
Para la fatiga en humano, colecte los resultados del grupo y haga promedios de los
valores con los brazos ligados o sin ligar, separe tomando en cuenta tambin el orden de
la experiencia.
Equipo
1
2
3
4
5
6
Media
EEM
Orden inicial
(presiones/minuto)
Brazo sin ligar Brazo ligado
Orden inverso
(presiones/minuto)
Brazo ligado
Brazo sin ligar
Nota: En estricto apego a las Normas Oficiales Mexicanas vigentes y a las recomendaciones del
Comit de Biotica de la ENCB, se ha decidido realizar en conjunto las prcticas Transmisin
sinptica y Msculo esqueltico con la finalidad de reducir en la medida de lo posible el uso de
animales de experimentacin. As mismo, se substituye el uso de ratas por ranas, lo que permite
un protocolo de experimentacin en que se evita al mximo el sufrimiento innecesario de los
animales. Los datos correspondientes a msculo esqueltico, sern analizados una vez que se
haya cubierto los aspectos tericos correspondientes en el programa del curso.
BIBLIOGRAFA
Aidley, D.J. The Physiology of Excitable Cells. 4 ed., 1998. Ed. Cambridge University
Press, Cambridge.
Brunton L.L., Lazo J.S. y Parker K.L. Goodman y Gilman: Las Bases Farmacolgicas de
la Teraputica. 11 ed., 2006. Ed. Mc Graw Hill Interamericana Editores, Mxico D.F.
Carpenter R.H.S. Neurofisiologa. 2a ed., 1998. Ed. El Manual Moderno. Mxico, D.F.
Kandel E.R., Schwartz J.H. y Jessell T.M. Principios de Neurociencia. 4 ed., 2001. Ed.
Mc Graw Hill Interamericana Editores, Mxico D.F.
Karp G. Biologa Celular y Molecular. 6a ed., 2011. Ed. Mc Graw Hill Interamericana
Editores, Mxico D.F.
Randall, D., Burgreen, W. y French, K. Eckert. Fisiologa Animal: Mecanismos y
Adaptaciones. 4 ed., 1998. Ed. Interamericana-McGraw-Hill, Madrid.
51
PRCTICA 8
MODULACIN DE UNA FUNCIN CELULAR POR SEALES
QUMICAS
INTRODUCCIN
Una de las caractersticas ms importantes de los seres vivos es su capacidad
para reconocer variaciones en las condiciones del entorno que los induzcan a realizar los
cambios funcionales o estructurales necesarios para adaptarse a la nueva situacin. A
nivel celular, se trate de organismos unicelulares o pluricelulares, es muy frecuente que
tal caracterstica recaiga en la existencia de sistemas de reconocimiento de seales
qumicas. Tales sistemas requieren de receptores, esto es, molculas especializadas en
reconocer la seal qumica y que adems sean capaces de inducir mediante un proceso
de complejidad variable, la respuesta especfica a la seal. La cantidad de complejos
moleculares formados entre el receptor y la seal determinan la intensidad de la
respuesta producida. Un primer nivel de control de sta puede establecerse a travs de
variaciones en la concentracin de la seal en el entorno celular. Habitualmente este
nivel de control es suficiente para cubrir las necesidades de las clulas individuales. Sin
embargo, se puede establecer un segundo nivel de control modulando el nmero de
receptores que las clulas estn expresando para responder a la seal. La existencia de
estos dos niveles de control en las clulas que constituyen un organismo pluricelular
proporcionan un mayor grado de flexibilidad en la modulacin de la respuesta celular y
una mayor capacidad de adaptacin al organismo en su conjunto.
OBJETIVO
Observar los niveles de control que pueden estar modulando una funcin celular, en este
caso la contractilidad uterina en la rata. De modo especfico se evaluaran las variaciones
de contractilidad en funcin de cambios en la concentracin de una seal especfica,
oxitocina, y en la densidad de receptores a la misma.
52
MATERIAL
Por equipo.
1 Parte:
- Benzoato de estradiol 0.5 mg/ml (diluyente aceite vegetal).
- Aceite vegetal.
- 1 jeringa de 1 ml con aguja No 27
- Balanza para pesar animales
- 1 rata hembra adulta (aprox. 150 g de peso).
2 Parte:
- Sistema de adquisicin MP36
- Transductor de fuerza.
- Gancho en S.
- 1 Soporte universal o de media luna
- 2 Pinzas dobles.
- 1 Bao con recirculador.
- 1 Termmetro.
- 1 Cmara para rgano aislado con tubo largo de desage y pinza Mohr.
- Tubera para el aireamiento de la preparacin.
- 4 Jeringas de 1 ml con aguja.
- 1 Aguja con hilo.
- Estuche de diseccin (cada equipo deber traer el suyo).
- 1 Caja de Petri.
- 1 Pizeta de 500 ml (aproximadamente).
Por grupo:
1 Parte (Tratamiento).- 2 Cajas para 3 ratas c/u.
2 Parte: (Obtencin de datos).
- Soluciones de oxitocina a 0.5, 1.5, 7.5 y 25 nM.
- 4 Litros de Solucin fisiolgica De Jalon.
53
DESARROLLO
1 Parte.
1.- Cada equipo recibir una rata hembra. Esta se pesar y marcar de acuerdo al plan
siguiente; equipos nones, condicin testigo, equipos pares, tratamiento con estrgenos.
Cada lote de ratas se coloca en una jaula debidamente rotulada con los siguientes datos:
Nmero de los equipos, grupo, tratamiento, fecha y profesor responsable.
2.- Durante cuatro das las ratas se inyectarn por va subcutnea con el volumen
correspondiente a la milsima parte de su peso ya sea con la solucin de estrgeno
(equipos pares) o con el aceite de maz (equipos nones). Los equipos se
responsabilizarn del lote de ratas que le corresponda en cuanto a su tratamiento y
cuidado, manteniendo las condiciones adecuadas de alimento, agua y limpieza.
2 Parte. Obtencin de los Datos con el equipo del Biopac.
1.- Conectar el transductor de fuerza a la entrada del canal 1 del MP-36 y calibrar el
equipo.
2.- Calibrar el bao con recirculador a 31 1 C procurando mantener constante esta
temperatura durante todo el experimento. La cmara para rgano aislado se llena con
solucin De Jalon y se coloca en el interior del bao. Esta solucin debe mantenerse con
aireacin continua (1 burbuja/segundo) y contar con un sifn para poder realizar los
lavados necesarios de la preparacin.
3.- Los alumnos recibirn sus respectivas ratas, previamente sacrificadas por
dislocamiento cervical; le abrirn el abdomen, desplazando los intestinos a un lado para
localizar los cuernos uterinos (figura 10). Una vez localizados se disecan y se transfieren
a una caja de Petri con solucin De Jalon aireada con una burbuja/segundo. Los cuernos
se limpian del tejido graso y se separan para utilizar uno de ellos en la preparacin.
54
5.- Se deja estabilizar la preparacin durante 25 minutos, durante los cuales se podran
observar contracciones espontneas.
6.- Se inicia el registro siguiendo las instrucciones del profesor. Las concentraciones de
oxitocina se probaran en orden ascendente siguiendo la secuencia siguiente en la toma
de datos:
a) Registro de la actividad basal.
b) Sin parar el registro adicionar 0.2 ml de la concentracin a probar y observar el efecto
durante 1 minuto.
c) Lavar la preparacin para recuperar el registro basal. Repetir el ciclo.
6.- Para hacer los lavados de la preparacin, se abre el desage de la cmara de rgano
aislado y simultneamente se llena con solucin De Jalon a 32 C de la pizeta, evitando
as perder el sifn.
7.- En los registros obtenidos se medir la amplitud en gramos de la contraccin inducida
con cada concentracin de oxitocina y con esta informacin se llenaran las tablas
siguientes.
DATOS
* Grupo testigo (aceite vegetal)
Rata
1
3
5
Media
EEM
0.5
[Oxitocina] nM
1.5
7.5
25
[Oxitocina] nM
1.5
7.5
25
0.5
56
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Con los datos de promedio y error estndar de las amplitudes de la contraccin realizar
una curva del efecto en funcin de las dosis de oxitocina, tanto para el grupo testigo,
como para el grupo tratado con estrgenos. Para cada grupo de ratas discutir si la
modulacin de la respuesta depende de la concentracin de la seal. Adems comparar
ambas curvas para determinar si la variacin en la densidad de recetores a oxitocina
afecta la respuesta evaluada.
BIBLIOGRAFA
Chambert, G., Lanzagorta, A., Ortiz, R., Paniagua, N., Quevedo, L. y Zamudio, S.,
Manual de fisiologa humana (QFI), 2 ed., 2003, Departamento de Fisiologa de la
E.N.C.B-I.P.N., pp. 27-33.
Departamento de Farmacologa de la Universidad de Edimburgo, Pharmacological
experiments on isolated preparations, 1 Ed., 1968, E. & S. Livingstone LTD., Edinburgh
and London, pp.92-95.
Ganong, W., Fisiologa mdica, 17a Ed., 2000, Edit. Manual Moderno, Mxico, pp 271272, 488 y 499.
Katzung, B., Farmacologa bsica y clnica, 7 Ed., 1999, Edit. Manual Moderno, Mxico,
pp 14-18.
Larcher, A., Neculcea, J., Breton, C., Aslan, A., Rozen, F., Russo, C. y Zingg, H.,
Oxytocin receptor gene expression in the rat uterus during pregnacy and the estrous
cycle and in response to gonadal steroid treatment, 1998, Endocrinology, Vol. 136 (12),
pp 5350-5356.
57
PRCTICA 10
PROPIEDADES DEL MSCULO CARDIACO
INTRODUCCIN
El corazn contina latiendo despus de ser despojado de su inervacin extrnseca, esto
se debe a la presencia de un tejido marcapaso especializado. Este tejido especializado
se caracteriza por poseer un potencial de membrana inestable (prepotencial), el cual
disminuye continuamente hasta alcanzar el valor de descarga desencadenando el
disparo de su potencial de accin.
Algunos agentes humorales que modifican la frecuencia de descarga del marcapaso, lo
hacen cambiando la pendiente del prepotencial (p.e. noradrenalina), aunque otras actan
tambin alterando el potencial de membrana cambiando as el tiempo requerido para
alcanzar el nivel de descarga (p.e. acetilcolina).
Como en otros tejidos excitables, los cambios en la concentracin externa de los iones
K+ afectan el potencial de membrana en reposo del msculo cardiaco, en tanto, que los
cambios en la concentracin externa de Ca
2+
musculares.
La contractilidad del miocardio ejerce una importante influencia sobre el volumen
sistlico. Los impulsos de los nervios noradrenrgicos simpticos en el corazn,
aumentan la frecuencia (efecto cronotrpico) y la fuerza de contraccin (efecto
inotrpico). Las catecolaminas ejercen su efecto inotrpico por medio de una accin
sobre los receptores 1-adrenrgicos.
Los impulsos de las fibras cardiacas vagales colinrgicas disminuyen la frecuencia
cardiaca (efecto cronotrpico negativo).
OBJETIVOS
+
2+
MATERIAL
Material biolgico
- Rana de 100 a 150 g de peso
Por equipo:
- Soporte de media luna
- Pinzas dobles
- Sistema de adquisicin MP36
- Ajustador de tensin
- Transductor de tensin
- Cable DB9
- Electrodos de estimulacin
- Estuche de diseccin
- Tabla de diseccin para rana
- Franela
- Hilo grueso y delgado
- Caja de Petri
- 3 vasos de p.p. de 50 ml.
- 6 jeringas de 1 ml
Soluciones:
- Acetilcolina 1:10 000
+
2+
DESARROLLO
I. Desmedular, descerebrar y montaje de la rana.
1. El profesor se encargar de anestesiar a la rana (pentobarbital sdico 80 mg/kg, ip.)
descerebrarla y desmedularla (figura 12), [NOM-033-ZOO-1995 (sacrificio humanitario de
los animales domsticos y silvestres)]. Con ello se persigue eliminar los reflejos y
59
tener solamente un animal vegetativo, el cual ser entregado a los alumnos para la
realizacin de la prctica.
DATOS
II. Sustancias simptico y parasimpaticomimticas
* Adrenalina
Tiempo (minutos)
Basal
Frecuencia
Amplitud
* Acetilcolina
Tiempo (minutos)
Basal
Frecuencia
Amplitud
62
* Atropina + acetilcolina
Basal
Atropina
Tiempo (minutos)
Atropina + acetilcolina
2
Frecuencia
Amplitud
IV. Efecto de los iones sobre la actividad del corazn
* Ringer alto en potasio
Basal
Tiempo (minutos)
2
Tiempo (minutos)
2
Frecuencia
Amplitud
* Ringer alto en calcio
Basal
Frecuencia
Amplitud
PRESENTACIN DE RESULTADOS
- Determine para cada experiencia la frecuencia (latidos/minuto) y amplitud (mm) de las
contracciones.
- Realice las grficas correspondientes para cada experiencia.
- Adicione a su reporte los resultados obtenidos para cada experiencia.
BIBLIOGRAFA
Aidley, D. J., 1998. The Physiology of Excitable Cells. 4- ed. Edit. Cambridge. University
Press. P. 381 393.
Conti, F. E., 2010. Fisiologa Mdica. McGraw-Hill-Interamericana, Mxico.
Eckert, R., D. Randall y G. Augustine, 1998. Fisiologa Animal. Mecanismos y
adaptaciones. 4. ed. Edit. McGraw Hill Interamericana. Madrid, Espaa. p 507 522.
Ganong, F. W. 2000. Fisiologa Mdica. 17. ed. Edit. El Manual Moderno, D. F., Mxico.
p. 84 89, 605 622.
63
PRCTICA 11
PROPIEDADES DEL MSCULO LISO
INTRODUCCIN
Aunque el msculo liso se ha estudiado menos que el esqueltico, se sabe que
contiene los elementos que pueden hacer su proceso contrctil semejante. La
distribucin de msculo liso en los organismos es abundante y bsica para muchos de
los procesos vitales y de conservacin del individuo y de la especie.
La excitacin en el msculo liso, en general, obedece a factores humorales y nerviosos.
El intestino es el tipo de rgano en el que mejor se puede ilustrar el comportamiento del
msculo liso: el automatismo, la influencia de la inervacin neurovegetativa, etc.
OBJETIVO
- Estudiar las propiedades contrctiles del msculo liso.
- Observar el efecto de las sustancias simptico y parasimpaticomimticas sobre la
actividad del msculo liso intestinal.
- Observar la influencia que ejercen algunos factores externos, como hipoxia,
temperatura y tensin sobre la actividad del msculo liso intestinal.
MATERIAL
Por equipo:
Soluciones:
- Hilo
- aguja
- Atropina 1: 1000
- termmetro industrial
- pinzas dobles
Material biolgico:
- cmara de vidrio
- caja de Petri.
- vaso de p.p. de 50 ml.
- resistencia
64
- pinza Mohr.
- 2 vasos de precipitados de 250 ml.
- soporte de media luna.
- 3 pipetas de 1 ml graduadas.
DESARROLLO
Preparacin del sistema de registro:
Con ayuda de la resistencia se lleva el bao a 37 1 C. Dentro del bao se coloca la
cmara para rgano aislado, la cual deber contener solucin de Tyrode con aireacin
continua (dos a tres burbujas /segundo) y un eficiente sifn que debe manejarse con
cuidado en el tubo de desage para realizar los lavados. Se sacrifica al conejo con un
golpe en la nuca y se le abre el abdomen para localizar el estmago, y aproximadamente
10 cm por debajo de ste se corta una porcin de intestino de 20 cm, el cual se transfiere
a una caja de Petri que contiene Tyrode aireado a 37 C. Se eliminan las membranas
mesentricas para que el msculo quede libre y se cortan porciones (asas) de 1.5 a 2 cm
(figura 15).
Figura 15.
65
Con movimientos suaves se vaciar el contenido de las asas y cada equipo tomar una.
Las restantes se mantendrn en el seno de la solucin aireada de Tyrode a 37 1 C. A
una porcin se le ata un hilo de unos 25 cm en cada uno de sus extremos teniendo
cuidado de que la luz intestinal no quede ocluido, como se observa en la figura 16.
Figura 16.
Esta preparacin se traslada a la cmara de rgano aislado, amarrando una de los
extremos en el gancho del fondo de la cmara y el otro al transductor del BIOPAC (figura
17). El equipo BIOPAC deber estar calibrado (pedir ayuda al profesor) de tal manera
que se registren claramente los movimientos del duodeno.
Figura 17.
66
IMPORTANTE: Cuidar que la temperatura del lquido de la cmara est entre los 35 y 37
C, y pasen 2-3 burbujas de aire/segundo.
PRECAUCIONES ADICIONALES:
a)
Mantener la aireacin.
b)
Mantener la temperatura a 37 C.
c)
EXPERIENCIAS:
1. Realice un registro basal (1 min) de las contracciones del intestino en el que pueda
apreciar claramente la ritmicidad y el tono del mismo.
2.- Hipoxia. Sin dejar de registrar, suspenda el burbujeo de aire de la preparacin; en
cuanto se noten los efectos volver a establecer la aireacin. Dejar transcurrir un tiempo
adecuado para observar el restablecimiento de la actividad contrctil.
3. Temperatura. Sin detener el registro agregue a la cmara solucin de Tyrode fro.
Anote la temperatura del interior de la cmara. Aumente la temperatura gradualmente por
calentamiento del recipiente exterior. Observe los cambios de la ritmicidad hasta tener
una temperatura de 38C; y regresar la temperatura a 37C.
4.- Tensin. Realizar un registro basal y sin dejar de registrar, aumente la carga del
msculo aumentando la altura del transductor. Observe la respuesta y determine si sta
se mantiene durante 3 min.
5.- Adrenalina. Realice un registro basal y sin detener el registro agregue una gota de
adrenalina de una solucin 1:10 000. Contine registrando durante 3 min; o hasta
observar los efectos sobre la amplitud y la frecuencia de las contracciones.
6.- Realice los lavados con solucin de Tyrode que sean necesarios hasta que la
preparacin presente la frecuencia y amplitud que tena en el registro basal anterior.
7. Acetilcolina. Realice un registro basal y sin detener registre los efectos que se
producen al regresar una gota de la solucin de acetilcolina de una solucin 1:10 000.
Contine registrando durante 3 minutos o hasta observar los efectos sobre la amplitud y
la frecuencia de las contracciones.
8.- Realice los lavados con solucin de Tyrode que sean necesarios hasta que la
preparacin presente la frecuencia y amplitud que tena en el registro basal anterior.
67
9.- Atropina. Realice un registro basal y, sin detener el registro, agregue 0.2 ml de una
solucin de atropina 1:1000. Registre durante 1 minuto y despus agregue una gota de
acetilcolina. Contine registrando durante 3 minutos o hasta observar los efectos sobre la
amplitud y la frecuencia de las contracciones.
DATOS
* Adrenalina
Tiempo (s)
Basal
10
15
20
25
30
45
90
25
30
45
90
25
30
45
90
Frecuencia
Amplitud
* Acetilcolina
Tiempo (s)
Basal
10
15
20
Frecuencia
Amplitud
* Atropina + Acetilcolina
Tiempo (s)
Basal
10
15
20
Frecuencia
Amplitud
PRESENTACIN DE RESULTADOS
- Determine para cada experiencia la frecuencia y amplitud de las contracciones.
- Realice las grficas correspondientes para cada experiencia.
- Adicione a su reporte los resultados obtenidos de cada experiencia.
68
BIBLIOGRAFA
Berne, R. y Levy, M.; 1992. Fisiologa. Ed. Mosby Year Book. Madrid, Espaa, pp. 352
373.
Ganong, F.W.; 2000. Fisiologa Mdica.17a. ed. Ed. El Manual Moderno, Mxico, pp. 89
92; 533570.
Stuart, I.F.; 2003. Fisiologa Humana. 7 ed. Ed. McGraw-HillInteramericana. Madrid,
Espaa, pp. 364368.
Eckert, R., Randall, D. y Augustine, G.; 1998. Fisiologa Animal. Mecanismos y
adaptaciones. 4a ed. Ed. McGraw-HillInteramericana. Madrid, Espaa, pp. 435 438.
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APNDICE
a) MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO
Las tcnicas bsicas para el manejo de animales incluyen:
i). Evitar sufrimiento innecesario al animal, que adems de contravenir normas ticas,
puede condicionar respuestas anmalas.
ii). Evitar el manejo inadecuado y brusco del animal, para prevenir reacciones agresivas
hacia el experimentador.
a1) Ratas
Evtese el manejar a la rata con violencia, pues rpidamente aprende a defenderse y se
torna difcil y peligrosa.
El manejo de la rata es similar al que se usa con el ratn, sin embargo, para levantarla y
manipularla es ms conveniente tomarla suavemente y con seguridad por el dorso,
rodeando el trax con la mano (figura 18), pero teniendo cuidado de no presionar con
demasiada fuerza porque se puede asfixiar.
Figura 18
a2) Ranas
La rana debe de tomarse con una franela hmeda para evitar prdida de agua por la piel
(respiracin cutnea) y facilitar su manipulacin.
* Descerebracin y desmedulacin:
Remueva la porcin anterior del cerebro haciendo un corte a nivel de las comisuras
bucales, que pase por el borde anterior de las membranas timpnicas (figura 19).
70
Figura 19.
* Preparacin citico-gastrocnemio: Corte la piel alrededor de la parte superior de la
pierna, como se muestra en la figura 20. Para desprender la piel, jale hacia abajo de la
pierna hasta que quede expuesta toda la musculatura.
Figura 20.
Cuide de mantener hmedos con solucin salina los tejidos expuestos.
Coloque una aguja de diseccin o una pinza entre el tendn de Aquiles y el hueso, pase
un hilo por debajo del tendn y amrrelo fuertemente. Finalmente corte el tendn de
Aquiles lo ms lejos posible del msculo (figura 21).
Con ayuda de sus pinzas y disectores de vidrio, separe cuidadosamente los msculos y
exponga el nervio citico, el cual se identifica por su color amarillento, corriendo cercano
y paralelo a los vasos femorales (figura 21).
Figura 21.
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a3) Conejos
No se debe tomar por las orejas, sino por la piel del cuello con la mano izquierda; la
mano derecha servir para sujetar las extremidades posteriores (restirando sin lastimar)
e inmovilizar al animal para poderlo trabajar (figura 22).
Cuando se tiene la caja adecuada para la manipulacin del conejo, basta con acomodar
la cabeza del animal en el cepo de la misma. Esta caja permite el uso de las orejas para
realizar inyecciones por la vena va Intravenosa (figura 22).
Figura 22.
Figura 23
73
c2) Ranas
Se les colocan cintillos de tela adhesiva en una de las extremidades, donde se anota el
peso corporal o un nmero que permita identificarlas.
c3) Conejos y cuyos
Cuando no se pueden identificar por alguna caracterstica natural (color, tamao, etc.) se
les colocan grapas en las orejas.
d) VAS DE ADMINISTRACIN
Un frmaco puede introducirse en un organismo en forma de gas, de solucin, de
suspensin, o en estado slido. La forma es un factor importante en la velocidad de
absorcin.
La vascularizacin del sitio de administracin, y el rea de la superficie absorbente
tambin influyen en la velocidad de absorcin. Los frmacos son absorbidos con mayor
rapidez en reas con riego abundante, por ejemplo los pulmones, que en sitios con
menor riego sanguneo, como los subcutneos.
Las vas de administracin de frmacos utilizadas para lograr sus efectos sistmicos
pueden dividirse en dos grupos principales:
- ENTERICAS- Que usan el tubo gastrointestinal. Ejemplos: oral, rectal, intragstrica,
sublingual.
- PARENTERALES- Cuando NO se utiliza el tubo gastrointestinal. Ejemplos:
Intravenosa, subcutnea, intramuscular, tpica, intradrmica, respiratoria (inhalacin),
etc.
d1) Va Intraperitoneal
Con toda la mano izquierda sujete la piel del cuello de la rata en una amplia zona
mantenindola inmvil, as con la mano derecha se puede estirar la cola o las patas
posteriores (sin lastimarla) y se presenta otra persona, la que har la puncin (figura 24).
Las punciones deben practicarse en la mitad inferior del abdomen, por fuera de la lnea
media. Con una mano se levanta la piel de la regin, para separar la pared del contenido
abdominal y evitar as su puncin. Primero se introduce la aguja subcutneamente hasta
la mitad de su longitud y luego se acaba de introducir verticalmente a travs de la pared
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Figura 24.
d2) Va subcutnea
Es precisamente debajo de la piel del dorso del cuello. Se puede aprovechar el pliegue
que se toma entre el pulgar y el ndice. Los dedos medio, anular y meique sirven para
abrazar abdomen y tren posterior del animal. La mano derecha queda libre para hacer la
inyeccin clavando la aguja en la piel que queda sobre el pulgar e ndice y en sentido
cfalo-caudal. Para asegurarse de que la inyeccin ser subcutnea, una vez atravesada
la piel, se seguir el trayecto de la aguja con los dedos.
e) SOLUCIONES FISIOLGICAS
Las soluciones utilizadas en los experimentos de fisiologa son llamadas SOLUCIONES
FISIOLGICAS (salina, Tyrode, Krebs, Ringer, etc.) y su composicin depende del tejido
u rgano aislado (in vitro) que requiera mantenerse en un estado razonablemente
satisfactorio durante algn tiempo, en los 2 cuadros siguientes se muestran ejemplos.
Componentes
g/L
NaCl
KCl
CaCl2
MgCl2 6H2O
MgSO4 7H2O
NaH2PO4 H2O
Na2HPO4 2H2O
KH2PO4
NaHCO3
Glucosa
Ringer
Krebs
6.5
0.14
0.12
6.9
0.35
0.28
0.01
0.29
0.16
0.2
2
2.1
2
75
Tyrode
Hank
8
0.2
0.2
0.1
8
0.4
0.14
0.2
0.05
1
1
0.06
0.06
0.35
1
Componentes
g/L
NaCl
KCl
CaCl2
NaH2PO4 H2 O
NaHCO3
K2HPO4 3H2O
KH2PO4
KHCO3
Glucosa
Citrato de sodio
LIC
Ringer
+
bajo K
6.5
Ringer
2+
bajo Ca
6.5
0.14
0.12
0.01
0.2
Ringer
+
alto K
6.5
0.28
0.12
0.01
0.2
0.01
0.2
Ringer
2+
alto Ca
6.5
0.14
0.24
0.01
0.2
0.11
10
3
1.24
1
76
Si la cantidad necesaria es de 100 ml, divida el peso molecular de este alcohol (32.04)
entre 10 y despus multiplique el valor obtenido por 0.3 (para obtener la molaridad de
0.3). Despus divida este valor entre la densidad (0.79) para determinar el volumen
necesario.
- Proceda de la misma forma para preparar las soluciones de:
Alcohol Etlico (PM=46.07; densidad=0.79).
Alcohol Proplico (PM=60.097; densidad=0.80).
Alcohol Butlico (PM=74.124; densidad=0.81).
PRCTICA 4. POTENCIAL DE DIFUSIN Y POTENCIAL DE LESIN.
-Solucin de Ringer.
-Solucin de LIC (lquido intracelular).
-Soluciones de K2SO4: 0.005, 0.01, 0.025, 0.05 y 0.1 M.
-Solucin de KCl: 400, 100, 50, 20, 10, 5, 2.5, 1 mM.
-Soluciones de Na2HPO4: 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 y 2.0 M.
PRCTICA 7. TRANSMISIN SINPTICA.
- Acetilcolina 1: 10 000:
Acetilcolina ........................ 1 mg
Solucin salina 0.9 % .. 10 ml
- Curare 50 g/ml:
Tubocurarina...................... 1 mg
Solucin salina 0.9 % .. 20 ml
- Fisostigmina 1.5 mg/ml:
Fisostigmina .................... 1.5 mg
Solucin salina ................... 1 ml
PRCTICA 8. MODULACIN
DE
UN FUNCIN
QUMICAS.
- Soluciones de oxitocina a 0.06, 0.2, 0.63 y 5 Ul/ml.
- 4 litros de solucin fisiolgica de Jalon
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CELULAR
POR SEALES
- Tyrode:
Acetilcolina ................... 1 mg
NaCl ...........................
Adrenalina ............. 1 mg
- Atropina 1:1000:
NaHCO3 ......................
1g
Glucosa ......................
1g
78
8g
3. En la ventana que se abre, debe decir adquirir y aadir usando memoria PC. 100
muestras/segundo en frecuencia de muestreo y 120 minutos en tiempo de adquisicin.
Seleccionar reajustar.
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5. Dar clic en el botn que tiene un tringulo negro invertido, seleccionar fuerza de 0 a
50 gramos o de 0 a 100 gramos (dependiendo de la prctica que se vaya a realizar).
80
6. Dar clic en el botn de la llave de tuercas, aparecer una ventana que tiene un botn
calibrar, dar clic en l.
81
82
10. De igual forma, si el paso anterior se realiz de forma adecuada, habr un cambio
en el valor de la casilla de valor de entrada que est frente al botn Cal 2:
11. Se da clic en OK de todas las ventanas que se han abierto. En el men Ver, se
selecciona Mostrar, y luego Cuadrcula. Se da clic en Inicio.
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12. Si la calibracin se realiz de forma adecuada, aparecer una lnea roja (o de otro
color) que se va desplazando sobre el valor de 10 gramos. Luego dar clic en stop.
13. Para comprobar que la calibracin es adecuada, se retira la pesa de 10 gramos del
gancho en S que est en el transductor de fuerza. Se da clic en Inicio, ahora la lnea
roja aparece en el valor de 0. La calibracin es adecuada.
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16. El equipo est calibrado y listo para llevar a cabo sus registros.
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