GUIA DE TRABAJOS

PRCTICOS
QUMICA BIOLGICA
Departamento de Quimica Biolgica
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - UBA
Pabelln II 4to Piso
http://www.qb.fcen.uba.ar

CARRERA

B
Biologia
2010

Q
Quimica

REGIMEN DE PROMOCION 2010 - QUIMICA BIOLOGICA I

Firma de Trabajos Prcticos:

La aprobacin (o firma) de los trabajos prcticos es requisito para aprobar la materia.
Firmarn los trabajos prcticos aquellos alumnos que hayan aprobado todos los informes de
laboratorio y obtengan una nota general delaboratorio igual o superior a 5 (cinco).
Dado que los informes sern material de estudio, aquellos que sean desaprobados debern ser
corregidos y entregados para su aprobacin.
La nota general de laboratorio estar compuesta de la siguiente manera:
30% del promedio de las notas de parcialitos.
15% de trabajos especiales referidos a los TPs o problemas. Estos pueden incluir la
preparacin de esquemas experimentales previo a la realizacin de algn(os)
determinado(s) TP(s) o la resolucin de problema(s), los cuales sern desarrollados en casa
y entregados en tiempo y forma para que los docentes los evalen.
5% del Estudio de un Caso Clnico. Esta tarea ser desarrollada a lo largo del cuatrimestre por
grupos de hasta 6 personas, en horario de problemas y se evaluar tanto la participacin personal
en su desarrollo como en la presentacin final en clase, incluyendo el informe escrito.
50% restante corresponder a la nota de 1 (un) parcial practico integratorio que abarcar todos
los temas incluidos en TPs y problemas. El parcial se aprobar con 5 (cinco),pudindose recuperar
una vez, sin que esto afecte la promocin general de la materia. En caso de desaprobar, la nota
del recuperatorio ser promediada con la del parcial. En dicho parcial no se podrn entregar
temas sin realizar. Es decir: si un alumno saca menos de 5 puntos, recupera el parcial completo,
pero si saca 5 o ms puntos y tiene un tema completo sin entregar, recupera ese tema y la nota
obtenida se promedia con el 0 del tema correspondiente en el parcial original.
La nota de concepto, junto con el desempeo en los informes permitir redondear la nota general de
laboratorio en hasta 0,5 puntos
.
Tanto las clases de laboratorio como las de problemas son obligatorias, con asistencia igual o
mayor al 80% en cada parte. En caso de faltar a una prctica de laboratorio, deber recuperarla
en otro turno o segn indique el Jefe de Trabajos Prcticos.
La aprobacin de los trabajos prcticos es requisito para aprobar la materia.

CONFECCIN DE INFORMES DE LABORATORIO

Todos los trabajos prcticos concluyen con la confeccin de un informe de laboratorio, el cual deber
ser entregado en el trabajo prctico subsiguiente para su correccin. Los informes entregados fuera de trmino
sern desaprobados y pueden o no ser corregidos por el Docente del turno.
Todos los informes seguirn una estructura que incluya:
Nmero y ttulo de trabajo prctico
Nombre(s) y apellido(s) del (los) autor(es)
1. Objetivos
2. Metodologa
3. Resultados
4. Discusin (este captulo no solo incluir las conclusiones sino tambin se
discutir si se cumplieron o no los objetivos. Al final se incluirn las respuestas
al cuestionario).

Aprobacin de temas tericos:

Se tomarn 3 (tres) parciales consistentes en 3 (tres) temas cada uno.
Cada tema deber aprobarse con 4 (cuatro) puntos o ms.
Cada alumno tendr oportunidad de recuperar hasta 3 (tres) temas entre los 3 (tres) parciales
tericos, sin perder la posibilidad de promocionar. La nota obtenida del recuperatorio se
promediar con la nota anterior de ese tema. El alumno que haya desaprobado ms de 3 (tres)
temas, pierde automticamente la posibilidad de promocionar y deber rendir un examen final.

Promocin sin examen final:

Promocionaran sin examen final aquellos alumnos que hayan obtenido un promedio de 7 (siete) o
ms en los temas tericos, sin tener algn tema por debajo de 4 (cuatro).
El alumno que promocione recibir, como nota final de la materia, la resultante del 50% de la nota
promedio de los parciales tericos y 50% de la nota final de laboratorio.
El alumno que, aun habiendo obtenido una nota de 4 o ms en cada parcial (sin haberlos
recuperado) no alcanzara la promocin, podr recuperar hasta 3 (tres) temas de su eleccin para
levantar la nota y conseguir la promocin. La nota obtenida en el recuperatorio se promediar con la
nota del parcial original.
Examen final:
Aquellos alumnos que hayan aprobado la parte prctica, pero que no alcancen la promocin, irn a
un examen final terico que abarcar toda la materia, sin importar la nota individual que hayan
sacado en cada tema.

CONFECCIN DE INFORMES DE LABORATORIO

Todos los trabajos prcticos concluyen con la confeccin de un informe de laboratorio, el cual
deber ser entregado en el trabajo prctico subsiguiente para su correccin. Los informes entregados fuera
de trmino sern desaprobados y pueden o no ser corregidos por el Docente del turno.
Todos los informes seguirn una estructura que incluya:
Nmero y ttulo de trabajo prctico
Nombre(s) y apellido(s) del (los) autor(es)
1.
2.
3.
4.

Objetivos
Metodologa
Resultados
Discusin (este captulo no solo incluir las conclusiones sino tambin se discutir si
se cumplieron o no los objetivos y al final se incluirn las respuestas al cuestionario).

TRABAJO PRCTICO I
ESPECTROFOTOMETRA Y CURVAS DE CALIBRACIN
Introduccin
La revolucin producida en el campo de la gentica hizo caer poco a poco, en una especie de letargo
cercano al olvido, el dominio de las protenas, muy estudiado hace unos aos. Curiosamente es de notar que
justamente son estos avances en el campo de la gentica, los que hicieron renacer el inters por las protenas. En
efecto, para poder secuenciar las protenas e identificar los genes correspondientes, hace falta purificarlas primero.
Inmediatamente, una vez que los genes se han insertado en un vector que permita su sobre-expresin, es necesario
purificarlas nuevamente, ya sea para poner a punto una vacuna, para su utilizacin como agente teraputico,
como herramienta de diagnstico, o para estudios acerca de la relacin estructura funcin.
El dosaje de protenas es una etapa muy importante dentro de un esquema de purificacin. A travs de
la cuantificacin de la protena podremos localizar a esta en una u otra fraccin de un proceso de separacin, y
de esta manera podremos medir la actividad biolgica de la misma. Los distintos mtodos de dosaje de
protenas deberan responder a criterios especficos, los cuales determinarn que sean utilizados a lo largo del
proceso de purificacin o para el control de calidad. Durante el proceso de purificacin, el dosaje debe ser rpido y
fcil de poner en prctica, mientras que el control de calidad requerir una respuesta especfica as como gran
sensibilidad (medicin de la actividad biolgica, respuesta a los anticuerpos, ausencia de contaminantes).
Criterios importantes para una buena tcnica de dosaje de protenas:
1) Bajo umbral de deteccin.
2) Buena especificidad.
3) Facilidad de puesta en prctica.
4) Rapidez.
5) Costo no muy elevado.
6) Fcil integracin en un protocolo de purificacin.
Frecuentemente es necesario estimar la concentracin de una mezcla de protenas al cabo de una etapa de
purificacin o de fermentacin (ya sea para calcular el rendimiento de la purificacin como la produccin de una
protena). Los diferentes mtodos de dosaje de protenas utilizan las propiedades fsicas y qumicas
intrnsecas de las mismas. A continuacin se resumen distintos mtodos segn el principio en el cual se
basan. Para una descripcin ms detallada consultar el anexo terico.
a) Mtodos espectrofotomtricos:
Medicin de absorbancia
Medicin de fluorescencia
b) Mtodos que involucran fijacin a colorantes:
Bradford (unin a Coomassie blue)
Fluorescamina (unin a fluorescamina)
c) Mtodos en los que intervienen reacciones qumicas:
Lowry (reactivo de Folin)
BCA (cido BiCinconnico)
d) Marcacin radiactiva.

Objetivos
- Conocer y comparar distintos mtodos para el dosaje de protenas.
- Aprender a disear curvas de calibracin y confeccionar los protocolos correspondientes.
- Hallar la concentracin de una muestra incgnita a partir de los parmetros matemticos de la recta
graficada.
- Conocer la importancia de contar con una curva de calibracin cuando se necesite vincular una
medicin experimental -tal como la absorbancia- con una determinada magnitud como, por
ejemplo, la concentracin de un dado compuesto.
a) Mtodo de Bradford
Materiales

Solucin patrn: Seroalbmina bovina (BSA) en concentracin 0,5 mg/mL.

Reactivo de Bradford (modificado): 40 mg de Coomassie Brilliant Blue G 250 + 50 mL

etanol + 100 mL cido fosfrico 85% y llevar a l litro con agua destilada.

Metodologa
Se deber construir una curva de calibracin para dosaje de protenas siguiendo el
protocolo de Bradford. La solucin patrn ser BSA en concentracin 0,5 mg/ml.
El mtodo de Bradford indica que a 0,1 mL de la solucin proteica a medir deben
agregarse 2 mL del Reactivo de Bradford. Seguidamente, se debe agitar vigorosamente para,
pasados 2 min aproximadamente, medir la absorbancia de la solucin a 595 nm. Se debe tener en
cuenta que el producto coloreado generado es estable slo dentro de la primer hora de producida la
reaccin.
En este Trabajo Prctico, la curva de calibracin deber cubrir el rango de protenas entre 5
g y 25 g. Las diluciones correspondientes debern hacerse en agua destilada. Tambin se deber
incluir un blanco de reactivos.
Es importante confeccionar el protocolo de la curva de calibracin (para determinar las
concentraciones proteicas y volmenes a utilizar) antes de realizar las mediciones
espectrofotomtricas correspondientes.
Con la curva de calibracin obtenida se deber determinar la concentracin de una muestra
proteica incgnita.

Tubos

Blanco

Muestra
incgnita

Protenas (g)

Solucin patrn (L)

Muestra incgnita (L)

H2O destilada (L)

6

Reactivo de Bradford (mL)

Mezclar y agitar bien y leer antes de 1 hora
A595
A595 Blanco
b) Mtodo de Lowry y col.
Materiales

Reactivo de Folin-Ciocalteau: mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato disponible

comercialmente que se diluye segn se especifique.

Solucin patrn: Seroalbmina bovina (BSA) o tripsina en concentracin de 0.5 mg/mL

Solucin alcalina de cobre: Se prepara mezclando las soluciones A, B y C en relacin 0,1

A : 0,1 B : 10 C. La preparacin debe realizarse mezclando primero A + B y recin despus
agregando C. Se prepara antes de usar y se descarta luego de un da.
A) Solucin de tartrato de sodio y potasio al 2%
B) Solucin de CuSO4 . 5H2O al 1%
C) Solucin de Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 N

Metodologa
Se deber, en este caso, confeccionar una curva de calibracin para dosaje de protenas
siguiendo el protocolo descripto por Lowry y col. El mismo indica que a 0,4 mL de solucin
proteica deben agregarse 2 mL de la solucin alcalina de cobre. Luego de una agitacin vigorosa,
se debe dejar 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, se agregan 0,2 mL del reactivo de Folin
y se agita inmediatamente. Se debe, entonces, dejar la solucin durante 30 min a temperatura
ambiente para luego poder medir la absorbancia a 660 nm.
Se dispondr de una solucin patrn de BSA (0,5 mg/mL) con la que se deber cubrir un
rango de cantidad proteica de 25 g a 125 g. Las diluciones se realizarn con agua destilada,
solvente con el que se har el respectivo blanco de reactivos.
Una vez diseado el protocolo de la curva de calibracin se debern realizar las mediciones
correspondientes para la confeccin grfica de dicha curva y la consiguiente determinacin de la
concentracin de una muestra incgnita.

Tubos

Blanco

Muestra
incgnita

Protenas (g)

Solucin patrn (l)

Muestra incgnita (L)

H2O destilada (l)

Solucin alcalina (mL)
7

Mezclar y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente

Reactivo de Folin
Mezclar inmediatamente y dejar reposar 30 minutos a temperatura ambiente
A660
A660 Blanco
Cuestionario
1- Por qu en la preparacin de la solucin alcalina de cobre no es lo mismo mezclar primero A
con B y luego agregar C que hacerlo en otro orden?
2- Por qu, luego de agregar el reactivo de Folin en el mtodo de Lowry, debe agitar
inmediatamente? Justifique.
3- Comparar el mtodo de Lowry y de Bradford en cuanto a rango en el cual se cumple la Ley de
Beer.
4- Por qu el rango de masas de protena utilizado en los dos mtodos es diferente? Cmo es la
sensibilidad en ambos mtodos?
5- Se dispone de distintas protenas patrn con las cuales se realizan las curvas de calibracin por el
mtodo de Lowry y Bradford. Cmo sern ambos grficos si se utilizan:
a) dos patrones que difieren en el contenido de tirosina y triptofano?
b) dos patrones que difieren en la cantidad de aminocidos bsicos?
Bibliografa
Lowry O.H.; Rosebrough I.; Farr A.L. y Randall R.J. J. Biol. Chem. 193: 265-275. 1951.
Bradford M. Anal. Biochem 72: 248-254, 1976.

TRABAJO PRCTICO II
CRISTALIZACIN DE PROTENAS
Para el estudio estructural de protenas y otras macromolculas uno de los mtodos mas utilizados
es la difraccin de rayos X. La nica limitacin de esta tcnica es que la obtencin de cristales adecuados
lo suficientemente grandes y ordenados para que difracten resulta sumamente difcil. Los modelos
estructurales obtenidos a partir de la cristalografa son usados ampliamente para revelar detalles
moleculares de los procesos biolgicos que permiten revelar, entre otras cosas, el funcionamiento
enzimtico, mecanismos de transporte molecular, mecanismos de reconocimiento antgenoanticuerpo, etc. La comprensin de la gentica-estructura-funcin puede ayudar a los cientficos a bloquear
o realzar una determinada funcin de un sistema.
La cristalizacin es uno de los medios por el cual una solucin sobresaturada metaestable puede
alcanzar un estado estable de menor energa mediante la reduccin de la concentracin de soluto y la
formacin de uniones intermoleculares. El fundamento de la cristalizacin es crear un sistema
termodinmicamente inestable que, al retornar al equilibrio, responda formando cristales.
En Qumica Orgnica se emplea con xito la recristalizacin como mtodo de purificacin. En
este curso de Qumica Biolgica vamos a presentar tcnicas para obtener cristales de protenas apropiados
para realizar estudios de difraccin de rayos X. Para ser usados en cristalografa, los cristales de protenas
deben reunir las siguientes condiciones:
1) 0,2-0,5 mm de longitud en la dimensin menor.
2) Ser monocristales.
3) Tener buena resistencia mecnica.
4) Poseer un alto grado de ordenamiento cristalino, para dar lugar a estructuras de alta resolucin.
Hasta el da de hoy, la cristalizacin de protenas es ms un arte que una ciencia. Sin embargo, estn
bien establecidos los factores que afectan la aparicin y el tamao de los cristales. Estos pueden ser
fsicos, qumicos y bioqumicos.
Fsicos
Qumicos
Bioqumicos
Concentracin de la
Temperatura: T
pH
macromolcula
Gravedad
Tipo de precipitante
Pureza de la macromolcula
Presin
Concentracin de precipitante Estado de agregacin de la
macromolcula
Tiempo
Fuerza inica
Punto isoelctrico
Vibraciones de todo tipo
Iones especficos
Simetra de la macromolcula
Campos electromagnticos
Grado de sobresaturacin
Protelisis, hidrlisis
Superficies
Ambiente oxidante o reductor Modificaciones postraduccionales
Metodologa utilizada
Cross-linkers
Modificaciones qumicas y
genticas
Propiedades dielctricas del
Detergentes, anfolitos.
Ligandos, inhibidores
medio
Viscosidad del medio
Impurezas
Procedencia
Velocidad de equilibrio
pH
Historia de la muestra
Tipo
de
precipitante
Homogeneidad de los
nucleantes

En todo ensayo de cristalizacin tenemos dos partes:

1)

la muestra, que debe estar lo mas pura posible y en solucin en un buffer con baja fuerza inica.

2)

el licor madre, esta formado por el precipitante, el buffer y los aditivos (a veces se puede
prescindir de estos dos ltimos)

Para obtener buenos cristales se necesita conocer algunas propiedades de la muestra con respecto al
precipitante usado, como ser la integridad de la estructura de la protena en su estado nativo, es decir evitar
los precipitantes que pueden desnaturalizar la muestra en forma irreversible.
Los primeros ensayos de cristalizacin se realizan para pescar condiciones en las cuales la protena
existe en forma cristalina, cabe remarcar que una determinada protena puede cristalizar en numerosas
condiciones con distinta simetra, grupo espacial, etc. Dichas condiciones presuponen el uso de
precipitantes, buffers y aditivos diferentes. Una vez que pescamos una condicin lo importante es
obtener monocristales perfectos y para ello disminuimos la cantidad de los centros de nucleacin. Para lograr
este objetivo jugamos con los factores fsicos y qumicos enumerados arriba para disminuir adems el
tiempo de aparicin y crecimiento de los cristales. Los cristales reconocen la paciencia como una virtud y
premian a aquellos que la practican.
Como regla general: se obtienen mayor nmero de cristales y ms defectuosos si el
crecimiento es acelerado. Lo inverso es vlido para la obtencin de cristales ms grandes y de mayor
calidad.
Cuando despus de varios ensayos sin xito no logramos cristalizar la muestra empezamos a analizar
las causas bioqumicas de ello, (enumeradas en la columna de la derecha de la tabla). En la mayora de las
veces analizando la historia de la muestra y cambiando por ejemplo la forma de purificarla obtenemos
cristales, otras veces agregndoles sus ligandos especficos.
Existen distintos mtodos de cristalizacin: 1) en batch y microbatch, 2) por dilisis,
3) por evaporacin lenta, 4) por difusin en geles y, 5) por difusin de vapor. En la prctica de utilizaremos
como mtodo de cristalizacin el de difusin de vapor. En l se distinguen tres tcnicas: a) gota
colgante, b) gota sentada y c) gota en sandwich En la prctica se trabajar con la tcnica de la gota
colgante.
.

Crearemos un sistema cerrado, sellando un recipiente con grasa de vaco, en el cual habremos

previamente colocado dos soluciones que contienen: la protena a cristalizar y NaCl como agente
precipitante y, la otra, slo NaCl, pero ms concentrado que el anterior. El mtodo de difusin de vapor se
basa en la igualacin de los potenciales qumicos de una sustancia en dos fases distintas de un sistema
evolucionando hacia el equilibrio. Como el NaCl est ms diluido en la gota que en el pozo hay pasaje de
molculas del solvente (agua) desde la solucin de la gota hacia la solucin del pozo, tendiendo a
igualar la concentracin de precipitante en la gota y en el licor madre. Convirtindose la gota en una
solucin sobresaturada que dar origen a los cristales esperados, cuando la concentracin de la protena y
el agente precipitante sean las apropiadas.

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En este Trabajo Prctico se precipitar lisozima, enzima presente en la clara de huevo de gallina
capaz de hidrolizar polisacridos de las paredes bacterianas
Objetivos
- Aprender un proceso de cristalizacin de una protena tipo.
Materiales

Lisozima 100 mg/mL en Buffer Acetato de Sodio 0,5 M pH 4,5.

Cajas de cristalizacin, lminas siliconadas, grasa de vaco.

Buffer Acetato de Sodio 0,5 M pH 4,5.

NaCl 2 M en H2O.

H2O destilada.

Metodologa
En este caso se realizar una curva de distintas concentraciones de la protena a cristalizar y de
agente precipitante, dentro de la cual se esperar encontrar aquella combinacin ptima de
concentraciones en la que se formen los mejores cristales.
Para ello se utilizarn placas multiwell de 24 pocillos. Se llenarn los pocillos con 1 mL de
solucin de NaCl (en la concentracin necesaria). Por otro lado, se dispondr tambin de 24 cubreobjetos,
en cada uno de los cuales se deber colocar 5 L de solucin proteica (de una determinada concentracin)
junto con 5 L de la solucin de NaCl del pocillo sobre el que se vaya a colocar dicho cubreobjetos. Para
lograr un sellado hermtico, se deber colocar grasa de vaco en el borde de cada pocillo sobre el que se
vaya a colocar un cubreobjetos.
Se sugiere, a continuacin, un posible protocolo a seguir para realizar la curva requerida.
[protena] en
la gota
(mg/mL)
5
10
25
50

1
[NaCl] base
del pozo
0
0.25
0.15
0.10

2
[NaCl] base
del pozo
0.5
0.5
0.25
0.15

3
[NaCl] base
del pozo
0.75
0.75
0.50
0.25

4
[NaCl] base
del pozo
1.00
1.00
0.75
0.50

5
[NaCl] base
del pozo
1.50
1.50
1.00
0.75

Las placas se dejarn a temperatura constante (18C) y se controlarn peridicamente Los cristales
se observarn al microscopio entre las 48 y 72 horas de realizado el experimento.

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TRABAJO PRCTICO III

ANLISIS ESTRUCTURAL DE MACROMOLCULAS
Herramientas informticas para el estudio de la Estructura de protenas
Conceptos: Forma y estructura tridimensional de molculas. Estructura y caractersticas de los
aminocidos. Estructura primaria, secundaria y terciaria. (Repaso de QB) Tipos y caractersticas de las
interacciones que determinan la estructura.
Tareas a desarrollar: Visualizacin de estructuras (molculas pequeas, protenas, complejos). Anlisis
de interacciones (puentes de Hidrgeno, clusters hidrofbicos, etc.). Reconocimiento de dominios de
plegamiento e interaccin protena-sustrato.
Introduccin
Las protenas son macromolculas (molculas muy grandes) formadas por una cadena de molculas ms
pequeas, los aminocidos. Las protenas son las principales responsables de realizar las funciones
biolgicas, y es la estructura o forma de las mismas la que determina su funcin. Los aminocidos son
molculas que contiene un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2) libres, ms una cadena
lateral (R) caracterstica. Para formar las protenas los aminocidos se unen entre s, mediante lo que se
denomina el enlace peptdico. ste se forma entre el grupo amino de un aminocido y el carboxilo de otro,
dando como resultado un enlace covalente CO-NH.
Existen aproximadamente 20 aminocidos distintos componiendo las protenas. stos se pueden clasificar
en funcin de las caractersticas de su cadena lateral R en:
Hidrofbicos: Aquellos no afines al agua
Hidroflicos: Aquellos afines al agua
cidos: Los cargados negativamente a pH fisiolgico
Bsicos: Los cargados positivamente a pH fisiolgico
A la secuencia lineal de la cadena de aminocidos se la conoce como estructura primaria de la protena.
En el espacio diferentes regiones de la cadena de aminocidos adoptan formas preferenciales, como
pueden ser: en forma de hlice (-hlice), adoptando una estructura de tipo lineal (hoja-) o adoptando
una estructura de rulo o bucle (loop). A estas regiones con una estructura particular se las conoce como
elementos de estructura secundaria de la protena. Los diferentes elementos de estructura secundaria se
combinan y ordenan el espacio de una manera particular generando as finalmente la estructura de la
protena propiamente dicha, o estructura terciaria. Conocer la estructura de una protena consiste en
conocer la posicin espacial de todos sus tomos. Finalmente existen protenas que estn formadas por
ms de una cadena (o subunidad) de aminocidos. A la forma en que se ensamblan las subunidades se la
conoce como estructura cuaternaria de la protena.
La estructura de una protena esta ntimamente ligada a su funcin. Por ejemplo, las protenas que
catalizan reacciones qumicas o enzimticas (como la amilasa) deben poder acomodar al sustrato en
algn bolsillo, y poseer aminocidos posicionados especficamente para realizar la reaccin. Muchas
protenas adems poseen unidas molculas orgnicas, o iones (cofactores) que ayudan a realizar su
funcin. Por otro lado las protenas estructurales que dan estructura a las clulas o tejidos poseen formas
sumamente complejas. Por ltimo, las protenas deben interactuar entre si o con otras macromolculas
como el ADN formando as complejos macromoleculares de gran tamao. El objetivo principal de esta
prctica es comenzar a comprender la estructura proteica y las formas que tienen los cientficos hoy en da
de representarla.

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Es importante notar, que las protenas no poseen una estructura rgida sino que se mueven. El
movimiento es esencial para su funcin, y existen varios mtodos para encarar su estudio. Un mtodo
relativamente popular para el estudio de la dinmica proteica consiste en la realizacin de clculos
computacionales, que simulan el movimiento real de los tomos de una protena, a lo largo del tiempo.
Uno de los campos ms interesantes de la qumica de protenas actual, consiste en estudiar como y porque las
protenas adoptan su estructura y uno de los mtodos para este tipo de estudios es la simulacin
computacional. El proceso por el cual una protena recientemente fabricada en la clula, pasa de estar
completamente estirada a poseer una estructura espacial definida se lo conoce como plegamiento de la
protena. Al proceso inverso por medio del cual las protenas nativas y activas funcionalmente, pasan a
un estado inactivo debido a que pierden su forma y se despliegan se conoce como desnaturalizacin. El
segundo objetivo de esta prctica consiste en visualizar la dinmica proteica as como el proceso de
plegamiento y desnaturalizacin inducida por factores externos.
Desarrollo
Parte 1- Manejo del programa, Visualizacin de estructura secundaria e interacciones,
Identificacin y comparacin de Dominios de plegamiento (DP)
Como ya mencionamos anteriormente, conocer la estructura de una protena consiste en conocer la posicin
espacial (en coordenadas cartesianas x,y,z) de todos los tomos que la componen. Cuando un grupo de
investigacin determina la estructura de una protena la deposita en una base internacional de libre
acceso denominada Protein Data Bank (PDB). El archivo depositado con extensin .pdb contiene adems
de la estructura informacin acerca del proceso utilizado Para su obtencin. Existen diferentes programas
para visualizar los archivos .pdb (estructuras de protenas) uno de los ms populares es el Rasmol y el
que utilizaremos en esta prctica es el VMD (que es gratis y puede bajarse de la red).
i) Inicializacin del VMD: Ejecute desde el Men Inicio de Windows el programa VMD. Si todo anduvo
bien deberan aparecer 3 ventanas. La ventana VMD Main, es la ventana de control del programa, y
funciona como cualquier programa de Windows. La ventana VMD OpenGL Display es donde se
representara la protena y la otra no la utilizaremos.
Para cargar nuestro primer archivo, vamos en VMD-MAIN: File-New Molecule- Aparece una nueva
ventana que nos permite buscar los archivos, seleccionamos el archivo peptido1.pdb y lo abrimos con
los comandos open y luego load. Si todo anduvo bien aparecer la protena representada en la
ventana VMD OpenGL Display
ii) Manejo de VMD Display: Al cargar una protena, esta aparecer inicialmente representada por
Lneas (cada lnea representa una unin covalente entre 2 tomos, que estn en los vrtices). Adems el
programa representa los diferentes tomos de diferente color. La convencin es: Carbono-Cian (o
celeste-verdoso), Nitrgeno-Azul, Oxgeno-Rojo, Hidrgeno-Blanco, Azufre-Amarillo, etc.

13

En la ventana VMD Display podemos, mover la molcula, moviendo el Mouse con el botn
izquierdo apretado. Existen tres modos de movimiento Rotacin, Traslacin y Zoom, para cambiar a
cada uno de estos modos debemos presionar las teclas R, T o S, respectivamente. As, si estamos en le modo
rotacin y presionamos T, ahora al mover el Mouse la protena se trasladara lateralmente en la ventana
VMD Display (modo Traslacin). Prueben los tres modos!
iii) Selecciones y Representaciones. Menu: Graphical Representations
El VMD permite mostrar diferentes regiones o tomos de la protena de diferentes modos. Para acceder al
men correspondiente, vaya a VMDMain-Graphics-Representations, esto abrir el men de
Graphical Representations (GR).
El men GR permite manejar el tipo Drawing method y color Coloring method de cada una de las
representaciones. Cada representacin consiste en una seleccin de tomos o aminocidos. Inicialmente hay
una sola representacin all representada en Lines y coloreada por name. Para representar
molculas pequeas se suele utilizar lines, bonds o CPK (prubenlas!). En la zona central del
men GR se puede cambiar la seleccin de la representacin. Se pueden elegir aminocidos por su
nombre (ej: resname TYR) mostrara todas las Tirosinas, o por su nmero (Ej. resid 1) mostrar el primer
aminocido. Este comando acepta rangos (ej Resid 2 to 4) Mostrara los aminocidos 2 a 4. Otros comandos
son name (nombre de los tomos ej CA es el carbono alfa) o index nmero de tomo. Los comandos
de seleccin se pueden adems combinar con las variables lgicas AND, OR y NOT (Pruebe resid 2 to 4
and name N C CA O)
iv) Anlisis de grficos de Ramachandran
Como ya se vio en terica una manera de reducir la informacin contenida en la estructura de una protena, es
analizar la distribucin de los ngulos Phi/Psi en un grfico de Ramachandran. Para esto en el VMD
Main seleccione la opcin anlisis Ramaplot. Esto generar un grfico de Ramachandran de toda la
protena, al igual que para las selecciones y representaciones se puede elegir qu aminocidos se desea
mostrar en el grfico.
Tarea 1 a) Identifique los aminocidos que componen la protena peptido1, determine la secuencia
de la misma. b) Identifique algn enlace peptdico, qu puede decir de la disposicin espacial de los
tomos que lo componen? c) Identifique los grupos funcionales de los aminocidos y clasifique los mismos.
d) Coloree la protena con la opcin Res Type, esta opcin colorea aminocidos cidos-rojos,
bsicos-azules, hidrofbicos-blancos y los hidroflicos verdes, coincide el color con su clasificacin?
e) Analice los ngulos de Ramachandran para los diferentes aminocidos
Parte 2- Visualizacin de estructura secundaria e interacciones
Ahora pasaremos a tarea ms complicada, borre del VMD el peptido1, para esto en el men VMD Main
presiones sobre el nombre con el botn derecho del Mouse y elija Delete Molecule.
i) Cargue ahora el archivo Tcage.pdb, Trp-cage es una de las protenas ms pequeas que se conocen,
tiene solo 20 aminocidos (puede distinguir alguno?). Una manera de analizar globalmente una
protena con el VMD es representarla simplificadamente (sin detalle atmico) para esto elija la
representacin New Cartoon, en el men GR. (A partir de ahora siempre usaremos esto para representar
protenas globalmente)
Visualice la protena globalmente e intente identificar elementos de estructura secundaria, -hlice, hoja- o
loops. Debera poder identificar una -hlice, seguida de un loop, seguida de una zona desordenada. Para
saber la identidad de un aminocido en la pantalla, presione tecla 1. Ahora si usted aprieta el botn
izquierdo del Mouse sobre una parte de la protena, el VMD le dir quin es. A modo de ejemplo cliquee
cerca del comienzo de la hlice, el VMD mostrara en letras verdes en pantalla: ASN1:CA, indicando
que el tomo seleccionado es el Carbono A, del aminocido Asparagina 1. Utilizando esta herramienta
determine la longitud de la hlice.

14

ii) Como hemos visto en terica, las protenas se mantienen plegadas debido a que existen
interacciones entre aminocidos, no contiguos. Una tipo de interaccin importante que mantiene unidas a
las protenas son los puentes de hidrgeno (PH). Vuelva a representar la hlice (resid 1 to 9) como lines
encuentra algn PH? Cree ahora en el men GR una nueva representacin, y seleccione drawing method
Hbonds, si todo anduvo bien los PH estarn representados como lneas punteadas, los ve ahora?. Vuelva a
representar la protena como New Cartoon y analice la disposicin de los PH en la hlice.
Nota: algunas versiones del VMD o para algunas protenas, la opcin drawing method Hbonds NO funciona,
en ese caso usted debe ser capaz de detectarlos basado en su conocimiento sobre lo que es un puente de
hidrgeno!
iii) Una de las interacciones ms importantes que mantiene unida la estructura de la protena es la llamada
interaccin hidrofobica. Esta consiste en la tendencia que tienen los aminocidos hidrofbicos de
agruparse para excluir ms eficientemente el agua. Para identificarlas tenga en cuenta que una
molcula de agua ocupa un volumen equivalente a una esfera de radio 1.4 Angstroms
aproximadamente. Por lo general en las protenas se encuentran grupos de aminocidos hidrofbicos
empaquetados apretadamente formando clusters. Utilizando la representacin lines de TrpCage
colorelos segn ResType, puede identificar alguna interaccin hidrofbica? Este tipo de
representacin tambin le debera permitir identificar interacciones carga-carga entre aminocidos positivos y
negativos respectivamente, fjese si encuentra alguna interaccin de este tipo.
Tarea 2 a) identifique en la protena TCage los elementos de estructura secundaria indicando que
aminocidos (identificados por su nmero) los componen (ejemplo Hlice 2 o B del residuo 20 AL 27)
b) identifique la caracterstica de los PH en y fuera de los elementos de estructura secundaria. (Indique entre
que tomos se forman, la distancia entre tomos pesados, la distancia del puente, el ngulo etc.) c)
Identifique interacciones hidrofbicas (indicando la naturaleza de los residuos que la componen y la distancia
de interaccin) y carga-carga d) Analice a) b) c) en la protena bloop.pdb e) Qu diferencias y
similitudes observa entre Tcage y bloop? f) Analice los ngulos de Ramachandran para los diferentes
tipos de estructura secundaria.
Parte 3- Identificacin y comparacin de Dominios de plegamiento (DP)
A la organizacin espacial de los elementos de estructura secundaria se los denomina dominios de
plegamiento (DP). Ms all de la conservacin de secuencia, muchas veces diferentes protenas, o protenas
de diferentes organismos, poseen el mismo DP. Y muchas veces protenas con el mismo DP realizan la
misma funcin o una funcin similar. Es por eso que el anlisis del DP permite agrupar y clasificar las
protenas en base a su estructura. La creatividad de los investigadores resulta en que adicionalmente los
DP posean nombres muy simpticos como sandwich-, o barril-.
Tarea 3 Suponga que usted es un investigador dedicado a clasificar protenas de acuerdo a su DP. Un
colega le envi las protenas A.pdb hasta X.pdb clasifquelas en los siguientes grupos: (consejo, pruebe
colorear las estructuras segn Structure)
2 hlices enrolladas; Hoja torcida rodeada de hlices; Barril ; sandwich de 3/3 hojas ; Manojo de 4
hlices; Barril / ; Sndwich de 3/3 -hlices.
Parte 4- Interaccin protena sustrato
Como sabemos de experiencias anteriores muchas protenas, son enzimas. Una de las caractersticas
ms importantes de las enzimas es cmo interactan con su sustrato. Comprender la interaccin

15

protena-sustrato es un paso clave en el desarrollo de frmacos, ya que estos muchas veces se unen a la
protena en el mismo lugar que el sustrato y de una manera similar, bloqueando el acceso del mismo a la
enzima e inhibiendo su fundn. Otro tema importante en enzimologa consiste en conocer cmo las
enzimas catalizan la reaccin qumica. Muchas veces las enzimas necesitan para realizar esta funcin de la
ayuda de cofactores, como son iones o molculas orgnicas de tamao medio. Como ya estudiamos en
IBMyC los bilogos (los qumicos si no lo saben le pueden preguntar a un compaero y/o docente) la amilasa degrada el almidn (un hidrato de carbono) utilizando un in cloro como cofactor. Estudiemos ahora
su estructura.
El pdb que estudiaremos corresponde a la estructura de -Amilasa con un anlogo de HdeC como inhibidor.
Tarea 4) a) Cargue en el VMD el archivo, amilasa.pdb qu puede decir del fold global? (y del tamao?)
b) El anlogo de sustrato (inhibidor) lleva el nombre de residuo ALM y el cloro Cl, puede identificar
dnde se encuentran en la protena (sugerencia represntelos como VDW sobre la protena representada como
New Cartoon), Por qu cree que la enzima no fue cristalizada con el sustrato real?) b) Es usted capaz de
darse cuenta por qu el anlogo de sustrato no es reactivo?
Para analizar la interaccin Enzima sustrato analizaremos visualmente slo esa parte de la protena. Para
esto en el Menu GR seleccione una representacin within 5 of resname ALM como Lines. Una
2da Representacin resname Cl como VDW, y una 3ra resname ALM como bonds.
c) Cuntos monmeros posee el polisacrido?, qu puede decir sobre la interaccin -amilasa sustrato?,
qu tipos de interacciones son las principales en este caso? d) Qu y cules son los residuos responsables de
mantener al Cl en su lugar?, Le sorprende esto? e) Cuntas (y cules) interacciones carga-dipolo
forma el Cl en el sitio activo de la -amilasa? f) Identifique el enlace reactivo del sustrato, cmo se dio
cuenta cul era? (si no lo logra pregunte al docente)
Tmese ahora 5 minutos para pensar y responda g) Cul es el posible mecanismo de reaccin?, quin es
el residuo responsable? Cmo lo demostrara experimental y tericamente?

16

TRABAJO PRCTICO IV
PURIFICACIN ENZIMTICA
Purificacin parcial de la enzima -aminolevulnico dehidrasa
(Parte 1: extraccin, tratamiento trmico y salting out)
Introduccin
La enzima -aminolevulnico dehidrasa (ALA-D) cataliza la condensacin de dos molculas de
cido -aminolevulnico (ALA) para dar el monopirrol porfobilingeno (PBG), que es precursor
aromtico de las porfirinas y otros compuestos tetrapirrlicos.

Esta enzima se encuentra ampliamente distribuida en animales, plantas y microorganismos; es

citoplasmtica, termoestable y sulfhdrica. En casi todos los sistemas estudiados el mximo de actividad
slo puede ser demostrado en presencia de compuestos tilicos como el -mercaptoetanol (Me), cistena o glutatin, solos o combinados con zinc. La actividad se pierde rpidamente por exposicin
al aire debido a la oxidacin de los grupos sulfhidrilo, por inhibicin de estos residuos con reactivos de
grupos -SH o metales pesados, o por desplazamiento del zinc por plomo o por quelacin con EDTA.
El ALA-D es una enzima oligomrica de PM 280.000, que consta de 8 subunidades similares
de PM 35.000. Se ha encontrado que, dependiendo de las condiciones experimentales, puede formar
fcilmente agregados consigo misma dando lugar a la existencia de especies de distinto PM en
equilibrio. La estructura mnima necesaria para la actividad es un dmero de PM 70.000 formados por dos
tipos distintos de subunidades que, aunque tienen similar composicin, juegan distintos roles en la
sntesis de PBG.
El PBG obtenido por accin del ALA-D, es sustrato de otra enzima que cataliza la formacin
de un anillo tetrapirrlico, el cual luego de algunas descarboxilaciones, se convierte, por insercin de un
tomo de hierro, en el hemo, grupo prosttico de varias protenas importantes (hemoglobina, mioglobina,
catalasas, peroxidasas, citocromos, etc.). En plantas, al incorporar magnesio, da lugar a la formacin de
clorofila.
En este trabajo prctico se aislar, purificar parcialmente y caracterizar la enzima ALA-D proveniente
de hgado de cerdo.
Objetivos
- Entender y poner en prctica los conceptos de purificacin y rendimiento.
- Aprender a seleccionar las condiciones para, mediante el estudio de la velocidad de una
reaccin enzimtica, conocer y comparar cantidades enzimticas en una mezcla proteica.
- Construir un cuadro de purificacin a partir de los resultados obtenidos en cada etapa y analizar la
eficiencia alcanzada en cada una.
17

a) Purificacin inicial de ALA-D: extraccin, tratamiento trmico y salting out

Materiales

Fuente enzimtica: hgado de cerdo

Buffer de extraccin: buffer fosfato de sodio 20 mM pH 6,8 + NaCl 0,15 M + Me 10 mM.
Buffer de resuspensin del precipitado de sulfato de amonio: buffer fosfato de sodio 50 mM pH
6,8 + -Me 10 mM
Buffer de incubacin: buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8
Sustrato: ALA en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8
Solucin desproteinizadora: CuSO4 ss (solucin saturada)
Reactivo de Ehrlich: 2 gr de p-dimetilaminobenzaldehdo disueltos en 25 mL de HCl (c) y 75
mL de cido actico glacial.
-Mercaptoetanol 200 mM y concentrado (14,34 M).

Metodologa
Durante el proceso de purificacin del ALA-D se deber tener especial cuidado de mantener
las muestras enzimticas en fro para reducir la actividad de proteasas.
La secuencia de etapas a seguir para lograr la purificacin parcial del ALA-D de hgado de cerdo
es:

1. Homogenato: El hgado se corta en pequeos trozos y se homogeneza en una licuadora en relacin

1:5 en el buffer de extraccin (1 g de tejido: 5 mL de buffer). Se centrifuga a 5.000 g durante 5
minutos, el sobrenadante resultante se denomina Fraccin H. Cada comisin comienza la
purificacin a partir de 30-35 mL de este homogenato. Reservar 1 mL para medir actividad,
protenas y para electroforesis.
2. Sobrenadante: La Fraccin H se centrifuga 15 minutos a 15.000 g, el precipitado se descarta y
el sobrenadante constituye la Fraccin S. Reservar 1 mL para medir actividad, protenas y para
electroforesis.
3. Tratamiento trmico: La fraccin S se divide en dos partes de igual volumen y se calientan a dos
temperaturas diferentes cada una. Se elegir (a indicacin del docente) alguna T (t1) entre 45, 55
75C para una de las fracciones y t2: 62C para la otra, con agitacin constante, en un bao
de agua, manteniendo cada una de estas temperaturas durante 2 minutos y, luego, se enfra
inmediatamente en un bao de hielo. Se centrifuga 15 minutos a 15.000 g descartndose el
precipitado y guardndose los sobrenadantes (Fracciones C1 y C2), al que se les agrega -Me hasta
una concentracin final de 10 mM. Reservar 1 mL para medir actividad, protenas y para
electroforesis.

18

4. Fraccionamiento con (NH4)2SO4: A la fraccin C2 se le adiciona sulfato de amonio

finamente dividido hasta llevarlo a 55% de saturacin, manteniendo el pH entre 6,8 7,0 por la
adicin de hidrxido de amonio si fuera necesario. Se deja agitando durante 20 minutos y luego
se centrifuga a 15.000 x g durante 15 minutos. El precipitado se resuspende en 5 mL de buffer de
resuspensin, rotulndolo como Fraccin P. Reservar esta fraccin para medir actividad y
protenas y para electroforesis y tamiz molecular.

b) Determinacin de la actividad de ALA-D y de protenas totales

Sobre una alcuota de cada fraccin aislada se proceder a determinar la cantidad de ALA-D
midiendo su actividad y la masa de protenas totales mediante el mtodo de Bradford.
Medicin de actividad enzimtica
Metodologa
La incubacin se realizar a 37 C y en aerobiosis durante 30 minutos. Cada mezcla de
reaccin contendr la enzima, su correspondiente sustrato y el buffer de incubacin adecuado, en la
proporcin que sigue:
Buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8, hasta completar un volumen
final de 1 mL.
-Me 200 mM, 0,1 mL.
ALA (8,35 mg/mL), 0,1 mL.
Solucin enzimtica: 0,1 - 0,5 mL, dependiendo de la fraccin
enzimtica.
De detendr la reaccin agregando 0,1 mL de CuSO4 ss (solucin saturada), se agitar
vigorosamente y se centrifugar durante 15 minutos a 3.000 r.p.m. El producto de la reaccin (el
PBG) se determinar en el sobrenadante. Para ello, ste se trasvasar a otro tubo y se le agregar 1
mL del reactivo de Ehrlich y se agitar inmediatamente. Se leer absorbancia a 555 nm entre los
8 y 15 minutos. Con estos datos, la cantidad de PBG en cada reaccin podr determinarse a
partir de la Ley de Beer, siendo el coeficiente de absorcin molar del PBG igual a 113.6
mL/mg.
Se define 1 Unidad Enzimtica (UE) como la cantidad de enzima que cataliza la
formacin de 1 nmol de PBG por hora de reaccin en las condiciones descriptas (1 UE= 1 nmol
PBG/h). Dato: PM del PBG = 226.
Determinacin de protenas totales
Metodologa
La cantidad total de protenas presentes en cada fraccin se cuantificar empleando el
mtodo de Bradford. En aquellos extractos en que hubiera -Me en el medio, se
realizarn los correspondientes blancos de reactivos en presencia de dicho compuesto.
Bibliografa
Mauzerall. D. and Granick, S. (1956) J. Biol. Chem. 219, 435
19

Moore. D. J and Labbe.R F. (1964) Clin. Chem. 10, 1105

.

Tomio, J. M. y San Martn de Viale, L. C. (1972) Bioqumica Clnica. VI 217

,

Apndice - Determinacin de PBG

La determinacin de PBG se basa en su reaccin con el p-dimetil-aminobenzaldehdo (DMAB
o reactivo de Ehrlich) en solucin cida para formar un compuesto rojo. El mecanismo de la reaccin
puede verse en la figura 1.

A temperatura ambiente y en solucin cida, un mol del pirrol reacciona reversiblemente con un
mol de aldehdo, formando un producto de condensacin rojo inestable (ecuacin I).
Treibs y Herrmann, estudiando esta reaccin, han demostrado que el mecanismo es ms complejo
y que, posteriormente, tienen lugar otras transformaciones. As, el compuesto de condensacin
coloreado adiciona una molcula ms de pirrol, dando como producto un dipirrilfenil- metano sustituido,
incoloro. Esta reaccin II es reversible.
Finalmente, como puede verse en la ecuacin III, el complejo incoloro puede perder
dimetilanilina, transformndose, a su vez, en un dipirrilmeteno, cuyo espectro de absorcin se ha corrido a
longitudes de onda ms cortas.
El color rojo que se desarrolla en la reaccin I aumenta muy rpidamente en intensidad,
dependiendo de las condiciones experimentales; alcanza un mximo y disminuye luego, muy
lentamente.

20

TRABAJO PRCTICO V
PURIFICACIN ENZIMTICA
Purificacin parcial de la enzima -aminolevulnico dehidrasa
(Parte 2: Filtracin molecular)

Objetivos
- Aprender cmo utilizar el tamao (o, ms precisamente, el radio hidrodinmico) de una molcula
para separarla de otros componentes de una mezcla.

Materiales

Dextran-Blue (Azul Dextrano) Solucin de CoCl2

Solucin de BaCl2
Reactivo de Bradford
Buffer fosfato de sodio 50 mM.

Metodologa
1) Determinacin del Volumen Excluido (V0) y del Volumen Total (Vt) de la columna a utilizar.
Esta primera etapa constituye la calibracin de la columna. Debern utilizarse dos compuestos, uno
de alto peso molecular cuyo Volumen de Elucin (Ve) determinar el V0 de la columna y otro de muy
bajo peso molecular y cuyo Ve determinar el Vt. El primero ser Dextran-Blue y, el segundo, cloruro de
cobalto.
Se deber recordar lavar con agua destilada (lquido con el que se equilibr la columna) la matriz
antes de utilizarla y nunca dejarla secar. A su vez, el volumen de muestra a sembrar deber ser entre un 5
y un 10% del Vt de dicha columna (10 mL aprox.). Previo a la siembra se agregar sacarosa a la muestra
para reducir fenmenos difusivos que puedan ocurrir durante la misma.
El eluido se deber colectar en fracciones de a 0,5 mL a la vez que se agrega continuamente agua
destilada a la columna (OJO! El tiempo de goteo debe ser entre 12 y 15 seg.). La elucin concluir
cuando se haya colectado todo el cloruro de cobalto que se haba sembrado en la columna.
Una vez colectadas las fracciones, se asignarn unidades arbitrarias de intensidad de
coloracin (azul para el Dextran-Blue y roja para el cloruro de cobalto) a cada fraccin colectada.
La representacin de la intensidad de color en funcin del volumen al que fue eluida cada fraccin
(Ve) ser el cromatograma o perfil de elucin a partir del cual podr leerse el V0 y Vt de la
columna utilizada.

21

2) Desalado de una muestra proteica

Utilizando la columna calibrada en 1), se desalar la fraccin proteica P obtenida en la Parte I de
purificacin del ALA-D, luego de la precipitacin con sales.
La metodologa a seguir ser la misma que la empleada al calibrar la columna. La elucin finalizar
una vez que haya salido de la columna un volumen igual al Vt determinado en 1) + 2 mL.
Sobre 2 alcuotas de cada fraccin recolectada se proceder a detectar, en la primera, presencia
proteica por la tcnica de Bradford (a 50 L de eluido se le agregan 500ul del reactivo de Bradford) y, en la
segunda, presencia de sales. Para esto ltimo se deber agregar cloruro de bario (BaCl2) 1:1 a una alcuota de 50
L de cada fraccin proteica colectada. El BaCl2 forma un precipitado blanco en presencia de iones sulfato (por
la formacin de sulfato de bario, insoluble).
Finalmente se asignarn unidades arbitrarias de cantidad de protenas y de sales a cada fraccin y se
confeccionar el cromatograma correspondiente para evaluar la eficiencia del desalado, el cual tambin deber
analizarse en funcin del obtenido en 1).
Se reservar el tubo con mxima cantidad de protenas y mnima de sales para sembrar en un gel de
SDS-PAGE, en el Trabajo Prctico VIII.

Bibliografa
P.Andrews, Biochem. J. (1964) 91: 222.
P. Flodin, J. Chromat. (1961) 5: 103.
M. Paget and P. Coustenoble, Ann. Biol. Clin. (1966), 24: 181.

22

TRABAJO PRCTICO VI
PURIFICACIN ENZIMTICA
Intercambio inico

Objetivos
- Conocer cmo una propiedad especfica de una molcula tal como su carga neta puede
aprovecharse para aislarla de otras que presenten una carga diferente.
- Aprender a elegir la combinacin de medios (resinas y buffers de siembra y elucin) necesaria para
optimizar la separacin requerida.

Materiales

Resina de intercambio inico DEAE-celulosa equilibrada en buffer fosfato de sodio 25mM pH 6,8.
Buffer de siembra: Buffer fosfato de sodio 25 mM pH 6,8.
Buffer de elucin: Buffer fosfato de sodio 25 mM pH 6,8 + NaCl 0,65 M.
Solucin de albmina srica bovina (5 mg/mL).
Solucin de lisozima (5 mg/mL).
Reactivo de Bradford.

Metodologa
Cada grupo recibir 5mL de una suspensin de DEAE-celulosa en buffer fosfato de sodio 25
mM pH 6,8 , a la que se deber agregar la mezcla proteica a separar (lisozima:BSA, 1:1).
Comenzar, entonces, la incubacin en batch que permitir la interaccin de las protenas con
la resina. Para una ptima homogeneizacin se deber agitar lenta y continuamente la suspensin, a
temperatura ambiente, durante el tiempo de incubacin (5min. aproximadamente).
Finalizada la incubacin se deber volcar la suspensin sobre una columna colocada en su
correspondiente soporte (puede resultar til, en este paso, agregar 2 mL ms de buffer de siembra a
la suspensin para facilitar el pasaje de la misma a la columna). Una vez hecho esto ya se podr
sembrar la muestra y comenzar a pasar buffer de siembra por la columna para, as, obtener el
percolado de la misma.
Posteriormente debe procederse a la elucin de la columna con el buffer correspondiente.
Es importante destacar que las fracciones colectadas de la columna no deben exceder 1m de
volumen.
Por ltimo, deber determinarse la presencia proteica en cada fraccin mediante la coloracin
de Bradford.
Los resultados obtenidos podrn graficarse mediante un cromatograma o perfil de elucin, a
partir del cual se lograr inferir el punto isoelctrico de cada una de las protenas de la mezcla.

23

TRABAJO PRCTICO VII

CINTICA ENZIMTICA
Estudios cinticos de la enzima -aminolevulnico dehidrasa
Introduccin
El objetivo de llevar a cabo estudios cinticos es establecer las caractersticas del mecanismo de
reaccin y determinar parmetros cinticos (mediante estudios de velocidades iniciales) y analizar de qu
forma distintos compuestos (en este caso cido levulnico) pueden actuar sobre la cintica de la reaccin. En
la mayora de los tejidos estudiados, el ALA-D responde a una cintica Michaeliana, con valores de Km
que se encuentran en el rango de 7,7 x 10-5 M a 1,0 x 10-3 M.
Este estudio implica llevar a cabo mediciones de velocidades iniciales (nmoles de PBG formados
por hora de incubacin) variando la concentracin de sustrato (ALA). En primer lugar evaluaremos como vara
la formacin de producto con el tiempo de incubacin para una concentracin constante de sustrato. En base
a los resultados obtenidos surgir como conclusin si la velocidad de la reaccin permanece constante
con el tiempo no. En caso afirmativo los valores de velocidades iniciales podrn obtenerse empleando un
nico tiempo de incubacin. El estudio de velocidades iniciales se llevar a cabo empleando como extracto
enzimtico el sobrenadante S y C, con fines comparativos. Por otro lado se determinar el Km y la V mxima
de la enzima determinando la velocidad inicial de a distintas concentraciones de ALA y realizando un grfico
directo y luego uno grfico de dobles recprocas (Lineweaver-Burk). Por ltimo se hallar la constante de
inhibicin (Ki) del cido levulnico, un inhibidor de la ALA-D de hgado de cerdo.
Objetivos
- Conocer cmo puede estudiarse la cintica bsica de una enzima y calcularse sus parmetros
Michaelianos.
- Estudiar el efecto que un inhibidor ejerce sobre la cintica enzimtica.

Materiales

Fuente enzimtica: hgado de cerdo

Buffer de la incubacin: buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8
Sustrato: ALA en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8
Solucin desproteinizadora: CuSO4 ss (solucin saturada)
Reactivo de Ehrlich (pipetear bajo campana): 2 gr de p-dimetilaminobenzaldehdo disueltos en 25
mL de HCl (c) y 75 mL de cido actico glacial.
-Mercaptoetanol (concentrado) (14,34 M) (pipetear bajo campana).

Metodologa
1) Formacin de producto en funcin del tiempo
Empleando como extracto enzimtico el sobrenadante S y C (alrededor de 0,15 ~ 0.25 mL), una
concentracin de ALA constante de 3 mM, -Me 20 mM y buffer de incubacin hasta completar un
volumen final de 1 mL, se incubar a 37C y en aerobiosis durante 0, 10, 20, 30 y 45 minutos. La reaccin se
detiene por el agregado de 0,1 mL de solucin saturada de CuSO4 y el producto (PBG) se cuantifica de la
manera habitual, (ver purificacin del ALA-D). Preparar los tubos rotulados de acuerdo al protocolo que
deber completarse previa realizacin de la prctica.

24

Tabla 1:
Tubo
1
2
3
4
5
Benzima

t de incubacin
(min)
0
10
20
30
45
45

Enzima
(mL)

ALA 10 mM
(mL)

-Me 200 mM
(mL)
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1

Buffer
(mL)

A555

En todos los tubos pipetear en primer lugar el buffer, (-Me y la enzima. En los
correspondientes a tiempo cero de incubacin (nicamente) agregar 0,1 mL de solucin saturada de CuSO4
para inactivar la enzima. Luego se pipetea el sustrato con lo cual comienza la reaccin. Hasta el
momento de colocar en el bao de incubacin los tubos deben mantenerse en hielo.
Cuestionario
Por qu se realizan los ensayos a tiempo cero?
Cual ser el volumen final de estos tubos y por qu?
Los tubos a tiempo cero se colocan en el bao a 37C? Justifique sus respuestas.
Actividades:
Hacer los grficos de producto formado vs. tiempo de incubacin e interpretar, variaron dichos grficos con
distintas concentraciones de ALA?, en caso afirmativo justificar.

2) Actividad de ALA-D en funcin de concentracin de sustrato: determinacin de Km y Vmx.

Se determinar la formacin enzimtica de PBG para siete concentraciones de sustrato, luego de 30
min de incubacin. Se emplear como extracto enzimtico al sobrenadante S (alrededor de 0,15 mL - 0,25
mL). Se preparan tubos rotulados de acuerdo al protocolo. El volumen de incubacin ser de 1 mL y
la concentracin de -Me 20 mM. La reaccin se detiene y el producto se cuantifica de la manera
habitual.
Ver el protocolo de incubacin en la tabla 2, los primeros tubos que no contienen inhibidor
corresponden a la determinacin de Km
Actividades:
*Para cada concentracin de sustrato determinar vi en unidades de nmoles PBG formado / h.
*Realizar un grfico vi vs. [ALA] y 1/vi vs 1/S y determinar los parmetros cinticos.
3) Estudios de inhibicin por cido levulnico.
Dada la similitud estructural entre ALA y cido levulnico, este ltimo es un potente inhibidor
del ALA.

25

Segn la tabla que se muestra a continuacin, una concentracin cido levulnico 0,6 mM produce
una inhibicin de alrededor el 50%, mientras que la prdida de actividad es casi total con concentraciones
mayores de 4 mM.

cido levulnico
(mM)
0
0,2
0,4
0,6
1
2
4
6

Actividad especfica
porcentual (%)
100
83
59
48
35
19
8
4

Efecto del cido levulnico sobre la

actividad del ALA-D de hgado de cerdo.
Para caracterizar el tipo de inhibicin por cido levulnico se mide la actividad de ALA-D en presencia de distintas
concentraciones de ALA para dos concentraciones diferentes de inhibidor. Se emplea como extracto
enzimtico el sobrenadante S (0,1 mL) y las condiciones estndar de incubacin (1 mL de volumen de
incubacin y [-Me] = 20 mM). La reaccin se detiene y el producto se cuantifica de la manera habitual,
luego de 30 minutos de incubacin.

El protocolo a seguir para el punto 2) y 3) se adjunta a continuacin en la tabla 2:

Tabla 2:
tubos
Benzima
1
2
3
4

ALA ALA
(mM) 10 mM
----0,05
0,10
0,25
0,50

c. lev.
(mM)
0
0
0
0
0

c. lev. 5 mM
(mL)

-Me 200 mM
(mL)

enzima

buffer
(mL)

A555

0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
26

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21

0,75
1,00
3,00
0,05
0,10
0,25
0,50
0,75
1,00
3,00
0,05
0,10
0,25
0,50
0,75
1,00
3,00

0
0
0
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50

0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1

Actividades:
* Para cada concentracin de inhibidor, determinar vi en nmoles de PBG formado/ hora al variar la
concentracin de sustrato.
* Caracterizar mediante grfico de inversas el tipo de inhibicin. Estimar Ki.

27

TRABAJO PRCTICO VIII

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES
DESNATURALIZANTES

Introduccin

Un mtodo muy comn para la separacin de protenas es la electroforesis en geles de

poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) descripto por Laemmli y
colaboradores (1970). La separacin de protenas por SDS-PAGE es utilizada con distintos fines
tales como la estimacin del peso molecular de las mismas, la determinacin de la abundancia
relativa de las principales protenas en una muestra, para evaluar la pureza de una muestra proteica
o el progreso de un proceso de fraccionamiento o purificacin.
Generalmente se utiliza un sistema discontinuo de geles como medio soporte lo que permite,
en general, una mejor resolucin de las protenas deseadas. Dicho sistema consta de un gel
separador y otro, que se encuentra por encima de ste, llamado gel concentrador el cual posee los
pocillos de carga de la muestra. En este sistema, los geles son generados a partir de dos buffers de
pH diferentes: 8.8 para el gel separador y 6.8 para el concentrador. Adems, a diferencia de una
electroforesis nativa, en este sistema se utiliza un detergente aninico llamado dodecil sulfato
sdico (SDS) que desnaturaliza protenas y les imprime una densidad de carga (carga/masa)
negativa y uniforme entre todas ellas. Por su parte, el poro presente en el gel depender del
porcentaje de acrilamida (%T) y del porcentaje del entrecruzador, la bisacrilamida (%C). Una vez
polimerizada, la poliacrilamida tiene la particularidad de frenar selectivamente el pasaje de
molculas ms voluminosas por sobre el de las ms pequeas. Luego de finalizada la corrida
electrofortica, la tincin del gel con un colorante para protenas permite la visualizacin de las
bandas proteicas obtenidas.
Debido a que la relacin carga/masa es uniforme entre todos los complejos polipptido
desnaturalizado-SDS, la velocidad de migracin de las protenas depende casi exclusivamente de
la masa molecular relativa (PM) de las mismas. En un gel de densidad uniforme, la distancia de
migracin relativa de la protena (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo de su PM. Si se
realiza una corrida electrofortica de protenas de PM conocido junto con muestras incgnita, una
vez determinados todos los Rf se puede calibrar el sistema graficando el logaritmo del PM vs. Rf
de las muestras conocidas y estimar as el PM de las protenas incgnita por interpolacin.

Objetivos
- Aprender a utilizar un mtodo electrofortico para separar los componentes de una mezcla en
funcin de su peso molecular.
- Determinar el peso molecular de una protena incgnita.
- Utilizar la tcnica de electroforesis como una herramienta para seguir el avance de un proceso de
purificacin proteico.
- Comprender las diferencias entre tcnicas electroforticas en condiciones nativas y desnaturalizantes.

Materiales
28

SE DEBER CONOCER LA PELIGROSIDAD DE LAS SUSTANCIAS A UTILIZAR.

Acrilamida / bis (30% T, 2.67 % C)

Acrilamida
29.2 g
Bis-acrilamida 0.8 g
Volumen total 100 mL
Buffer de corrida: Tris 25 mM - glicina 192
mM - SDS 0.1%. pH: 8,3 (5X)
Para 1 L de buffer:
Tris Base................................15 g
Glicina ............................................. 72 g
SDS................................................ 5 g
Para usar diluir 1:5 con agua destilada.
Buffer Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 (1X): 90.75 g de Tris y ajustar el pH a 8.8 con HCl 4 N.
Llevar el volumen a 500 mL con agua destilada.
Buffer Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 (1X): 15.13 g de Tris y ajustar el pH a 6.8 con HCl 4 N.
Llevar el volumen a 250 mL con agua destilada.
Buffer de siembra:
Agua destilada
Tris-ClH 0.5 M pH:6.8
Glicerol
SDS 10% (p/v)
Azul de Bromofenol 0.1% (p/v)
-mercaptoetanol
Volumen total

4.8 mL
1.2 mL
1.0 mL
2.0 mL
0.5 mL
0.5 mL
10.0 mL

Solucin fijadora:
Solucin de cido tricloroactico al 12.5 %
Reactivos para tincin con Coomassie Brilliant Blue:
a) Coomassie Brilliant Blue R-250 0.15% en solucin de Metanol (30%): cido
actico (10%).
b) Solucin para desteir: cido actico 7%: metanol 5%.
Standards de peso molecular (1ug/ ul):
Protena
Fosforilasa b
Seroalbmina bovina
Ovoalbmina
Anhidrasa carbnica
Inhibidor de tripsina

PM
97.400
66.000
45.000
30.000
20.100
29

Lactalbmina

14.400

Metodologa
1. Preparacin de las placas de vidrio:
Limpiar bien las placas de vidrio con alcohol y una vez secas colocarlas en los armadores
interponiendo los separadores correspondientes entre ambas. La placa de vidrio ms grande es la posterior.
Mover las llaves laterales del armador y asegurarse que queden firmemente sujetos al soporte.
2. Preparacin de los geles.
Se corrern geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 15% y 10% de T con SDS segn la tcnica
de Laemmli.
Gel separador:

Acrilamida/bis (stock
30%T/2,67%C)
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8
SDS 10% p/v
H2O destilada
APS 10%
TEMED
Volumen total

Gel separador 15%T

4,05 mL

Gel separador 10%T

2,7 mL

2 mL
80 L
1.82 mL
40 L
6 L
8 mL

2,0 mL
80 L
3,17 mL
40 L
6 L
8 mL

Cargar los geles con aproximadamente 4 mL de la solucin de gel separador y luego adicionar
suavemente H2O destilada en la parte superior con una piseta, para evitar el contacto con el oxgeno del aire.
No moverlos hasta que gelifiquen, lo cual se ver por la formacin de una interfase. Mientras esto ocurre
prepare la solucin correspondiente al gel concentrador. Una vez polimerizado vuelque el H2O destilada.
Gel concentrador 4%:

Acrilamida/bis (stock 30%T/2,67%C)

Tris-HCl 0.5 M pH: 6.8
SDS 10%w/v
H2O destilada
APS (persulfato de amonio) 10%
TEMED
Volumen total

0.53 mL
1 mL
40 L
2.41 mL
20 L
4 L
4 mL

Llenar la parte superior con la solucin de gel concentrador. Colocar inmediatamente los peines en
la parte superior evitando la formacin de burbujas y cuidando que queden derechos.
Tener en cuenta en los pasos previos que una vez agregado el persulfato de amonio (APS) y el
TEMED comenzar la reaccin de polimerizacin.
30

3. Armado de las cubas.

Retirar el peine y colocar la placa en la cuba de electroforesis colocando el vidrio delantero hacia la
parte interna de la cuba.
Llenar la cuba con el buffer de corrida y proceder al sembrado de las muestras.
4. Preparacin y siembra de las muestras.
Se seleccionan muestras correspondientes a las diferentes etapas del esquema de purificacin
de la enzima ALA-D. Se siembran en distintos carriles cuidando de sembrar la misma cantidad de protena
en todos ellos. Tambin se sembrarn standards de peso molecular (5-10 g de cada uno).
Por otro lado, se sembrar una protena homognea (5-10 g) cuyo peso molecular deber
determinarse a partir de la calibracin realizada con los standards (de ser posible, sembrados en
carriles adyacentes).
Se tratan las muestras y los estndares de peso molecular con igual volumen del buffer de siembra.
Calentar 5 minutos a 100C, enfriar y sembrar 20 l como mximo (es decir, 10 L de muestra con 10
L de buffer de siembra). La muestras deben tener una concentracin de protenas entre 20-30 g/ 10
L.
5. Corrida electrofortica.
Se conecta la cuba a la fuente de poder y se corren a 80 V-1/2 hora y 130 V
aproximadamente 1 hora, hasta que el colorante llegue a la parte inferior del gel.
6. Fijacin y tincin con Coomassie Blue.
Se desarma la cuba, se retira el gel de las placas de vidrio y se mide la distancia recorrida por el
colorante. Se procede a la fijacin y tincin de las bandas proteicas.
Se agrega la solucin del colorante Coomassie Blue (tincin rpida), se deja al menos 30 minutos y
se destie con solucin lavadora hasta que las bandas proteicas sean visibles. Si los geles no se van a
teir luego de la corrida fijarlo con TCA 12.5 % durante 1 hora o ms.
Una vez finalizada la coloracin correspondiente, se evaluar el avance del proceso de purificacin
logrado y se determinarn los Rf de los standards y de la protena incgnita.

Bibliografa
- Neville, D.M. J.Biol Chem. (1971) 246: 6328-6334.
- Laemmli, U.K. Nature (1970) 227: 680- 685.
- Merril, C.R., Harrington, M., Alley, V. Electrophoresis (1984) 5: 289-297.
- Blum, H., Beier, H., Gross, H.J. Electrophoresis (1978) 8: 93-99.

31

TRABAJO PRCTICO IX
ESTUDIO DE LA INTERACCIN LIGANDO-PROTENA
Introduccin
El mtodo de Bradford puede ser utilizado, no solamente para determinar la concentracin de
protena en una solucin, sino tambin para determinar el nmero total de sitios de interaccin de la protena con el
colorante y, a partir de este dato, hacer predicciones acerca de la estructura primaria de una protena.
Objetivos
- Utilizar un colorante para el estudio de la interaccin proteica con su ligando.
- Determinar el nmero de sitios de unin para el colorante presentes en una molcula proteica.
Materiales

Coomassie Brilliant Blue G-250 0,7 x 10-4 M.

Albmina srica bovina.

Metodologa
Utilizando el mtodo para la determinacin de protenas con el colorante Coomassie Blue se deber
determinar el nmero total de sitios de unin para el colorante (n) en la molcula proteica. El nmero de sitios se
correlaciona con el nmero total de argininas y lisinas en una determinada protena.
Experimento 1: Determinacin de libre para el colorante
La absortividad para el colorante libre puede obtenerse por la Ley de Beer en las condiciones de
ensayo, utilizando cantidades variables de colorante, llevando a un volumen de 2,0 mL con el
solvente del reactivo. Luego completar a 3,0 mL con agua desionizada y determinar la absorbancia.
Protocolo de trabajo:
tubo
B
1
2
3
4
5

colorante (mL) solvente de reactivo (mL) agua (mL)

0
2.00
1
0.50
1.50
1
1.00
1.00
1
1.50
0.50
1
1.75
0.25
1
2.00
0
1

A620

Experimento 2: Determinacin de unido para el colorante

La absortividad molar del complejo protena-colorante puede calcularse agregando a una dada
solucin del colorante, cantidades variables de protena. Se partir de una solucin madre de protena de 10 mg
protena/mL, de la que se tomarn volmenes crecientes y se completar hasta 1,0 mL con agua desionizada
cuando fuese necesario. Luego se agregar 0,4 mL de colorante 10-4 M. Finalmente se agregar 1,6 mL de
solvente de reactivo para completar el volumen total a 3 mL. Deben esperarse 15 minutos antes de su
lectura en el espectrofotmetro.
La absortividad del colorante unido puede obtenerse de la siguiente manera: se realiza un grfico de
(1/A) versus (1/cantidad de protena) a una concentracin fija de colorante. La extrapolacin a cero
(concentracin infinita de protena) permite determinar el mximo de absorbancia (Amx.) para el colorante
unido, porque todas las molculas del colorante estarn unidas a la protena en estas condiciones. El cociente
32

Amx./CTotal dar la absortividad molar requerida ( unido).

Protocolo de trabajo
tubo
protena (10 mg/mL)
(mL)
B
0
1
0.05
2
0.075
3
0.1
4
0.2
5
0.3

agua
(mL)
1.0
0.95
0.925
0.9
0.8
0.7

colorante
(mL)
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4

solvente de reactivo
(mL)
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6

A620

Experimento 3: Curva de calibracin para protena

El anlisis estndar se lleva a cabo utilizando 2,0 mL del reactivo y cantidades variables de protena,
a partir de una solucin acuosa de 0,5 mg protena/mL, ajustando el volumen total a 3,0 mL con agua
desionizada. La cantidad de protena puede variarse entre 0 y 50 g. Todas las mediciones de
absorbancia se realizarn contra agua destilada, luego de mezclar bien y dejando incubar la mezcla por 15
minutos, por lo menos.
Para cada muestra, se calcular el A sustrayendo la absorbancia del blanco conteniendo colorante
pero no protena, del valor obtenido para la muestra conteniendo protena. Se construir la curva de
calibracin correspondiente.
Nota: Por qu si Ud. ya realiz una curva de protenas por el mtodo de Bradford, debe ahora realizar
una nueva curva?
Protocolo de trabajo

B
1
2
3
4

protena (0,5 g/mL)

(mL)
0
0.02
0.04
0.06
0.08

agua
(mL)
1
0.98
0.96
0.94
0.92

colorante
(mL)
2
2
2
2
2

0.1

0.90

tubo

A620

Determinacin de n
Se utilizarn los datos obtenidos en los tres experimentos anteriores para calcular este parmetro.
Las deducciones matemticas desarrolladas en el apndice muestran que:

medio =

A
P (unido libre)

En los experimentos 1 y 2 fueron calculados libre y unido respectivamente. La pendiente de

la curva de calibracin del experimento 3 corresponde al valor de A/P. Cules deben ser las unidades
33

de P? Qu operaciones permiten expresar P en las unidades correctas?

Para completar el informe los alumnos debern obtener el nmero de residuos Lisina + Arginina de la
seroalbmina bovina. Para ello, debern:
- Ingresar en el sitio: http://au.expasy.org
- Elegir en Tools and software packages: Primary structure analysis y, una vez dentro de esta
parte, elegir ProtParam.
- Dentro de esta herramienta, en la ventana que indica Search Swiss-Prot/TrEMBL escribir en for
bovine albumin y presionar Go.
- Al aparecer el resultado de la bsqueda, elegir ALBU BOVIN (P02769) Una vez dentro de la pantalla de resultado, elegir [Sequence]
- Dentro de la pantalla de secuencia, buscar Sequence analysis tools: ProtParam
- Dentro de la pantalla de ProtParam tool, hacer clic en SUBMIT
Finalmente comparar los resultados tericos con los experimentales.

Apndice Deducciones matemticas

La ecuacin que permite describir la unin del colorante puede ser alcanzada mediante una
aproximacin basada en la ley de Beer. Para la absorbancia inicial (Ao), antes del agregado de protena,
podemos escribir:
Ao= libreCtotal
donde libre es la absortividad molar del colorante libre y Ctotal es la concentracin total del colorante. Se
considera que el paso de la luz es de 1 cm.
Luego del agregado de la protena, la absorbancia final (Af) es igual a la suma de las
contribuciones de ambos: el complejo colorante-protena y el colorante libre residual, como sigue:
Af = Alibre + Aunido
Af = libreClibre + unidoCunido
donde Clibre es la concentracin del colorante residual libre y Cunido es la concentracin del colorante unido a
la protena.

34

Una suposicin que se hace en este momento es que la absortividad molar del colorante unido
es la misma para todas las clases de sitios de unin. Si las cadenas laterales de ambos, arginina y
lisina, unen al colorante, esta suposicin puede no ser cierta.
El principio de conservacin del colorante requiere que:
Ctotal = Clibre + Cunido
El cambio en absorbancia, a la longitud de onda medida, est dado por la diferencia Af Ao de
manera que:

A = Af Ao
A = libreClibre + unidoCunido libreCtotal
A = libreClibre + unidoCunido libre (Clibre + Cunido)
A = libreClibre + unidoCunido libreClibre libreCunido
A = unidoCunido libreCunido
A = Cunido (unido libre)
Cunido =
A
(unido libre)
Esta ecuacin puede ser expresada en trminos de medio, definido como el nmero de molculas
unidas de colorante por molcula de protena. Este parmetro puede, por lo tanto, escribirse como:

medio =

Cunido
P

donde P es la concentracin molar de protena. Las unidades de concentracin de C y P deben ser las
mismas para que el nmero de sitios sea adimensional.
Sustituyendo, podemos escribir:

medio =

A
P(unido libre)

Podemos observar que, disponiendo de los parmetros libre y unido y, determinando el A para una
concentracin proteica en particular (P), el nmero medio de molculas de colorante, unidas por molcula
de protena, puede ser encontrado. Si las condiciones son tales que la protena se encuentra saturada con
el colorante, todos los sitios de unin estarn ocupados y este nmero ser igual a n, el nmero total de
sitios de unin.

35

TRABAJO PRCTICO X
REGULACIN DE LA ACTIVIDAD DE NITRATO REDUCTASA
Introduccin
El nitrgeno juega un papel clave en la produccin agrcola. Todas las plantas se nutren de las
diferentes formas de nitrgeno existentes en el suelo, pero hay dos de ellas que representan el mayor
porcentaje; el amonio y el nitrato. El mejoramiento de los suelos agrcolas deficientes en nitrgeno se
logra mediante las diferentes tcnicas de fertilizacin nitrogenada, con la utilizacin de urea, nitratos y sales
amoniacales o amoniaco gaseoso, manufacturadas con un alto costo.
El nitrgeno que es tomado bajo la forma de nitrato, es reducido a amonio antes de entrar en el
camino biosinttico de los aminocidos; las enzimas responsables de este proceso son la nitrato reductasa
(NR) y la nitrito reductasa (NiR), catalizando la siguientes transformaciones:

NO-3

NR
NiR
NO 2 NH+4 Aminocidos

En los tejidos verdes la asimilacin del nitrato esta ntimamente asociada a la fotosntesis, no
solo por el suplemento de factores de reduccin, sino tambin por proporcionar los compuestos carbonados
requeridos para la sntesis de aminocidos.
La reduccin del nitrato es un paso limitante por el hecho de que el mismo se puede acumular
en los tejidos de la planta sin causar ningn efecto deletreo, y el nitrito y el amonio no se pueden almacenar.
Por lo tanto la incorporacin de nitrgeno proveniente de la reduccin del nitrato para la sntesis de
aminocidos es controlada por la actividad regulatoria de la NR por ser:
1) La primer enzima del camino biosinttico.
2) Inducible por el sustrato.
3) Ser relativamente inestable tanto in vivo como in vitro cuando la planta est sometida a stress hdrico o
de temperatura.
4) Su actividad relativa con respecto a las otras enzimas del camino biosinttico es baja y su Km
para nitrato es alta.
Existe una correlacin positiva entre la actividad NR y el crecimiento de la planta y con el contenido
de protena en los granos.
El suplemento de nitrato induce la actividad de la NR y al desarrollo de peroxisomas y por lo
tanto se acepta que el nmero de estos ltimos esta relacionado con la actividad de la NR.
EL PAPEL DE LA LUZ EN LA ACTIVIDAD DE LA NR
Un gran nmero de organismos heterotrficos como, por ej., los hongos, asimilan el nitrato en
oscuridad haciendo uso del poder reductor generado por la oxidacin de la glucosa. Similarmente
en las plantas superiores, en los tejidos no fotosintticos como las races, se produce la asimilacin del
nitrato en oscuridad utilizando los fotosintatos provenientes de los tejidos verdes. Sobre esta base
podramos pensar que la luz no juega un rol directo, sin embargo se sabe que la reduccin del nitrato se
acelera considerablemente en presencia de luz.
De trabajos de investigacin realizados por distintos autores se sabe que:
1) La luz aumenta la actividad de NR.
2) La luz estimula el transporte de nitratos desde el lugar de almacenaje hasta el pool
metablico, en las clulas vivas (hojas).
36

3) La luz es necesaria para la induccin de la sntesis de la NR.

4) La luz activa la NR inactivada preexistente.
5) La fotosntesis provee el poder reductor para la reduccin del nitrato.
Caractersticas de la NR
La NR presenta niveles diferentes de actividad y cantidad de enzima segn la especies y rganos
en los cual se ha determinado, sin embargo, por la misma razn, la cantidad de enzima extrada varia. Las
ms altas actividades se han obtenido en los tejidos cloroflicos.
Para estudiar la NR es fundamental considerar:
1)
2)
3)
4)

La especie
La variedad dentro de la especie
La edad de las planta s
L as t c n i c a s d e c u l t i v o

Como la enzima es inducible por el sustrato y exhibe una variacin diurna, las ms altas
actividades se obtienen cuando las plantas estn creciendo con altos contenidos de nitrato y expuestas
a un fotoperodo adecuado. La menor actividad se ha registrado al final del periodo de oscuridad.
La edad de los tejidos tiene un efecto marcado sobre la actividad en algunas especies, pero no en
otras, dependiendo de la especie, ya que el mismo tejido de distintas especies puede mostrar el mximo
de actividad a edades diferentes. La enzima es capaz de utilizar NADH o NADPH como donante de
electrones y esto depende de la especie sin embargo en ciertas especies coexisten ambas formas.
- Peso molecular:
El peso molecular es muy variable oscila entre 25.000 (en hojas de Perilla) a 600.000 (en hojas de Trigo).
- Afinidad por el sustrato:
La Km para Nitrato es del orden de 0,2 mM
- Especificidad por el cofactor
Los valores de Km para NADH son del orden de 2,5 M
- Requerimientos de flavinas
El FAD es constituyente de la enzima en algunas especies, incrementando la actividad de la enzima en un
50% a concentraciones de 0,1 M de FAD o 3,7 M de FMN segn el caso, cuando los piridn
nucletidos son los dadores de electrones.
- Metales
La NR de plantas contiene molibdeno. Su funcin radica en la participacin del transporte de electrones
.En algunas especies la enzima posee como grupo proteico al citocromo b557.
- Fosfatos
Ciertas especies requieren ortofosfato que facilitara la reduccin de molibdeno formando un complejo
con l.
- Inhibidores
Se inhibe ante la adicin de pCMB en concentraciones de 1 mM a 1 M en sistemas en los cuales el donante
de electrones es un piridn nucletido. La cistena y el glutatin del orden de 5 a 100 veces protegen a la
enzima contra la inhibicin. La enzima es sensible a reactivos que reaccionan con metales; el cianuro y
la azida son efectivos mientras que los agentes orgnicos quelantes dan diferentes grados de inhibicin.
Atabrina inhibe la enzima a concentraciones de 5 mM. No es inhibida por el monxido de carbono ni
por los fluoruros.
- Localizacin celular

37

Es una enzima citoplasmtica, aunque algunos investigadores opinan que tambin la han hallado en
cloroplastos.
- Induccin
Es inducida por nitratos en plantas enteras y tejidos y por molibdeno en tejidos provenientes de plantas
que crecen con deficiencia en molibdeno.
- Estabilidad
La enzima es relativamente estable tanto in vivo como in vitro; posee una vida media que varia segn
la especie y condiciones, entre 4 y 15 horas. Sin embargo parcialmente purificada y a -20C puede
conservar su actividad hasta 3 meses.

Objetivos
- Comprender el papel regulatorio de los factores ambientales sobre la actividad de un sistema
enzimtico vegetal.
- Estudiar el efecto que un cofactor ejerce sobre la actividad de la enzima que lo utiliza.
- Abordar el estudio de la regulacin enzimtica desde dos modelos experimentales diferentes: in
vivo e in vitro.

Materiales

Solucin de Hewitt.
NO2 Na 100 M.
Sulfanilamida (1% en HCl 1,5 N (p/v)).
Naftil-etilendiamina (0,02%; p/v)
Buffer fosfato pH 7,5 50 mM
NO 3 K 200 mM
Tritn X-100 0,1%
GSH 5 mM
EDTA 5 mM
Casena 1,5%
Polivinilpirrolidona 1,5%

Metodologa

1)Curva de calibracin de nitrito

Se efectuar una curva utilizando el nitrito de sodio en concentraciones de 2,5-30 nmol.
Reactivos
nmoles de KNO2
2,5
5
10
20
30
KNO2 100 M (mL)
Agua
Sulfanilamida (1% en HCl 1,5 N; p/v)
Naftil-etilendiamina (0,02%; p/v)
Esperar 15 minutos
A540nm

1
1

1
1

1
1

1
1

1
1

B
----1,5
1
1

A540nm
38

2) Determinacin de actividad enzimtica de NR

Se harn crecer plantas de trigo en arena, previamente lavada, con una solucin nutritiva adecuada
(de Hewitt), con KNO3, y un control sin fuente de nitrgeno, durante 15 das (hasta que
las plantas alcancen 10 a 15 cm de altura). Se emplearn 2 plantas para cada tratamiento.
Dos das antes, una de las macetas se pondr en condiciones de oscuridad.
Determinacin in vitro
Se pesarn 1,5 g de hojas de trigo de plantas crecidas a la luz en presencia y ausencia de nitrato, se
cortarn en trozos pequeos y se rompern suavemente en un mortero previamente enfriado en hielo con 8
mL de buffer de extraccin. Se filtrar a travs de un trozo de tela de algodn, y ese homogenato ser
utilizado para la determinacin de actividad. La experiencia se realiza segn el protocolo que se indica,
empleando dos concentraciones de sustrato diferentes.
Buffer de extraccin:
Buffer fosfato de K pH 7,5
GSH
EDTA
Casena
Polivinilpirrolidona

50 mM
5 mM
5 mM
1,5%
1,5%
Hojas

Buffer PO4(K) 0,2 M pH

7,5
KNO3 0,1 M
NADH 1 mM
Enzima
H2O

Control
(mL)
+NADH
-NADH
0,5
0,5

Bk
Nitrato
(mL)
+NADH
-NADH
0,5
0,5

(mL)
0,5

0,1/0,2
0,1/0,2
0,1/0,2
0,1/0,2
0,2
0,4
-----0,4
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0,9
0,9
0,9
----------0,4
-----0,4
1,3
Incubacin: 60 minutos a 30C.
Acetato de Zinc 1 M
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
Centrifugar 20 minutos a 5000 r.p.m. Tomar sobrenadante con pipeta Pasteur.
Sobrenadante
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
Sulfanilamida
1
1
1
1
1
-Naftil-etilendiamina
1
1
1
1
1
15 minutos a t ambiente
A 540nm
A540nm
moles / 60 minutos
UE / gr. tejido

39

Determinacin in vivo
El tejido de las plantas conteniendo o suplementado con carbohidratos cuando es inmerso en una
solucin que contiene nitratos y en condiciones de oscuridad, es capaz de acumular y liberar nitritos al
entorno.
Se tomarn 0,5 gr de hojas de trigo cortadas en trozos pequeos y se colocarn en un
Erlenmeyer de 50 mL con 5 mL de buffer de infiltracin. Tapar con tapn de goma y hacer vaco.
Buffer de infiltracin:
Buffer fosfato pH 7,5
KNO3
Tritn X-100

1 mM
200 mM
0,1%

Las incubaciones se harn en oscuridad (se forrar el Erlenmeyer con papel metlico) y se incubar a 30C
durante 1 hora con una agitacin suave. Sobre distintas alcuotas del incubado se determinar concentracin de
nitrito.
a) NR en plantas crecidas en distintas condiciones

Alcuota
Agua
Sulfanilamida
-Naftil-etilendiamina
A540nm
moles / 60 minutos
UE / gr. tejido

Control
(mL)
Luz
Oscuridad
0,2
0,4
0,2
0,4
1
1

1
1

1
1

1
1

Nitrato
(mL)
Luz
Oscuridad
0,1
0,2
0,1
0,2
1
1

1
1

1
1

1
1

b) Actividad de NR en funcin del tiempo de incubacin

En las plantas crecidas a la luz y en presencia de nitrato se efectuarn ensayos in vivo empleando
tiempos de incubacin diferentes y concentracin de NO3K en el medio de infiltracin:
200 mM. Se retirarn alcuotas de los tubos de ensayo a 30, 60, 90 y 120 minutos de incubacin
determinndose en ellas la concentracin de nitrito.
Nitrato 200 mM
30
60
90
120
Alcuota
0,1
0,1
0,1
0,1
Agua
1,4
1,4
1,4
1,4
Sulfanilamida
1
1
1
1
Naftil-etilendiamina
1
1
1
1
A540nm
moles / 30 minutos
UE / gr. tejido
- Realizar un grfico de nmoles de producto vs. tiempo de incubacin.
Bibliografa
1) Methods in Enzymology Vol. XXIII (1971) pag 1491 y Vol. LXIX (1980) pag 272.
2) H. J. Evans y A. A. Nason. Plant Physiol. 28 (1953) 233.
3) L. Veevers y col. Biochim. Biophys. Acta 89 (1964) 453.4) E. J. Hewitt y D. J. D. Nicholas en
Modern Methods in Plant Analysis. Springer. Berlin 1964
4) L. E. Schrader y col. Plant Physiol. 43 (1968) 930.
5) J. Imsande y B. Touraine Plant Physiol. 105 (1994) 3
40

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Pg. 1 de 1 (Reglas bsicas de Higiene y Seguridad en laboratorios de Qumica y Biologa Procedimientos ante Emergencias - 2007)

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Pg. 2 de 2 (Reglas bsicas de Higiene y Seguridad en laboratorios de Qumica y Biologa Procedimientos ante Emergencias - 2007)

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Pg. 3 de 3 (Reglas bsicas de Higiene y Seguridad en laboratorios de Qumica y Biologa Procedimientos ante Emergencias - 2007)

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Pg. 5 de 5 (Reglas bsicas de Higiene y Seguridad en laboratorios de Qumica y Biologa Procedimientos ante Emergencias - 2007)

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