PROTOCOLO DE INVESTIGACIN

Aislamiento y seleccin de cepas de Lactobacillus spp. nativas del municipio de

Montera para su empleo como probitico en la salud y produccin de porcina.
Ttulo: Efecto probitico de Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis y
Lactobacillus plantarum en los indicadores biolgicos de cerdos en crecimiento-engorda.

INVESTIGADOR
PRINCIPAL
COINVESTIGADOR

Cesar
Augusto
Hurtado
Cecilia Lara Mantilla

Betancur

15956.418

3002134359

betanci@yaho
o.com

63`280.089

7821639

Lara_mantilla_
cecilia@hotma
il.com

Tu iras como investigador invitado (Yordan Martinez Y)

RESUMEN DEL PROYECTO

El uso indiscriminado de los antibiticos como promotores de crecimiento en las producciones

intensivas porcinas pueden incrementar el nmero de cepas resistentes, as como transferir
resistencia cruzada a otros microorganismos, el reto es buscar nuevas alternativas para modelar y
maximizar la produccin animal. Con el objetivo de caracterizar las cepas de Lactobacillus spp.
nativas del municipio de Montera y evaluar su efecto probitico en la salud y produccin de
porcina, se desarrollar un experimento para aislar e identificar cepas de Lactobacillus en cerdos
aparentemente sanos. Adems, se determinar la accin probitica in vitro de estas cepas frente a
bacterias patgenas intestinales porcinas. Se valorar el efecto probitico in vivo de las bacterias
Lactobacillus spp. en los principales indicadores productivos de los cerdos, tambin se determinar
la incidencia, frecuencia, grado y causa de la diarrea. Por otro lado, se identificarn las variaciones
fisiolgicas en los cerdos alimentados cepas de Lactobacillus spp. tales como inmunoglobulinas,
conteo sanguneo completo, aminocidos, lpidos, prostanglandinas, electrolitos y status cidobsico. Se evaluar el efecto de cepas de Lactobacillus spp. en el peso relativo de las porciones
comestibles y la calidad de la carne de cerdos, as como las variaciones en el peso de los rganos y
vsceras, morfometra intestinal, pH, exclusin competitiva y produccin de cidos grasos voltiles.
Este proyecto de investigacin obtendr a partir de cepa probiticas, un nuevo suplemento
alimenticio para la produccin porcina, lo que incrementar los indicadores productivos y reducir
el sndrome diarreico (sobre todo despus del destete) mediante una exclusin competitiva en el

TGI y modulacin del sistema inmune, sin el uso de antibiticos preventivos convencionales, a su
vez mejorar la calidad del producto final, con disminucin de los lpidos perjudiciales e
incremento de carne magra. Los indicadores verificables obtenidos de este proyecto de
investigacin, se evidenciarn en la divulgacin de los principales resultados en revistas de alto
impacto (A1), presentacin de Congresos, Eventos y/o Reuniones cientficas internacionales y
escritura de un libro sobre la temtica.|
1.

PROBLEMA Y SU JUSTIFICACIN

En las producciones intensivas actuales, los cerdos estn sometidos a diferentes

situaciones de estrs que provocan desbalances en la microbiota intestinal, desarrollo de
microorganismos patgenos, inmunosupresin, ineficiente conversin de los alimentos y
disminucin de la respuesta zootcnica; por lo que constituye un reto sustituir el empleo de
antibiticos como preventivos por bacterias benficas, sobre todo nativas con posible
efecto nutracutico, que mejoren la salud y reduzcan el riesgo de contraer enfermedades
digestivas, como principal causa de mortalidad y desbalance nutricional.
La satisfaccin de las necesidades nutricionales en los seres vivos es una condicin
indispensable para la vida; el hombre a travs del tiempo ha hecho una seleccin de los
alimentos atendiendo a su entorno, las condiciones alimentarias que ste ofrece y los
recursos tcnicos disponibles para satisfacer estas necesidades (Martnez et al., 2013).
El consumidor moderno busca alimentos con caractersticas nutritivas excepcionales y que
a la vez aporte salud y bienestar, es por eso que las caractersticas cualitativas de los
alimentos son de carcter prioritario (Lee et al., 2012).
Por las caractersticas biolgicas del cerdo, en cuanto a la productividad numrica, ritmo
de crecimiento y hbitos alimenticios es considerado entre los animales ms eficientes
para producir carne y satisfacer las necesidades nutritivas del hombre, por lo que
desempea un papel protagnico en el mundo. No obstante, la produccin porcina a nivel
mundial, al igual que otros sectores de la produccin animal, est sufriendo una profunda
transformacin, determinada por las demandas del consumidor sobre la industria
alimentaria para la produccin de alimentos de calidad. De igual forma, en la bsqueda
de alternativas para la produccin y comercializacin de carne, se presta cada vez mayor

atencin al cerdo como fuente estable y saludable de protenas para la alimentacin

humana. Este sector porcino supone el 30% del producto final agrario (Meja et al. 2007).
En los nuevos esquemas de produccin, los lechones que han sido destetados precozmente
(entre 15 y 28 das de edad) son sometidos a tensiones ambientales y nutricionales,
provocando la proliferacin de bacterias patgenas intestinales (Escherichia coli
Clostridium perfringens y Salmonella typhimurium), sndrome diarreico, retraso en el
crecimiento y trastornos en su sistema inmunolgico, as como aumento de la morbilidad y
mortalidad alrededor del 41% de la camada (Meja et al., 2007, Kong et al., 2007a; Kong
et al., 2007b; Liu et al, 2008).
Los antibiticos se han suplementado en las dietas de los cerdos para corregir los
problemas del tracto gastrointestinal mediante el incremento de los indicadores
productivos y la reduccin de la incidencia de la diarrea (Wang et al., 2011). Sin embargo,
en los ltimos aos, ha habido un mayor inters para eliminar o minimizar el uso de
antibiticos a niveles subteraputicos en la ganadera como promotores de crecimiento,
debido a que los antibiticos pueden incrementar el nmero de cepas resistentes, as como
transferir resistencia cruzada a otros microorganismos (Martnez et al., 2013) .
En este sentido, las investigaciones destinadas a obtener nuevos aditivos promotores del
crecimiento alcanzan cada da ms desarrollo, a raz de la prohibicin de los antibiticos
(Wenk, 2003; Carro & Ranilla 2005). Al respecto el 28 de mayo de 1999, el CDC de la
Comisin Europea emiti un dictamen sobre la resistencia hacia los antibiticos. Esta
comisin sealaba la necesidad de una rpida actuacin a fin de reducir el uso global de
los agentes antimicrobianos de una manera equilibrada en todas las reas: medicina
humana, medicina veterinaria, cra de animales y productos fitosanitarios. Por lo que se
deban realizar estudios sobre los sectores ms crticos (en particular la produccin de
cerdos y pollos de ceba), a fin de reducir las posibles prdidas econmicas o el incremento
en el uso de los antibiticos para tratamientos prescritos por un veterinario y disponer de
otras clases de aditivos utilizados como factores de crecimiento. Por tal razn, en la
actualidad existe una tendencia, cada vez ms creciente, a la utilizacin de aditivos ms
inocuos, como los probiticos (Gutirrez et al. 2002).

En los ltimos aos, el uso de probiticos en la profilaxis y terapia de enfermedades

gastrointestinales ha sido objeto de gran inters y de controversia cientfica. Hoy en da se
reconoce la importancia y posible eficacia de la terapia bitica (probiticos y prebiticos)
como herramienta mdica en el tratamiento de enfermedades digestivas (Nava et al., 2004).
En este sentido, a partir de 1908, Metchnikoff, evalu las facetas benefactoras de los
Lactobacillus, para posteriormente en 1974, proponer el trmino de "probiticos" en
contraposicin al de antibiticos, ya que la primera acepcin hace referencia a los efectos
favorables de la vida (Garca, 2004). Por otro lado, Fuller (1989) define a los probiticos
como suplementos alimenticios microbianos vivos, que afectan beneficiosamente al animal
husped mejorando su equilibrio microbiano intestinal.
El uso de probiticos en las estrategias de alimentacin animal ha ganado favorables
criterios en muchos sectores acadmicos (Wang et al., 2011). En los animales,
especialmente Bacillus y Lactobacilum se han utilizado como aditivos en la dieta, con el
objetivo de promover el peso vivo, salud intestinal, digestibilidad de los nutrientes,
capacidad antioxidante, inmunidad y disminucin de la incidencia de la diarrea (Kalavathy
et al., 2003; Saxelin et al., 2005). Estos efectos positivos son provocados por una exclusin
competitiva de bacterias patgenas por una eficiente colonizacin de bacterias benficas en
el tracto gastrointestinal. Adems se logra la eliminacin de patgenos en el tracto
gastrointestinal, as como residuos de antibiticos y sustancias anlogas en productos
finales, lo que permitir expresar el potencia gentico del modelo animal en estudio (Marco
et al., 2006).
En cerdos los estudios han sido dirigidos a mejorar los sntomas de estrs, actuando como
un promotor natural del crecimiento, con aumento de la produccin y el estado general del
animal (Carceln et al., 2005). En casos de diarreas y prdida de peso, las colonias de
bacterias probiticas se reducen en poco tiempo, sin importar la causa. Por lo que
reincorporacin de dichas cepas probiticas lo antes posible podr contrarrestan los
microorganismo patgenos que son frecuentemente en la causa de la diarrea. Tanto la
duracin como la intensidad de los ataques de diarrea pueden ser reducida (Vera, 2007).

Por tal razn la aplicacin de las cepas probiticas de Lactobacillus collinoides,

Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum, como suplemento alimenticio de cerdos
post-destete en el departamento de Crdoba, Colombia contribuir de manera significativa
al mejoramiento de la sanidad animal y la produccin porcina en Colombia.
2. Hiptesis

Conociendo que las levaduras tienen efectos beneficios en la produccin y salud animal, el
empleo de Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum, como
suplemento dietticos en cerdos en crecimiento-engorda, pudiera mejorar los indicadores
productivos y la calidad del producto final, con reduccin de la incidencia de diarrea.
3. Objetivo general
Caracterizar las cepas de Lactobacillus spp. nativas del municipio de Montera y
evaluar su efecto probitico en la salud y produccin de porcina como
reemplazo de los antibiticos preventivos.

3,1 Objetivos especficos

Determinar la accin probitica in vitro (antimicrobiana) de Lactobacillus collinoides,

Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum frente a bacterias patgenas intestinales
procedente de cerdos en produccin.
Valorar si los principales indicadores productivos de los cerdos en diferentes etapas
productivas se modifican, cuando son alimentados con suplementaciones de
Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum.
Determinar la incidencia, frecuencia, grado y causa de la diarrea de cerdos (sobre
todo despus del destete) alimentados con suplementaciones de Lactobacillus
collinoides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum.
Identificar las variaciones hematolgicas de inmunoglobulinas, conteo sanguneo
completo, aminocidos, lpidos, prostanglandinas, electrolitos y status cido-bsico
en cerdos (sobre todo despus del destete) alimentados con suplementaciones de
Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum.
Evaluar el peso relativo de las porciones comestibles y la calidad de la carne de

cerdos

alimentados

con

suplementaciones

de

Lactobacillus

collinoides,

Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum.

Evaluar el peso relativo de los rganos digestivos y vsceras; as como la
morfometra, el pH, la exclusin competitiva de microorganismos y la produccin
de AGV en el TGI de cerdos alimentados con suplementaciones de Lactobacillus
collinoides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum.

4. MATERIALES Y MTODOS

4.1. Aislar e identificar las cepas de Lactobacillus spp. en heces de cerdos

aparentemente sanos en la etapa de crecimiento.

Cepas salvajes de Escherichia coli, Salmonella spp. y Staphylococcus spp, y cepas de Lactobacillus
spp con posible accin probitica se identificarn y se aislarn de cerdos en produccin en el
laboratorio GRUBIODEQ de la Universidad de Crdoba.
Todas las cepas patgenas se inocularn en caldo nutriente enriquecido y se incubarn en zaranda
termostatada (MAXQ-600) durante 18 h a 37 C, por otro lado, las cepas de Lactobacillus spp. se
cultivarn en caldo MRS por 18 horas a 37 oC, en condiciones estticas.
4.2. Determinacin de la actividad antimicrobiana in vitro de cepas de Lactobacillus

spp. Nativas del municipio de Montera.

De los cultivos de las cepas se tomarn 200 Ml, se inocularn en tubos con 20 Ml de agar nutriente
enriquecido (con 1 % de Ion-Agar, OXOID) a 45 C, luego se vertern en placas para su
solidificacin. En cada placa que contiene las cepas indicadoras se abrieran pocillos de 7 mm de
dimetro, en los que se depositarn 20 Ml de las variantes 1, 2 y 3 de la mezcla productora. Se
realizarn adems controles positivos con la mezcla M2 ms cido lctico 1N hasta alcanzar Ph 3 y
controles negativos con M2 a Ph 7. Las placas se mantendrn a 5 C por un tiempo de 4 h para una
mejor difusin de las sustancias en el agar. Luego se incubarn por 24 h a 37 C hasta detectar el
crecimiento y la aparicin de los halos de inhibicin. El dimetro de los halos se medir con una
regla milimetrada. A cada valor se le restar el dimetro de los pocillos (Prez et al., 2011).
4.3. Valorar si los principales indicadores productivos de los cerdos en diferentes

etapas productivas se modifican, cuando

suplementaciones de cepas de Lactobacillus spp.

son

alimentados

con

4.4. Ubicacin y ecologa experimental

La investigacin se desarrollar en las reas de experimentacin porcina de la Universidad de
Crdoba, Montera, Colombia y en las reas del Centro de Estudio de Produccin Animal de
la Universidad de Granma, Cuba. Se determinar la humedad relativa y temperatura

ambiental segn un termgrafo en las reas de investigacin.

4.5. Animales y tratamientos

Se utilizarn 150 cerdos destetados de forma precoz (mayor de 5.5 kg) hasta completar su vida
productiva, se ubicarn segn diseo completamente aleatorizado con 30 cerdos/tratamiento y 10
repeticiones/tratamiento. Las dietas se formularn segn Rostagno et al. (2011). Para la confeccin
de la dieta se emplear los siguientes alimentos: harina de maz, harina de torta de soya, premezcla
de minerales y vitaminas, sal comn, aminocidos sintticos, antioxidantes, aceite vegetal y polvo
de arroz. Los tratamientos experimentales se disearn como se muestra a continuacin:
Control negativo: Solo dieta convencional
Control positivo: Se utilizar un antibitico diettico (colistina 200 mg/kg)
Tratamiento 3: Cepa nativas de Lactobacillus spp. (1) (51011 CFU kg-1)
Tratamiento 4: Cepa nativas de Lactobacillus spp. (2) (51011 CFU kg-1)
Tratamiento 5: Cepa nativas de Lactobacillus spp (3) (51011 CFU kg-1)
4.6. Condiciones experimentales

El experimento se llevar a cabo de acuerdo con las directrices colombianas y cubanas para el
bienestar animal y el protocolo experimental.
Todos los corrales sern equipados con un comedero, un bebedero tipo de pezn y pisos de metal
expandido de plstico cubierto. Los correales tendrn las siguiente caractersticas: longitud de 0.5
m, ancho, 0.3 m y altura 0.4 m. El agua y la comida se ofertarn ad libitum.
4.7. Indicadores productivos

Todos los animales se pesarn semanalmente. El consumo de alimentos, EM y nutrientes de los

cerdos se medirn diariamente durante todas las semanas experimentales, mediante la diferencia
entre la pesada de la oferta y el rechazo. Se calcular la ganancia media diaria, la conversin
alimenticia y la viabilidad semanalmente.
5. Determinar la incidencia, frecuencia, grado y causa de la diarrea de cerdos (sobre
todo despus del destete) alimentados con suplementaciones de cepas de Lactobacillus
spp. nativas del municipio de Montera.
Se evaluar la incidencia, frecuencia y grado de la diarrea en los cerditos. Para esto se observar si
hay presencia de la misma a las 12, 24, 48, 72 horas y 15 das postdestete. La consistencia se
determinar con una escala de rangos del 0 al 3 (0= heces normales, 1= heces pastosas, 2= heces
semilquidas y 3= heces lquidas o acuosas). Si el valor de la escala es superior a 1 se considerar
como animal con diarrea. El grado, frecuencia e incidencia de diarreas se determinar de acuerdo a
la metodologa de Ding et al. (2011).
Para la determinar la causa de diarrea se tomarn muestras de heces fecales de animales diarreicos,
luego las muestras sern enviadas al laboratorio para realizar pruebas microbiolgicas.

6. Identificar las variaciones fisiolgicas: inmunoglobulinas, conteo sanguneo

completo, prostanglandinas, status cido-bsico, aminocidos, lpidos y
electrolitos.

6.1. Plasma sanguneo

De la vena yugular se tomar 20 mL de 5 cerdos/tratamiento y se le adicionar heparina sdica, se
centrifugar a 3000 rpm por 20 minutos a 20 C. Seguido, el status cido-bsico se determinar por
los anlisis de pH, PCO2, SB, BB y BE, mediante un equipo Astrup (Astrup, 1963).
Los leucocitos se analizarn por frotis sanguneo y colorante de giemsa; la hemoglobina, por el
mtodo Hemotest; el hematocrito segn Wintrobe y las protenas totales por Biuret, sern ledas
mediante un espectrofotmetro ultravioleta.
6.2. Suero sanguneo
Despus de la extraccin de sangre de la vena yugular de 5 cerdos/tratamiento, 15 ml de sangre se
depositarn en tubos sin revestimiento de plstico. Seguido las muestras de sangre se centrifugarn
a 8000 rpm y 4 C durante 10 min. Mediante Kit enzimticos se determinarn las IgG, IgM, IgA,
IgD e IgE, TNF, y la prostaglandina PG2.
Mediante un espectrofotmetro ultravioleta y Kit enzimticos se cuantificarn los electrolitos. Para
determinar los aminocidos sricos 1 ml de muestra y 2.5 ml de solucin de cido tricloroactico al
7.5% se mezclarn a fondo, seguido se centrifugar a 12.000 rpm y 4 C durante 15 minutos.
Despus, el fluido sobrenadante se recoger y la concentracin de aminocidos se determinar
mediante un analizador de intercambio inico AA.
Para determinar los lpidos totales, triglicridos, colesterol total, lipoprotenas de alta densidad
(LAD), lipoprotenas de baja densidad (LBD) y las lipoprotenas de muy baja densidad (LMBD), se
utilizarn mtodos enzimticos colorimtricos, mediante la utilizacin de Kits y un
espectrofotmetro ultravioleta. Tambin se calcular el ndice aterognico (IA), de acuerdo con la
relacin informada por Salma et al. (2007): IA=LBD/LAD.

7. Evaluar el peso relativo de las porciones comestibles y la calidad de la carne de

cerdos alimentados con suplementaciones de cepas de Lactobacillus spp.
nativas del municipio de Montera.
Al finalizar el experimento se sacrificarn 5 cerdos/tratamiento en un matadero comercial. Antes
del sacrificio los animales se mantendrn en ayuna durante 16 horas, solo con agua ad libitum
(Tern et al., 2004).
Se realizar un pesaje antes del sacrificio, despus del sacrificio se pesar la canal (costillar, grasa
perirrenal, lomo, solomo, paleta, lacn, jamn y panceta). Los diferentes cortes se separaron en
carne, grasa ms piel y hueso.
La calidad de la carne se determinar por la terneza, prdida de goteo, flacidez, prdida por
coccin, luminosidad, grasa dorsal (paleta, lomo y principio, centro y final del msculo glteo),

grasa intramuscular, pH (45 min y 24 horas post mortem) y humedad (Tern et al., 2004 y Snchez
et al., 2011).
En los msculos longissimus dorsi y semitendinosus de 5 cerdos/tratamiento se determinar la
materia seca, cenizas, protena bruta y extracto etreo segn la AOAC (2006). Los aminocidos y
los lpidos se determinarn segn la metodologa descripta en el acpite 5.4.
Para la calidad sensorial de la carne, se seleccionarn los msculos
longissimus dorsi y semitendinosus despus de la maduracin de la carne y se conformar
un panel de catadores con perfecto estado de salud, sin hbitos de fumar o consumidores habituales
de caf y/o bebidas alcohlicas, edades entre 20 y 55 aos. Se seguir la metodologa descrita por
Tan et al. (2009). Los parmetros para la calidad sensorial encuestados sern: Aroma (normal y
anormal), Sabor (normal y anormal), Dureza (Normal, dura, muy dura y muy blanda), Color
(Normal, plido e intenso).

8. Evaluar el peso relativo de los rganos digestivos y vsceras; as como la

morfometra, el pH, la exclusin competitiva de microorganismos y la
produccin de cidos grasos voltiles en el tracto gastrointestinal de cerdos
alimentados con suplementaciones de cepas de Lactobacillus spp. nativas del
municipio de Montera.
Despus del sacrificio, 5 cerdos/tratamiento se seleccionarn al azar para determinar el peso
absoluto y la longitud del esfago, estmago, intestinos delgado y grueso y ciego. Adems se
pesarn el corazn, hgado, riones, bazo y pncreas. Tambin, se tomarn y refrigerarn en
congelacin muestras de ciego para la determinacin del pH.
Pasados 24 horas del sacrificio, las muestras (ciego) se descongelarn hasta alcanzar la
temperatura ambiente, seguido se cortarn varias porciones de ciego y se homogenizarn en
forma de pasta en un mortero de parmela. Luego las muestras se pesarn en un vidrio reloj de 2 g,
se aadir 10 ml de agua destilada y se homogenizar en un vortex por 2 min. A esta preparacin se
le determinar el pH en un potencimetro digital Bantex modelo 300 A, calibrado con
soluciones buffer de pH 7 y 10.
Al sacrificio de los cerdos, se extraer 5 ciegos/tratamiento y mediante tcnica PCR a tiempo
real, se determinar Staphylococcus aureus, Lactobacillus salivarius, Ruminococcus forques,
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Salmonella typhimurium y
Clostridium lituseburens segn la metodologa descrita por Simpson et al. (1999). Los AGCC
totales e individuales (cido actico, propinico, butrico, valrico e isovalrico) se
determinarn por cromatografa gaseosa segn la metodologa de Abou-Donia et al. (2008).

1. Resultados esperados

 Obtener a partir de cepas probiticas, un nuevo suplemento alimenticio para cerdos en

crecimiento y establecer el mejor tratamiento.
Incrementar los indicadores productivos de los cerdos en las etapas productivas, debido
a su efecto promotor de crecimiento no antibitico.
Reducir la incidencia del sndrome diarreico, as como modular una mejor respuesta
inmunolgica y mayor circulacin de nutrientes sricos, por el incremento de una
exclusin competitiva en el TGI.
Mejorar la calidad de la carne de cerdos, por una reduccin de los lpidos perjudiciales
e incremento de los aminocidos esenciales.
Difundir la importancia de la aplicacin de los probiticos como suplemento
alimenticio, para el sector porccola.

6. Referencias
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