Biotecnologia de soja

Transgenia e
Marcadores Moleculares
rpriolli@usp.br

Melhoramento Gentico
Objetivo
Aumento da frequncia de genes ou de
combinaes genticas de interesse econmico,
atravs de ferramentas como cruzamentos e
seleo, para maximizar a produo nas condies
ambientais existentes

A soja resultado de um
longo processo de seleo
realizada pelo homem
Glycine soja
Glycine max

Biotecnologia
Aplicao dos mecanismos que
envolvem:

Tecnologia do DNA recombinante

Marcadores moleculares
Cultura de tecidos
Biologia celular e molecular
Informtica

Construindo um transgene

Plasmdeos e vetores

ocorrem naturalmente em algumas bactrias

so molculas de DNA dupla fita e circular
muitas vezes carregam genes para resistncia a antibiticos
tm replicao independente da replicao cromossmica

Caractersticas importantes dos

vetores
Hind III (11076)
S p h I (11 074)
Pst I (11 068)
S a l I (11 058)
Xb a I (11 052)
Ba mH I (11046 )
S ma I (11 043)
Kp n I (11 041)
S a c I (11 035)
EcoR I (11025 )

Origem de replicao
Genes para resistncia a
antibiticos

la c Z a lpha
Ca MV 3 5 S promote r
Gus fir s t e x on
Nco I (1)
Bg l II (8)

Ca ta la s e intr on
Gus s e c ond e x on

Bst XI (10782 )

Ca MV 3 5 S pr om ote r
Nh e I (20 14)

Xh o I (99 95)

His tidine ta g
Bst EII (205 0)

hygr om yc in (R)

pCAMBIA1301

Xh o I (89 01)

Ca MV 3 5 S polyA
T-B or de r (le ft)
S a c II (8383 )

11837 bp

pV S 1 s ta

k a na myc in (R )

pB R3 2 2 or i
pB R3 2 2 bom

Nos poly-A
T-B or de r (r ight)
S p h I (24 55)

Nh e I (54 58)

pV S 1 r e p

Permite que a clula

hospedeira cresa em meio
seletivo

Mltiplos stios de
clonagem
Permite a insero de DNA
exgeno

Enzimas de restrio
Protenas que reconhecem e clivam o DNA em
pontos especficos, geralmente em sequencias
de 4, 6 e 8 bases palndromas

DNA recombinante

DNA ligase

Mtodos de transformao
Insero do DNA recombinante INDIRETO
Agrobacterium

DIRETA
Biobalstica
Eletroporao - Protoplastos e Tecidos ntegros

Transformao por Agrobacterium

Bactrias do solo que tem a capacidade de transferir parte do seu DNA

para dentro da clula da planta

No laboratrio, a bactria colocada em cultura junto com as clulas de
plantas, ou inoculada no tecido da planta, transferindo parte do seu DNA
para as clulas da planta

Transformao por Biobalstica

Partculas de ouro ou tungstnio so cobertas com DNA e
aceleradas em direo ao tecido da planta (hlio comprimido)
As partculas perfuram a parede celular e penetram dentro da
clula
Utilizado quando no possvel por incompatibilidade biolgica o
uso de Agrobacterium
Vetores - no requerem sequencias especiais
Micropartculas - ouro ou tungstnio - 0,4 a 1,5 mm

Partculas de ouro

Partculas de tungstenio

Acelerador de partculas com alta presso de gs hlio (Biorad).

Esquema de funcionamento

TRANSFORMAO POR
ELETROPORAO
Consiste em submeter os protoplastos e DNA a
um campo eltrico de intensidade controlada
Choque eltrico - formao de poros
reversveis na membrana plasmtica
permitindo a entrada do DNA
Fatores importantes
Durao do pulso
Voltagem aplicada

Esquema de eletroporo

Cubetas para eletroporo

Eletroporador

CULTIVO E REGENERAO DE PLANTAS A

PARTIR DE PROTOPLASTOS

E
A

Tipos de Transgnicos
1 Gerao
Caractersticas de produo
reduo do custo de produo
resistncia a herbicida, doenas e insetos
Estresse ambiental

2 Gerao
Caractersticas de consumo
agregar valor ao produto final
melhoria nutricional
melhor conservao ps-colheita

Variedades e eventos de transgenia

http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database

Soja: Transgnicos de 1 gerao

GTS 40-3-2 soja tolerante ao herbicida glifosato (Roundup
Ready) da MONSANTO
Introduo do gene cp4 epsps (5-enolpiruvil chiquimato-3-fosfato sintase)
presente em Agrobacterium tumefaciens

ACS-GMOO5-3 soja tolerante ao herbicida glifosinato de

amnia (LibertyLink)da BAYER
Introduo do gene gene PAT presente em Streptomyces
viridochromogenes

BPS-CV127-9 soja tolerante ao herbicida imidazolinona

(chlorsulfuron, imazapyr e imazaquim) da BASF
Introduo do gene csr1-2 de mutantes de A. Thaliana (serina por uma
asparagina)

- MON87701 soja tolerante a lagartas

Introduo do gene Cry1Ac de ao biocda presente em Bacillus
thuringiensis

Soja: Transgnicos de 2 gerao

Metabolismo dos principais cidos graxos em soja e genes
associados

10.2%
Palmitic
(C16:0)

FAT-A

3.8%
Stearic
(C18:0)

SAD

23.8% FAD2-1 49.1%

Oleic
Linoleic
(C18:1)
(C18:2)

FAD3

8.1%
Linolenic
(C18:3)

= 81% of fatty acids insaturated

Silenciamento do Gene Fad2-1

Duas cpias do gene
ativas

Soja: Transgnicos de 2 gerao

DP-305423 soja com alto teor de cido graxo
oleico da Pioneer Hi-Bred
Insero de cpia de uma poro de gene GmFad2-1 provocando a
supresso (silenciamento) do gene

G94-1, G94-19, G168 soja com alto teor de cido

graxo oleico da Du Pont Canada
Insero de cpia de uma poro de gene GmFad2-1 provocando a
supresso (silenciamento) do gene

Marcadores Moleculares
Marcadores Moleculares
Todo e qualquer fentipo
molecular oriundo de um gene
expresso ou sequncia de DNA
(expressa ou no) onde se
pode detectar polimorfismo
Fisicamente ligados a locos
que determinam
caractersticas de interesse
econmico (QTLs)

Necessidade de ocorrncia de
desequilbrio de ligao para
detectar a ligao entre os locos

Alguns tipos de marcadores

de DNA

RFLP
VNTR Hibridizao
RAPD
PCR
SSR
AFLP RFLP e PCR
SNP

Contribuies dos Marcadores Moleculares no

Melhoramento
Caracterizao de germoplasma
Diversidade gentica e genealogia
A
R

B
C
D
E

Caracterizao de germoplasma
Seleo de genitores

Caracterizao de germoplasma
Identificao de acessos

Proteo Varietal

Seleo Assistida por Marcadores - SAM

Ferrugem asitica Phakopsora pachyrhizi

Gentipo selecionado
Mapa

Marcador AFLP

 Mapeamento gentico
Populao de So Paulo
9.291.000 habitantes em 2.600.00 domiclios

Soymap
http://bldg6.arsusda.gov/cregan/soymap.htm
Akaya et al (1993)
Morgante et al (1994)
Cregan et al (1999)
Song et al (2004)
Choi et al (2007)

MARCADORES MOLECULARES

RFLPs: Restriction Fragment Length Polymorphisms;

(Botstein et al. 1980)
RAPDs: Random Amplified Polymorphic DNAs;
(Williams et al. 1990; Welsh & McClelland, 1990)
AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms;
(Zabeau & Vos, 1993; Lin & Kuo, 1995)
Microssatlites ou SSRs: Simple Sequence Repeats;
(Hamada et al. 1982; Tautz & Renz, 1984)

MARCADORES MOLECULARES

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms);

(Schimid et al., 2003; Zhu et al., 2003)

MARCADORES MULTILOCO
DOMINANTES NO-ESPECFICOS

No so dirigidos a uma regio particular do

genoma

Revelam polimorfismo em dezenas de locos

simultaneamente

MARCADORES LOCO-ESPECFICOS
CODOMINANTES

Desenvolvidos para cada espcie

Identificao dos heterozigotos

CONCEITO DE MARCADOR dominante e codominante

dominante
P1

codominante

P2

P1

AA

P2

P1 x P 2

aa Aa

Ex: RAPD

P1

P2

a
a
P1

P2

AA

P 1 x P2

aa a
A

Ex: SSR

Equipamentos para
amplificao por
PCR

Equipamentos para
eletroforese em gis
de agarose

Random Amplified Polymorphic DNA

CARACTERSTICAS PRINCIPAIS
Amplificao aleatria de fragmentos de DNA

Amplificao do DNA com um pequeno e nico

primer (9 a 10 pb) de seqncia arbitrria e com
seqncia alvo desconhecida

RAPD: passo a passo

Isolamento do DNA
(total, cloroplasto ou mitocondrial)

Reao de PCR com um primer

Separao dos fragmentos de DNA em gel

de agarose

Visualizao de fragmentos de DNA

usando Brometo de Etdeo

PCR

Polymerase Chain Reaction

Separao das fitas de DNA

(94oC, 5 min.)
DESNATURAO

Primers ligam-se as fitas

de DNA (35 a 65oC, 30s.)
ANELAMENTO

Separao das fitas de DNA

para incio de um novo ciclo
(94o C, 30s.)
DESNATURAO

Taq DNA polimerase

Sintetiza novas fitas de DNA
(72 o C, 2-5 min.)
EXTENSO

RAPD
Primers
DNA
Nucleotdeos
Taq-DNA
polim.
Gentipo A

Gentipo B

CARACTERSTICAS (RAPD)

1. AMPLIFICA VRIOS LOCOS

2. POLIMORFISMO: PRESENA / AUSNCIA
3. MARCADOR DOMINANTE

PADRO RAPD
CAUSAS DO POLIMORFISMO:
1. Mismatches no stio do primer

2. Surgimento de um novo stio

3. Comprimento de uma regio amplificada entre
dois stios de primers

CRITRIOS PARA A LEITURA DAS BANDAS:

1. REPRODUTIBILIDADE
3. TAMANHO

2. ESPESSURA

4. SEGREGAO ESPERADA

RAPD: utilizao e vantagens

Avaliao de recursos genticos
Fingerprint :

Identificao de materiais
Anlise da diversidade gentica
Caracterizao de germoplasma

Rpida Identificao de marcadores ligados a uma

caracterstica de interesse
-Polimorfismo na regio de interesse
Nvel de Polimorfismo muitas marcas / ensaio

RAPD: utilizao e vantagens

Identificao de cultivares
Pureza dos Hbridos
Deteco de variao somaclonal;
Estrutura gentica de populaes e domesticao
Mapeamento genmico
No necessrio conhecimento prvio do genoma da
espcie
Custo baixo em relao aos outros marcadores

RAPD:
LIMITAES &
DESVANTAGENS
Dominantes;
Falta de conhecimento prvio da identidade dos
produtos de amplificao;
Problemas com reprodutibilidade entre laboratrios;
Custos:

Plsticos
Agarose
Enzima

EXEMPLO

Restriction Fragment Length Polymorphism

Hibridao molecular: corte do DNA com enzima de restrio e posterior
hibridao com sonda pela homologia das sequncias
Examina diferenas nos fragmentos de DNA digeridos
Polimorfsmo deriva de mutaes pontuais, inseres e delees
Requer grande quantidade de DNA genmico com alto grau de pureza
Utilizao de sondas radioativas ou por quimioluminescncia (a frio)

Enzimas de restrio:

Reconhecem e cortam seqncias especficas do DNA;

Stios palindrmicos - RADAR
Centenas de enzimas disponveis:
EcoRI: 5 GAATT C 3
3 G TTAA G 5
HaeIII: 5 GGCC 3
3 CCGG 5

Alteram o tamanho do fragmento de restrio

RFLP

Mtodo:
1) Extrao e digesto do DNA.
2) Eletroforese
3) Southern blotting
4) Marcao da sonda
5) Autorradiografia

RFLP

RFLP
SONDA
- cDNA
library
transcrio reversa
do mRNA
-gDNA
library
fragmentos de DNA
genmico clonados
ao acaso.

MARCADOR
- Loco: combinao
Sonda/enzima
- Informativo

- Alelos distinguveis

Figura 1. Perfil de RFLP para as 18 linhagens

endogmicas de milho com 4 diferentes enzimas de
restrio (Bam HI, Eco RI, Eco RV e Hind III). (A)
Sonda BNL6.32, (B) UMC128 e (C) UMC107.

Limitaes - RFLP
Custos Instalao
Insumos

Enzimas
Membranas
Hibridizaes

Radioativas
N-Radiativas

Nvel de Polimorfismo poucos locos / ensaio

Laborioso

Vantagens dos RFLPs

Robusto
Boa transferibilidade entre laboratrios
Codominante Heterozigosidade
No requer informao prvia de seqncia
Baseado em homologia de seqncia anlise filogentica
entre espcies;
Aplicvel a qualquer planta
Poder discriminatrio: * nvel de populao ou espcies
(sondas cpia nica)
* nvel de indivduos
(sondas mltiplas cpias)

Microssatlites (SSR)
Seqncias curtas (1 a 6 bases) repetidas
em tandem
Presentes em procariotos e eucariotos
Presentes em regies codificantes e no
codificantes
Maioria das repeties so dinucleotdeos
(AC) n (AG) n (AT)n

Microssatlites (SSR)
Polimorfismo devido a diferenas no nmero de
repeties
Escorregamento da DNA polimerase durante a
replicao
Crossing-over desigual entre cromtides irms

Codominantes
Normalmente loco simples e multi-allico

CARACTERSTICAS

Presentes em diversos organismos

(CA)n (TG)n: mais freqentes em mamferos
50.000 a 100.000 cpias por genoma
(AT)n: mais freqente em plantas
Soja: (AG/AT)n

(CCT/GGA)n (CCG/GGC)n

Par de primers especficos

(Forward e Reverse ~ 20 bases cada)

ALELOS

2 pb de diferena

Microssatlites

Microssatlites (SSR)
Deteco do polimorfismo

Seqenciador
Gis de agarose
Gis de acrilamida (detecta diferenas de at 2pb)
colorao direta: nitrato de prata (barato)
Colorao indireta: marcao radioativa ou fluorescente

Desenvolvimento de marcadores
microssatlites
Mtodo tradicional

Outras estratgias
Busca em banco de genes
Utilizao de sequncias ESTs
Utilizao de BACs (Bacterial
Artificial Chromosomes

Microssatlites (SSR)
Problemas

Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dos

primers

Construo de bibliotecas genmicas

sequenciamento
Triagem dos melhores primers

Possibilidade de se usar seqncias depositadas em

banco de dados

(B)

Nenhuma seqncia disponvel

Usar SSRs conhecidos para isolar

clones de uma Biblioteca

Usar seqncias de SSRs como

sondas contra DNA digerido:
Biblioteca Enriquecida

Seqnciar clones positivos

Desenhar primers especficos
Detectar polimorfismo

Metodologia e Visualizao
dos SSRs
Metodologia :
Extrao DNA
PCR com primers especficos
(flanqueiam as repeties)
Separao dos fragmentos

Visualizao:
Agarose ou Metaphor: Agarose + BET, UV;
Acrilamida + Prata ou Radioistopos
Sequenciador + fluorescncia

Microssatlites

(Gel de poliacrilamida 6%)

Amplified Fragment Length Polymorphism

CARACTERSTICAS
MARCADOR DOMINANTE
DISPERSO NO GENOMA
GRANDE NMERO DE LOCOS POR ANLISE
NO ESPCIE-ESPECFICO
NO NECESSITA DE INFORMAO DE
SEQNCIA
ROBUSTO, REPRODUZVEL ENTRE LABORATRIOS
RPIDO

ETAPAS AFLP
1. DIGESTO DO DNA

2. LIGAO DE ADAPTADORES ESPECFICOS

3. PR-AMPLIFICAO (oligonucleotdeo com

nenhuma ou apenas uma base seletiva)

4. AMPLIFICAO SELETIVA (oligonucleotdeo
com trs bases seletivas)
5. ANLISE EM GEL

DIGESTO

1) ENZIMA DE CORTE RARO:

Reconhece a cada 06 a 08 pb EcoRI, Not I
2) ENZIMA DE CORTE FREQENTE:

Reconhece a cada 04 pb MseI , Rsa I

AFLP
FRAGMENTOS GERADOS PELA CLIVAGEM:
Classe 1
Fragmentos grandes
(cliv. da enzima rara em ambas as extremidades)

Classe 3

Classe 2

Fragmentos
intermedirios
rara/freqente
(cliv. combinada)

Fragmentos pequenos
(cliv. da enzima freqente em ambas as
extremidades)

4 a 5 Kb

Boa Visualizao

AFLP
2

LIGAO DE
ADAPTADORES
ESPECFICOS

1) Seqncias especficas complementares s

extremidades coesivas resultantes da clivagem
pelas enzimas de restrio:
Adaptadores EcoRI, adapatdores MseI

2) Adaptadores: 20 a 30 pb,
seqncias diferentes para cada adaptador

AFLP
3

PR-AMPLIFICAO E
AMPLIFICAO

PRIMERS SEQNCIA ARBITRRIA

Caractersticas: - 20 a 25 nucleotdeos complementares

aos adaptadores
- 01 a 03 nucleotdeos de seqncia
arbitrria ( extremidade 3 ) = Ao
Seletiva

Ao Seletiva Dos Primers

1a ETAPA : primers com apenas 01 nucleotdeo
arbitrrio, no-marcados
01 em cada 04 bases (A, T, C, G)

1 : 16 fragmentos
amplificados

2a ETAPA : primers com 03 nucleotdeos arbitrrios,

aumento da intensidade de seleo, terminal 5marcado
01 em cada 43 x 43 // 1 : 4096 fragmentos /
corte de enzima rara

GAATTCN

NTTAA

CTTAAGN

NAATT

Eco RI + Mse I
5 AATTC N

NT

N AAT 5

GN

AATTC N

EcoRI

TTAA 5 G N

5 AATTC N

NT

N AAT 5

GN
NT

5 TA

A
AATTC N

N TTA

TTAAG N

N AAT

C
5

MseI

N AAT

AAC
AATTC T

C TTA

TTAAG A

G AAT

AAC
AATTCAAC

TTGTTA

TTAAGTTG

AACAAT

A. AFLP ANALYSIS
- digesto, ligao, PCRs
B. ELETROFORESE VERTICAL
- gel desnaturante de poliacrilamida (6%)
- 4h
C. GEL

- mtodo radiativo: transferido para

papel de filtro, secagem a vcuo (1h),
exposio filme hipersensvel 10 a 15 dias
- mtodo colorao prata: soluo
fixadora, soluo reveladora (1h)

AFLP
Polimerizao
Montagem
Transferncia

Aplicao de Amostras

Deteco do polimorfismo
Fluorescncia

Colorao com prata

P32 ou P33

AFLP
Perfil AFLP contm de 50 e 100 fragmentos
amplificados (80-500 pb) provenientes de
muitos stios do genoma,

Interpretado como marcador dominante

Entretanto, usando scaner automticos de
gel, heterozigotos podem ser distinguidos
de homozigotos pela intensidade do sinal.

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Polimorfismos resultantes da alterao de uma nica
base no genoma
Substituies

Transio

purina purina A G
pirimidina pirimidina
T C

Transverso
purina pirimidina
pirimidina purina
A ou G T ou C

Inseres/delees
(Indel)

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Co-dominante

http://www.siriusgenomics.com/technology/

Para que uma variao seja considerada SNP

deve ocorrer em pelo menos 1% da
populao

SNPs Identificao
Sequenciamento direto
amplificao por PCR e sequenciamento de
fragmentos genmicos e de regies gnicas
equivalentes de vrios indivduos

Anlise eletrnica da variao de ponto banco

de dados
sequncias de projetos genomas
bibliotecas de cDNA de diferentes indivduos
(ESTs)
Diferentes estratgias para comparar regies
especficas do DNA de diferentes indivduos

SNPs Sequenciamento direto

Necessidade de desenho de
primers para amplificar
segmentos de DNA de 400700 pb
Adiciona-se extremidade
5 extenses que iro
facilitar o pareamento dos
primers posteriormente
usados para o
sequenciamento do
fragmento amplificado

Consideraes Finais
Biotecnologia define-se pelo uso de
conhecimentos sobre os processos
biolgicos e sobre as propriedades
dos seres vivos, com o fim de
resolver problemas e criar produtos
de utilidade
Conveno sobre Diversidade Biolgica da ONU

Muito obrigada pela ateno!

Agradecimentos pela concesso de material :

Dra Luciana Becchimol (IAC)
Dra Maria Imaculada Zucchi (APTA Piracicaba)
Dra Mariza Monteiro (CTC)