Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Relatório de Bioquímica
FOTOCOLORIMETRIA E ESPECTROCOLORIMETRIA:
FRACIONAMENTO DAS PROTEÍNAS DO LEITE
E SUA DOSAGEM PELO MÉTODO DO BIURETO
1. Introdução ..........................................................................................................................2
1.1. Métodos Fotocolorímetros ................................................................................................2
1.2.Curva padrão ......................................................................................................................4
1.3. Procedimento para montagem de uma curva padrão ........................................................4
1.4. Métodos para quantificação de proteínas totais ................................................................4
1.5.Método do Biureto para determinação de proteínas ..........................................................5
1.6. Proteínas presente no leite ................................................................................................5
2. Objetivos .............................................................................................................................6
4. Metodologias ......................................................................................................................7
4.1. Precipitação Isoelétrica da Caseína ..................................................................................7
4.2. Diluição do leite para a dosagem das proteínas totais ......................................................8
4.3. Curva de calibração e dosagem de proteína .....................................................................8
6. Conclusão ..........................................................................................................................12
7. Bibliografia ......................................................................................................................13
A = ε.l.c
onde:
A = absorbância é definida pela reação seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma razão, não
possui unidade (Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz transmitida);
ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm)-1;
l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm;
c = concentração da substância em mol/L.
Onde:
T= tranmissão ou transmitância;
Io= intensiadade do feixe luminoso incidente;
It= intensidade de feixe luminoso transmitido ou emergente;
a= coeficiente decádico de absorção ou extinção;
c= concentração da solução;
I= espessuara da solução.
• Relacionar os métodos fotocolorimétricos às situações onde poderão ser aplicados, tendo como
exemplo a dosagem de proteínas do leite pelo método da reação do biureto.
a) leite desnatado;
b) água destilada.
4. METODOLOGIA
a) Colocou-se 10mL de leite com 10mL de água destilada morna em um béquer de 50mL;
b) foram acrescentados 2mL de solução de ácido clorídrico a 2%, gota a gota, com constante
agitação até atingir o ponto isoelétrico da caseína, que corresponde ao pH 4.6, no qual o leite
coagula;
c) o pH foi medido com o auxílio de um papel indicador universal;
d) anotou-se o volume de HCl 2% gasto;
e) após sedimentação do precipitado, filtrou-se o material por papel;
f) o filtrado foi utilizado para a dosagem de proteína que não precipitaram nas condições acima
descritas.
a) Diluiu-se 0,5mL de leite em 9,5mL de água destilada à temperatura ambiente (proporção 1:20);
OBS.: Neste trabalho PF refere-se a proteínas do filtrado; PT, proteínas totais e (PT-PF) à
quantidade de caseína.
Obs.: É necessária a limpeza externa da cubeta que recebe as soluções do tubo 2 ao tubo 8 usando
papel higiênico, a fim de não afetar o valor da absorbância registrada pelo fotocolorímetro. A partir
do tubo 6 é necessário lavar as cubetas. Além disso, a troca das cubetas deve ser instantânea para o
aparelho não se descalibrar.
Tubo mg/ml 1 2 3 4 5 6 7 8
Luz absorvida 0,0 0,04 0,07 0,10 0,14 0,18 0,09 0,09
Tabela 5.1- resultados obtidos no fotocolorímetro
Lembrando que o tubo 7 contém o material solúvel restante após a precipitação da caseína e
que primeiramente o leite foi diluído para 20mL (o dobro do volume inicial), a concentração
encontrada para esta amostra ( Tabela 5.1 ) deve ser multiplicada por 2 para se ter a quantidade real.
Esperava-se obter um resultado entorno de 85% de caseína, como está escrito na literatura.
Supõe-se que o esperado não ocorreu devido a um erro de pipetagem, onde, ao se adicionar o ácido
HCl 2% em excesso, o pH ficou mais ácido do que o necessário, fazendo com que o ponto
isoelétrico da lactoalbumina que é entre 4,2 e 4,5, fosse atingido também, e esta, então, estaria
presente no precipitado juntamente com a caseína que possui seu ponto isoelétrico muito próximo
(pI = 4,6). O mesmo já não ocorre com a lactoglobulina que contém o pI aproximadamente igual a
5,2.
As curvas de calibração são determinadas através dos resultados obtidos por esses aparelhos.
Onde inicialmente há sempre um solução, considerada o branco, onde não está diluído nele o
material em estudo, no caso as proteínas, e as demais soluções aumentam gradativamente a
concentração deste material, gerando assim um gráfico de conc. (mg/ml) X absorvância, formado
por uma reta, já que é diretamente proporcional o aumento das variáveis.
LIMA, CAROLINA & SAGIO, SOLANGE. Curvas padrões para determinação de açúcares
redutores, açúcares solúveis totais, proteínas e aminoácidos. Universidade Federal de Lavras,
departamento de biologia. Lavras MG, agosto de 2007.