Medicina Laboratorial para o Clínico 01 - 03

Lucia na de Gouva Viana
01
INTRODUO
MEDICINA LABORATORIAL
A MEDICINA LABORATORIAL
NA PRTICA E ENSINO MDICOS
rologia, bacteriologia, m icologia). moniwramento de

drogas rerapuricas, laboratrio forense, informtica
laborawrial. gesto laboramrial, entre oucras.
A Pawlogia Clnica, recentemente denominada
Nest e contexro, o pawlogisra clnico desempenha
Medicma Laborawrial. uma especialidade mdica
um papel voltado tanto para a relao com os m-
que pode ser definida como a rea que conduz e in-
dicos-assistentes, como consulcor, quanto atividades
terpreta restes laboracoriais, aplicando mewdologias
t cnicas e relativas gesto laborarorial.
qumicas, fsicas, imunolgicas, mo rfolgicas, gen-
No Brasil, o mdico parologista clnico passa por
ricas, encre oucras, em diversos materiais biolgicos.
formao q ue inclui, alm dos seis anos regu lamenta-
Os objecivos principais da especialidade na assistncia
res do curso superior em Med1cina. mais crs anos de
sade so diagnosticar o u excluir doenas, definir
residncia mdica. credenciada pela Comisso Nacio-
marcadores prognsticos, acompan har as repercu s-
nal de Residncia Mdica, sendo um ano em clnica
ses terapu ticas ou verificar a existncia de fatores
mdica e dois anos em laboratrio clnico. O ttulo
de risco para agravos sade humana.
de especialista pode ser obtido tambm po r mdicos
A especialidade rem se cornada cada vez mais
atuantes em laboratrios clnicos a parrir de exame
complexa, em funo da rpida evoluo tecno lgica,

a qual tem permitido o aprimoramento e diversifica-
ministrado anualmente pela Sociedade Brasileira de

Parologia Clnica/Medicina Laborarorial- SBPC.
o das mecodologias analticas e dos instrumentos de
O mercado de trabalho para o parologista clnico
apoio na operac ionalizao da assistncia laborarorial.
se encontra principalmente em laborat rios de hospi-
A colaborao de o urros profissionais, alm daqueles

de formao mdica, sempre ocorreu e crescente,
tais, centros diagnsticos, clnicas especializadas com

recursos laboramriais integrados e instituies de en-
cirando-se: farmacuticos-bioqumicos, biomdicos,
si no e pesquisa. Ressalta-se que a Medicina Labora-
bilogos, qumicos, entre outros. A s reas especficas
rorial cresce cada vez mais no que se refere impor-
de aruao, no contexm da Medicina Laborarorial,
tncia cientfica e na sua utilizao para a wmada de

decises m dicas, havendo quem aponte que o peso
abrangem diversas ram ificaes e so, na prtica, verdadeiras subespecialidades. Destaca m-se: bioqumica, genrica, hemarologia, imunologia, parasirologia,
das informaes geradas pelo seror de diagnstico

chega a ser de at 70% nos processos cognitivos dos
microbiologia (esta, por sua vez, subdividida em vi -
mdicos-assistentes.
A ESTRUTURA ORGANIZACIONAL DO
LABORATRIO CLNICO
A estrutura organizacional de um laboratrio clnico
deve concemplar as necessidades processuais das fases
pr-analtica, analtica e ps-analtica, ramo no que diz respeico aos aspectos arquicecnicos, quamo em relao aos
equipamencos, equipe tcnica e tecnologia de informao.
A planra fsica do laboratrio deve acender s exigncias legais para estabelecimentos de assistncia sade. No
Brasil, cal regulamencao feita pela Agncia Nacional de
Vigilncia Sanitria - ANVISA, por meio da Resoluo de
Direwria Colegiada RDC n 50, de 21 de fevereiro de 2002,
a qual dispe sobre o Regulamento Tcnico para planejamento, programao, elaborao e avaliao de projecos
fsicos de escabelecimencos assiscenciais de sade. Deve-se
enfatizar a necessidade de contemplar a minimizao dos
riscos para a equipe tcnica e para o pacieme.
A tendncia acual a consuuo de plataformas laborawriais horizonralizadas e flexveis (modulares) com
o mximo de integrao processual e mecodolgica. Tal
integrao tremendamente faci litada pela implantao
de sistema de informatizao laboracorial. Este tem papel
crucial na otimizao dos processos, a partir do momenco
em que impe alto grau de automao, interfaceamento
entre as etapas do processo, segurana, rasrreabilidade e
eliminao do retrabalho. Quando o laboratrio est inserido em um contexto mulcidisciplinar, particularmente
hospitalar, fundamental a integrao das informaes
geradas pela plataforma laboracorial com todo o aparato
do servio ao qual est vinculado. Tal eficincia na transmisso da informao relativa assistncia ao paciente
interfere, positivamente, na resolutividade do caso e nos
aspeccos gerenciais relacionados, tais como eficincia no
facu ramento e na gesto de insumos.
A existncia de postos de coleta dissociados fisicamente da plataforma de processamento cria a necessidade de estru turao de logstica segura e eficiente para
o material biolgico, garantindo adequados armazenamento e transporte. Para tal, existe legislao especfica
no Brasil, definida pela Agncia Nacional de Transportes
Terrestres- ANTT, por meio da Resoluo N 420, de 12
de fevereiro de 2004.
A ANVISA definiu, em 2005, os requisitos para o funcionamento dos laboratrios clnicos e postos de coleta
laboratorial pblicos ou privados que realizam atividades
2 [ M edicina laboratorial para o clnico
na rea de anlises clnicas, patologia clnica e citologia.

Trata-se da RDC n. 302, de 13 de outubro de 2005, elaborada a partir de um trabalho conjunto de tcnicos da
ANVISA, Secretaria de Ateno a Sade (SAS/MS), Secretaria de Vigilncia Sade (SVS/MS), Vigilncias Sanitrias
Estaduais, Laboratrio de Sade Pblica, Sociedade Brasileira de Patolog1a Clnica/Medicina Laboratorial, Sociedade Brasileira de Anlises Clnicas, Provedores de Ensaio
de Proficincia e um consultor tcn ico com experincia
na rea. Esta RDC aplicvel a todos os servios pblicos
ou privados que realizam atividades laboracoriais na rea
de anlises clnicas, patologia clnica e citologia.
A FASE PR-ANALTICA
Os estudos mais recentes tm apontado fatores pranalticos como responsveis por at 70% dos erros registrados em um laboratrio clnico. Antes da coleta de
qualquer material biolgico para a realizao de exames
laboratoriais. importance conhecer, controlar e, se possvel, eliminar algumas variveis que possam incerferir nos
resultados. Entre as causas comuns de variabilidade pranaltica, tm-se: gravidez, atividade fsica, perodo neonacal e infncia, idade avanada, postura, dieta, uso de drogas
teraputicas ou de abuso, infuso de frmacos, hemlise,
lipemia, jejum, corniquete e variao cronobiolgica.
Gravidez
Diversos analitos ap resentam significativa vanaao

nos valores de referncia durance a gravidez, sendo possvel, inclusive, a estratificao pelos diversos perodos
gescacionais e ps-parto (Tabela 1.1 ).
Atividade fsica
A acividade fsica no deve ser considerada fator impeditivo ou limitante para a coleca da material biolgico
para a realizao de exames laboratoriais. Deve-se cer em
mente. porm, que exerccios fsicos extenuantes geralmente elevam os nveis sricos de alguns analitos, tais
como laccaco, creatinoquinase, aldolase, alanina aminotransferase, asparcaco aminocransferase, fsforo, creatini-
na, cido nco, haproglobina, rransferrina. carecolaminas

e leucCito total. Albumina, ferro e sdio podem dlminwr. Tal InterfernCia pode perdurar por 12 a 24 horas.
Por ouuo lado. o repouso excessivo impostO em algumas situaes, como a hospitalizao e/ou imobilizao
no leito. tambm causa de interferncia.
red uo na concentrao de colesteroi- HDL e elevao

de algumas substncias, como corrisol e antgeno carci
noembrinico - CEA. O etilismo, por sua vez. alcera rapidamente a concentrao plasmtica de gl1cose. odo
lrico e cnglicrides, entre outros. J o consumo crnico
responsvel. por exemplo. pela elevao da at1vidade de
gamaglutamil transferase.
Perodo neonatal, infncia e idade avanada

Infuso de frmacos
Valores de refernc1a defimdos para a populao adulta geralmente no se aplicam populao peditrica. As
s1m, necessna a utilizao de referncias apropriadas a
cada faixa etna. Novas Investigaes tm definido valores de refernCia especf cos para a populao idosa.
Postura
Alteraes repentinas na postura corporal podem

causar variaes na concentrao snca de d1versos analitos, tais como albumina. colesterol, rriglicrides, hematcrito, hemoglobina e leuccitos.
Dieta
Alguns exames sofrem interferncia da d1eta qual o

paoente est submetido, bem como a alteraes bruscas nesta. A introduo de dieta hospitalar. por exemplo,
deve ser considerada como interferente em potencial
para tais determinaes.
Uso de drogas teraputicas ou de abuso
Cons1dera-se boa prtica laboratonal o registro, no

ato do atendimento, dos frmacos que o paciente usou
ou tem usado pelo menos nas ltimas 72 horas que antecedem a coleta de sangue. Tal medida visa deteco
e alerta ao mdico-assistente de possvel interferncia
m v1vo ou m v1tro em relao ao exame laboratOrial.
Merecem destaque o tabagismo e o etilismo, pela sua
freqncia. No primeiro, tm-se elevao na concentrao de hemoglobina, elevao no nmero de hemcias
e leuccitos e no volume corpuscular mdio, alm da
Introd uo Medicina Laboratorial
A coleta de sangue deve ser realizada em local dis

rance de carecer. Se possvel. esta deve ser real1zada pelo
menos uma hora aps o final da infuso. mesmo que em
local diferente.
Hemlise
Representa a causa mais comum de re1e1o de

amostra de sangue no laboratrio clnico. Quando discreta. interfere em poucas anlises, mas. se intensa. causa
elevao nos resultados de desidrogenase l rica, bilirrubina. potssio, creatinoquinase. alanina aminorransferase.
aspartaro aminotransferase e magnsio.
lipemia e jejum
A lipemia decorrente do estado ps-prandial pode

interferir em algumas determinaes laboratoriais. Com
o avano metodolgico. porm, a exigncia do jejum,
preconizada at alguns anos atrs, tornou-se uma recomendao para a maioria dos exames. O jejum prolongado tambm deve ser lembrado. sendo uma interferncia franca nas dosagens de glicema, quando superior a
16 horas.
Aplicao do torniquete
Na aplicao do tOrniquete por tempo supenor a

dois minutos, haver alteraes metablicas secundrias
estase venosa, provocando aumento de porss1o e lactato e decrscimo de pH.
Tabela 1.1 - Resul[ados de exames laborawriats durame a gravidez expressos como porcemagem da mdia dos valores
observados em mulheres no-grvidas
Percentual da mdia dos valores obtidos em mulheres no-grvidas
Ana lito
12 semanas 28 semanas 32 semanas
36 semanas
Termo
l 0 dia
ps-parto
ACidO lHICO
68
79
92
106
120
135
Album1na
93
78
78
78
78
71
Bicarbonato
85
85
85
85
81
88
Bilirrubina mdireto
56
56
67
67
78
78
C.c
98
94
94
95
97
94
Capac,dade de ligao do ferro
95
129
139
142
144
128
Cloreto
98
99
100
99
99
100
Colesterol HDL
121
121
119
127
130
116
Coleste1ol LDL
80
118
118
150
146
121
Colesterol total
100
132
144
148
156
138
CreatJmno
71
71
74
79
81
74
Ferrihna
81
33
33
37
59
81
Ferro
112
82
94
94
94
82
Fosfatase alcalino
90
131
203
274
347
284
Fsbo
108
99
97
103
96
106
Gilcem1o de jejum
98
94
94
91
94
94
Hemotocnto
94
89
91
94
97
91
Hemoglobina
95
89
90
93
96
89
leu c to global
144
167
67
165
2.40
222
Magnsio
92
90
87
87
87
86
Potss1o
95
95
95
98
100
98
Protena
92
83
83
83
83
77
Sdo
97
99
98
98
97
99
Tempo de protrombina
99
99
97
98
97
100
Tempo de trombaplostmo parcial otivodo
95
94
91
92
93
92
Triglicrides
141
244
300
356
3.49
328
UiO
77
63
63
63
77
72
Plaquetas
98
99
96
95
100
9.4
F;bnno nio
119
132
154
157
165
161
T3
100
121
121
116
121
95
T4
98
71
72
62
74
80
TSH
I II
106
122
III
139
III
Cort.sol
111
28.4
301
?9?
309
238
Adaptado de: Jacob!. DS. Oxley Dk De'v\oa WR. Laboratory T~t Handbook. Hudson. Lex.-Comp tnc 2001
~dicina laboratorial para o clnico
Variao cronobiolgica
Esra corresponde s alceraes cclicas da concentrao de determinado parmeuo em funo do rempo. O

ciclo de variao pode ser dirio, mensal, sazonal, anual,
Tal sicuao justifica o registro, por parce do laboratrio

clnico, da dara da ltima mensuuao, comando possvel a correra correlao clnico-laborawrial e liberao
do respectivo valor de referncia no laudo.
e[c. A concemrao de cor[isol no soro corresponde a

um exemplo bastante ilusrrarivo de variao circadiana
de um analiro. Nesre caso, as coleras realizadas carde
fornecem resultados ar 50% mais baixos em relao s
coleras realizadas pela manh. Na Tabela 1.2 encontramse ouuos exemplos de flutuaes fisiolgicas de resultados de exames laboracoriais.
Tabela 1.2 - Vanao torai em percenrual das concentraes sricas de analitos determ inadas em amosrras colhidas s oito e 14 horas
Va ria o Tota l (%)
Analito
Sd io
1,9
Potssio
~1
Cloreto
3,8
Clcio
3,2
Fsforo
10,7
Urio
22.5
Creotinino
14,5
cido rico
11 ,5
Ferro
36,6
Colesterol
14,8
Albumino
5,5
Protenas toto1s
4.8
A sparto to a mino tra nsferase
25
Ala nina ominotronsferose
56
Fosfa ta se a lcalino
20
Desid rogenose l tico
16
Adaptado de: )acobs DS. Oxfey DK. DeMon WR. Laboratory Test Handbook.
Hudson. Lext-Comp lnc.. 2001
As variaes hormonais dpicas do ciclo menstrual

representam ourro exemplo de variao cronobiolgica.
Introduo
M edicina Laboratorial
A SOLICITAO MDICA
Toda amostra biolgica destinada realizao de

exames deve ser acompanhada de requisio formal
adequada, na qual constem os dados de identificao
do paciente, o rnarerial biolgico a ser colhido e os exames a serem realizados. A jusrificariva para a realizao
dos exames um dado de exuema importncia e, para
diversos servios. obrigatria. No aco do atendimenw,
cabe ao laboratrio a confirmao de codos os dados de
identificao do paciente e seu responsvel legal, quando pertinente, mediante apresentao de documentos
oficiais, cal como a carreira de identidade. Recomendase o registro dos seguintes dados cadastrais do paciente
pelo laboratrio:
nmero de regisrro gerado pelo laboratrio;
nome;
idade, sexo e procedncia;
telefone e/ou endereo. quando aplicvel;
nome e comaco do responsvel em caso de menor
de idade ou incapacitado;
nome do solicitante;
dara e hora do arendirnenco;
horrio da coleta, quando aplicvel;
exames solicitados e ripo de amosu a;
quando necessrio, informaes adicionais, cais
corno medicamentos em uso, dados do ciclo
menstrual, indicao/observao clnica;
dara prevista para a entrega do laudo;
indicao de urgncia, quando aplicvel.
O PREPARO DO PACIENTE
O laboratrio deve fornecer orientaes claras e, prefere ncialmente, por escrico, relativas ao preparo para a
realizao de exames. No aco do arendimenw, esre deve
ser verificado e, se a colera do material for realizada em
condies especiais ou com alguma rescrio, esras devem ser regisuadas. As particularidades referentes ao
preparo do paciente para realizao de exames laboramriais sero apresentadas nos respectivos captulos.
Se forem utilizados frascos de vidro, deve-se obedecer

seguinte ordem:
A COLHEITA, TRANSPORTE E
ARMAZENAMENTO DO MATERIAL BIOLGICO

A puno venosa o procedimento mais comumenre realizado para obteno de amosrras sanguneas para
realizao de exames laboraroriais. D-se preferncia s
veias baslica mediana e ceflica no membro superior,
lembrando que a ltima mais propensa formao de
hemaromas. Devem-se evitar reas com terapia ou hidrarao intravenosa, locais com cicatrizes de queimaduras,
reas com hematomas, fsculas arrrio-venosas, membro
superior prximo do local onde foi realizada masrecromia,
cerererismo ou qualquer outro procedimento cirrgico.
A utilizao do torniquete para auxiliar na evidenciao
da veia deve ser feira com cautela, pois, se empregado por
mais de dois minucos, causa alteraes em diversas determinaes laboratoriais, podendo, inclusive, inviabilizar a
utilizao da amostra devido hemlise. Recomenda-se
a higienizao do local de puno com lcool isoproplico
ou etlico 70%, limpando-o com movimentos circulares
do centro para a periferia. So necessrios cerca de 30 segundos para secagem da rea, evitando-se, assim, ardncia no aro da colera e at hemlise.
Procede-se, a seguir, colera do material. O sistema
de colera a vcuo o mais recomendado e utilizado no
mundo. Este apresenta como vantagem a possibilidade
de coleras mltiplas por meio de uma nica puno. O
tubo de colera rem, em seu inrerior, quantidade de vcuo proporcional quantidade de anticoagulante, dando ao fleboromisra a cerreza de que o volume de sangue
colhido foi correto, bastando observar a marcao do
fabricante no cubo. Outra vantagem diz respeito segurana do profissional de sade, uma vez que o sistema de
colera a vcuo fechado, no havendo necessidade de
manipulao do material colhido pelo floboromisra.
Recomenda-se a seguinte seqncia de colera para
cubos de plstico:
frascos para hemoculcura;
tubos com cirraro (rampa azul claro);
cubos para soro com arivador de cogulo (rampa
vermelha ou amarela);
tubos com heparina (rampa verde);
[ Medicina laboratorial para o cln ico
rubos com edra (rampa roxa);

cubos com fluoresco (rampa cinza).
frascos para hemoculrura;

cubos para soro siliconizados (rampa vermelha);
tubos com cirraro (rampa azul claro);
rubos para soro com arivador de cogulo (rampa
amarela);
rubos com heparina (tampa verde);
cubos com edra (rampa roxa);
rubos com fluorero (tampa cinza).
Uma vez colerada e identificada adequadamente, a
amostra dever ser encaminhada ao seror de processamento em maletas isotrmicas que garantam a segurana
no transporte. O tempo entre a colera do sangue e sua
centrifugao no deve exceder uma hora. Amostras colhidas com anticoagulante, nas quais o exame ser realizado no sangue total. devem ser mantidas refrigeradas entre
2 e goc ar o processamento. Todo cuidado deve ser tomado para que o prazo mximo e as condies ideais de
armazenamento do material biolgico sejam respeitados.
evitando-se interferncias no resultado dos exames.
fundamental que o laboratrio clnico tenha mecanismos que garanram a rastreabilidade de codo o processo pr-analtico. Vale mencionar, novamente, o grande
impacto desta fase nos erros verificados em resultados
de exames laboratoriais.
A FASE ANALTICA: O PROCESSAMENTO

DO MATERIAL BIOLGICO
Na fase analtica, as grandes preocupaes referem-se

aos reagentes, equipamentos gerais e especficos e qualidade da gua utilizada no laboratrio (gua reagente). Alm
destas, a qualificao dos profissionais envolvidos e seu
compromisso com a educao continuada fundamental.
O processo analtico deve ser o referenciado nas instrues de uso do fabricante, em referncias bibliogrficas ou em pesquisa cientificamente vlida conduzida
pelo laboratrio. Assim, deve-se zelar pela utilizao de
merodologias que renam sensibilidade, especificidade e
cusro-efetividade adequadas e estas, quando implanta-
]f--- - -- - -- - - - - - - - - - -- - -- - - -- - - - - -
das, devem seguir rigorosamente as especificaes do fabricante. A validao interna considerada etapa essencial e preliminar inuoduo de qualquer merodologia
analtica no laboratrio.
Tende-se, arualmente, auromao da maioria dos
processos analticos, empregando-se analisadores robusros e inrerfaciveis, ou seja, com capacidade de receber
e transmitir informaes ao sistema informatizado do laboratrio. As tcnicas man uais encontram-se remiras s
merodologias em relao s quais no foi possvel auramao com manuteno de adequadas sensibilidade e/ou
especificidade. Muitas vezes no possvel o laboratrio
Implantar merodologias de ltima gerao em seu parque tecnolgico, o que fortalece o papel dos laboratrios
de apoio. Estes so representados por estabelecimentos
de grande porre, alro nvel tecnolgico e de informatizao, capazes de receber e processar amostras de diversos
locais, com liberao rpida dos resultados. Assim, h desonerao de rodo o processo do laboratrio associado a
este, sem perda na qualidade do resultado.
A FASE PS~ANALTICA: REPORTANDO

RESULTADOS DE EXAMES LABORATORIAIS
O laudo de um exame laborarorial deve comer, no

mnimo, os seguintes itens:
identificao do laboratrio;
endereo e telefone do laboratrio;
identificao do responsvel tcnico (RT);
n de registro do RT no respectivo conselho de
classe profissional;
identificao do profissional que liberou o exame;
n de registro do profissional que liberou o exame
no respectivo conselho de classe do profissional;
n de regisuo do laboratrio clnico no respectivo
conselho de classe profissional;
nome e registro de identificao do cliente no
laboratrio;
data da coleta da amostra;
data de emisso do laudo;
nome do exame, tipo de amosrra e mtodo
analtico;
resultado do exame e unidade de medio;
valores de referncia, limitaes tcnicas da metodologia e dados para interpretao;
Introduo Me d icina l abora[Qria l
observaes pertinentes.
Quando for aceita amostra de paciente com restrio,
esta condio deve constar no laudo. t fundamental que
o laboratrio defina os limites de risco, valores crticos ou
de alerta para analitos cujo resultado necessite de imediata
ao mdica. recomendvel que comentrios relevantes
em relao ao reste e/ou resultado sejam adicionados ao
laudo, com o intuiro de auxiliar a interpretao mdica.
A equipe tcnica do laboratrio clnico deve estar capacitada para avaliar a consistncia dos resultados antes
de liber-los, correlacionando-os com os dados cadastrais
(idade, sexo, medicamentos em uso, etc.) do paciente e
com as informaes clnicas disponveis. O julgamento
ps-analtico fundamental para assegurar ao mdico e
ao paciente a confiabilidade no laudo emitido.
CONTROLE DA QUALIDADE
NO lABORATRIO ClNICO
A garantia da qualidade pode ser definida como um

conjunto de processos que visa obteno de resultados laboratoriais confiveis. Um programa de garantia da
qualidade adequado deve abranger as fases pr-analtica,
analtica e ps-analtica. O RT do laboratrio deve elaborar uma lista abrangendo rodos os analiros e rodos os
sistemas analticos que utiliza. Para cada SIStema analtico,
deve haver um plano para controle interno (monirorao da estabilidade do sistema analtico) e para controle externo (monirorao da exatido ou da acurcia). O
programa de garantia e controle da qualidade deve documentar o material de controle ou de proficincia que
ser usado, a freqncia de seu uso e os limites e critrios
de aceitabilidade dos resultados. Todas as arividades referentes garantia da qualidade devem ser registradas e
analisadas criticamente de maneira regular que possibilite
a investigao de causas raiz de problemas que impactem
a confiabilidade das anlises.
SEGURANA NO lABORATRIO CLNICO
Profissionais da rea de sade e outros trabalhadores

que exercem suas arividades em laboratrios aruam sob
diversos riscos:
riscos de aodentes;
classe de risco III: risco individual elevado, baixo
riscos ergonmicos;
riscos fsicos;
risco comunirrio. O ageme pawgnico podepro-
riscos qumicos;
riscos biolgicos.
vocar enfermidades humanas graves, podendo

propagar-se de uma pessoa infectada para outra,
entretanto, existe profilaxia e/ou tratamento. Ex:
Considera-se risco de acideme qualquer fator que co-
Mycobacterium tuberculos1s;
loque o trabalhador em siwao de perigo e possa afetar

sua integridade, bem-estar fsico e moral. So exemplos
de risco de acidente: as mquinas e equipamentos sem
proreo, probabilidade de incndio e exploso, arranjo fsico inadequado, armazenamento inadequado, etc.
Considera-se risco ergonmico qualquer fator que possa
interferir nas caractersticas psicofisiolgicas do trabalhador, causando desco nforto ou afetando sua sade.
So exemplos de risco ergonmico: o levantamento e
transporte manual de peso, o ritmo excessivo de trabalho, a monotonia, a repetitividade, a responsabilidade
excessiva, a poswra inadequada de trabalho, o trabalho
em wrnos, etc. Cons1deram-se agentes de risco fsico as
diversas formas de energia a que possam estar expostOs
os trabalhadores, tais como: rudo, vibraes, presses
anormais, temperawras extremas, radiaes ionizantes,
radiaes no ionizantes, ultra-som, materiais cortantes e
pontiagudos, etc. Consideram-se agentes de risco qumico as substncias, compostos ou produtos que possam
penetrar no organismo pela via respiratria, nas formas
de poeiras, fumos, nvoas, neblinas, gases ou vapores ou
que, pela nacu reza da atividade de exposio, possam ter
contato ou ser absorvido pelo organismo atravs da pele
ou por ingesto. Consideram-se agentes de risco biolgico as bactrias, fungos, parasitos, vrus. entre outros.
A classificao do risco biolgico definida pela patogenicidade para o homem; virulncia; modos de transmisso; disponibilidade de medidas profilticas eficazes,
disponibilidade de tratamento eficaz e endemicidade.
classe de risco 1: escasso risco individual e comunitrio. O microrgan ismo tem pouca probabilidade de provocar enfermidades humanas ou enfermidades de importncia veterinria;
classe de risco 11: risco individual moderado. risco
comunitrio limitado. A exposio ao agente patognico pode provocar infeco, porm, dispese de medidas eficazes de tratamento e preveno, sendo o risco de propagao limitado. Ex.:
Schistosoma mansoni;
Medicina laboratorial para o cln ico
classe de risco IV: elevado risco individual e comunit rio. Os agentes pacognicos representam
grande ameaa para as pessoas e animais, com
fc il propagao de um indivduo ao outro, direta ou indiretamente, no existindo profilaxia nem
tratamento. Ex: vrus ebola.
Conforme os riscos definidos no laboratrio, so necessrios equi pamentos de proteo individual (EPI) e
coletiva (EPC) para minimiz-los ou el imin-los. Luvas,
culos de proreo, proretor facial e jaleco so exemplos
de EPI. Cabine de segurana biolgica, chuveiro de emergncia e lava-olhos so exemplos de EPC.
preciso que o laboratrio elabore uma lista dos riscos a que a equi pe tcnica pode estar sujeita, incluindo
os produtos qumicos utilizados. A cada produtO qumico adquirido para uso, o laboratrio deve solicitar ao
fabricante a respectiva Ficha de Informao de Segurana de Produto Qumico - FISPQ. necessrio, tambm.
que o laboratrio normacize os procedimentos relativos
segurana por meio de manuais ou instrues tcnicas.
Estes devem conter, no mnimo:
normas e condutas de segurana biolgica, qumica,
fsica, ocupacional e ambiental;
instrues de uso para EPI e EPC;
procedimentos em caso de acidentes;
manuse1o e transporte de material e amostra
biolgica.
So as seguintes as principais recomendaes relativas segurana ocupacional em um laboratrio clnico:
nunca pipetar com a boca; usar dispositivos de pipetagem mecnica;
no comer, beber, fumar, mascar chiclete ou utilizar cosmticos no laboratrio;
evitar o hbiro de levar as mos boca, nariz,
olhos, rostO ou cabelo, no laboratrio;
lavar as mos antes de iniciar o trabalho e aps a
manipulao de agentes qumicos, material 1nfec-
)1 ------ - - - - -- - - - -- - - - -- - - - - - -- - -
cioso, mesmo que cenha usado luvas de proceo,

bem como ames de deixar o laboratrio;
no guardar objeros de uso pessoal no laboratrio;
utilizar jaleco ou outro tipo de uniforme procecor,
de algodo, apenas dentro do laboratrio. No
utilizar essa roupa fora do laboratrio;
utilizar apenas sapacos fechados no laboratrio;
utilizar luvas quando manusear material infeccioso;
no usar jias ou outros adornos nas mos, que
podem impedir uma boa limpeza destas;
manter a porra do laboratrio fechada. restringindo o acesso equipe tcnica;
no manter plantas, bolsas. roupas ou qualquer
outro objeco no relacionado com o trabalho
dentro do laboratrio;
usar cabine de segurana biolgica para manusear
material infeccioso ou materiais que necessitem
de proceo contra contaminao;
utilizar dispositivos de conteno ou que minimizem as arividades producoras de aerossis. essas
arividades incluem: centrifugao (usar copos de
segurana). misturadores ripo vortex (usar cubos
com tampa). homogeneizadores (usar homogeneizadores de segurana com copo metlico). entre outras;
descontaminar todas as superfcies de trabalho
diariamente e quando houver respingos ou derramamentos;
colocar todo o material com contaminao biolgica em recipientes com tampa e prova devazamento ames de remov-lo do laboratrio para
autoclavao;
descontaminar por aucoclavao ou por desinfeco qumica codo o material com contaminao
biolgica, como: vidraria, caixas de animais, equipamentos de laboratrio. etc;
descontaminar codo o equipamento ames de
qualquer servio de manuteno;
Introduo Medicina Laboratorial
depositar agulhas em recipientes rgidos. prova

de vazamento e embalados como lixo pacolgico;
manter-se informado, atravs de treinamentos oficiais. sobre as providncias em caso de acidente,
bem como sobre a localizao e instrues de uso
do lava-olhos, chuveiro de segurana e extintor de
incndio;
informar chefia imediata a ocorrncia de qualquer acidente.
REFERNCIAS
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de 2005. D1spe sobre Regulamemo Tcnico para funcionamemo de Laboratnos Cl n1cos. Dino Oficial da
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3.
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h t t p :/ / w ww . s b pc .o rg. b r / u pI o ad / conte u do /
320070130154104.pdf.
02
Fernando Valadares Basques
INTERPRETANDO RESULTADOS DE
EXAMES LABORATORIAIS
A interpretao dos resulrados de exames laboramriais requer o domnio da clnica e da epidemiologia da

doena, bem como o conhecimento da merodologia laborarorial. Qual o melhor mrodo para o diagnstico
e acompanhamenro da doena7 Qual o significado real
de um resultado negativo ou positivo7 Neste captulo sero revistos conceiros laboratoriais bsicos para auxiliar o
clnico na interpretao dos resultados de exames.
Uma hiptese diagnstica formulada com base nos conheCimentos sem1olgicos, clnicos e ep1dem1olgicos a
base para o sucesso diagnstico e. na maioria das situaes,
os exames laboratoriais so complementares, cabendo ao
laboratrio a confirmao da hiptese formulada ou a quantificao de um resultado esperado. A utilizao de exames
laborawriais para "adivinhar" um diagnstico quase sempre
um equvoco. onera o paciente e os sistemas de sade e, algumas vezes. pode at mesmo confundi r o mdico-assistente.
Com base na epidemiologia de algumas doenas e
no 1mpacto do diagnstico precoce, existem exames
que so utilizados para rastrear hipteses diagnsticas.
Exemplos dessas situaes so os exames solicitados nas
consultas pr-natais, diagnstico do diabetes melito e a
triagem neonatal do hipotireoidismo e fen ilceronria.
VALORES DE REFERNCIA
A forma mais habitual para o diagnstico de uma
doena a comparao de um valor mensurado com
valores observados em uma populao saudvel: os valores de referncia. Por exemplo, a avaliao antropomtrica de uma cnana requer valores de referncia para
elaborar-se uma h1ptese de dficit de crescimento. A
Medicina Laborarorial no foge a esta regra. Os valores
de referncia so comumente utilizados para a anlise
dos resultados dos exames laboratoriais.
A definio do valor de referncia, embora possa
parecer, no ta refa simples. A maior dificuldade consiste em determinar se um indivduo ou no saudvel.
A sade um conceiro relativo: para se defini r se um
indivduo saudvel, h que se estabelecer um padro,
o que nem sempre fcil. Alm disso, afirmar que um
indivduo no tem doena praticamente impossvel.
O valor de referncia definido como o intervalo
de valores obtidos pela observao ou quantificao de
determinado parmetro em indivduos "de referncia".
Os indivduos "de referncia" devem ser selecionados
por meio de cmrios como idade, sexo. farores genticos e tnicos (farores endgenos). Esses critrios devem
ser considerados no s no momento da construo do
valor de referncia, mas tam bm quando se avaliam os
resultados de um paciente. Ademais, devem ser determinadas com preciso as condies em que as amostras
so coletadas, como: horrio da coleta, tipo de alimentao no dia anterior, tempo de jejum. privao hdrica e alcolica (farores exgenos), bem como o tipo de
amostra (soro ou plasma), o tipo de anticoagulante e a
merodologia utilizada (farores laboraroriais).
Outros aspectos importantes devem ser considerados na determinao de um valor de referncia:

a mecodologia ucilizada deve ser rasuevel a um
mcodo de referncia ou definitivo, denominado
"padro-ouro";
referncia no devem ser utilizados como nico parmetro para diagnstico. Alguns pacientes com cncer de
prstata podem apresentar valores "normais" de PSA e,
por ouuo lado, esre marcador tumoral pode estar elevado na ausncia de doena maligna da prstata, como
as mensuraes devem ser feicas obedecendo a
em indivduos com prosmice ou aps exerccios fsicos,
critrios de controle da qualidade laboratorial;

a seleo dos indivduos "de referncia" deve ser
feita de forma aleatria ou por meio de ouuos
mcodos estatsticos de seleo de grupo.
manipulao ou massagem prosttica.

A esuarificao dos valores de referncia em idade e
sexo muito importante em alguns casos. A hemoglobina, a contagem global e especfica de leuccitos e os hormnios sexuais fem ininos e masculinos so exemplos de
parmetros que variam em relao idade e ao sexo. Em
crianas, os valores de referncia da contagem especfica
de leuccitos variam muito rapidamente entre as faixas
etrias. Nesres casos, os exames devem ser avaliados
comparando-se os resultados obtidos com os valores especficos para a idade. Os hormnios sexuais variam no
s de acordo com a idade e o sexo, mas tambm com a
fase do ciclo menstrual nas mu lheres em idade frtil.
A gravidez tambm pode influenciar de maneira importante os resultados de exames laboratoriais. Os nveis
de fosfatase alcalina podem aumentar-se at 274% e os
rriglicrides variam de 114% na 14 semana a 356% na 36
semana de gestao. Ouuos exemplos de analitos que
tm seus valores influenciados pela gravidez so creatinina, uria, alfafetoprorena, protenas torais e albumina,
contagem de leuccitos, ferri tina e colesterol.
Um resultado de exame nunca pode ser avaliado
isoladamente. O conhecimento fisioparolgico corroborado por um conjunto de resultados laboratoriais relacionados a base para o sucesso diagnstico e teraputico. Por exemplo, a suspeita clnica de anemia ferropriva
no pode ser afastada simplesmente por um resulcado
de ferritina dentro dos valores de referncia. A ferritina
uma protena de fase aguda, portanto, condies inflamatrias podem elevar a sua dosagem, mesmo em um
paciente com anemia ferropriva.
O nvel de deciso clnica fornece a melhor separao entre duas ou mais categorias clnicas e no pode
ser confundido com valor de referncia. O valor de referncia para a glicose plasmtica de jejum de 70 a 99
mg/dl, j o nvel de deciso clnica para o diagnstico do
diabetes melito de 126 mg/dl. O colesterol mral, HDL,
LDL e triglicrides so outros exemplos de parmetros
laboratoriais (analitos), cujos resultados so comumente
reportados acompanhados dos nveis de deciso clnica.
Aps a realizao do teste laboratorial na populao

selecionada, os valores encontrados devem ser tabulados. O valor de referncia formado pelos valores obtidos em 95% dos indivduos restados, com a excluso de
2,5% dos menores e maiores valores (mdia 2 desviospadro) (Figura 2.1). Os valores outliers, aqueles numericamente discrepantes das demais observaes, tambm
so retirados dos clculos.
~ . 2dp
fl
fl + 2dp
Figura 2.1 - Distribuio gaussiana de resultados para um analito

hipottico, mostrando a mdia 2 desvios-padro (dp).
recomendvel a utilizao do termo valor de refe-
rncia em substituio ao termo valor de normalidade, de
modo a evitar idias equivocadas a respeiro do seu real

significado. Um resultado laboracorial dentro da faixa de
referncia, "normal", no significa ausncia de doena, bem
como um resultado fora da faixa de referncia, "anormal",
no significa doena. Alm disso, muitos parmetros biolgicos no apresentam distribuio gaussiana, "normal".
A dosagem do antgeno prosttica especfico (PSA),
largamente utilizada como rasueamento para o cncer
de prsrara, um exemplo clssico de que os valores de
12 (
Medicina laboratorial para o clnico
VARIAO BIOLGICA
Uma das mais importantes fomes de variao dos
resultados laboratoriais a variao biolgica, flucuao
fisiolgica que se verifica em menor ou maior grau em
todos os analitos. Essa variao pode ocorrer seguindo
um ritmo circadiano (cortisol e contagem especfica de
leuccitos), padres de alimentao (ferro srico e protenas plasmticas), mudana poscural (protenas plasmticas), ritmo mensal (hormnios sexuais femini nos) e
idade (contagem global e especfica de leuccitos).
Os parmetros biolgicos alteram-se ao longo da
vida e o grau dessa variao ou o coeficiente de variao
intra-individual depende do parmeuo escudado. Por
exemplo, os valores do sdio srico flu cuam muito pouco ao longo da vida, ao passo que a protena C reativa e
os u iglicrides ap resentam grandes variaes em curtos
perodos de tempo, sem que haja mudana no estado
de sade do indivduo.
Todos os exames laboratoriais apresentam variaes
nos valores mensurados, que podem ser de dois tipos:
a variao aleatria ou impreciso e a variao sistemtica ou inexatido. A pri meira o grau de coincidncia
entre medidas repetidas de uma amostra obtida em
condies padronizadas. O laboratrio clnico mede a
impreciso de um mtodo pela dosagem diria de uma
amostra controle, um dos processos do controle interno da qualidade laboratorial. A distribuio dos resultados obtidos permite calcular o coeficiente de variao
analtico (CVA), a impreciso. A inexatido o grau de
coincidncia enue o valor mensurado e o valor "verdadeiro" da amostra.
A anlise da variao biolgica pode indicar no s
mudanas no estado de sade do indivduo, como resposta tera putica de forma mais precoce do que a observao isolada dos valores de referncia. Se as variaes
pr-analticas forem controladas, as variaes analticas
estiverem denuo das especificaes do mtodo (disponvel em http://www.wesrgard.com/biodata baselhtm)
e a diferena entre dois ou mais valores de um analito
for maior que a especificada, pode-se assumir que existe
mudana no "valor de referncia individual" (MVR), de
acordo com a frmula:
Int erpretando resultados de exames laboratoriais
na qual 21/ 2 se refere a duas medidas seriadas; 1,96

o valor de Z para 95% de probabilidade (p<0,05);
CYA o coeficiente de variao analtico; e CY 1 ocoeficiente de variao biolgica individual. A hemoglobina, por exemplo, possui variao biolgica individual
muito baixa, 2,8%. Uma situao clnica para exemplificar a utilizao do MYR a avaliao de merrorragia
em uma paciente em idade frtil com hemoglobi na
de 12,8 g/dl , com hemograma anterior realizado no
mesmo laborat rio (CVA de 1,4%), que mostrava hemoglobina de 14,2 g/dl . Embora as duas med idas se
encontrem dentro dos valores de referncia (11,7 a 15,5
g/dl ), a mudana observada foi de 15,6% e o MVR calculado foi de 8,67%. Desta forma, pode-se afirmar com
95% de certeza que existe diferena significativa entre
os dois valores.
evidente que no exerccio clnico dirio, o clculo
do MVR utilizando a variao biolgica no muito prtico. Nem sempre os dados necessrios para o clculo esto disponveis e o clnico no pode assumir que as boas
prticas que visam a minimizar as variaes pr-analticas
so respeitadas pelo laboratrio, condies fundamentais para a anlise do MVR. Mesmo assim, a anlise da
variao biolgica uma importante ferramenta para
o mdico. Compreender que essa variao inerente
Medicina Laboramrial e que muitas vezes ela mais
significativa que as variaes analticas (erro laboratorial)
pode auxiliar de forma importante na interpretao dos
resultados e melhorar sobremaneira a prtica clnica.
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE
Avaliar a capacidade que um determinado mtodo

laboratorial tem para diagnosticar ou afastar uma doena requer o conhecimento de alguns conceiws estatsticos. A sensibilidade e a especificidade esto entre
os mais importantes deles. A sensibilidade a probabilidade de um teste ser positivo quando o indivduo est
doente. Quanto maior for a sensibil idade de um teste,
maior ser sua capacidade de detectar doena quando
um resultado estiver fora dos valores de referncia. A
especificidade a probabi lidade de um teste ser negativo quando no existe doena. Um teste muiw especfico quando a maioria dos resultados negativo na
ausncia de doena.
13
Apesar de sempre eiradas nos cesces diagnscicos de

doenas infecciosas, raramence a sensibilidade e a especifiCidade so mencionadas nos restes diagnstiCOSde oueras doenas. Elas devem ser ucilizadas para caraccerizar
codos os cesces laboraconais.
A relao emre a sensibilidade e a espeof1odade de
um cesce pode ser representada pela curva ROC do Ingls Receiver Operating Characteristic. A curva ROC
formada pelos pomos da sensibilidade colocados no etxo
y (taxa de verdadeiro-posicivos) e de "1 - especificidade"
no eixo x (caxa de falso-positivos) - (Figura 2.2) A anlise da curva permite definir qual o melhor ponto de
corte, valor que separa resultados positivos e negativos.
Quanro menor for a distncia enrre um ponto da curva e o canto superior esquerdo (100% de sensibilidade e
100% de especificidade), maior ser a eficincia do teste
(capacidade de diferenciar enue sade e doena). A observao da curva permite concluir que sempre que se
aumenta a sensibilidade de um cesce, diminuindo-se o
ponto de corte, dimtnui-se a especifiodade. O contrrio
tambm verdadeiro, sempre que se aumenta a especificidade, aumentando o ponto de corte, diminui-se a
sensibilidade do teste. Concluindo, no existem testes
100% sensveis e 100% especficos simultaneamente.
{l .60
o
:;g
:.
;;;
c
Jl
. 20
VALORES PREDITIVOS
Ouuos conceims estatsticos importantes para a avaliao de um mtodo laboracorial so os valores preditivos. O valor preditivo positivo (VPP) de um teste a probabilidade de o indivduo escar doente quando o ceste
positivo. J o valor predltlvo negatiVO (VPN) a probabilidade de o indivduo no ter a doena quando o teste
negativo. Alm da sensibilidade e da especificidade do
tesce, o clculo dos valores predit1vos cambm leva em
considerao a prevalncia da doena na populao e s
se pode utiliz-los quando se conhece essa prevalncia.
O VPP do teste aumenta proporcionalmente com a prevalncia da doena. Assim, quanto maior for a prevalncia,
maior ser o VPP, quando so comparados tesces com amesma sensibilidade e especificidade em populaes diferentes.
RESGATE DA IDIA CENTRAL DO CAPTULO

O conhecimento da fisiopatologia e da epidemiologia das doenas so as bases para o sucesso diagnsLico.
Os valores de referncia so a forma mais hab1cual
para o diagnstico laboratorial de doena.
Grupos semelhantes de pacientes em relao a sexo e
idade devem ser usados para avaliar resultado dos exames.
Os valores de referncia representam 95% dos resultados esperados para uma populao "saudvel".
Os valores de referncia isoladamente no definem
sade ou doena.
A variao biolgica a flutuao aleatria de um resultado laboracorial em corno do estado homeostLico.
Compreender conceitos estatsticos, como sensibilidade, especificidade e valores preditivos, fundamental
para a interprecao dos exames laboraroriais .
REFERNCIAS
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Dtsponvel em: hnp://www.clst.org/source/Oiders/free/
c28-a2.pdf.
I.
0.0
.20
.40
.60
.80
1.0
1 - especifidode
Figura 2.2 - Curva ROC do PSA mostrando do1s nve1s de deoso. 4

e 10 ~g/L Note-se que no ex1ste na curva um valor que represente
100% de sens1b1hdade e 100% especificidade('). Adaptado de TIETZ
Textbook of Clin1cal Chem1stry.
14
03
Lucienne Frana Reis Paiva

Maria de Ftima Fi/ardi Oliveira Mansu r
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO:
PRINCPIOS E TCNICAS
O Laboratrio de Microbiologia Clnica desempenha importante papel no diagnstico e controle das

doenas infecciosas. Todavia, sua eficincia limitada
pela qualidade da amostra, pelos meios como transportada at o laboratrio e pelas tcnicas empregadas para demonstrar a presena do microrganismo na
amostra. Como as doenas infecciosas podem surgir
em qualquer parte do corpo, sistema ou rgo e podem ser causadas por uma grande variedade de microrga nismos, incl uindo bacrrias, fungos, parasitos e
vrus, a seleo do espcime para o exame laboracorial
um pomo crtico no processo de d iagnstico e a comunicao encre o mdico-assistente e o laboratrio
, tambm, essencial.
Alm disso, a maior pane dos prococolos para testes sofisticados tem pouco valor se a amostra coletada no for representativa do local de infeco. Tendo
em vista que muitas amostras enviadas ao laboratrio
para anlise so contaminadas durante a coleta pelos
microrganismos que colonizam a superfcie de mucosas e pele, a interpretao do resultado de cultura contaminado corna-se difcil e algumas vezes impossvel,
pois a maioria das infeces causada por microrganismos endgenos.
O mdico-assistente precisa estar consciente da
complexidade dos exames e de suas limitaes mecodolgicas, inerentes ao processo, e conhecer o tempo real
necessrio para obteno dos resultados numa rotina
laboratorial para no criar falsas expectativas.
COLETA, ACONDICIONAMENTO E
TRANSPORTE DE AMOSTRAS
PARA EXAME MICROBIOLGICO
Dentre os conceicos bsicos referentes coleta, acondicionamento e transporte de materiais biolgicos destinados anlise microbiolgica, destacam-se:
a amostra clnica deve ser material represemativo
do verdadeiro local da infeco e deve ser coletada com um mnimo de contaminao, a partir de
tecidos adjacentes, rgos ou secrees;
devem ser estabelecidos perodos timos para coleta de amostras, a fim de se conseguirem maiores
possibilidades para isolamento dos possveis agentes causais;
deve ser obtida quantidade de amostra suficiente para a execuo das tc nicas microbiolgicas
solicitadas;
utilizar dispositivos de coleta, recipientes para
amostras e meios de culturas adeq uados para assegurar um timo isolamento dos microrgan ismos
responsveis pelo processo infeccioso;
sempre que possvel, coletar material antes da administrao de antibiticos;
o recipiente de transporte da amostra para cultura deve ser adequadameme rotulado e estril.
O objetivo primrio do transporte de amostras para
diagnstico microbiolgico consiste em mant-las o
mais prximo possvel de seu estado original, com deteriorao mnima, para que a recuperao dos microrganismos no seja prejudicada. A s amostras devem ser
enrregues ao laboratrio o mais rpido possvel, sendo
um padro mrernacional considerar-se o prazo mximo
meio de transporte para anaerbios: frascos contendo vcuo e com meios especficos para cultura
anaerbica. mantendo os microrganismos viveis
por at 24 horas.
de uma hora para a maioria dos rnareriais (Quadro 3.1).

Quando amostras forem colhidas fora do laboratrio, estas devero ser colocadas em meios de transporte, dentre eles os mais indicados so:
meio de Stuart: meio de transporte que suporta
a viabilidade da ma1oria das bactrias, incluindo as
exigences, por at 24 horas;
meio Cary 8/air: 1ndicado para transporte de fezes ou swab recai quando se deseja cultura para
V1bno cholerae, Campylobacter ou outras bactrias enceroparognicas, mantendo-as v1veis por
at 48 horas;
meio de Amies com carvo: utilizado principalmente quando h suspeita de microrganismos exigentes como Neisseria spp ou Haemophilus spp;
tampo de fosfato com glicerol: para patgenos
encricos comuns;
frasco estril: unhzado para transportar pequenos
fragmentos de tecidos ou bipsias, podendo-se adicionar de 0,5 a 1.0 ml de salina estril ou quando h
puno de abcessos, fezes. urina, escarro e outros;
PROCEDIMENTOS TtCN ICOS D E COLETA
Secreo de ouvido
Para se estabelecer o diagnstico microbiolgico

especfico de 1nfeco do ouvido mdio, necessrio
eferuar uma timpanocentese com aspirao de lquido
do ouvido mdio. Essa coleta no muito usual, pois o
tratamento de tal infeco geralmente emprico.
O material ideal a ser coletado no canal audit ivo
externo a secreo existente logo aps a ruptura da membrana timpnica. Este deve ser coletado
pelo ocorrino laringologisra com equipamento estril.
Para coleta de material do ouvido externo, deve-se
proceder descontaminao local, principalmente
quando h drenage m espontnea. Deve-se coleta r o
material da parte mais profunda, correspondendo a
secrees mais recentes, e empregar dois swabs, um
destinado cultura e ouuo para o preparo da lmina
de bacterioscopia.
Quad ro 3.1 - Condies de acondicionamemo e transporte dos principais m ateriais enviados ao laboratrio para exames
microbiolgiCos
Material
Acondicionamento
Transporte
Lquor
Lquido pleural
Lquido sinoviol
Lquido pericrdico
Hemoculturo
Enviar imediatamente
(manter em estufo 37C at processamento)
Temperatura ambiente
Secreo ocular
Secreo de ouvido
Swab oroforinge
SecrP.no genilol
Urino de 1 joio
Esperma
Fezes
Tempero luro ambiente

!plantio mo1s rpido possvel quando no enviodo em me1o de transporte)
Temperatura ambiente
Urino
Escorro
Secreo brnquico
Secreo traqueal
Cateteres
Secrees em geral
Manter refrigerado at processamento
Em caixa trmico o .1 (, com exceo

de amostras respiratrios, que devero
ficar em temperatura ombienle
16 [ Medicina laboratorial para o clnico
Secreo ocular
Conjuntiva
inmuir o paciente a comparecer ao laboratrio

sem lavar o rosw;
colher dois swabs: um para microscopia e outro

para cultura. Deve-se utilizar de preferncia um
swab de Dacron ou alginaw de clcio.
A coleta poder ser realizada mesmo aps o pacien-
colher, preferencialmente, no fundo do saco con-
te rer feiro higiene bucal e se alimentado. Na presena
jumival, rodando suavemente o swab para colher

secreo e clulas, evitando o comam com a borda da plpebra;
preparar o esfregao para bacterioscopia no momenm da coleta e, preferencialmente, semear o outro
swab imediatamente nos meios selecionados;
coletar, separadamente, para o olho direiw e esquerdo.
de pseudomembrana, como a que ocorre na difteria

(Corynebacterium diphtheriae), deve-se coletar uma
poro dela e proceder cultura em meio de Leffler e
colorao de Gram e Albert Laybourn.
Pesquisa de Chlamydia em conjuntiva ocular
Esta coleta deve ser feita pelo oftalmologista ou por

profissionais especialmente treinados.
proceder coleta empregando-se swab pequeno
ou esptula de Kimura;
fa zer esfregao em lmina limpa e desengordurada; deixar secar ao ar e fix-lo com metanol absoluw.
lcera de crnea
O raspado corneano dever ser coletado pelo oftalmologista. Neste caso, o laboratrio deve fornecer lminas e os meios de cultura usuais para que o planeio seja
feito imediatamente aps a coleta, pelo prprio mdico.
Seios paranasais
A coleta de secreo dos seios para nasais um procedi mento mdico, sendo o material coletado diretamente dos seios por meio de agulha e seringa. O transporte dever ser anaerbico e o processamento imediato.
Ressalta-se que a cultura de amostras da nasofaringe no
tem valor algum.
Swab nasal
A coleta de swab nasal encontra-se restri ta avaliao da microbiota de indivduos hospitalizados ou

com aruao direta no ambiente hospitalar com o objetivo de detectar portadores de microrga nismos de
interesse em surtos e controle de infeco hospitalar.
Em algumas situaes, indica-se a coleta deste e de
swabs axilares e perianais para estudos mais amplos.
Amostras das vias areas inferiores

Vias res piratrias superiores
Orojaringe
dirigir um foco de luz para a cavidade oral aberta

e, com o auxlio de um abaixador de lngua estril, aplicar o swab estril na rea de inflamao
(amdalas, faringe posterior e qualquer exsudaco
ou rea ulcerativa). preciso evitar a contaminao da amostra com saliva, visto, na presena
de saliva, algumas bactrias podem crescer excessivamente. Por outro lado, o crescimento de
Streptococcus do grupo A pode ser ini bido;
Diagnstico microbiolgico: princpios e tcnicas
Escarro expectorado
o paciente deve lavar a boca com gua ames da

coleta da amostra, elimi nando assim secrees
orofarngeas e saliva. Esse procedimento fundamental, j que a qualidade da amostra obt1da
ir validar o resultado do cultivo microbiolgico.
Aps, orient-lo a tossir profunda mente e expecto rar as secrees das vias areas inferiores diretamente em recipiente estril e de boca larga;
se possvel, colher a primeira amostra da manh, porque contm o conjunto das secrees
norurnas;
17
quando h dificuldade de coleta ou no h produo de escarro, a coleta poder ser feira com induo de salina nebulizada. com um respirador de
presso positiva, com superviso direta da equipe
de enfermagem ou da fisioterapia.
Secreo traqueal! Aspirado traqueal
A coleta deste material rea lizada em pacientes incubados, atravs de sonda de aspirao. Embora esta
cultura seja realizada roti neiramente, os resultados microbiolgicos podem refletir colonizao local ou com
outros patgenos nosocomiais. sendo a interpretao
clnica extremamente complicada.
Lavado broncoa/veolar
um procedimento realizado por equipe mdica
especializada. O material obtido por meio de procedimento broncoscpico, no qual so injetados cerca
de 100 a 300 ml de soluo salina e amostras so colhidas. sendo a primeira usada para citologia. a poro
intermediria para cultivo microbiolgico e microscopias e a poro final a mais recomendada para pesquisa de micobactrias. Deve-se enviar ao laboratrio com
urgncia para que o processamento seja imediato.
O lavado broncoalveolar e cultura quantitativa
esto indicados em casos de pneumonias graves.
que necessitem de suporte ventilatrio, de evoluo
rpida ou em imunocomprometidos ou quando h
falha teraputica emprica. o material de escolha
para pesq uisa de Pneumocystis carinii (renomeado P.
jiroveoi), vrios fungos, micobactrias, incluses virais
e outros microrganismos.O material dever ser obtido antes de bipsias e de escovados, para evitar-se
excesso de sangue.
Amostra de broncoscopia
A broncoscopia com fibra ptica uma tcnica

empregada para obteno de bipsias e outras amostras transbronquiais, em particular em pacientes com
abcessos pulmonares ou outras infeces profundas de
pulmo. Se for utilizado broncoscpio "protegido", este
constitui o material adequado para realizar culturas anaerbicas. Os anestsicos podem inibir o crescimento das
baccrias, de modo que as amostras devem ser processadas imediatameme.

Aspirado/lavado gstrico
Coleca ucilizada especialmence em crianas ou em

outros pacientes que tm dificuldade de expectorar.
quando da necessidade de estabelecer diagnstico da
tuberculose.
Urina
Urina (jato mdio)
Deve-se evitar a contaminao da amostra com a

microbiota indgena da uretra ou vagina. Recomenda-se
a coleta da pri meira urina da manh ou urina retida na
bexiga por quat ro horas.
mulheres: fazer rigorosa higiene da regio vulvar
com gua e sabo, enxaguar e secar com gaze estril. Orientar a paciente para afastar os grandes
lbios, evitando tambm qualquer contam de
partes do perneo com a urina coletada;
homens: expor a glande e cuidadosamente lavar
com gua e sabo e depois enxaguar e secar com
gaze estril;
instruir o paciente para desprezar o primeiro jaco,
colher o jaco mdio em frasco estril e desprezar o
restante da mico no vaso;
crianas: a coleta deve ser realizada no laboratrio
por pessoal treinado. Fazer rigorosa ami-sepsia na
regio genital com gua e sabo. Em seguida, adaptar cuidadosamente o colecor peditrico estril. Se a
coleta no for realizada em at 40-60 minutos, substituir o coletor, repetindo codo o procedimenco;
enviar imediatamente ao laboratrio. Caso no
seja possvel. refrigerar a amostra. Tempo mximo
aps coleta sem refrigerao: duas horas.
Urina (paciente cateterizado)
retirar a bolsa e clampar a sonda; realizar desinfeco na ponca da sonda com sabo neutro lquido,
reti rar o sabo com soro fisiolgico; desprezar o
pri meiro fl uxo uri nrio;
18 ( Medicina laboratorial para o clnico ]1-- - - - -- - - - - - - - - - - -- - - -- - - - - - - --
fazer a desinfeco da sonda em sua parte inicial,

com lcool a 70%, polvidine tpico por dois minutos e novameme com lcool a 70%;
punciona-se a sonda com seringa e agul ha estreis.
Transferir o material para um frasco estril;
enviar imediatamence ao laboratrio. Caso no
seja possvel, refrigerar a amostra. Tempo mximo
aps coleta sem refrigerao: duas horas.
Urina (aspirado suprapbico)
Trata-se de amostra obtida por procedimentO mdico invasivo e sem a possibilidade de comaminao pela
microbiota urecral. o n ico mtodo vlido para cultura anaerbica e tambm til para a coleta de amostras
de crianas ou adultos incapazes de fornecer amostras
represemativas por meio dos procedimemos usuais. Os
cuidados com aco ndicionamento e transporte so os
mesmos utilizados para coleta de uri na do jaro mdio.
No local da puno dever ser realizada anti-sepsia com
lcool a 70%.
Aparelho genital feminino e masculin o
Secreo vaginal
Quando for solicitado exame a fresco (pesquisa de

fungos e Trichomonas), Gram e/ou cultura de germes
banais. deve-se:
instruir a paciente para comparecer ao laboratrio
sem higiene vaginal e sem urinar por pelo menos
duas horas ames da coleta;
colocar a paciente em posio ginecolgica e introduzir no canal vaginal dois swabs estreis. O
primeiro ser usado para bacterioscopia (Gram e
exame a fresco) e o outro para cultu ra.
Swab endocervical
Quando solicitada pesquisa de Chlamydia e/ou cultura de Ureaplasma e Mycoplasma, deve-se:

realizar a coleta com o uso de espculo vaginal;
remover com bola de algodo ou gaze estril rodo
o muco ou secreo existente no colo uterino;
com swab prprio (de algodo ou fibra txtil) fazer a coleta no colo uterino, provocando uma leve
raspagem para obter clulas do endocrvix. Um
swab usado para preparar a lmina de imunofluorescncia para pesquisa de Chlamydia e outro
swab para colocar no meio de transporte para cultura de Ureaplasma e Mycoplasma.
Quando solicitado, especificamente, pesquisa e cultura para Neisseria gonorrhoeae. o stio timo de coleta
o endocrvix. Na presena de corrimento abundante. este o material de excelncia para exame a fresco,
Gram e cultura de germes banais.
Secreo uretra!
o paCiente dever comparecer ao laboratrio preferencialmente pela manh, sem ter urinado e sem
uso de qualquer medicao;
orientar o paciente para que retraia o prepcio e
limpe o meato com gaze estril umedecida com
soro fisiolgico estril;
solicitar ao paciente que comprima a base do
meato ureual e, com uma ala bacceriolgica, coletar o material e preparar o esfregao
para Gram no ato da coleta. Col her, tambm,
dois swabs para realizao do exame a fresco
e cultu ra.
Caso seja solicitada pesquisa de Chlamydia e/ou
cultura de Ureaplasma e Mycoplasma. proceder como
se segue:
introduzir na uretra em mais ou menos 1,0 cm o
swab prprio e, delicadamente, fazer uma raspagem da mucosa com movimentos rotatrios;
um swab usado para preparar a lmina de imunofluorescncia para pesquisa de Chlamydia e oun o para ser colocado no meio de transporte prprio para cultura de Ureaplasma e Mycoplasma.
Urina de primeiro jato
A coleta de urina de primeiro jaco est indicada

quando no h secreo urerral ou esta for mu ito escassa. Para se proceder coleta, deve-se:
19
ro ou fazer esfregaos quando for UEilizar colorao de Fonrana-Tribondeau. Neste caso. no fiambar a lmina, fixando-a com lquido de Ruge.
orienrar o pacienre para que faa limpeza com

gua e sabo do mearo uretra! e ento colher no
mximo 10 ml de urina do primeiro jaro, desprezando o restante da mico no vaso;
no laboratrio. centrifugar o material e trabalhar
com o sedimenro.
Quando a suspeita for de Trichomonas em secreo uretra! masculina e esta for escassa, introduzir um
swab prprio no mearo uretra! do paciente e raspar a
mucosa, pois este microrganismo rem predileo pela
parede uretra!.
Quando solicitada cultura em canal anal. inserir um
swab prprio em aproximadamente 2 cm, fazendo movimentos rorarivos. O proced imento o mesmo para
homens e mulheres.
Esperma
A colera deve ser realizada por masturbao manual,

seguindo as orientaes:
o paciente dever lavar as mos com gua e sabo
e com adequada rerrao do prepcio. lavar os rgos genitais e secar com toalha limpa;
colher o esperma em trasco estril de boca larga.
se a coleta for realizada em domiclio do paciente, a amostra dever ser mantida em temperatura
ambiente e transportada o mais rpido possvel
para laboratr o.
Leses genitais
Cancro duro (pesquisa de Treponema pallidum)
remover a crosta, quando presente;

limpar a leso com gaze umedecida em soluo
fisiolgica estril. no usar sabo ou anti-sprico;
raspar a leso com ala de platina at provocar
ligeiro sangramenro ou utilizar irritao qumica
com ter ou xilol;
apertar a base da leso. entre polegar e indicador,
e segurar ar exsudao de soro claro ou lquido
seroso;
colerar esse material com ala e preparar lminas.
com lamnulas. para microscopia em campo escu-
20
Cancro mole (pesquisa de Haemophilus ducreyi)
limpar a rea da leso com gaze umedecida em

soro fisiolgico estril;
com uma ala bacteriolgica, coletar material do
centro da leso e fazer esfregaos em uma nica
direo, em lminas limpas e desengorduradas,
para colorao de Gram. Este procedimento necessrio para preservar as caractersticas morfolgicas tpicas do microrganismo.
Como o principal diagnstico diferencial do cancro
duro feiro com cancro mole e como as infeces podem ser mistas. aconselha-se a pesquisa simultnea de T
pallidum e H. ducreyi. Se o cancro for interno. na vagina.
deve-se usar o espculo vaginal e. primeiramente. remover o material vaginal. limpar com soluo fisiolgica e
secar. Se for observada a presena de pomada sobre a
leso, remov-la e orientar o paciente para fazer compressas mornas no local. rerornando em 24 horas.
Fezes
Recomenda-se a colera de fezes para coproculru ra

na fase aguda (diarrica) da doena. O transporte ao
laboratrio deve ser imediato para garantir a viabilidade dos agentes infecciosos e para evitar qualquer alterao das fezes, pois com o metabolismo bacteriano
o pH torna-se cido, comando-se txico para Shigella.
O recipiente deve ser um frasco estril com tampa de
rosca. No se deve usar swab, a no ser em pesquisas
direcionadas, como em surcos hospitalares. levantamentos epidem iolgicos e quando da impossibilidade
do paciente de colher fezes. A quantidade de material
colhido com swab escassa, diminuindo a sensibilidade do exame.
Para coleta de swab recai, recomenda-se:
umedecer o swab em sa'ina estril e inseri-lo no
esfncrer reral. realizar movimentos rotatrios;
ao retirar o swab, certificar-se de que existe material fecal no algodo;
Medicina laborarorial para o clnico ]1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --
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incroduzir o swab no meio de cransporce. O nmero de swabs depende do ripo de investigao

solicitada .
Tecidos e fragmentos sseos
O melhor material o obtido por procedimento cirrgico, removendo-se e debridando-se o tecido desvitalizado. Os tecidos devem ser obtidos de panes representativas do processo infeccioso. eferuando-se, quando possvel.
a coleta de mltiplas amostras. A amostra deve ser transportada em recipiente estril com adio de soluo salina
estril para evitar o ressecamento, principalmente se for
obtida pequena amostra, como uma bipsia. O mdicoassistente deve informar todos os dados clnicos relevantes, tais como: presena de gs, cheiro ftido (suspeita de
anaerbios), mordida, suspeita de tuberculose, suspeita de
infeco fngica e presena de imunossupresso.
Como o procedimento invasivo, rodos os esforos
devem ser feitos para assegurar a obteno de amostra
adequada e tambm para isolamento dos microrganismos clinicamente significativos da infeco.
Lquor e outros lquidos corporais
Deve-se proceder anti-sepsia da pele com lcool e

soluo de iodo (tintura de iodo 1 a 2% ou PVPI 10%) e
remoo com lcool a 70%. O lquor dever ser coletado em tubos estreis com rampa de rosca e um volume
de S-10 ml deve ser obtido. Em nenhuma circunstncia a amostra dever ser refrigerada ou aquecida. Caso
a colera permita somente a disponibilidade de um tubo,
o laboratrio de Microbiologia dever ser o pri meiro a
manipul-lo. E, caso haja colera de dois ou mais tubos.
o laboratrio de Microbiologia dever ficar com o tubo
que contiver menos sangue. Se no for possvel o envio
imediato do lq uor ao Laboratrio, este deve fornecer
tubos estreis vazios e com meio de cultura (gar chocolate) para que o material seja semeado no ato da coleta e
com instrues de acondicionamento e tra nsporte.
A colera de outros lquidos corporais deve ser antecedida
pela anti-sepsia do stiOda puno com lcool a 70% e tintura de iodo. a qual dever ser removida aps o procedimento
com lcool a 70%. Trata-se de procedimento mdico. por
meio de puno percucnea, utilizando agulha e seringas estreis. Se o volume for pequeno, o material obtido dever ser
enviado em frasco ou tubo estril com tampa de rosca. Se
o volume obtido for grande, este poder ser inoculado em
frasco de hemoculrura, rendo o cuidado de retirar bolhas de
ar. Neste caso, uma pequena quantidade dever tambm ser
enviada ao laboratrio para o preparo de bacterioscopias.
Sangue
Os facores mais importantes e que determinam o

sucesso de uma hemoculrura so a anti-sepsia do srio
de puno e o volume de sangue processado. O volume ideal corresponde a 10% do volume total do frasco
de coleta. Quanto maior o volume de sangue inoculado
no meio de cult ura, por amostra, melhor a recuperao
do microrganismo, respeitando-se a pro poro sangue/
meio, pois o sangue em desproporo com o meio pode
dificultar a recuperao de microrganismos. Frascos que
possibilitem coleta de at 10 ml so mais indicados.
No se deve coletar sangue para hemoculrura durante o pico feb ril, pois neste momento esto sendo liberadas endocoxinas ou exotoxinas dos microrganismos, que
podem inibir a recuperao dos microrganismos. O momento ideal no incio do pico febril ou da bacteremia.
No recomendada a tcnica de coleta atravs de cateteres ou cnulas para diagnstico de infeco sistmica,
quando punes venosas podem ser utilizadas. Tambm
no se recomenda a troca de agulhas entre coleta e distri buio do sangue nos frascos especficos.
Como em qualquer solicitao de exame laboratorial. o mdico-assistente deve registrar a suspeita clnica,
como endocardites, infeces fngicas, suspeita de bactrias do grupo HACEK (Haemophilus, Actinobacillus.
Cardiobacterium. Eikene/la, Kingella), pois so microrganismos de crescimento muico lento, necessitando de
mais tempo de incubao. Diante da suspeita de brucelose e leptospirose. o laboratrio deve ser comunicado previamente para providenciar o envio do material a
centros de referncia e indicar os meios especficos.
Recomenda-se o seguinte procedimenco para colera
de amostras de sangue para hemoculru ra:
coletar em local fechado, sem correntes de ar;
lavar as mos com sabo degermante, enxugar e
secar adequadamente;
21
desinfetar a tampa dos frascos de hemoculrura

com lcool a 70%;
garrocear o brao do paciente e, pela inspeo ou
palpao, selecionar uma veia adequada. Esta rea
no dever mais ser cocada com os dedos;
colocar as luvas de procedimento;
fazer anti-sepsia da pele com lcool a 70%, seguido de soluo de iodo 1 a 2%, depois remover
o iodo com gaze embebida de lcool a 70% em
movimencos centrfugos. Esperar um minuto para
secagem e para ao adequada do iodo;
coletar assepticamente e inocular nos frascos recomendados e agitar levemente por inverso;
anocar no rtulo do frasco: dados de identificao
do paciente, data e hora da coleta, via de coleta
(sangue perifrico ou cateter).
Volume de sangue recomendado:
10-20 ml em adulcos;
5,0-1 0 ml para crianas e adolescentes;
1,0-2,0 ml para recm-nascidos.
utilizando luvas. examinar o local, verificando se

h presena de edema, ericema, linfangite, calor,
dor e trombose venosa palpvel;
fazer a desinfeco local com algodo embebido
em lcool a 70%, lcool-iodado ou PVPI 10% tpico, removendo qualquer anrimicrobiano ou sangue presente na pele em torno do cateter;
retirar o cateter com auxlio de pina hemosttica
estril. A poro externa deve ser mantida para cima
e afastada da pele. O cateter no deve tocar a pele;
enviar para o laboratrio 5,0 a 7,0 cm da ponta distal
do cateter, ou seja, a que estava mais profundamente introduzida na pele. Cortar o fragmento com tesoura estril e colocar em um frasco estril seco;
anocar informaes cl nicas, tais como: tipo de
infuso, local izao anatmica, data da insero e
remoo do cateter, suspeita ou infeco provvel.
uso de antibiticos.
Exsudatos, transudatos, lceras, feridas e abcessos
Nmero de amostras:
Deve-se coletar duas ou trs amosuas a cada 24 horas.
As coletas devem ser eferuadas em intervalos de 30 a 60
minucos. Caso o paciente apresente choque sptico ou
seJa necessrio instituir imediatamente antibioticoterapia,
obter simultaneamente as trs amostras em stios diferentes. Paciente com febre de origem indeterminada, coletar
duas amostras em locais diferentes; se estiver com cateter,
convm coletar uma terceira amostra pelo cateter. Manter
a mesma proporo de sangue da coleta por via perifrica:
1,0 ml de sangue para 5 ou 10 ml de meio de cultura/
caldo. Caso a febre persista e as hemoculruras continuem
negativas aps 48 horas de incubao, coletar mais duas
amostras perifricas. Em se tratando de paciente neutropnico com cateter de longa permanncia, coletar uma
amostra pelo cateter. Diante da suspeita de endocardite,
obter trs amostras com intervalo de 30 a 60 minucos. Se
negativas aps 48 horas de incubao, coletar pelo menos
mais duas amostras com o mesmo intervalo.
Deve-se evitar a contaminao com o material da superfcie, procurando-se obter amostras da parte profunda
da ferida aps limpeza de sua superfcie. Pode-se obter material por aspirao com seringa e agulha de abscessos localizados ou outros procedimentos cirrgicos. Os aspirados
de um abcesso fechado devem ser obtidos do centro ou da
parede do abcesso e no da base do abcesso. Pode-se coleta r a drenagem de infeces do tecido mole por aspirao.
Se no houver flutuao, pode-se infundir pequena quantidade de soluo salina no tecido e, a seguir, retir-la para
cultura. O volume ideal para pesquisa de bactrias varia de
1,0 a 5,0 ml e, para micobactrias, 3,0 a 5,0 ml.
Sempre que possvel. deve-se evitar o uso de swab.
Caso seja necessrio usar swabs de algodo, deve-se colher
a maior quantidade possvel de exsudato e aco ndicionlo em recipientes adequados. Para realizao de cultura, a
imerso em meio de transporte fundamental.
Catet er venoso
RECEPO DE AMOSTRAS E O BSERVAES

PRELIMINARES
A coleta de carecer venoso para cultura segue o seguinte procedimento:
A manipulao das amostras biolgicas que chegam

ao laboratrio de Microbiologia deve obedecer s nor-
22
Medicina laboratorial para o clnico )1-- - - - - -- - - -- - - - - - -- - -- - - - - -- -- -
mas de segurana, utilizando-se das barreiras de proteo necessrias para cada procedimento, como uso de
capela de fluxo laminar, equipamentos de proreo individual (EPI) e um fluxo de trabalho bem estabelecido. As
amostras devero ser registradas num sistema informati-
raes, desde os menores vrus at parasitos multicelulares maiores. O resulcado de uma anlise microscpica auxilia no diagnstico presuntivo de um processo
infeccioso e permite o incio de terapia antimicrobiana
direcionada.
zado ou caderno de registro e processadas o mais rpido

possvel. O laboratrio deve avaliar as condies gerais
das amostras enviadas e critrios de rejeio devem ser
aplicados, quando necessrio.
Deve-se avaliar se a amostra e a solicitao mdica
dispem dos dados necessrios ao seu processamento:
nome completo e legvel/nmero de registro do
paciente/leito;
idade e sexo; data/hora de atendimento e hora
da coleta;
nome do profissional solicitante;
exames solicitados e tipo do espcime clnico;
informaes adicionais, como uso de medicamentos e outros de relevncia;
indicao de urgncia, quando aplicvel.
EXAME DIRETO SEM COLORAO

Preparao com salina
Trata-se de uma preparao no corada examinada microscopia ptica comum, de campo escuro ou
contraste de fase. til para examinar a morfologia em
geral de organ ismos e amostras biolgicas, tais como
exame a fresco de secreo vaginal e secreo uretra!.
Gota pendente
utilizada para avaliar morilidade de bactrias Gram
Representam critrios de rejeio de amostras:

quando as informaes contidas no pedido mdico no correspondem s da amostra
(nome do paciente ou espcime clnico, por
exemplo);
transporte de amostras em temperatu ra imprpria;
transporte de amostras aps duas horas da coleta,
sem utilizao de meio de transporte;
amostra insuficiente para realizao dos exames
solicitados, tais como swab nico com mltiplas
requisies de testes microbiolgicos;
amostras enviadas em recipientes com vazamento, frascos quebrados ou com sinais de contaminao na superfcie externa;
amostras enviadas em formal ou outras solues
fixadoras ou amostras ressecadas.
negativo no fermentadoras de acares. A tcnica consiste em colocar uma gota do caldo com a bactria em
estudo no centro de uma lamnula; pingar leo em cada
ponta; inverter a lamnula sobre a concavidade de uma
lmina com esta depresso. Resultado: a motilidade positiva observada quando as bactrias trocam de posio
em relao a si mesmas.
Soluo iodada de lugol
Adiciona-se iodo a preparaes a fresco de amostras

para exame parasitolgico, a fim de aumentar o contraste das estruturas internas. A tcnica facilita a diferenciao entre amebas e leuccitos.
Preparao com hidrxido de potssio - KOH

(10% a 40%)
TCNICAS MICROSCPICAS
APLICADAS MICROBIOLOGIA
O uso da microscopia no laboratrio de Microbiologia ajuda a definir as relaes entre uma diversidade
de microrganismos com o meio ambiente e suas inte-
O KOH utilizado para dissolver o material de fundo

(proteinceo) e facilitar a deteco de elementos fngicos, que no so afetados pela soluo alcalina forte. Podem ser adicionados corantes como o lactofenol azul de
algodo para aumentar o contraste entre os elementos
23
fngicos e o fundo da preparao. empregado no exame micolgico de raspado de pele, unhas ou cabelo.
Preparao com tinta da China
Modificao do tratamento pelo KOH. em que se

adiciona tinta da China como material de contraste.
Corante utilizado principalmente para detecrar espcies de Cryptococcus no lquor e outros lquidos orgnicos. A cpsula de polissacardeo das espcies de
Cryptococcus afasta a tinta, criando um halo transparente ao redor da clula.
Microscopia de campo escuro
So utilizadas as mesmas lentes do m1croscpio ptico. entretanto, usa-se um condensador especial que
impede que a luz transmitida ilumine diretamente a
amostra. Apenas a luz oblqua e dispersa atinge a amostra e passa pelos sistemas de lentes. fazendo com que a
amostra torne-se ilum1nada contra um fundo escuro. A
vantagem desse mcodo seu poder de resoluo, que
significativamente superior ao da microscopia ptica. isto
, 0.02 versus 0,2 IJm. permitindo a deteco de bactrias
extremamente finas. como Treponema pallidum. Borre/10
e espoes de Leptosp1ra.
do microrganismo, das condies de cultura e das habilidades de colorao do microscopista.

Entre as indicaes para realizao do exame bacterioscpico pelo mcodo de Gram, destacam-se:
fornecer resultados preliminares para os objetivos
clnicos e secundariameme para medidas do controle da qualidade do cultivo bacteriano;
avaliao da qualidade de algumas amostras, tais
como escarro, urina e secrees de feridas.
vlido ressaltar que a grande limitao do reste a
sensibilidade, pois para que uma clula bacteriana possa
ser observada por campo em aumento de 1.000x (lente
de imerso), a concentrao dever ser em torno de 105
clulas bacterianas/ml de espcime clnico.
No Quadro 3.2 encontram-se as caractersticas morfotlntoriais de diversos microrganismos de interesse mdico.
Colorao de Ziehi-Neelsen
Utilizada para corar micobacrrias, bem como outros

microrganismos cido-resistentes. Os microrganismos so
corados com carbolfucsina bsica e resistem descolorao com solues de lcool-cido. O fundo contracorado com azul de metileno. Os organismos aparecem
vermelhos contra um fundo azul-claro. A captao de carbolfucsina requer o aquecimento da amostra (colorao
cido-resistente a quente).
COLORAES DIRETAS
Colorao de Gram
Colorao de Kinyoun
A colorao de Gram a mais comumence utilizada

no laboratrio de Microbiologia, constituindo a base de
classificao dos principais grupos de bactrias (Gram poSitivo e Gram negarivo). Ars fix<~o ri<~ <~mo~rr<~ ~ l~mina
(tratamento pelo calor ou lcool). esta exposta a uma
soluo de cristal violeta e, a seguir, adiciona-se iodo (lugol)
para formar um complexo com o corante primrio. Durante a descolorao com lcool ou ter-acetona, o complexo
retido nas bactrias Gram positivo, porm perd1do nas
bactrias Gram negativo; o contracorante (fucsina ou safranlna) retido pelos microrganismos Gram negativo (cor
vermelha). O grau de reteno do corante uma funo
Colorao cido-resistente a frio (no exige aquecimento). Mesmo princpio da colorao de Ziehi-Neelsen.
24 ( Medicina laboratorial para o clnico
Colorao auramina-rodamina
Mesmo princpio de outras coloraes odo-resistentes, exceto que so utilizados corantes fluorescentes como
corante primrio, enquanto o permanganato de potssio
(agente oxidante forre) o contracorante que inativa os
corantes fluorocromos no ligados. Os organismos emitem
fluorescncia verde-amarelada contra um fundo preto.
Quadro 3.2 - Caractersticas morfotinroriais de diversos

microrganismos de interesse mdico
Colorao cido-resistente modificada
Utiliza-se um agente de descolorao fraco com

Cocos Gram positivo
Gnero
Dispostos aos cachos
Stophylococcus
Drspostos em cadeias
Streptococcus,
Enterococcus
Dispostos aos pores, encapsulados,

s vezes em chamo de velo
Streplococcus
pneumonioe
Dispostos em grupos de quatro

(ttrode)
Micrococcus
Cocos Gram neg ativo
Gnero
Aerbios em formo de gros de

caf, dispostos aos pores
Neisserio
Anoerbios
Veilonello
Bastonetes G ra m n egativo
Bastonetes retas, normalmente
pequenos, com cpsula
quanto as micobactrias so fortemente cido-resis-
tentes, outros organismos coram-se mais fracamente

(exemplos: Nocardia, Rhodococcus, Cryptosporidium,
/sospora, Sarcocystis, etc.). Esses organismos podem ser

corados com mais eficcia utilizando-se um agente descorante fraco nas coloraes cido-resistentes. Os organismos que retm este corante so conhecidos como
parcialmente cido-resistentes. uma colorao utilizada principalmente para diferenciar os gneros Nocardia
(parcialmente cido-resistente) do gnero Actinomyces.
Gnero
Klebsiello,
enteroboctrios
Formas diplobacilares
Moroxello,
Acmetobocter
Bastonetes retas, normalmente mais

finas
Pseudomonos e outros
no fermentadores
Bastonetes curvos
Vibrio
Bastonetes curvos, mais curtos ou

mdios (esfregaa endocrvix/
vaginal)
Mobiluncus
Formas filamentosos, de extremidades afiladas (fusifarmes)
Fusobocterium
Bastonetes curtos ou mdios, de

extremidades arredondados (anaerbio)
Bocteroides
Bastonetes Gram positivo no
Gnero
esporu lados
Filamentos ramificados que, nos
tecidos, formam gros
qualquer um dos trs corantes acido-resistentes. En-
Nocordio (oerbio).
Aclinomyces
(anaerbio)
Bastonetes retas ou lrge~romente

encurvados, com extremidades
claviformes e granulaes
Coryneboc/erium
Bastonetes curtos
Usterio
Bastonetes curtos com tendncia

formao de filamentos
Erysipelothrix
Bastonetes retas, finos e relativamente longos
Loctobocillus
Bastonetes Grom positivo esporulodos aerbios. bastonetes ndios,

largos
Boci//us
Bastonetes Grom positivo esporulodos onoerbios: bastonetes mdios,

largos
Closlridium
CO LORAES FLUORESCENTES
Neste tipo de microscopia so utilizados alguns compostos denominados fluorocromos, que podem absorver a
luz ultravioleta ou azul-violeta e emitem energia num comprimento de onda maior vtsvel. O microscpio emprega
uma lmpada de vapor de mercrio, halognio ou xennio
de alta presso, que emite um comprimento de onda de luz
mais curro do que aquela emitida pelo microscpio ptico
tradicional. A luz emitida a partir do fluorocromo aumentada por meio da objetiva e ocular tradicionais. As amostras
e organismos corados com fluorocromos aparecem iluminados de modo brilhante contra um fundo preto. embora
as cores variem, dependendo do fluorocromo utilizado. O
contraste entre o organismo e o fundo grande o suficiente
para que a amostra possa ser rapidamente visualizada com
baixo aumento; uma vez detectada a fluorescncia, o material observado em maior aumento.
COLORAO PELO AZUL DE TOLUIDINA E AZUL

DE METILENO
Colorao utilizada principalmente para deteco
de Pneumocystis em amostras respiratrias. Os cistos
coram-se de azul-avermelhado a prpura denso, com
fundo azul claro. A colorao de fundo removida por
soluo sulfatada. Clulas leveduriformes coram-se. sendo difcil diferenci-las. Est sendo substituda por coloraes fluorescentes especficas.
D iagnstico m icrobiolgico: p rincpios e tcnicas
25
Azul de metileno
aumentando seu nmero
e se acumulando
em co-
lnias (grupo de clulas que podem ser visua lizadas

Colorao tndicada para ser realizada junto com a
sem a utilizao de um microscpio) que contm
colorao de Gram para sedimentos de lquor. As bac-
milhares de clulas ou populaes que agrupam bi-
trias Gram negativo como
Haemophdus rnfluenzae e
Ne1ssena meningitidis freqemememe
no
se desta-
lhes de clulas.
Os objerivos principais do cul tivo microbiano so
cam conua o fundo corado em vermelho da colora-
o isolamemo de agemes etiolgicos de determina-
o do Gram. Com a utilizao do azul de metileno.
do processo infeccioso. distinguindo-os de provveis
os leuccitos polimorfonucleados coram-se de azul
concaminames e da f lora indgena. As cu/curas quan-
escuro e as baccrias so melhor visualizadas contra
t itativas. por sua vez. cm por fina lidade correlaciona r
um fundo cinza claro.
a incens1dade do crescimemo com dada situao cl nica. na qual a pamopao de agemes da microbioca
indgena relevance.
COLORAO COM BRANCO DE CALCOFLOR
Existe grande variedade de meios disponveis comercialmeme, porm a seleo de um pequeno nmero de
Utilizada para a deteco de elemenws fngicos e
meios seletivos e no seletivos suficiente para o iso-
Pneumocystis. O corante liga-se celulose e
lamento da grande maioria de microrganismos envol-
espcies de
quitina nas paredes celulares; pode-se misturar o corante
vidos em infeces humanas. Esta seleo depende de
com KOH (mutws laboratrios substituram a prepara-
cmrios biolgicos Individuais dos m icrorganismos e da
o cradic1onal de KOH por esca colorao).
origem do stio de infeco. rendo como referncia quais

so os pnnopa1s microrganismos envolvidos naquele srio especf1co.
COLORAO D E W RIGHT-GI EMSA
Me1os seletivos so elaborados com o objecivo de

favorecer o crescimento da bactria de interesse. impe-
Utilizada para deteco de parasiws no sangue,
dindo o crescimemo das outras bactrias. Tm-se como
corpsculos de incluso virais e estruturas fngicas de
exemplos o ga r MacConkey-seletivo para baswnetes
Borre/ia. Toxoplasma,
Gram negativo. Meios no seletivos, como o gar sangue
micoses sistm1cas e espcies de
PneumocystJS.
uma colorao policromtica que as-
e o gar chocolate, so isencos de inibidores e permitem
socia azul de metileno e eosina. Os uofozocas dos pro-
o crescimemo da maioria dos microrganismos isolados
wzorios possuem ncleo vermelho e ciwplasma azul-
no laboratrio clnico.
acinzentado; as leveduras intracelulares e corpsculos

de incluso coram-se tipicamente de azul; espcies de
Pneumocystrs coram-se de prpura.
CULTIVO SECUNDRIO
CULTIVO PRIMRIO
para o estudo de um microrganismo isolado no plan-
Quando so necessrios procedimemos adicionais

eio pnmrio, subculcivos so realizados com o ob)et1vo
O cultivo primrio um processo de crescimen-
de obter uma cultura pura originria de uma cultura
to de microrganismos presentes em um srio infec-
mista. isco , com mais de um tipo de colnia. A tc-
(m vivo) recuperado em um ambiente artificial

(rn vitro). O xito da cransio do meio in vrvo para
o meio in vitro depende dos nucrientes e con dies
nica consiste na transferncia da colnia para oucro
cioso
meio de cultura.
Essa dinmica da rotina microbiolgica. classicamen-
ambientais adequados para que a bactria desen-
te lema. deve ser compreendida pelos mdicos e uma
volva e se multiplique. Crescimento microbiano se
comunicao com o laboratrio deve ser estabelecida
refere ao nmero e no ao tamanho das clulas. Os
a fim de evitarem-se prejuzos ao paciente, como o uso
mtcrorganismos em crescimento esto, na verdade,
desnecessrio de amimicrobianos.
26 ( Medicina laborarorial para o clnico
TESTES DE SENSIBILIDADE
A ANTIMICROBIANOS
Difuso de discos (Kirby-Bauer) a prova clssica,

usada h vrios anos pela grande maioria dos laboratrios. um mtodo que oferece resultados qualitativos.
uma atribuio fundamental do laboratrio de
ou seja. o microrganismo
avaliado como sensvel (S),
Microbiologia realizar metodologias padronizadas que
intermedirio (i) ou resistente (R) aos diferentes antibi-
permiram a anlise de sensibilidade dos microrganiscrobiano mais adequado, contribuindo para o sucesso
ricos resrados, de consranre pad ronizao pelo Clinical and Laboratory Standards lnstitute (CLSI), de fcil
real izao e de custo razovel, razo pela qual ainda
teraputico.
o mais utilizado pelos laboratrios de Microbiologia. O
mos, com o objetivo de auxiliar a escolha do antimi-
O conhecimento das caractersticas do perfil de
princpio bsico consiste no contara de discos impreg-
sensibilidade de cada instituio hospitalar pea fun-
nados com antibitico com a super fcie mida do gar
damental para que a Comisso de Controle de Infeco
Mueller-Hinron; a gua
Hospitalar possa instituir uma poltica de uso racional de
e o antibitico se difunde para o mei o circundante. Este
antimicrobianos.
mcodo tem como prin cipais lim itaes a impossibili-
O objetivo do antibiograma verificar a sensibili-
absorvida pelo papel de f iltro
dade de liberao de resu ltados quantitat ivos
e a no
dade ou resistncia de um microrganismo frente a
aplicao para m icro rganismos de crescimento lento,
uma concentrao padronizada de antimicrobiano.
como fungos e anaerbios, alm da impreciso em re-
indispensvel para microrganismos que apresentam
lao a antimicrobianos de fraca difu so em gar. como
variaes quanto sensibilidade e resistncia aos anti-
as polimixinas.
microbianos, para bactrias isoladas de amostras clnicas representativas de um processo infeccioso, no qual
a sensibilidade aos antimicrobianos no p revisvel, e
CONSIDERAES FINAIS
para fins epidemiolgicos.

O antibiograma apresenta limitaes. como:
Todo resultado liberado pelo laboratrio de Micro-
no prediz tOxicidade ou hipersensibilidade;
biologia conseqncia da qualidade da amostra re-
no prediz resistncia futura;
cebida. O material coletado deve ser representativo do
no reproduz as condies do stio de infeco;
processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o
no garante que o agente antimicrobiano testado

renha acesso ao srio de infeco.
melhor stio de coleta, evitando-se contam inao com

reas adjacentes.
A colera e o transporte inadequados podem acarre-
Existem vrias metodologias bem padronizadas que

podem ser utilizadas:
mtodos quanmativos que determinam a concentrao inibitria mnima (cim): m icrodiluio,
macrodiluio e e-test;
tar falhas no ISolamento do agente infeccioso, tanto em

relao ao isolamento de contaminantes, quanto ao no
isolamento do m icrorganismo responsvel pelo processo em investigao.
Muitas vezes impossvel definir o significado cl-
mtodos qualitativos, que dividem os microrga-
nico de um isolado microb iolgico, caracterizando-o
nismos em resistentes. sensveis ou de grau de
como patgeno ou mero contaminante. Tal deciso
suscetibilidade intermedirio ao antimicrobiano
deve ser pautada em evidncias microbiolgicas, clni-
testado (disco difuso);
cas e epidemiolgicas.
mtodos automa tizados;

mwdos que diretamente detectam a presena
REFERNCIAS
de um mecanismo de resistncia especfica em

uma bactria isolada;
mtodos especiais que medem interaes do
complexo anrimicrobiano - microrganismo.
Diagnstico microbio lgico: princpios e tcnicas
1.
Cl inical and Laborarory Standards lnstitute. CLSI. M100S15: normas de desempenho para testes de sensibilidade
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Honzonre: Medsi; 2001.
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aerbio: norma aprovada. 6 ed. D1sponvel em: hrrp:/1
www.sbmlcroblologla.org.br/clsi_OPASM7_A6.pdf.
Cybele de Andrade Paes

Sandra Guerra Xavier
Teresa Bunte de Carvalho
04
DIAGNSTICO HEMATOLGICO:
PRINCPIOS E TCNICAS
O exame do sangue perifrico necessariamente solicitado na avaliao hemawlgica do paciente.

Devido ao fcil acesso e proximidade com codos os
tecidos. o sangue pode proporcionar evidncias precoces de alteraes no estado de sade e no desenvolvimento de doenas. As informaes fornecida s
pela histria clnica e exame fsico aliadas avaliao
cuidadosa da morfologia celular e quantificao dos
elementos sang neos podem fi rmar um diagnstico preciso e orientar quanto instituio de teraputica adeq uada.
A COLETA DE AMOSTRAS PARA

EXAMES HEMATOLGICOS
A coleta de amostra biolgica adequada fundamental para a obteno de dados laboratoriais confiveis e precisos. devendo ser padron izada para reduzir-se
variabilidade nos resultados.
Para o exame hematolgico. o sangue obtido por
puno venosa (flebocomia) e coletado em tubos contendo anticoagulante. Na sua impossibilidade, vrias determinaes podem ser realizadas em amostras colhidas
em polpa digital. lobo de orelha ou superfcie plantar do
calcanhar ou hlux (crianas e recm-nascidos). Respeitando-se a tcnica de coleta adequada, recomendada
a utilizao de tubos a vcuo siliconizados comercializados por conterem a concentrao correta de anticoagu-
lance. se preenchidos com volume adeq uado de sangue.

Desta forma. tanto a morfologia quanto as contagens
das clulas so preservadas.
FATORES FISIOLGICOS QUE

AFETAM OS RESULTADOS DOS TESTES
Fatores fisiolgicos tais como sexo do paciente. idade, raa. atividade fsica. nvel de hidratao e temperatura corporal podem afetar significativamente os parmetros hematolgicos. Outros fatores, incluindo uso de
medicamentos. tabagismo e ansiedade. tambm podem
provocar alteraes em alguns deles (Quadro 4.1). Em
fu mantes, observam-se concentraes elevadas de carboxihemoglobina. que produzem eritrocitose absoluta
e nveis aumentados da concentrao de hemoglobina
e do hematcrito. sendo esse aumento proporcional ao
consumo dirio. Alm disso, contagens mais baixas de
neutrfilos podem ser encontradas nesses indivduos.
Quadro 4.1 - Facores que influenciam os parmetros hemacolgicos
sexo
idade
raa
a tividade fsica
nvel de hidratao
uso de medicamentos
temperatura corporal
tabagismo
ansiedade
a) Variao fisiolgica na contagem de ertrctos

Variaes na contagem de eritrcicos so mais acentuadas nas primeiras semanas de vida. Aps a primeira
ou segunda semana de vida extra-uteri na, os nveis de
hemoglobina caem, em mdia, de 17 g/dL para 12 g/
dL at os dois meses de idade. Aps esse perodo. os

nveis permanecem relativamente constantes durante
o primeiro ano de vida. Crianas com concentraes
de hemoglobina aba ixo de 11 g/dL devem ser consideradas anmicas.
Segundo o critrio da O rganizao Mundial de Sade, uma concentrao de hemoglobina abaixo de 12 g/
dL para mulheres e 13 g/dL para homens indica anemia. Nos adultos de ambos os sexos, as taxas de hemoglobina e de hemarcrito tendem a ser mais elevadas
nos homens. Aps a meia-idade, os homens tendem
a apresentar queda nos parmetros hematimtricos
e nas mulheres estes podem elevar-se levemente ou
manter-se inalterados.
Na gravidez normal ocorre uma expanso gradativa
do volume sangneo de 40 a 50%, mantendo-se at o
termo. Esse aumemo parece ser mediado pela ao de
estrgeno e progesterona. Observa-se, tambm, elevao do nmero de eri trcitos conseqente hiperplasia
eritride da medula ssea. Apesar do aumento da eritropoese, as concentraes de hemoglobina, hemcias e
hematcrito diminuem ligeiramente.
Policitemia secundria baixa presso atmosfrica
observada em altas altitudes devido a aumento nos
nveis de eritropoerina plasmtica. A exposio hipxia ocasiona elevao transitria na concentrao de
hemoglobina e do hematcrto devido a um rpido decrscimo no volume plasmtico seguido de aumento da
eritropoese per se.
b) Variao fisiolgica na contagem de leuccitos
A leucomerria ao nascimento e nas primeiras 24
horas de vida apresenta grandes variaes. Os neutrFilos so as clulas predominantes nessa fase, variando
de 6 a 28 x 109 /L e permanecendo em torno de 5 x
109/L a parti r da primeira semana. Ao nascimento, a
contagem de linfcitos , em mdia, 5.5 x 109/Le assim
permanece at aproximadamente os sere anos, qua ndo os neutrfilos passam a predomi nar. As contagens
de neutrfilos e de leuccitos tendem a apresenta r
um mesmo padro de variao diurna, em um mesmo
indivduo. Leucocitose est relacionada a exerccios f-
30 [ M edicina laboratorial para o clnico
sicos; e concentraes mais baixas de neuufilos so

encontradas em indivduos negros.
c) Variao fisiolgica na contagem de plaquetas
Ao nascimento, a contagem de plaquetas rem seus
valores de referncia mais baixos que em crianas maiores e adultos, podendo variar de 84 a 478 x 109/L. Estes
valores atingem os nveis de adultos aps a primeira semana de vida. Nas mulheres. contagens mais baixas so
encontradas durante o perodo menstrual.
ASPIRADO DE MEDULA SSEA

A aspirao da medula ssea o procedimento utilizado para obteno de material medular, objerivando:
a) escudo ciromorfolgico. por meio do mielograma;
b) estudo citoqumico; c) escudo imunofenorpico, por
imunofluorescncia ou ciromerria de fluxo; d) estudo
citogentico, por meio de citogentica clssica e/ou molecular; e) estudo molecular, por meio de mtodos de
biologia molecular; f) escudo do ferro medular; g) estudo microbiolgico, por intermdio de mtodos di retos e
cultura, emre outros.
A avaliao minuciosa da medula ssea deve incluir
tanto a aspirao quanto a bipsia, sendo ambos os restes complementares. Diversos tipos de agulhas so utilizados para a aspirao; a maioria possui um mandril removvel para prevenir a sua obstruo, at que se atinja o
canal medular, momento em que ser retirado e a agulha
acoplada a uma seringa, para que se proceda aspirao.
Alguns modelos de agulha possuem um anteparo protetor para aJUStar a profundidade da penetrao no tecido
sseo (Figuras 4.1 e 4.2).
Figura 4.1 - Agulha de mielograma reutilizvel.
esradiamento de rumores envolvendo a medula;

possveis infeces por organismos intracelulares;
doenas metablicas de depsiro;
desordens imunolgicas;
doenas no hematopoticas.
Ocasionalmente, a medula ssea encontra-se to envolvida pelo processo infilrrativo que nenhum material
aspirado (puno seca) e a bipsia representa a nica
opo diagnstica.
Figura 4.2- Agulha de m1elograma descarcvel com anceparo
procecor.
BIPSIA DE MEDULA SSEA

A escolha do stio de coleta da amostra medular
condicionada, entre outros fatores, idade do paciente,
sua condio clnica, d1ficuldade de acesso e aos riscos
envolvidos. Em recm-nascidos e lactentes, as punes
so realizadas na reg1o nb1al mdia anterior; em crianas
maiores e adultos, na cnsta ilaca postenor ou ante no r. Em
adultos, o manbno e o corpo do esterno (na altura do
segundo espao Intercostal) tambm so freq entemente utilizados como local para aspirao de medula ssea
havendo, no entanto, risco de complicaes secundrias
penetrao acidental da cavidade torcica.
Procedimento tcnico:
1. Definir o local do procedimento e realizar assepsia;
2. Anestes1ar a pele, o tecido celular subcutneo
subjacente e o peristeo, com xilocana 2% sem
vasoconscritor (alguns pacientes peditricos e
adultos requerem sedao prvia);
3. Introduzir a agulha acoplada ao mandril. com
movimentos rotatrios, at a comcal ssea;
4. Retirar o mandril ao se atingir o canal medular;
5. Acoplar uma seringa de 20 ml agulha e proceder aspirao (a quantidade de material aspirado dependente do estudo a ser realizado);
6. Ret1rar a agulha e fazer curatiVO compressivo local.
As indicaes para a aspirao da medula ssea incluem:
diagnstico de leucemias agudas e crnicas;
mielodisplasias;
controle de tratamento quimioterpico;
avaliao de citopenias;
depsiros de ferro e presena de ferro anormal em
precursores eritr1des;
Diagnstico hemacolgico: princpios e tcnicas
A bipsia de medula ssea um procedimenro

amplamente utilizado na prtica mdica, no s para
o diagnstico de diversas doenas hemarolgicas ou
metastticas, como tambm no acompanhamento das
primeiras. Embora menos simples e confortvel que a
puno aspirativa, a bipsia preserva a arquitetura medular e fornece dados importantes sobre sua estrutura, celularidade, topografia das clulas e grau de fibrose
(atravs da impregnao das fibras de reticulina pela
prata). Por outro lado, devido sobreposio de clulas
e desidratao das mesmas pelo formal (freqentemente utilizado como fixador), torna-se difcil a identificao de estruturas isoladas, seu estgio de maturao
e detalhes morfolgicos.
No momenro do procedimento a bipsia de medula
ssea deve ser realizada ames da puno aspirativa da
crista 11aca, posterior ou amenor ou em um stio contguo ao da aspirao para eVItar hemorragia no local e
artefatos no material biopsiado. A agulha de bipsia
mais calibrosa que a de aspirao e acompanhada de
obturador, lmina cortante e estilete para remoo do
fragmento sseo (Figura 4.3). O procedimento consiste
na retirada de um fragmenro sseo cilndrico de 2 a 3 cm
de comprimento e os cuidados prvios realizao da
bipsia so os mesmos aplicados puno aspirativa.
Procedimento tcnico:
1. Definir o local do proced1mento e realizar assepsia local;
2. Anestesiar a pele, o tecido celular subcutneo
subjacente e o peristeo com xilocana 2% sem
vasoconsrritor (alguns paciemes peditricos e
adultos requerem sedao prvia);
31
doenas infecciosas;
processos infiltrativos focais (carcinomas, linfomas
e outros rumores).
ADITIVOS UTILIZADOS NOS TUBOS DE CO LETA

Anticoagulantes so substncias utilizadas para pre-
venir a coagulao e retardar a deteriorao do sangue.

Os mais utilizados em hemarologia so os sais dissdicos ou dipotssicos do cido etilenodiaminocerractiCO
Figura 4.3 - Agul ha de b1psia de medula ssea descartvel.
(EDTA), o cirrato trissdico
ea
heparina. O EDTA
cirraro trissdico impedem a coagulao removendo o
3. IntroduZir a agulha acoplada ao obturador, com
clcio do plasma por precip itao o u por ligao em for-
movimentos rotatrio s, em sentido horrio. at
ma no ionizada. O EDTA o anticoagulante de escolha
ultrapassar a cortical ssea;
nas contagens hematolgicas e na confeco de esfrega-
4. Retirar o obturador ao se at1ngir o cana l medular
os (produz distores mnimas nas clulas sangneas.
e medir a parte da agulha ainda exteriorizada;
impede a aglutinao das plaquetas) e o citrato triss-
5. Prosseguir com movimentos no sentido horrio
dico nos estudos da hemostasia. A heparina, na presen-
at que se penetrem aproximadamente 2 a 3 cm;
a da antitrombina III plasmtica. neutraliza a trombina
6. Q uebrar o fragmento biopsiado, que se encontra
inibindo a interao de vrios fatores da coagulao. Esse
na luz da agulha, forando a agulha em movimen-
aditivo no altera a morfologia e o tamanho cel ular, pre-
tos ltero-laterais e longitudinais;
vine a hemlise e seu uso est indicado nos testes de
7. Proceder retirada da agulha com movim entos
fragilidade osmtica dos eritrmos. Os esfregaos de
rotatrios, em sentido anti-horno. devagar;
sangue heparinizado adquirem colorao azulada quan-
8. Comprimir o local e realizar curativo com pressivo;
do corados. contra-indicando sua utilizao para estudo
9. Com auxlio do estilete, retirar o fragmento biop-
ciromorfolgico.
siado do interior da agulha, sempre em sentido

contrrio. para no danific-lo;
10. Realizar
dro
imprint do fragmento em lmina de vi-
rransferi-lo para um frasco com soluo
CONFECO DO ESFREGAO DE
SANGU E PERIFRICO E MEDU LA SSEA
fixadora;
11. Em seguida, a amostra deve ser descalcificada,
O exame do esfregao sangn eo proporciona in-
parafinada, microcorrada e montada em lminas
formaes importantes em uma ava liao hemarol-
e estudos anatomopatolgico e
gica e complementa os dados o btidos pelo analisador
para colorao
imunohistoqumico.
hematolgtco. O esfregao uma camada de clulas

estend ida sobre uma lmina de microscopia. As clu-
As indicaes da bipsia de medula ssea incluem:

avaliao de aplasia
e hiperplasia medular;
las. aps serem fixadas e t ratadas com corantes especiais, adquirem colo rao adequada para seu estudo
doenas mieloproliferativas;
microscpico. Os esfregaos de sangue perifrico po-
mielodisplasias:
dem ser preparados com amostras colhidas em EDTA
m1eloma mltiplo;
ou sem anticoagulante, co lhidas p or puno de polpa
leucemia de clulas pilosas;
d igital. Os esfregaos de sangue no anticoagulado,
inflamao granulomatosa;
quando confeccionados prontamente aps a colhei ta,
fibrose;
preservam melhor a morfo logia e as caractersticas cin -
doenas de depsito;
roriais das clulas.
Uma gota de sangue ou de medula ssea

colocada a 1 ou 2 cm da extremidade da lmina.
Uma segunda lmina posicionada a um ngulo
de 30 a 45 graus em relao primeira e movida em direo ao sangue. Aps a gota de sangue
espalhar-se ao longo de sua borda, a lmina deslizada rpida e uniformemente em sentido contrrio, ao longo de 3 ou 4 cm, mantendo a mesma
angulao, evitando-se que o sangue toq ue as
bordas latera is da primeira lmina (Figu ra 4.4). O
esfregao deve secar ao a r livre, antes de ser identificado e corado.
c
Figura 4.4 - Confeco do esfregao. A: uma gota de sangue ou de medula ssea colocada a 1 ou 2 cm da extremidade da lmina. Uma segunda lmina posicionada a um
ngulo de 30 a 45 graus em relao primeira e movida em
direo ao sangue. B: a gota de sangue espalha-se ao longo
da segunda lmina. C: a segunda lmina deslizada rpida
e uniformemente em sentido contrrio, ao longo de 3 ou 4
cm, mantendo a mesma angulao. evitando-se que o sangue roque as bordas lateraiS da prime1ra lmina.
O esfregao dividido em trs partes: cabea ou

poro inicial, corpo e cauda. No sangue perifrico,
os neutrfilos polimorfonucleares e os moncitos
predominam nas margens e cauda do esfregao e os
linfcitos na parte central. A sua espessura depende
do tamanho da gota de sangue, da angulao e da
velocidade de deslizamento da lmina. A camada de
clulas adelgaa-se progressivamente da origem
cauda do esfregao; o local ideal para a anl ise individual das clulas na transio do corpo com a cauda e na cauda, onde as mesmas se encontram lado a
lado, sem se tocar.
Diagnstico hematolgico: princpios e tcnicas
O EXAME DO ESFREGAO DE
SANGUE PERIFRICO E MEDULA SSEA
O estudo morfolgico da medula ssea e do sangue
perifrico consiste na anlise quantitativa e qualitativa de
suas clulas por meio de microscopia ptica comum de
esfregaos corados. O escudo microscpico do esfregao
pode ser sistematizado em duas fases:
1 fase: em aumento de 100 e 400 vezes - aspectos gerais do esfregao, observando-se a distribuio
das clulas, a qualidade da colorao, a cel ularidade do
material, a presena de agrupamentos celulares e da
populao megacarioctica (nos estudos de medula
ssea) e a escolha dos campos para o exame com a
objetiva de imerso;
2 fase: em aumento de 1.000 vezes, sob imerso
em leo - contagem diferencial, avaliao das caractersticas citomorfolgicas dos diferentes tipos celulares e
presena de parasitos. Essas clulas so definidas pela
anlise do contorno celular; tamanho do ncleo e relao ncleo-citoplasmtica; colorao e padro de
cromatina nuclear, presena de nuclolos; colorao
citoplasmtica, presena e caractersticas dos grnulos;
presena de vacolos, projees ou incluses.
O escudo da medula ssea pelo mielograma propicia
uma excelente visualizao da morfologia celular e enumerao de seus elementos. So aspectos analisados:
a celularidade e o aspecto do material e a celularidade relativa (ndice gra nuloctico/eritroctico - GE);
a maturao das clulas (sries eritroctica, granuloctica, megacarioctica, linfoplasmocitria e
histioctica);
atipias celulares;
a presena de clulas de depsito. eritrofagocitose,
infiltrao por clulas tumorais e clulas necrticas;
a presena de parasitos.
A contagem diferencial da medula ssea de indivduos normais pode apresentar grandes variaes devido ao padro naturalmente variegado de seus componentes. assim como a distribuio irregular das clulas
nos esfregaos. Variaes fisiolgicas da celularidade
so encontradas devido idade. Nas crianas, a proporo de clulas hematopoticas em relao de tecido
gorduroso maior do que nos adultos. Estudos comparativos de contagens diferenciais em aspirados medula-
33
res mostram que as crianas apresentam 30 a 50% de

linfciws no primeiro ano de vida; estas po rcentagens
declinam at os valores apresentados pelos adulros por
volta dos quatro anos de idade. Da mesma forma, as
crianas mais jovens tendem a apresentar contagens de
eosinfilos mais elevadas que os adulcos. Na gravidez, a

medula apresenta hi perplasia leve a moderada, afetando
ramo a erirropoese quanto a granulo poese. Um estudo
sistemtico da medula ssea, fundamentado nos dados
clnicos e no exame do sangue perifrico, muitas vezes
dispensa a contagem diferencial para a definio de um
diagnstico preciso.
A celularidade depende, tam bm, da representatividade da amostra; aspirao excessiva pode ocasionar
variveis graus de dil uio com sangue perifrico e a presena de fibrose pode proporciona r uma puno seca.
Os esfregaos representativos geralmente contm partculas medulares (Figura 4.5).
Quadro 4.2 - Contagem diferencial de aspirados de med ula

ssea em indivduos normais
Medula ssea
Srie Eritroctico:
Proeritroblastos
Eritroblosios bosfilos
Erilroblastos policromticos
Eritroblastos ortocromticos
Percentagem
0- 1,6%
0 -5,0%
5,0-34,0%
5,0-8,0%
Srie Granuloctica :
M ieloblastos
Promielcitos
Mielcilas neutrfilos
M ielcitos eosinfilos
M ielcitos basfi los
Metam ielcitos lneutr., eosin , basof.)
Bastonetes e segmentados neuhfilos
Bastonetes e segmentados eosinfilos
Segmentados bosfilos
0-0,4%
10.0 - 30,0%
7,0-30, 0%
0.2 - 3,0%
o- 0, 4%
Sne Linloplasmocitria:
Linfcitos
Clulas plasmticos
5,0-20,0%
0,2-5,0%
Monc itos
o- 1,0%
Clula s reticulares
o- 2,0%
ndice G/E
1,5- 5,0
o- 3,6%
o- 5.0%
5,0-20,0%
o- 3,0%
Observao: Esses valores so cons1derados apenas como referncia aproximada e

devem ser Interpretados luz do laudo md1co
PRINCPIOS DE COLO RAO PAN PTICA

F1gura 4.5 - Esfregao de aspirado de medula ssea corado por
May-Grunwald-G1emsa, contendo panculas medulares na exrre
m1dade caudal. Ver pag111o 34
Na anlise do mielograma so contadas SOOa 1 000 clulas e o ndice G/E consiste na relao entre o nmero de
elementos granulocticos e eritrocticos. Devido diversidade de valores de referncia apresentados na literatura especializada, o Setor de Hematologia do Servio de Medicina
Laboracorial do Hospital das Clnicas da UFMG elaborou o
Quadro 4.2, a partir de uma compilao dessas fontes.
A maturao das sries eritroctica e granuloctica
interpretada pelo escalonamento maturativo de seus
elemenws e pelo tipo de eritropoese e gran ulopoese,
respectivamente. No aspirado de medula ssea, os megacaricitos so analisados pela sua distribuio no esfregao e pela presena de plaquetas. As plaquetas so
derivadas de fragmentos citoplasmticos dos megacaricitos, seus precursores.
34 (
Os mecanismos pelos quais certos componentes da

estrutura celular se coram por determinados corantes
dependem de complexas diferenas de ligao desses corantes a estruturas qumicas e de interaes entre as suas
molculas. Os corantes atualmente utilizados em hemawlogia so modificaes do corante de Romanowsky e
associam o azul de metileno e a eosina mais o azur B, derivado do azul de metileno. O azul de metileno e o azur B
so corantes azuis bsicos e a eosina corante vermelho
cido. Esses corantes possuem a propriedade de corar os
grnulos leucocitrios distintamence. Os corances bsicos
ligam-se s estruturas cidas do DNA nuclear, aos ribossomos e grnulos do citoplasma e os corantes cidos s estruturas bsicas do citoplasma (hemoglobina e grnulos).
Os citoplasmas dos proeritroblastos, dos eritroblastos basfilos e dos mielo blastos so basoflicos devido
aos ribossomos das clulas imatu ras. As hemcias e os
eritroblastos ortocromticos, devido ao seu contedo
de hemoglobina, so eosinoflicos e coram-se em verme-
lho alaranjado. As esrrururas coradas pela combinao

de ambos os corantes so neutroflicas e apresentam colorao vermelho-violcea.
Os grnulos dos neutrfilos possuem leve excesso
de comedo bsico e coram-se fracamente com o componente azur. Os grnulos dos eosinfilos contm force
derivado bsico da espermina e coram-se imensamente pela eosina. Em conuaste, os grnulos dos basfilos
comm uma procena cida, heparina, que tem afinidade
com o componente bsico do corante.
A maioria dos corames de Romanowsky dissolvida em lcool merlico e combina fixao com colorao.
Entre os mwdos mais conhecidos esto os corantes de
Giemsa, Wright, Leishman e May-Grnwald-G iemsa. O
corante de Giemsa particularmente indicado para corar parasiws da malria e prorozorios.
COLORAES ESPECIAIS
Diversas coloraes especiais podem ser realizadas
nos esfregaos de sangue perifrico, medula ssea, im
prints e materiais de bipsia medular, as quais proporcionam informaes adicionais sobre a linhagem celular
alm das obtidas pelas coloraes-padro com corames
de Romanowsky ou de hemaroxilina-eosina. Elas geralmente enquad ram-se em duas categorias: coloraes
citoqumicas, que utilizam reaes enzimticas para
possibilitar a colorao, e corantes imu nociwqumicos,
que coram epiropos especficos das clulas. Esses corantes so particularmente teis na caracterizao de
neoplasias hemawlgicas e metastticas, distinguindo,
por exemplo, padres de diferenciao de granulciros
e monciros imaturos nas leucemias.
Coloraes citoqumicas
Mieloperoxidase: os grnulos pnmanos das sries

neuuoflica e eosinoflica contm a enzima mieloperoxidase. Os monciros coram-se fracamente, linfciws e
clulas vermelhas nucleadas so negativos.
Sudan Negro B: detecta fosfolipdios inuacelulares e
outros lipdios. A colorao positiva em neuufilos e
eosinfilos, fracamente positiva em monciros e usualmente negativa em linfciros.
Diagnstico hemarolgico: prin cpios e tcnicas
Esterase especfica (cloro-acetaco): identificao de

clulas blsticas mielides.
Esterase inespecfica (u -naftilbutiraro ou u - naftilacetaro): identificao de clulas monocticas.
Colorao para ferro pelo azul da Prssia: identificao de sideroblascos e sidermos e avaliao do ferro
medular (hemossiderina).
Colorao lmunohistoqumica
lmunohisroqumica uma das mais importantes ferramentas microscpicas utilizadas acualmente em hisroparologia e ciroparologia. Geralmente, a deteco de
antgenos em tecidos designada imunohistoqumica
e a deteco em clulas, imunociroqumica. Ambos os
mrodos utilizam anticorpos monoclonais conjugados
a marcadores que se ligam especificamente s procenas celulares investigadas (antgenos), permitindo sua
localizao em reas dentro das clulas, preservando
sua morfologia ou estrutura imerna. O marcador pode
ser um corame fluorescente, metal colide, hapteno,
marcador radioativo ou enzima, esta mais utilizada em
microscopia ptica.
CITOMETRIA DE FLUXO
Ciromeuia de fl uxo a tcnica de identificao, caracterizao e isolamenro de clulas individuais a partir

de suas propriedades fsicas. qumicas ou imunofenotpicas, que podem ser medidas por meios pticos. Emre
essas propriedades encontram-se o tamanho e a esuucura celular, comedo de DNA, dist ri buio ancignica e
atividades enzimticas.
Avanos nas tcnicas imunolgicas nas duas ltimas
dcadas permitiram a identificao de recepw res antignicos especficos na superfcie, ciroplasma e ncleo das
clulas leucocitrias (imunofenotipagem). Um grande
progresso na identificao desses marcadores foi alcanado com a descoberta da tcnica de hi bridomas para a
produo de reagentes puros e especficos em quantidades adequadas para uso laboratorial amplo: os anticorpos monoclonais (AcMo).
Os anticorpos monoclonais so conjugados a compostos fluorescentes (fluorocromos), que absorvem
35
energia luminosa de comprimenco de onda caraccersrico para cada composro. A cc-expresso de ancgenos
em uma mesma clula ou populao de clulas pode ser
dececrada pelo uso de dois ou mais anticorpos conjugados a diferences fluorocromos com espectros de emisso
discintos. A combinao de diversos anticorpos monoclonais contra antgenos celulares permice a identificao de populaes celulares especficas (Figura 4.6).
CD7 FITC
CDJ
CD45 PERCP
CD45 PERCP
Figura 4.6 - Marcao celular com amicorpos monoclonais conjugados com fluorocromos. Diagrama represemando a conjugao dos amicorpos monoclonais C07, C03 e C045, marcados
com fluorocromos, a diferentes srios antignicos de uma clula.
nomenclatura CD (cluster differentiation) foi
proposta e estabelecida em 1982 no 1st lnternational
Workshop and Conjerence on Human Leukocyte Dijjerentiatwn Ant1gens (HLDA), visando uma classificao
uniforme dos anticorpos monoclonais contra molculas de superfcie leucocicrias (ancgenos) desenvolvidos
mundialmente. Por ocasio da oicava conferncia realizada em 2004, 339 CDs j haviam sido identificados e
caraccerizados. Cada CD designado quando uma mesma molcula reconhecida por mais de um anticorpo
monoclonal. cescando-se os padres de expresso da
molcula-alvo em grande painel de clulas e tecidos. Estudos recentes estimam existirem mais de 4.000 diferentes molculas nas membranas leucocitrias.
A imunofenocipagem por citometria de fluxo a tcnica pela qual clulas ou outras partculas em suspenso.
alinhadas uma a uma, passam diante de um feixe luminoso (raio laser), possibilitando medir a percentagem e o
nmero de clulas positivas para os marcadores ucilizados.
A maioria dos citmecros de fluxo possui dois cipos de sistemas pticos de medida: de disperso de luz e de fluorescncia. O feixe luminoso, ao acingir a clula ou partcula,
dispersado gerando sinais que so captados por detectores adequados. A luz dispersada para freme uma medida do camanho celular (forward scatter. FSC). enquanto a
A
36
No estudo imunofenotpico por cicometria de fluxo, obtm-se dois tipos diferentes de informao para
cada clula e para cada marcador escudado: presena ou
ausncia do marcador e a quantidade de fluorescncia
obt1da. A Intensidade da fluorescncia corresponde afinidade da amoscra pelos corantes. refletindo o nmero
de molculas de antgenos.
RP~CD7 FITC
~.f7o
"-).
disperso lacerai (side scatter, SSC) define a granulosidade
e a complexidade interna da clula (Figura 4.7).
APLICAES HEMATO LG ICAS

O desenvolvimento de anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos e a marcao simultnea de diferentes antgenos celulares levaram a importantes conquistas
no diagnstico clnico. Entre elas. destacam-se a contribuio da citometria de fl uxo no escudo da hemacopoese normal. das subpopulaes linfocitrias em distintas doenas
e o diagnstico e classificao imunolgica de leucemias e
linfomas. Alm disto, o emprego dessa tecnologia tem demonstrado ser de grande utilidade em oueras reas, como:
qua ntificao de clulas pluripocenciais, em amoseras de medula ssea ou afrese perifrica para
transplante;
anlise de ciclo celular;
monitoramenco de doena residual mnima;
diagnstico de hemoglobinria paroxstica nocurna;
deteco de auto-a nticorpos e imunocomplexos;
diagnstico de crombocicopenias adquiridas;
contagem de reciculcicos;
realizao de provas linfocicrias cruzadas;
diagnstico diferencial de neoplasias epiceliais;
deteco de oncoprocenas, de receptores celulares para fa rores de crescimento e de hormnios.
CITOG EN TICA
PRINCPIOS BSICOS DA CITOGEN TICA

O exame cirogencico a anlise do conjunto cromossmica celular (caritipo) em seus aspectOs morfolgico e numrico. A deteco das alteraes do caritipo pode contribuir para o diagnstico, prognstico e
acompanhamento de diversas doenas.
Medicina laboratorial para o clnico )f---- - - - - - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- -
fiUOte~oe6ndo
Voto
Fluorew:inc10 lotuf'ltO
Flvoresdnc10 Vtm.'hg
R3
R2
50
~o-~~
50
f!IC-
rc
100 150 200 250
Tamanho
Figura 4.7 - Desenho esquemtiCO demonstrando o pnncp10 da

Otomema de Fluxo. Ver pog a 37
O complemento genrico normal em humanos

composto de 22 pares de aurossomos e o par de
cromossomas sexuais, chamado de conjunto dipli de (2n). A Figura 4.8 exibe um caritipo masculino
normal.
As alteraes cromossmicas podem ser estruturais e/
ou numricas e. resumidamente, sero descritas a seguir.
As alteraes estruturais dentro de um mesmo cromossoma podem ser:
Deleo (dei): ausncia de parte do cromossoma.
Inverso (inv): quebra com rotao de 180 do fragmento e posterior reunio ao ponto de quebra original.
Duplicao (dup): segmento de um homlogo presente em duplicao na seqncia original ou invertida.
lsocromossomo (i): formado pelo mesmo brao cromossmico, possivelmente a partir de erros na diviso
celular, permanecendo com duplicao de um dos braos e ausncia de outro.
Cromossoma em anel (r): formado a partir de duas
quebras e posterior reunio das extremidades.
As alteraes estruturais envolvendo mais de um
cromossoma podem ser:
Translocao (r): transferncia de segmentos de um
cromossoma para outro.
Derivativo (der): formado a partir de rranslocaes e
referido com o nmero do centrmero.
Insero (ins): adio de material genrico entre dois
segmentos normais de um cromossoma. Esse material
pode pertencer ao mesmo cromossoma ou ser originrio de ourro.
u :f
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)} ,.,,
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13
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14
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22
!
17
(
X
18
I
y
46,XY
Figura 4.8- Foromicrografia de carinpo masculino normal.
Cromossoma marcador (mar): formado por segmento cromossmica de origem desconhecida, deve possuir
cenumero.
As alteraes numricas referem-se ao nmero de
cromossomas. As clulas poliplides possuem ml-
37
tiplos do nmero bsico haplide que no o diplide, como, por exemplo, criploidia (3n) e tecraploidia
(4n). Variaes numricas que envolvam reduo o u
adio ao nmero, mas no de todo o conjunto, so
chamadas de aneuploidias, como as trissomias e as
monossom1as.
O estudo citogentico pode ser realizado em diferentes amostras biolgicas, como sangue perifrico,
medula ssea e tecidos, devendo ser utilizadas as clulas tumorais, que possuem d iviso espontnea. O
material de escolha o aspirado de medula ssea, que
poder ser processado imediatamente ou colocado
em cultura na incubadora de co2ou estufa por 16,
24 ou 48 horas. Caso no seja possvel a aspirao medular, o material poder ser obtido por bipsia. Para
os pacientes com contagem de leuccitos superior
a 10 x 10 9 /L - sendo no mnimo 10% dessas clulas
formas imaturas - poder ser utilizada amost ra de
sangue perifrico sem o estmulo com a fitohemagluti ni na, agente habitualmente utilizado na citogentica
clnica. Devero ser colecados 1 a 5 ml de medula ssea ou 10 mi de sangue perifrico utilizando-se como
anticoagulante a heparina sdica. Para o estudo citogentico dos linfomas, dever ser utilizado material
proveniente da bipsia de linfo nodos.
Assim que so obtidas as clulas em diviso,
agentes mitognicos (colchicina, co lcemide ou vinblastina) so adicionados cultura para a obteno das mecfases, fase em que os cromossomas
so mais bem visualizados. A seguir, as clulas so
submetidas a choque hipmnico co m clo reto de
pmssio (KCI), para aumento do vo lume e melhor
espalhamento dos cromossomas e posterior fi xao com sol uo de t rs pan es de metanol e uma
de cido actico (fixador de Carnoy) para conservao. Aps a fixao, a suspenso celular gotejada em lminas que so submetidas a bandamento
com tripsina (tratamento enzimtico que permi te
a ind ividualizao dos cromossomas), coradas com
corante de Wright e analisadas ao microscpio ptico. Devero ser contadas e analisadas 30 clulas
de cada preparao disponvel. Duas metfases de
cada clone celular so fotog rafadas, recortadas e o
caritipo montado. Em substituio fotografia e
ao recorte para a montagem do caritipo, pode ser
uti lizado um sistema de digitalizao das imagens.
A definio de clone celular adorada quando duas

ou mais clulas apresentam cromossoma extra ou a
mesma alterao estrutural ou monossomia do mesmo
cromossoma em mais de trs clulas. A descrio dos
caritipos feita de acordo com o lnternational System
for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN 2005).
Como mado previamente, para o estudo mogentico necessrio que as clulas estejam em diviso para
a obteno das merfases. A citogentica convencional
mostra alteraes relativamente grosseiras, ou SeJa, a
rea envolvida deve comer pelo menos cinco milhes de
pares de bases. Isto explica porque, em alguns casos que
apresentam exame esuutu ral normal. possvel detectar
a alterao gentica (crptica) por tc nicas mais sensveis,
como os mtodos gentico-moleculares.
A tcnica de hibridao in situ com fluorescncia
(FISH) um mtodo cicogencico-molecular que permite
a demonstrao morfolgica de seqncias de DNA ou
RNA em clulas, cortes de tecidos e preparaes cromossmicas. O mtodo baseia-se no princpio de que sequncias de fica simples de DNA ou RNA (sondas) marcadas
com fluorocromos ligam-se ao DNA ou RNA celular, em
condies propcias, formando hbridos estveis. A anlise realizada com microscpio de fluorescncia e as metfases ou os ncleos so fotografados (F1gura 4.9).
Figura 4.9- H1bndao 1n s1tu com fluorescnoa para pesquisa do

gene de fuso BCR ABL. Ver pog nn 38
O FISH, apesar do alto custo e de visar deteco de

anormalidades genticas especficas, cem como vantagens a rapidez de execuo, sensibilidade e especificidade altas e a possibilidade de utilizao de ncleos inter-
38 ( M edicina laboratorial para o clnico ]r-- - - - -- -- - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - -
fsicos. No entanto, deve-se salientar que a cirogentica

convencional permanece como mtodo imprescindvel,
j que permite detecm alteraes cromossmicas adiClonais presentes no diagnstico e no decorrer do uatamento de neoplasias hemacolgicas.
APLI CAES HEMATOLG ICAS

Um dos objetivos do estudo cicogentico na rea
de hematologia o estudo de quebras cromossmicas
feito em pacientes com sndromes que apresentam instabilidade cromossmica, tais como anemia de Fanconi,
ataxia telangiectasia e sndrome de Bloom. Esses pacientes apresentam quebras espontneas, as quais tm sua
freqncia aumentada pela adio de drogas indutoras
especficas do meio de cultura.
No estudo das leucemias, a deteco de alteraes
cromossmicas especficas por citogentica convencional e FISH permite d1ferenciar subgrupos com comportamento clnico-biolgico particular. alm de contribuir
para o melhor entendimento da doena e auxiliar na
escolha da melhor opo teraputica. Durante o acompanhamento, a utilizao dessas tcnicas permite a deteco de recada e de evoluo clonai.
Ademais, a cicogentica convencional e o FISH podem ser utilizados para avaliao de quimerismo. O quimerismo a coexistncia de clulas de dois organismos
diferences (provenientes de dois zigotos distintos) em
um nico indivduo. Na avaliao de pacientes submetidos a transplante de clulas-tronco hematopoticas
(TCTH), a utilizao dessas mecodologias apresenta a
limitao de que doador e recepcor devem possuir sexos diferences, po1s a anlise realizada comparando-se
a constituio cromossmica sexual dos mesmos. No
caso de doador e receptor do mesmo sexo, a monitorao apenas poder ser feita se um deles possuir algum
heteromorfismo cromossmico.
MTODOS GENTICO-MOLECULARES
Em alguns centros de referncia, crescente a disponibilidade de diferences metodologias moleculares para a

deteco das alteraes genticas associadas a doenas
hematolgicas, desde as mais simples, como as baseadas
na reao em cadeia da polimerase (PCR), at as mais

complexas, como os microarrays.
APLICAES HEMATOLGICAS
O estudo gentico-molecular de mutaes que determinam uma variedade de doenas hematolgicas
hereditrias mtodo de rotina para o diagnstico de
algumas delas, particularmente na fase pr-natal. Alguns
exemplos dessas doenas incluem:
herana autossmica recessiva: anemia falciforme,
talassemias e doena de Gaucher;
herana autossmica dominante: esferocitose hereditria, trombofilia devida ao fator V de Leiden e
vrias formas da doena de von Willebrand;
ligao com o cromossoma X: deficincia de glicose-6-fosfato desidrogenase e hemofilias A e B.
Por ourro lado, um alto nmero de doenas hemacolgicas adquiridas, como as leucemias e os linfomas,
resulta de alceraes em vrios genes regu latrios. Algumas dessas alteraes no podem ser detectadas
por meio da cicogentica convencional (crpticas), mas
o produto qUimrico pode ser evidenciado por tcnicas
moleculares. A utilizao dos testes moleculares para o
estudo dessas doenas tem grande importncia no s
para o diagnstico, como tambm para a esrratificao
de risco e a identificao de alvos para o monitoramenco da doena residual mn ima (ver captulo 29) e para a
teraputica dirigida.
Ouuas aplicaes de importncia dos mtodos gentico-moleculares na hemacologia incluem:
a deteco de polimorfismos de nucleotdeo
nico (SNPs) nos genes que codificam o complexo de histocompatibilidade (HLA - human
leucocyte antlgens). Arualmeme, o status dos antgenos HLA investigado para avaliao da compatibilidade por metodologia molecular, ames de
transplantes de clu las-tronco hematopoticas e
de outros rgos;
a anlise de quimerismo, mtodo cada vez mais
utilizado para a monicorizao da presena do
enxerto no paciente no perodo ps-TCTH. Nessa
fase do rratamenco, essa anlise pode auxiliar na
deteco precoce de recada ou rejeio.
39
CONSIDERAES FINAIS
REFERNCIAS
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Publtshing; 2006.
Barch MJ, Knutsen T. Spurbeck JL. The AGT CytogenetiCs
Laboratory Manual. ew York: L1pp1ncou-Raven Publtshers; 1997.
O d1agnstico laboratonal das doenas hematolgicas, especialmente as neopls1cas. deve ser multidlsophnar. Os relevantes avanos ocorridos na medicina labo-
2.
rarorial nas lrimas dcadas perm1mam desvendar. com
3. Beutler E, Llchrman MA, Coller BS, K1pps TJ, Sellgsohn U.
nvel crescente de sofisticao e complexidade, a grande

heterogeneidade envolvida na parognese dessas doenas. possibilitando diagnsticos mais precisos, a criao
de protocolos individualizados e a monitorizao da doena residual mnima ao longo do tratamento.
S.
6.
7.
8.
9.
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40
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Sysrem for Human Cyrogener1c Nomenclacure. Basel:
Karger; 2005.
os
Myriam de Siqueira Feitosa

Rosngela Ftima Di Lorenzo Pires
DIAGNSTICO BIOQUMICO:
PRINCPIOS E TCNICAS
PRINCPIO
ESPECTROFOTOMETRIA
As dererminaes especrroforomrricas ganha-
Quando uma rad iao elerromagnnca (luz) ime-
ram significariva popularidade no laborarrio clnico,
rage com a marna, os romos e molculas emirem
principalmente pela sensibilidade, especificidade e fa-
uma energia radtanre, que pode ser derecrada na for-
cilidade na execuo das dererminaes bioqumicas
ma de luz visvel ou invisvel. Newron descobriu, em
em amosrras biolgicas, das rcnicas manuais s gran-
1600, que a luz branca uma misrura de vrias cores.
des auromaes.
Mais rarde, Thomas Young demonsrrou que a luz se
Quase rodas as subsrncias de inreresse clnico para o
propagava em ondas cujo comprimenco define a cor
diagnsrico e comrole rerapurico de doenas humanas
da luz, variando de 380 nm a 760 nm a regio do es-
podem ser quamtflcadas por merodologia especrroforo-
pectro visvel. A regio acima e abaixo corresponde
mrrica, que a capacidade de uma subsrncia ou um
regio do infravermelho e ulrravioleca, respecrivamen-
produro derivado de reao bioqumica em absorver ou
ce. De faro, essas regies so someme uma pequena
emirir luz, em um dererminado comprimemo de onda,
parre da famlia da radiao conhecida como espectro
sob condies fsico-qumicas esrabelecidas. (Figura 5.1)
eleuomagncico.
Cor a sensao fisiolgica associada a um com primemo de onda. Objeros possuem cor porque refie-
Espectrofotometria
rem comprimemos de onda especficos, porramo, cor

relaciona-se com o espectro de energia radiame. Todas
as cores somadas resultam na cor branca. As subsr nfeixe
incidente
feixe
emergente
cias emirem cores diferences daquelas que absorvem.

Por exemplo, uma soluo de cor azu l absorve rodas
as cores, excero o azul, que reflerido. As cores absor-
Soluo
vidas e reflecidas so dicas complemencares.

A maioria das anlises bioqumicas rea lizadas no laborarrio clnico baseia-se no princpto da quamidade
de luz absorvida ou reflerida, de acordo com as leis de
Cu beta
Figura 5.1 - Pnncpto da espe([roforomerria.
Beer e Lambere:
1 Lei de Lambere quando a concentrao de um

analiro consrame. a absoro depende do comprimento do caminho ptico.
2 Lei de Beer: quando o camtnho ptico constante
e igual a 1, a concentrao diretamente proporcional
quantidade de luz absorvida ou inversameme proporcional ao logartimo da luz transmitida, em relao luz
incidente:
A= abc= log (100 I %T) onde
A= absorvncia
a= absortividade do composto, sob determinadas
condies
b= dimetro da clula analtica (cubeta)
c= concentrao do composto
%T= porcentagem de transmitncia. (Figura 5.2)
<t:
'
c
O
>
..0
<t:
concentrao
concentrao
Figura 5.2 - Relao da absorvnCia (A) e porcenragem de trans-
mitnCta (%T).
A determinao da concentrao do analito feita
a partir da comparao de uma soluo padro de concentrao conhecida da mesma substncia. Quando a
concentrao tem relao linear com a absoro. calcula-se o fator de calibrao, que multtplicado pela absorvnoa da substncia a ser quantificada, encontrando-se
assim a concentrao.
Exemplo: Dosagem de glicose em plasma sanguneo

Padro =100 mg/dL
Abs (00)=0,120
Fator de calibrao =100 I 0,1 20=833
Absorvncia (abs) da amostra= 0,095
Concentrao de glicosena amoscra =0,095 x 833=79 mg/dL
Quando uma substncia no segue a lei de Beer, ou
seja. no h linearidade entre absoro e concentrao.
usa-se uma curva de calibrao por meio de grfico da
absorvncia de padres de concentraes conhecidas. A
concentrao desconhecida calculada interpolando-se
os valores na curva.
ESPECTROFOTMETRO
Os principais componentes do espectrofotmetro
so a fome de luz. o monocromador, o compartimento
para amostra, o detector e o dispositivo de leitura. A
fonte de luz incandescente de tungstnio usada para
comprimento de ondas na regio visvel (320 a 1000
nm) e de deutrio para regio UV (100 a 390 nm). O
monocromador separa a luz em bandas individuais. O
compartimento para amostra, ou cubetas, geralmente
de quartzo, quadrada, com 1 cm 2. Para medir pequenas amostras, microcubetas podem ser usadas. Um
tipo de dispositivo foi desenvolvido para facilitar e agilizar a rotina laboratorial, o fl uxo contnuo, cuja amostra
levada para a cubeta atravs de tubos de teflon, por
bomba peristltica. O detector converte a radiao eletromagntica em sinal eltrico. H relao direta entre
a intensidade da radiao e o sinal eltrico produzido.
Hoje, com o avano tecnolgico, os especcrofotmetros microprocessados permitem funes automticas,
armazenamento de dados, clculo de curva-padro, mais
sensibilidade e confiabiltdade nos resultados, menor volume de amostra e reagentes, controle de temperatura e
facilidade operaoonal.
ELETROFORESE
PRINCPIO
t a separao de molculas baseada na sua carga

eltrica sob a ao de um campo eltrico externo.
42 [ Medicina laboratorial para o clnico ) 1 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - -
Quando uma voltagem aplicada a uma soluo, gera-se uma corrente eluica pelo fluxo dos ons: ctions
(partculas com carga positiva) migram em direo ao
plo negativo (catado) e nions (partculas com carga
negativa) em direo ao plo positivo (anodo). Muitas
molculas orgnicas so anfotricas, ou seja, podem
estar carregadas positiva ou negativamente, dependendo do pH da soluo. A mobilidade, ou taxa de migrao, da molcula dependeme de vrios fawres:
carga eltrica: quamo maior a carga, mais rpido
ela se move no meio de suporte; ou seja, mais se
afasta do ponto de aplicao;
tamanho: quamo maior o peso molecular (pm),
menor o deslocamento;
propriedades do meio de suporte: meio poroso separa as partculas por carga e por tamanho,
meio viscoso diminui a mobilidade e adsoro da
partcula;
fora do campo eltrico: quanto maior a voltagem, mais rpida a migrao;
e ndosmose: quando o meio de suporte adsorve ons hidroxila do tampo, w rnando-se carregada negativameme, h retardo na migrao
das molculas;
fora inica do tampo: quanto menor a fora
inica, mais rpida a migrao;
temperatura: o aumento da temperatura aumenta a taxa de migrao.
Portanto, tendo em vista wdos os fato res influentes
sobre a migrao elet rofortica, ao ser aplicada uma diferena de potencial a uma mistura de macromolculas com taman ho e/ou cargas diferentes, as molculas
migraro com velocidades e/ou direes diferentes, dependendo de seus tamanhos e cargas. Deve haver equilbrio entre todos os fatores citados, de modo a permitir modelos de migrao sem distoro, com exatido,
sensibilidade e qualidade dos resultados obtidos.
SISTEMA DE ELETROFORESE
O sistema de eletroforese composto de uma cuba

com tampa, meio de suporte, reagentes (tampo, corante
ou revelador, fixado r, transparentizador), fonte eltrica de
corrente contnua, densitmetro. A cuba de eletroforese
Diagnstico bioqumico: princpios e tcnicas
consiste de duas cmaras no comunicveis entre si, nas

quais colocado o tampo e nivelado entre os dois lados.
Entre as duas cmaras, que possuem os eleuodos responsveis pela passagem da corrente eltrica, fica um suporte
no qual colocada a amostra biolgica a ser analisada (Figura 5.3). Vrios tipos de tampes e meios de suporte podem ser usados, dependendo da substncia a ser separada
e quantificada. A evoluo dos meios de suporte, com elevado grau de pureza e propriedades bem definidas, permite separao mais ntida e estvel dos elementos:
/
/
tampo
tampo
I Eletrodo (+)
ponte
Eletrodo
fonte
(li
Figura 5.3 - Diagrama de uma cmara de eletroforese.
acetato de celulose: material desenvolvido para

reduzir a natureza polar do papel. atravs da acetilao do radical hidroxila da celulose. O material
prensado em fitas resistentes. algumas das vantagens do seu uso so o baixo custo e a necessidade
de menor volume de amostra (1 a 2 ~L);
gel de amido: preparado aquecendo-se uma soluo de amido a 100 c, colocado sobre um suporte. trabalhoso e pouco usado;
gel de agarose: mais fcil de manusear que o amido, com menos adsoro da amostra;
gel de poliacrilamida: formado pela polimerizao de dois compostos monomricos, a acrilamida e a n,n-metileno-bis-acrilamida.
Os corantes mais usados so a ninhidrina, sudan black B, Ponceau S, Fat Red 7B e amido black.
O densitmetro mede a absorvncia do corante no
meio de suporte, por meio de um mecan ismo tico. O
sistema percorre a fita, registra a densidade tica de cada
frao e traa o perfil eletrofortico. Atualmente, existe no mercado densitmetro integrado ao sistema de
43
elecroforese capaz de capcurar o traado elecroforcico.

analisar e imerprerar os resulrados abridos.
APLICAO CLN ICA
A eletroforese encontra apl icaes cama na pesquisa

e no desenvolvimento biocecnolgico (DNA recombi name) quanto nos diagnsticos clnico e forense.
A aplicao da eletroforese no laboratno clnico
diversificada. sendo utilizada na separao e quantificao de procenas sricas. anlise de isoenzimas (LDH.
CPK. fosfatase alcal1na), hpoprocenas. hemoglobinas e na
separao de cidos nuclicos.
Pelo pri ncpio da eletroforese, novas mecodologias
foram desenvolvidas com o objecivo de melhorar a especificidade e sensibilidade do reste, diminuir o volume de
amoscra, tempo de anlise e aucomatizao do processo:
Focalizao isoeltrica: a base de separao pela
carga da molcula em um gradiente de pH. A principal
aplicao tem sido o escudo de isoenz1mas da fosfatase alcalina em eritrcicos e soro. procenas em bipsias e
bandas monoclonais em lquor.
Eletroforese de protenas em alta resoluo: a tcnica
envolve o uso de gel de agarose sob alta voltagem e com o
resfnamenro do SIStema. Aelerroforese de protenas em lquor,
por alea resoluo. cem sido considerada efeciva no diagnscico

da esclerose mlcipla. alm do escudo das doenas linfoproliferativas. especialmente doenas de cadeia leve.
Eletroforese capilar: tambm chamada de eletroforese de zona capilar ou elecroforese capilar de alta performance, um avano na ccnica de separao, auwmacizada e com resultados rpidos nas identificaes das
fraes de procenas no soro, urina, lquor e hemoglobinas variantes.
CROMATOGRAFIA
A cromacografia pode ser definida como um sistema

que separa os componentes de uma mistura (soluo)
pela incerao do composco com uma fase estacionria
e outra mvel medida que atravessa o meio de suporte. A fase estacionria aquela composta pelo meio de
suporte e qualquer solvente e a fase mvel aquela em
que h o fluxo de gs (cromacografia gs) ou lquido
(cromacografia lquida) pelo sistema. O mcodo cromatogrfico classifica-se geralmente de acordo com o mtodo de separao (princpio cromatogrfico. o tipo da
fase mvel e fase estacionria).
Quanco aos mecanismos de separao fsico-qumicos, a cromacografia classifica-se em (F1gura 5.4):
Papel
Camada delgada
em a lta resolu o
Ca mada delgado
Figura 5.4 - Class1ficao da cromatografia.
44
Medicina labora torial para o clnico
)1-- - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - -
Os princpios de separao das cromacografias lqui-
cromatografia lquida por:

adsoro (lquida/slido)
da e gasosa tm os mesmos fundamentos. As bases fsi-
partio (lquida/lquido)
co -qumicas do processo de separao fundamentam-
troca inica
permeao (filtrao por gel ou molecular).
se em dois equilbrios: o de fase e o de distribuio. O

equilbrio de fase refere-se ao estado de equilbrio entre
slido, lquido e gasoso, como, por exemplo, as tcnica s
cromatografia gs por:
de sublimao e outras de destilao. Os equtlbrios de
adsoro (gs/slido)
distribuio referem-se s diferenas de solubilidade
partio (gs/lquida)
adsoro de uma substncia entre duas fases imiscveis.

Encontra-se no Quadro 5.1 a classificao de cromatografia quanto ao princpio da tcnica:
Na cromatografia por adsoro (lquida/slido. ou
gs/slido). o composto adsorvido a um suporte slido, como a slica ou alumina. Na cromatografia por partio (lquido/lquido. L/L ou gs/lquido. G/L). os solutos
so separados pelas diferenas na distribuio entre as
fases lquidas ou entre o gs e a fase lquida. A troca inica usa coluna com grupos inicos ligados covalentemente a um polmero na fase estacionria. onde pode
haver troca inica, de forma reversvel. com a fase mvel.
Na filtrao por gel. os solutos so separados conforme
o tamanho das partculas, em relao aos poros do gel
na fase estacionria.
CROMATGRAFO
O cromatgrafo o equipamento usado para a realizao da separao cromatogrfica. Ele consiste de cinco
unidades bsicas: um sistema para o suprimento da fa se
mvel, injetor de amostra, uma coluna ou coluna aberta.
um detector (fotmecros. fluormetros. sistemas elecroqumicos, condutividade trmica, ionizao de chama) e
um processador de dados. O sistema para o suprimenco
da fase mvel pode variar de um simples cilindro de gs
a um complexo mecanismo de mbolos conectados a
quatro ou cinco reservatrios de solventes.
Quadro 5.1 -Classificao dos mwdos cromawgrficos.

Princpio cromatogrfico
Tipo de fase mvel
Dispositivo da fase estacionria
Tipo de cromatografia
Adsoro
Competio entre um
odsorvenfe slido e o fase mvel
Gs
Coluna
Gs/ Slido (GS)
Coluna
Lquido
Camada plano
Partio
Competio entre o fase estacionrio
lquido e o fase mvel
Troco inico
Competio entre a resina de troco
inica da fase estacionrio e o fase
mvel lquido
Gs
Coluna
lquido
Coluna
Lquido (LI
HPLC
Delgado (D)
Popei(P)
Gs/ Lquido iG/ LI
Lquido/ lquido (LL)
HPLC
Troco inico (TI)
Lquido
Permeao
Competio entre o polmero do motriz Lquido
e o fase mvel lquido
Coluna
HPIC * *
Coluna
Filtrao por gel
t tPLChigh performance liquid chromarography

HPICh1gh performanceionchromarography
Diagnstico bioqumico: princpios e tcnicas
45
APLICAO CLN ICA
Devido ao grande nmero de combinaes entre as

fases mvel e estacionria, a cromatografia um procedimento importante no laboratrio clnico, permitindo separar misturas complexas, identificando e quantificando
as substncias individualmente, sendo o mtodo de referncia em toxicologia (drogas teraputicas e de abuso).
Em geral, a cromarografia a gs usada para a separao de materiais volteis. A cromatografia lquida separa lquidos no volteis e slidos. Muitas substncias
no volteis, tais como aminocidos, esterides, cidos
graxas de alto peso molecular, so derivatizadas em subprodutos volteis e dosados por cromatografia gasosa.
Peptdeos, polipeptdeos, protenas e outros biopolmeros so separados somente por cromatografia lquida. A
evoluo da cromatografia lquida de alta presso, inicialmente para separar e medir a concentrao de drogas
e seus metablicos nos lquidos corporais, alcanou os
limites de picogramos para uma grande variedade de
compostos de interesse clnico.
A cromatografia lquida em coluna e a cromatografia
a gs tm algumas desvantagens: tempo de preparo da
amostra, tempo de anlise, necessidade de pessoal altamente capacitado e custo elevado do equipamento e
sua manuteno.
presena de uma fonte com voltagem constante, chamada de eletrodo de referncia. O eletrodo usado para
a medio chamado de eletrodo indicador. A concentrao de determinados ons em uma soluo pode ser
obtida medindo-se a diferena de potencial entre esses
dois eletrodos, pelo potencimetro.
ELETRODOS DE REFERNCIA
Existem vrios tipos de eletrodos de referncia. O eletrodo saturado de calomel e o de prata/cloreto de prata
(Ag/Agcl) so muito usados na prtica. O eletrodo de
referncia tem potencial fixo, independentemente da
atividade do analito. Nos equipamentos de medida, esse
potencial comparado ao potencial gerado por um ou
mais eletrodos indicadores, para calcular a atividade do
analito desejado.
ELETRODOS ON SELETIVOS
Eletroqumica engloba a medida da voltagem ou corrente eltrica gerada pela atividade de ons especficos. No
laboratrio clnico, so especialmente usados os procedimentos baseados na potenciometria e amperometria.
Potenciais de membrana so causados pela permeabilidade de certos tipos de membrana a determinados

ctions ou anions. Um eletrodo on seletivo consiste em
uma membrana seletiva para o on a ser medido, separando-se uma soluo de referncia de concentrao
fixa para esse mesmo on e um elemento de referncia
de uma soluo a ser analisada. muito sensvel e especfica para o on a ser analisado. A complexidade do design
depende da composio da membrana que determina a
seletividade da mesma. Existem vrios tipos de eletrodos
on seletivos, como eletrodos de vidro, eletrodos lquidos
de troca inica e eletrodos de fase slida.
POTENCIOM ETRIA
ELETRODOS DE VIDRO
Potenciometria a diferena de voltagem ou potencial eltrico entre dois eletrodos numa clula eletroqum ica, quando nenhuma corrente externa aplicada
e a clula est em equilbrio. A clula eletroqumica
composta de dois eletrodos conectados por uma soluo eletroltica conducora. Um eletrodo consiste em um
condutor metlico nico em uma soluo eletroltica.
Para medir o potencial de um eleuodo, necessria a
Eletrodos de vidro so feitos de vidro especialmente

formulado com diferentes composies, para determinar a seletividade para H+, Na+, K+, Li+ e outros. Eles foram os primeiros e ainda so os mais comuns para medir
pH. So tambm muito usados para medir Na+ no soro.
Eletrodos com superfcie achatada tm sido usados para
medir Na+ diretamente na pele para diagnstico de fibrose cstica.
ElETROQUMICA
46
Medicina laboratorial para o cln ico ]1---- -- - -- - -- - - -- - -- - - - - - - - -- --
ELETRODOS DE FASE SLIDA

Podem ser de membranas homogneas ou heterogneas. O eletrodo de clorew de prata rem sido usado
para medir direrameme a atividade de Cl-.
ELETRODOS DE TROCA IN ICA

Uma membrana lquida de troca inica consiste
numa substncia carreadora de ons seleriva envolvida
por um solvente inerte. A membrana lquida pode ser separada da soluo a ser restada por uma membrana de
coldio; ou uma matriz porosa pode ser embebida pela
membrana lquida. Essas membranas so muito usadas
para medir K+, NH4+,e Ca 2+
ELETRODO DE pC0 2
Incorpora os dois elecrodos, referncia e indicador,
em um mesmo sensor. A amostra fica em comam com
a membrana que, nesse caso, permevel ao gs e no
soluo. O gs difunde-se atravs da membrana e entra
em coma to com uma soluo de bicarbonaw, alterando
o pH dessa soluo, que medido por um eletrodo de
vidro interno.
AMPEROMETRIA
baseada na medida da corrente que passa atravs
de uma clula eletroqumica quando aplicada uma voltagem constante aos elerrodos. Uma importante aplicao dessa tecnologia o elerrodo de p0 2. descriw originalmente por Clark. O sensor consiste em um carodo
de platina, um anodo de prata, uma soluo elerroltica
e uma membrana gs permevel. Uma voltagem constante mantida entre o catodo e o anodo. O oxignio
da amostra passa atravs da membrana e reduzido no
catodo. Ao chegar ao anodo, ele doa os elrrons recebidos. A quantidade de oxignio reduzido direramenre
proporcional ao nmero de eltrons recebidos no carodo. Assim, pode-se determinar a quantidade de oxignio
na soluo medindo-se a mudana na corrente (fluxo de
eltrons) entre carodo e anodo.
Diagnstico bioqumi co: princpios e tcnicas
Alguns biossensores desenvolvidos nos ltimos anos

incorporam a amperomerria para medir alguns analiws.
Essa tecnologia tem se expandido para atender demanda de restes realizados em laboratrios-satlite ou
em unidades de tratamento intensivo e/ou de emergncia. O primeiro biossensor desenvolvido foi para medir
glicose e, desde ento, alguns outros esto disponveis,
como uria, bilirrubinas e lactaro. medida que novos
sensores tornam-se disponveis, cresce a demanda por
outros sensores.
AUTOMAO EM QUMICA CLNICA
Analisadores automticos no laboratrio permitem

que sejam processadas muitas amostras em curw perodo de tempo, graas maior velocidade de realizao
das anlises. Em uma hora, podem ser feitas centenas ou
milhares de anlises nesses equipamentOs. A auwmao
permite tambm a eliminao de passos ou tarefas repetitivas e monwnas, que podem levar instabilidade ou
erro nas anlises. melhorando de forma significativa a reprodutibilidade dos restes. Embora a melhoria da reprodutibilidade no seja acompanhada necessariamente de
maior exarido, j que esra est ligada ao mwdo analtico usado, houve melhoria significativa na qualidade dos
exames laborawriais nos ltimos anos. lsw ocorreu devido combinao de equipamentos automatizados. cada
vez mais bem projetados. com bons mwdos analticos
e programas eficazes de garantia da qualidade.
Em geral, os sistemas auwmatizados so verses mecanizadas de tcnicas e procedimentos laborawriais manuais, tais como:
identificao da amostra e do paciente;
medida e adio de reagentes;
pipetagem da amostra;
homogeneizao de amostra e reagente;
incubao da mistura;
calibrao do ensaio;
medida e leitura da reao;
liberao do resultado e armazenamento dos dados.
As amostras so transportadas dentro do equipamenw de modos diferentes, dependendo do tipo de
equipamento. Em analisadores de fluxo contnuo, o fluxo feiw por bombas perisrlricas. Em analisadores de
47
acesso randmico, o transporte pode ser feiro por seringas, probscides com ponteiras descartveis acopladas
e agulhas de aspirao. A pipetagem dos reagentes tambm feira por seringas ou agulhas. Os reagentes ficam
armazenados no prprio equipamento, em geral em
quamidade suficieme para trabalhar horas ou mesmo

dias. As diluies das amostras e reagenres tambm so
feitas por seringas ou agulhas adaptadas para aspirao.
As diluies podem ser previamente programadas, assim
como os volumes de amostra e reagentes utilizados. A
incubao da reao feita de maneira a manter a temperatura constante, com mnimas variaes.
A dosagem dos analiros baseia-se tradicionalmente
na espectroforomerria. Alguns analiros, ons como sdio, porssio e cloro, so medidos pela incluso nesses
equipamentos de elerrodos on-selerivos. Mrodos alternativos incluem forometria de reflectnCia, como nos
equi pamentos de qu m1ca seca e fl uo romema.
A introduo de computadores nos instrumentos
laboraroriais permitiu que os usurios visualizassem os
resultados em diversos formaros. Entre outras funes,
eles podem fazer clculos, curvas de calibrao e controle Interno da qualidade. Podem acumular dados dos
pacientes, do controle da qualidade e das calibraes.
Os resultados podem ser enviados direramenre ao
sistema do laboratrio, evitando-se a transcrio manual
dos mesmos, onde podero ser avaliados para serem liberados para o paciente e/ou mdico-assistente.
A escolha do instrumento ou equipamenro a ser utilizado em cada servio depender de inmeros aspectos tcnicos e econmicos. Nenhum instrumento pode
atender todas as necessidades de laboratrios de porres
diferences. Existe no mercado uma demanda crescente
de eficincia e rap1dez. levando os laboratrios a prover
serv1os de mane1ra mais rpida, com menor cusro e
a automao em qumica clnica se estendeu a outras
reas do laboratrio, especialmente para a dosagem de
hormnios e imunoensaios.
Muiros dos princpios analticos usados para determinao de constitUintes sricos so tambm usados para
analisar os mesmos constitUintes na urina. A auromao
de dosagens urinrias mais difcil, pois muiros constituintes esto presentes em concentraes bem menores
que no soro, exigindo menor limi te de deteco e maior
faixa de linearidade da reao. que permitam a medida
de concentraes maiores do anal iro sem diluies.
TESTES LABORATORIAIS REMOTOS

Aps a introduo dos analisadores de bancada no
incio dos anos 80, surgi u uma nova gerao de lnsrrumenros cada vez mais compacros. auromarizados e de
mais fcil manuseio. Existem agora muiros instrumentos
compactos. para uso fora do laboratrio central, em salas
de emergncia, unidades de rraramemo intensivo, blocos cirrgicos. asilos, etc. Esses instrumentos podem ter
grande variedade de restes d1sponveis e usar vrios tipos
de amostra. preferencialmeme sangue rotai. eliminandose a etapa de preparo da amostra. A maioria usa pequenos volumes de amostra, menores que 50 ~ L. e libera
resulcados em at 15 minutos. Os reagentes usados, em
geral, so prontos para uso. assim como os calibradores
e controles. O crescimemo rpido desses insrrumemos
rornou-se possvel pelo avano tecnolgico dos microprocessadores, elerrodos on-selerivos e biossensores.
J existe no Brasil regulamentao do funcionamenro dos laborarnos clnicos deliberando sobre o com role
da qualidade em rodos os procedimentos. incluindo os
restes laboraroriais remoros. O manuseio, controle da
qualidade e treinamento do pessoal envolvido deve ser
supervisionado e documentado pelo laboratrio clnico.
REFERNCIAS
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laborarnos de pesqUisas biomd1cas. Porto Alegre: Arrmed; 2002.
2. Henry JB. Ciln1cal d1agnosis and managemenr by laborarory merhods. 20th ed. Phdadelph1a: W. B. Saunders;
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and selectlon. Phdadelphia: W. B. Saunders; 1994.
1.
]r-- - - - - -- - - - -- - - - - - - - -- -- - - - - - - -
Leonardo de Souza Vasconcellos

Silvana Maria Eloi Santos
06
DIAGNSTICO IMUNOLGICO:
PRINCPIOS E TCNICAS
Define-se como teste sorolgico todo ensaio laboratorial que envolva uma reao imunoqumica de ligao
de molculas de anticorpo a um ou mais determinantes
antignicos, levando formao de imunocomplexos.
IStO . complexos antgeno-anticorpo.
PRINCPIOS GERAIS
DOS TESTES SOROLGICOS
Na prtica do laboratno clnico, o teste sorolgico pode ser empregado tanto na procura de antgenos
quanto na procura de anticorpos. Como uma reao
qumica, h o envolvimento de uma constante de assoCiao e uma constante de dissociao cujo efeito somatno produz uma constante de equilbrio.
Ag + Ac =; AgAc
Os diferentes tipos de reaes sorolgicas so nomeados em funo dos princpios utilizados na deteco
do 1munocomplexo formado. Assim, resumidamente.
temos a precipitao, em que antgenos e anticorpos
solveis so misturados e ao reagiram entre si formam
um precipitado insolvel que pode ser visualizado. Na
aglutinao. outra reao imunolgica clssica, um ou
ambos os componentes da reao esto sob a forma
de partculas em suspenso. que so aglutinadas quando da formao dos imunocomplexos. Na floculao,

tcnica utilizada na reao de VDRL, o antgeno empregado. um composto de cardiohpina-lecitina-colesterol.
no se encontra sob a forma de partcula. mas. por
sua composio hpd1ca. tambm no solvel. Ass1m,
cunhou-se o termo floculao para a reao que se forma quando da combinao de anticorpos sricos com o
antgeno do VDRL, uma vez que flocos so visualizados
microscopia ptica.
Outros mtodos sorolg~eos envolvem uma segunda etapa, na qual um segundo anticorpo. antiimunoglobulina humana, encomra-se conjugado com
algum marcador que pode ser detectado por diferentes maneiras. Nas tcnicas de imunofluorescncia, o
marcador utilizado a molcula de 1sotiocianato de
fluorescena que, quando excitada pela luz ultravioleta.
emite uma cor esverdeada, que visualizada em um
microscpio apropriado. J nas tcnicas imunoenzimticas, utilizam-se compostos enz1mticos e seus respectivos substratos para a pesquisa do imunocomplexo. A
reao final mensurada por um espectrofotmetro.
que avaliar a mudana de cor da soluo do substrato.
Nas reaes de radioimunoensaio, agora em desuso,
so utilizados compostos rad1oat1vos que em item raios
gama detectados por contadores de radioatividade e.
nas tcnicas de quimiluminescncia. empregam-se
compostas capazes de emitir ftons. que sero detectados por leirores de luz.
CONCEITOS BSICOS DE IMUNOLOGIA

Para o bom entendimento de tais tcnicas, torna-se
necessrio relembrar alguns conceiros bsicos da imunologia e da imunoqumica.
No final do sculo XIX, o termo "amicorpo" foi utilizado para indicar o fator presente no soro responsvel pela
resposta administrao de um "amgeno", ouu o vocbulo introduzido para designar qualquer substncia (na
ocasio, princi palmente clulas e microrganismos) capaz
de induzir uma resposta imune contra si. Vrios outros
termos foram historicamente usados para indicar diferentes atividades dos anticorpos (agluti ninas, preopitinas,
opsoninas), uma vez que as caractersticas fsico-qumicas
dos antgenos e dos anticorpos no eram conhecidas.
A partir de Paul Ehrlich (1 854-1915), que sugeriu que
reaes imunolgicas ti nham uma base qumica, uma
nova fase da imunologia foi desencadeada, a fase da imunoqumica. Em 1936, Heldelberger e Kendall purificaram
anticorpos a partir da dissociao de precipitados por
solues salinas concentradas. Posteriormente, foram
aplicados mtodos de ultracentrifugao (1937) e eleuoforese (1938), quando se confirmou que os anticorpos
pertenciam frao globulina das protenas sricas de
baixa mobilidade, designadas ento de gamaglobulinas.
Atualmente, considera-se que o sistema imune humano seja produto de milhes de anos de evoluo de
sistemas primordiais presentes ta nto em invertebrados
(de onde provavelmente deriva o chamado sistema imune inato) quanto em vertebrados (de onde deriva o sistema imune adaptativo).
Por sistema imune inato emende-se o conju nto
de fenmenos moleculares e celulares que envolvem
algumas linhagens celulares (macrfagos, granulcitos, clulas dendrticas, clulas NK) que utilizam um
nmero limitado de receptores proticos codificados
na linhagem germinal (germ-line encoded proteins),
conservados ao longo da evoluo (tambm conhecidos como receptores de reconhecimento de padro primitivo ou RRPP), que reconhecem padres
(motifs) moleculares comuns (lipdios e carboidratos)
altamente conservados nos microrganismos. Entre as
pri ncipais aes do sistema imune inato, destaca-se a
ativao do complemen to, fagocitose, citotoxicidade
celular e produo de ci tocinas, quimioci nas e peptdeos antimicrobianos.
J o sistema imune adaptativo envolve a participao de recepto res antignicos em linfcitos T e B gerados por rearranjo gentico clone-especfico, de forma
que individualmente tais clulas expressam em sua superfcie apenas um nico tipo de receptor antignico,
que capaz de reconhecer um limitado nmero de (ou
um nico) determinantes antignicos. Outra caracterstica do sistema imune adaptativo o desenvolvimento de uma resposta anamnstica, isto , uma resposta
imune secundria exposio antignica subseqente
exposio primria. Essa resposta secundria que ocorre
aps um tempo considervel depois da primeira exposio ao antgeno geralmente mais rpida e intensa.
Assim, o brao adaptativo do sistema imune responsvel pelas suas propriedades relativas "memria"
e "especificidade", que sero, muitas vezes, avaliadas
pelas reaes sorolgicas.
CARACTERSTICAS DAS IMUNOGLOBULI NAS

So protenas plasmticas pertencentes ao grupo das
gamaglobulinas, que so as protenas sricas com a mais
lenta mobilidade elerroforrica. So produzidas por li nfcitos B diferenciados e medeiam a chamada resposta
imune humoral. Sua estrutura molecular bsica consiste
na presena de um par de cadeias polipeprdicas menores (cadeias leves, constitudas por um domnio constante - CL e um domnio varivel - VL) e um par de cadeias
polipepcdicas maiores (cadeias pesadas, constitudas por
um domnio varivel - VH e domnios constantes - CH)
unidas por ligaes covalentes. A poro Fc constituda
pelas pores constantes das cadeias pesadas e a poro
Fab pelas pores variveis das cadeias leves e pesadas
(Figura 6.1). So descri ros dois tipos de cadeias leves: kappa (K) e lam bda (). De cadeias pesadas, temos cinco
tipos: alfa (a ), gama (y), delta (8), mi (~) e epsilon (e), as
quais determinam os istipos, ou classes, de imunoglobulinas (lgA, lgG, lgD, lgM e lgE, respectivamente).
PRO DUO DE IMUNOGLOBULI NAS NA CRIANA

Apesar de linfcitos pr-Bserem detectados no fgado
fetal humano desde a oitava semana de gestao e clulas
Bexpressando lgM de superfcie serem detectadas na 10a
50 [ Medicina la borarorial para o clnico ]f-- - - - - - - - - - -- - - - -- - - - -- - -- - - - -
semana de gestao, o recm-nascido a termo produz pequena quantidade de anticorpos. Entretanto, em seu soro,
h elevada concentrao de lgG materna, devido ao transporte ativo transplacentrio que ocorre desde o terceiro
ms de gestao. Isso faz com que os nveis de lgG no plasma do recm-nascido seJam prximos aos do materno, ao
nascimento, caindo a seguir devido ao catabolismo das
lgGs maternas e arraso no incio da sntese das prprias
lgGs. Como conseqncia, entre seis e nove meses de vida,
as crianas apresentam hipogamaglobulinemia fisiolgica.
Aps esse perodo, os nveis elevam-se. atingem 60% dos
adultos no primeiro ano de vida e tornam-se comparveis
aos dos adulms por volta dos sete anos de idade. A lgM
pode ser detecrada no sangue do cordo devido produo fetal. Aps uma semana de vida, a sntese de lgM
acelera-se. mrnando-se a principal lg do recm-nascido.
Atinge 50% dos nveis adultos aos seis meses e 80% aos
12 meses de vida. lgA, lgD e lgE no so sintetizadas em
quantidades significativas pelo neonato. Suas concentraes no sangue do cordo so muito baixas e aumentam
lentamente durante o primeiro ano, atingindo, ento, 10%
a 25% dos nveis adultos.
lulas Bem relao especificidade antignica, passando

de altamente especfica a antgenos estranhos para mais
especfica a antgenos prprios.
Embora indivduos idosos renham mais alto nme ro
de auto-anticorpos, no se pode afirmar que isso reflita
em manifestaes subclnicas de doenas auco-imunes.
Auto-anticorpos associados a doenas auco-imunes
geral mente so antgenos especficos. ao contrrio de
auto-anticorpos naturais apresentados por idosos que
apresentam resposta ampla variedade de antgenos de
diferentes tecidos (ver captulo 61).
PRODUO DE IMUNOGLOBU LI NAS PELO IDOSO
Cadeias pesadas
O processo de senescncia do sistema imune caracterizado por mudanas principalmente na imunidade

celular e parece estar associado a diferentes fatores, sendo
os mais expressivos a diminuio da atividade do timo e a
permanente estimulao antignica ao longo da vida.
Idosos saudveis demonstram decrscimo de 10% a
15% na contagem de linfcitos totais. Observa-se elevao do nmero de linfcims T imaturos (CD2+CD3-) associada ao aumento simultneo de clulas NK, aumento
dos linfcitos T de memria (expressando CDLSRO) e
depleo de linfcitos T virgens (expressando CD4SRA).
Em relao imunidade humoraL no envelhecimento humano ocorre decrscimo na resposta de
anticorpos a antgenos especficos, contribuindo para
o aumento da suscetibilidade e gravidade de doenas
infecciosas, assim como na menor eficincia de vacinas
em idosos. Verifica-se tambm aumento no nmero
de clulas B secretoras de anticorpos que reconhecem
antgenos prprios (auto-antgenos), sugerindo que no
envelhecimento ocorra mudana na populao de c-
Diagnstico imunolgico: princpios e tcnicas
Figura 6.1 - llusuao esquemtica da estrutura de um monmero

de imunoglobulina. As cade1as leves (que podem ser da classe K ou
) possuem dois domnios: um varivel (VL) e um constante (CL). As
cadeias pesadas da lgG. lgAe lgD possuem 1 domnio varivel (VH) e
3 domnios constantes (CH). Os monmeros de lgM e lgE possuem
um domnio extra na poro constante da cadeia pesada.
A poro Fab, composta pelos domnios VL e VH, contm o stio
de ligao com o amgeno (paratopo) que tridimensionalmente
complememar ao epitopo (poro antignica). O reconhecimento
antignico se d atravs das ligaes no-covalentes que se estabelecem enrre estas duas superfcies.
TERMOS COMUMENTE
UTILIZADOS EM SO RO LOG IA
Afinidade e avidez
Afinidade: medida da fora de ligao entre um stio

de combinao de anticorpo e um determi nante antignico. calculado pela lei de ao das massas.
Sl
Avidez: a somatria das afinidades individuais

e da proporo de cada amicorpo em um sistema
policlonal (ex: uma amostra de soro), que comm
anticorpos de diferences afinidades para um ancgeno. Em restes imunoenzimcicos, a avidez pode ser
aferida pela eiUio dos anticorpos de menor afinidade por me1o do emprego de agentes caotrp1cos
que desfazem as reaes antgeno-anticorpo de baixa
afinidade.
Anticorpos polidonais e monodonais
Anticorpos podem ser utilizados como ferramentas

para o reconhecimento de molculas antignicas especficas com grande preciso e podem ser induzidos
artificialmente. Dependendo da forma de obteno. e
conseqente clonalidade, so classificados em policlonais ou monoclonais.
Anticorpos Policlonais: Entende-se por anticorpos policlonais o conjunto de anticorpos isolados a
partir do soro de animais (geralmente coelho ou cabra), obtido aps imunizao com preparao antignica purificada. Apesar de serem uma miscura de
anticorpos de diferences especificidades individuais,
isco , provenientes de dis[lntos clones de linfcitos B
responsivos ao mesmo ancgeno, apresentam alta especificidade dev1da aos processos de purificao realizados aps sua obteno. Podem ser produz1dos em
grande quantidade e so amplamente utilizados em
diferentes testes sorolgicos.
Anticorpos Monoclonais: Em 1975, Kohler e M1lstein
desenvolveram um clone celular capaz de produzir um s
anticorpo com especificidade bem definida para o ancgeno pesquisado. originando. ento, o denominado anticorpo do tipo monoclonal. Em reconhecimento aos seus
estudos. foram congratulados com o prmio Nobel de
Med1cina em 1984.
AntiCOrpos monoclonais so obtidos a partir da
fuso de linfcitos B esplnicos de animais imunizados (geralmente camundongos) com clulas humanas
de mieloma mltiplo. que consistem em plasmcicos
monoclonais com taxa de diviso maior que a de
plasmcitos normais e intensa produo de imuneglobulinas. O hibridoma resultante mantido em
cultura e seu sobrenadance contm anticorpos de um
nico tipo, provenientes de um nico linfcito B, da

o nome monoclonal (Figura 6.2).
Efeito prozona
Na formao dos imunocomplexos, para que ocorra a reao necessria a equivalncia das concentraes relativas de antgenos e anticorpos. O excesso de
qualquer um favo rece uma reao subtima que pode
no ser detectada. Considera-se como efeito "prozona"
a ausncia de reao sorolgica detectvel em um sistema de teste na presena de altas concentraes de
anticorpos sricos. A Figura 6.3 apresenta a ilustrao
do fenmeno de prozona.
Epitopo
Mesmo que determinante antignico. So regies estruturais dos antgenos, que so reconhecidas pelos anticorpos. Quanto maior a complexidade dos antgenos.
maior a heterogeneidade de epitopos presentes e maior
a clonalidade da resposta desencadeada.
Fase slida
Substrato ou poro fixa dos mtodos de imuneensaios, geralmente constituda de vidro. celulose ou
plstico, onde os componentes antignicos ou anticorpos esto fixados e onde se processam e ev1denciam as
reaes. So apresentados habitualmente na forma de
placas. partculas, esferas, tubos. grades, pentes. fitas.
Janela imunolgica
Perodo de tempo compreendido entre a exposio

fonte de infeco e o surgimento de algum marcador sorolgico detectvel pelos testes sorolgicos disponveis.
naturalmente observada durante o curso natural das
infeces e sua durao varivel, dependendo especialmente da natureza do agente infeccioso, do tamanho do
inculo, da eficcia da resposta imune do hospedeiro e
do imunoensaio empregado.
]1 -- - - - - - - - - - - - - - - - - -- -- - - - - - - - - -
Imunizao
Linfcitos B
extrados do bao
'( )f
.~.t:
Fuso
r'
Clo nagem
Cultura
Hibridoma
Cultura de clulas
de mieloma
. . . . ...
...
...........
Seleo dos
hibridomas de
interesse
....
'<I
...
Anticorpos monoclonais
presentes no sobrenadante
da cultura
'f
A " A
....
..:
Figura 6.2- Produo m v1tro de anr1corpo monoclonal a parm da fuso de linfCito Bespecfico para o anrgeno alvo {proven1enre de an1mal
1mun1zado) +clulas provenienres de culcura de clulas de m1eloma mlnplo humano {plasmciros monoclona1s).
PRO ZONA
!excesso de anticorpos)
ZONA DE EQUIVAl ~NCIA
PS.ZONA
!excesso de onngenas)
<t>-i)
~A >
J- A
~
<({ \~~ y>
y>
.f. ~ A"k,~
y>
{A~A ~
~
~ <({<({~
~
y>
~ ~
J.A~
~<({~A~
~t!
YJ_;,-
t;t~~
i)
~~
~
v
(f
~v~i) i)(f
(f i)
i)
v>
v~i) ~
rf ~(f ov o
i) i) i)
v v
i)
(f
(fi)~
i>
(f
Figura 6.3 - Na presena de excesso de anrtcorpos (prozona de equivalncia) ou anrgeno (ps-zona de equtvalnoa). no ocorre formao
de complexos grandes. necessnos para visualizao da reao. O fenmeno de prozona causa de resultados falso-negattvos em algumas
reaes sorolgicas. como o VDRL.
Resposta anamnstica
PRINCIPAIS MTODOS SOROLGICOS

MTODOS DE AGLUTINAO
Resposra imune secundria que se segue aps expoSIes posreriores ao amgeno. Geralmeme mais rpida
e imensa.
Ttulo
expresso como o tnverso da lrima diluio de soro
que apresemou reao posiriva.
Diagnstico imu nolgico: princpios e tcnicas
Nos mrodos de aglurinao, que podem ser realizados em rubos ou em placas, um dos dois componenres da reao anrgeno-anricorpo deve esrar
fixado na superfcie de panculas insolveis. Aps a
formao do imunocomplexo. possvel visualizar a
formao de agregados. A imensidade da reao poder ser medida considerando-se o ramanho final dos
53
agregados formados, podendo variar desde negativa,

na ausncia de agregados, at fonemente positiva, na
presena de agregados maiores (Figura 6.4). Vrios fawres interferem na aglutinao, como a classe a que
pertence o amicorpo pesquisado (a lgM, por sua estrutura pentamrica e presena de 10 stios de ligao
ao antgeno, 750 vezes mais eficiente em aglutina r
panculas que lgG), concentrao de eleuliws, pH
(ideal entre 6,0 e 8,0), tempo de incubao antgenoanticorpo e temperatura.
Aglutinao intenso
Antgenos e ou anticorpos
porticulodos so
adiciono dos
e misturados
/ /
/
/0 /
Aglutinao fraco
/ /
"""
Ausnc ia de aglutinao
/ 0 /
Figura 6.4 - Mtodo de aglutinao em placa: aglutinao daspartculas

graduada de negativa a 1mensa. dependendo da formao de grumos.
Caso os determinantes amignicos sejam constituintes de estruturas naturalmente insolveis, como bactrias, protozorios, fungos ou hemcias, a reao chamada de aglutinao direta. geralmente utilizada para
a deteco de microrganismos ou de antgenos eritrocitrios, a partir do emprego de anticorpos especficos.
Seus usos clnicos mais freqemes so no diagnstico de
infeco por clamdia, salmonelose, brucelose, nckettslose e em imunohematologia. na cipagem de grupos sanguneos e na deteco de auto-anticorpos amieritromnos nas hemlises imunolg1cas.
Se o mwdo necessitar da fixao artificial de
algum dos dois componentes da reao antgenoanticorpo na superfcie de panculas insolveis (geralmente hemcias, poliestireno (conhecidas como ltex)
ou bentonita), ele chamado de aglutinao indireta
ou passiva. Os teste de aglutinao so examinados a
olho nu, aps perodo de incubao curw, em geral
menor que cinco minutos (Figura 6.5).
54 ( M edicina laboratorial para o clnico
Partcula
correodoro
Antgenos
solveis
Partculas
sensibilizados
Anticorpos
Partcula
sensi bilizado
Aglutinao
visvel
Fi gura 6.5 - Aglutinao indireta: Partculas ou clulas sensibilizadas (impregnadas por amgenos) so aglutinadas por ao
de anticorpos, formando grumos visve1s.
Reaes de hemaglutinao
Os testes de hemaglutinao indireta so amplamente empregados na pesquisa de anticorpos.

Exemplo clssico a reao de hemaglutinao lndireta (geralmente abreviada por HAI) para pesquisa de anticorpos no d iagnscico de diversas doenas infecciosas, como sfilis, toxoplasmose, doena
de Chagas, entre oucras. Nesses casos, antgenos
provenientes dos agentes infecciosos so fixados
na superfcie de hemcias de carneiro ou humanas
do grupo O. que so fixadas com formaldedo ou
glutaraldedo para melhor conservao. Para a execuo dos testes. amostras de soro dos pacientes,
em diferentes diluies, segundo recomendaes do
fabricante, so incubadas em microplacas com suspenso de hemcias sensibilizadas, isto revestidas
com a preparao antigncia. Aps o tem po preconizado para incubao. realizada leitura da reao:
no teste considerado positivo, verifica-se a formao
de fina camada homognea de hemcias recobrindo
o fundo da cavidade, enquanto nos testes negativos
a ausncia de aglutinao permite que as hemcias
se sedimentem no fundo da cavidade, formando um
pequeno crculo compacw. O ttulo da amostra ser
a maior diluio em que ainda se observa reao positiva. Pe la HAI, detectam-se anticorpos das classes
lgM e lgG em concentrao superior a O.Ol~g/ml.
Entre suas vantagens esto: apresentam baixo custo,
no necessitam de equi pamentos automatizados e
so testes semiquantitativos, podendo ser utilizados
na monitorao de ttulos (Figura 6.6).
de ltex so revestidas com anticorpos, monoclonais ou

policlonais, que reconhecem antgenos microbianos e os
restes so, em geral, qualitativos, sugerindo a presena
ou no do agente infeccioso.
TESTE DE FLOCULAO- AGLUTINAO DE

CRISTAIS DE COLESTEROL
No caso da reao de VDRL- Venerai Disease Research
Laboratory, no so empregadas partculas sensibilizadas e
Figura 6.6 - Hemaglurinao indireta em placa: Os testes
negativos (por exemplo: A2. A3. AS) so identificados pela
compactao das hemms sed1memadas na base do poo
(presena de um pomo hemtiCO central) e os posi6vos (por
exemplo: ALi, B3, BS, C4. Dl), pela formao de um tapete no
fundo da placa.
Reaes de aglutinao de ltex
As partculas de ltex so esferas de poliesrireno que

podem ser utilizadas como suportes na adsoro de proreinas solveis e anrgenos polissacardeos, para emprego
em reaes de aglutinao. Foi descrita inicialmente por
Singer e Plorz. em 1956. para a pesquisa do faror reumatide, mas ainda basta me utilizada, servindo como base
para ensaios qualiranvos. semiquamitativos e at automatizados. Apesar de poder ser empregada tanto na pesquisa de antgenos quanto de anticorpos. seu uso clnico mais
freqente na pesquisa de antgenos. Uma utilizao clssica da reao de aglur1nao de partculas de ltex ainda
a pesqu1sa de fato r reumatide (auto-anticorpo da classe
lgM que reconhece poro Fc de lgG humana), em que
parrculas de ltex sensibilizadas com pores Fc de lgG
humanas so incubadas com diferentes diluies de soro
e verifica-se qual a maior dilUio em que se observou
aglutinao das partculas de ltex. Outras indicaes freqentes so a semiquantificao de protena C reativa e a
pesquisa de hCG. Nesses casos. partculas de ltex enconrram-se sens1b1lizadas, respecrivamente, com anticorpos
am1prorena C reariva ou amicadeia ~ do hCG.
Outra unlizao cln1ca seria na deteco de antgenos polissacardeos bacterianos, como os estreptococos.
os esrafilococos e os meningococos. e na deteco de
microrganismos em diferences lquidos biolgicos (soro.
secreo, urina. lquor, erc.). Em tais situaes, parrculas
sim suspenso antignica alcolica de cardiolipina juncamente com cristais de colesterol com lecirina (ver captulo
54). Trata-se de um mtodo de pesquisa de anticorpos anricardiolipina que esto presentes em diferentes situaes
clnicas, especialmente na sfilis, no lpus eritematoso sistmico e na sndrome antifosfolpide. Os anticorpos anticardiolipina presentes no soro formam imunocomplexos
com a cardiolipina que so precipitados sobre os cristais
de colesterol, que so refringentes. A leitura do teste feita microscopicamente, sendo positivo quando h formao de flocos refringentes e negativo quando se apresenta homogneo e sem agregados (Figura 6.7).
MTODOS DE PRECIPITAO
Reaes que envolvem precipitao de imunocomplexos solveis, tam bm chamadas de ensaios de imunoprecipitao, so freqentemente adoradas em ensaios
laboratoriais, sendo os principais mtodos a nefelometria
e a turbid1merria. Heidelberg, em 1935. j havia descrito
que a formao de imunocomplexos solveis depende
de vnos fatores, entre eles a equ ivalncia na concentrao de antgenos e anticorpos, a avidez e afinidade entre
eles, condies do meio (tampo, pH, fora inica da soluo) e presena de polmeros (por ex. polierilenoglicol),
que aumentam a sensibilidade, a faixa de deteco e a
velocidade do ensaio.
Ao receber uma luz incidente, imunocomplexos formados em soluo podem provocar disperso, absoro,
reflexo e alterao da rransmisso da luz. Esses fenmenos so proporcionais ao tamanho, forma e concentrao das partculas e quanto maior a precipitao entre
ancgeno e ancicorpo, maior a disperso e a reflexo da
luz incidente e menor a sua rransmitncia.
ss
Fonte
de luz
Detector B
Detector A
Figura 6.8- Princpios da automao para mensurao da reao ancgeno-anricorpo por mtodos de precipitao. A luz
incidente no cubo pode ser capeada pelo detector A (nefelometria - que quantifica a disperso da luz) ou pelo detector
B(rurbidimerria - que mede a absoro da luz), cuja leitura
final apresenta correlao com a concentrao de anrgeno
ou anticorpo da amostra resrada.
Figura 6.7 A e B- A: reste negar1vo - ausncia de floculao,

com disperso de antgenos na placa. B: Teste positivo - formao de "flocos", conseqentes formao de imunocomplexos, evidenciando presena de anticorpos no soro reste.
Nefelometria
A nefelometria um mtodo direto de med ida da

disperso de uma luz incidente, em um determinado
ngulo, sendo sensvel para dimensionar as reaes de
precipitao. Geralmente, os aparelhos, chamados de
nefelmetros, utilizam, como fome de luz, lmpadas
de rungsrnio, mercrio, xennio, hlio-nenio (laser),
etc. Os feixes de luz ou do laser so coletados por
lemes focalizadoras e atravessam o tubo comendo a
amostra e a soluo reagente. Outras lentes coletam
a luz emergente em ngulo de 70 e a focalizam para
um detector eletrnico, q ue amplifica o sinal. Este
convertido em unidades de registro digital que so
relacionadas com a concentrao do anrgeno ou do
anticorpo na amostra (Figura 6.8).
Na determinao de compostos de baixo peso

molecular, como hormnios, drogas e outros haptenos, utiliza-se a nefelomecria de inibio, em que os
haptenos a serem dosados competem com haptenos
conjugados com protenas carregadoras pelos stios no
anticorpo especfico, havendo inibio na formao de
precipitados. O emprego de micropanculas inertes,
tais como ltex (esferas de poliestireno) recobertas com
antgeno ou anticorpo, aumenta a sensibilidade dos ensaios nefelomtricos. Essas panculas so usadas como
suporte dos reagences, amplificando a precipitao e a
disperso da luz.
Vantagens: reao precisa, rpida, de fcil realizao e
tmalmente automatizada. Com partculas amplificadoras apresenta elevada sensibilidade (na ordem de 1J.lg/
ml e de 1ng/ml).
Desvantagens: alto custo do nefelmetro e dos anticorpos, reaes inespecficas em amostras lipmicas ou
hemolisadas e a necessidade de mltiplas diluies quando os antgenos do teste esto muito concentrados.
Aplicao: quantificao de drogas, hormnios, protenas (por ex. imunoglobulinas, componentes do complemento, faror reumatide e protena C reativa), imunocomplexos, lipoprotenas, etc.
Turbidimetria
excitadas com luz de alta energia, absorvem parte dessa
um mrodo muiw semelhante nefelometria, mas
energia, emitindo luz de um comprimento de onda maior

e menor energia. fenmeno denominado de fluorescn-
que mede a diminuio da imensidade de luz transmiti-
cia. Assim, a leitura das reaes feira em microscpios
da, em relao incidente, por meio de uma suspenso
de fluorescncia, que possuem uma fome de luz de alta
de panculas, devido a: reflexo, absoro ou disperso
imensidade (geralmenre lmpadas de quarrzo-halognio),
do seu feixe de luz. As leicuras so conduzidas em uni-
filtros de excitao e de barreira, que permitem alta transmisso da fluorescncia emitida. Pode-se ento dizer que
dades de absorbncia que refletem a relao entre luz

incidente e luz transmitida. Assim como na nefelometria, partculas amplificadoras (por ex. polierilenoglicol)
podem ser admadas, aumentando a sensibilidade do
a reao de imunofluorescncia associa as propriedades
reste. Nesses casos tm-se os restes PETIA (imunoensaio

rurbidimrrico com partculas de ltex amplificadoras) e
PETINIA (imunoensa1o turbidimmco de inibio com
partculas de ltex amplificadoras).
A comparao entre as tcnicas de nefelomerria e
turbidimerria depende mais da qualidade dos aparelhos de leitura do que do princpio do mrodo propriamente dico.
Vantagens: reao precisa, rpida, de fcil realizao, au-
tica, realizada em lminas. O substrato utilizado deve ser

visvel microscopia rica (clulas, micoorganismos) e a
tcnica no passvel de automao. uma vez que exige a
atuao de pessoal treinado na leicura microscpica.
da fluorescncia, da reatividade anrgeno-anricorpo e ainda da microscopia ptica. Devido a essa ltima caracters-
O reste de imunofl uorescncia oode ser realizado de

forma direta ou indirera (Figura 6.9).
lmunofluorescncia direta
tomatizada e econm1ca. No necessita de separao entre as fases e as amostras podem ser ensaiadas d1retamente
sem a necess1dade de pr-tratamento. A turbidimerria tende a ser mais precisa, ma1s reprodutvel e mais s1mples que
a nefelomema. A utilizao do especrroformetro, que
um aparelho mais comum, reduz o seu cusw.
Nessa tcnica, empregada na pesquisa de microrganismos e na localizao de anrgenos em clulas ou tecidos,

utiliza-se anticorpo especfico, monoclonal ou policlonal.
marcado com fluorocromo (chamado de conjugado). Na
lmina de vidro, onde ocorre a reao. fixa-se a amostra a
ser examinada, geralmente lquidos corporais, secrees
Desvantagens: reaes inespecficas em amostras

lipmicas ou hemolisadas. A curbidimeuia rende a ser
menos sensvel que a nefelometria.
do paciente ou cortes h1srolg1Cos, que podem comer

os antgenos que sero reconhecidos pelo anticorpo flu-
Aplicao: quantificao de drogas, hormnios, pro-
oresceinado. Aps incubao, este se fixa ao anrgeno,
tenas (por ex. pr-albumina, albumina e protena C reariva), lipoprotenas. etc.
formando um complexo estvel. Posteriormente, a lm ina lavada para remoo dos anticorpos no ligados e
IMUNO FLUORESCNCIA
Descrita com sucesso pela primeira vez por Coons et
ai. em 1941, envolve a capacidade da molcula de anticorpo se ligar covalenremenre a fluorocromos sem perder
sua reatividade especfica. Isso possvel, pois geralmente a conjugao do fluorocromo com o anticorpo se faz
por me10 dos grupos am no da lisina, que no so crticos
para a reat1v1dade do anticorpo. Fluorocromos (por ex.
1smioe~anaro de fluorescena, isonoe~anaro de tetrame-
tilrodamma, lisamina-rodamina B e cido d1metli nafralenossulfnlco) so substncias complexas que, quando
levada ao microscpio de fluorescncia para leitura da

reao. Na reao positiva, a estrutura comendo o antgeno apresenta-se com a tpica cor esverdeada brilhante
da fluorescena, enquanto na reao negativa a estrucura
apresenta-se no corada ou, em alguns casos, corada por
colorao de fundo, que geralmente empregada para
facili tar a leitura final.
Vanragens: alm da especificidade, que dependente
do anticorpo utilizado, permite a localizao do amgeno no substrato utilizado.
Desvantagem: sensibilidade relativa, demorada, no
passvel de automao, requer a aruao de profissional
bem treinado para a leitura e microscpio com manuteno rigorosa.
57
<:
..
Lavagem
'
Antgeno presente no
amostro o ser testado
(p.ex . Chlomydia trochomotis)
Soluo de anticorpos
especfi cos marcados
com fluoresceno
Complexo
o ntgen<Xlnticorpo
fluoresce nte
..
..
Lavagem
Lavagem
)
An tgeno lixado no
lmina de vidro
(Trypanosomo cruz~
Anticorpos
presente
no soro do
paciente
Complexo
ontgencranticorpo
Antiimunoglobulinos
marcados
(fluorocromo)
Complexo
ontgeno-onticorpo
fluorescente
Figura 6.9- Exemplos de tcnicas de imunofluorescncia di reta e indireta. A) lmunofluorescncia di reta: utiliza-se de um preparado de anticorpos especficos marcados com fluorescena para a pesquisa de antgenos em amostras do paciente. Na ilustrao,
pesquisa de Chlamydia trachomatis por imunofluorescnc1a di reta. B) lmunofluorescncia indireta: utiliza-se preparado antignico fixado a uma lmina de vidro (na ilustrao, uma suspenso de T cruzi). para pesquisa de anticorpos no soro do pac1ente (na
ilusuao. pesqu1sa de anticorpos an tiT cruzl). A revelao feita com anticorpos ami1munoglobulina humana marcados com
fluorescena.
Aplicaes: principalmeme na imunocitoqumica e

na demonstrao de vrios amgenos de clulas e tecidos. alm da pesquisa de alguns agemes infecciosos
como clamdia, treponemas, amebas. etc.
lmunofluorescncia indireta
Nas reaes chamadas indireras. emprega-se uma segunda preparao de amicorpos, que ser aquela que estar complexada com a fluorescena. Esse mcodo geralmeme empregado na pesquisa de amicorpos sricos.
Nesses casos, preparaes amignicas padronizadas, geralmeme protozorios. bactrias ou clulas. encomramse fixadas lmina de vidro. Diluies de soro do paciente so colocadas sobre o substraco e incubadas para
permitir a formao do complexo antgeno-anticorpo.
58
Aps lavagem, a preparao reincubada com anticorpos. geralmente de cabra ou coelho amipores constantes de imunoglobulinas humanas, conjugados com
fluorescena. Utilizando-se diluies seriadas do soro
possvel determinar o ttulo de amicorpos, que ser a
mxima diluio em que se observa fluorescncia.
Resumidamente: para facilitar o entendimento das
duas formas de fluorescncia (direta ou indireta), lembrem-se de que no mtodo direto o reagente fornecido
no kit a preparao de amicorpos especficos conjugados com a fluorescena. O amgeno ser pesquisado na
amostra do paciente. J na reao de imunofluorescncia
indireta, o kit fornece as lminas comendo a preparao
antignica e os amicorpos sero pesquisados no soro do
paciente. Nessa reao, o kit tambm fornece uma preparao de anticorpos de origem an imal que reconhecem anticorpos humanos conjugados com fluorescena.
Vantagens: alta sensibilidade e especificidade

Desvantagens: as mesmas da fluorescncia direta.
Aplicaes: Alm da pesquisa de anticorpos em doenas Infecciosas. como sfilis (FTA-ABS), roxoplasmose.
ciromegalovrus. herpes simples, doena de Chagas e
malria, o mcodo de escolha para pesquisa de auraanticorpos na pesquisa de anticorpos antinucleares.
litativos, quantitativos ou semiquantitativos. Nos ensaios

de quantificao de antgenos. uma curva-padro traada a partir de diferentes amostras de referncia contendo
concentraes conhecidas do antgeno. Na pesquisa de
anticorpos, cujas concentraes so mais variveis, a quantificao ou semiquamificao envolve esrabelecimemo
de um limiar de afinidade ou pomo de corte (cut-ofj), acima do qual os valores sero considerados positivos.
REAO DE IMUN OPEROXIDASE

Empregada essencialmente em ensaios de imunohistoqumica, foi descrita inicialmente em 1966 com o
objetivo de detectar e localizar antgenos celulares, empregando microscopia ptica comum e ao da enzima
peroxidase. Segue o mesmo princpio da imunofluorescncia, exceto pela utilizao da enzima no lugar do fluorocromo. Essa enzima converte o substrato em produro
insolvel que precipita no stio da reao. sendo visvel
no microscpio ptico comum. Outras enzimas. como
a fosfatase alcalina e a glicose oxidase. tambm podem
ser empregadas. Uma grande vantagem da peroxidase
est no seu baixo peso molecular, permitindo maior penetrao celular e conseqentemente melhor definio
das estruturas. A deteco simultnea de dois ou mais
constituintes celulares pode ser conduzida com a utilizao de dois ou ma1s cromgenos.
As principa1s vantagens da imunoperoxidase em relao imunofluorescncia esto no fornecimento de preparaes mais duradouras. no baixo custo e na utilizao
de microscopia ptica comum. Amplificadores como
avidina (ligada enzima) e biotina (ligada ao anticorpo)
podem ser utilizados em escudos de imunociroqumica
e imunohisroqumica.
ENSAIOS IMUNOENZIMTICOS
Os ensaios imunoenzimticos (ELISA) so aqueles
nos quais empregada marcao de anticorpos com enzimas e a leitura se faz pela medida da ao enzimtica
sobre substrato cromognico, levando mudana de cor
da soluo. As enzimas mais utilizadas como marcadores
nos ELISA so peroxidase e fosfatase alcalina.
So mtodos mu1ro empregados e tm substiwdo amplamente a reao de imunofluorescncia. Podem ser qua-
Mtodos imunoenzimticos para

deteco de anticorpos
Os ensaios de deteco de anticorpos solveis podem ser conduzidos basicamente por dois mrodos: indirero e de captura dos anticorpos lgM. O mtodo indirero o mais amplamente empregado (Figura 6.10).
No mtodo indireto, microplacas de poliestireno
contendo vrios pequenos poos so sensibilizadas com
preparaes antignicas. Amostras de soro em diluies
recomendadas pelo fabricante so incubadas por perodo preestabeleCido para permitir a reao dos anticorpos
presentes na amostra com o antgeno fixado na microplaca. Aps lavagem dos poos, um preparado de anticorpos anciimunoglobulinas humanas conjugados com
enzimas adicionado. Esse conjugado antiimunoglobulina humana reage com o anticorpo capturado pelo antgeno da fase slida e a reao revelada com adio do
substratO especfico para a enzima utilizada. Em casos de
reaes positivas, ocorre mudana de cor na soluo e a
intensidade da cor estimada colorimeuicamente, sendo
proporcional concentrao do anticorpo pesquisado.
Caso o antiCOrpo a ser pesquisado seja da classe lgM.
freqente a ocorrncia de resultados falso-negativos
ou falso-positivos. Por isso, emprega-se o mtodo de
captura de anticorpos lgM. Nesse teste, a fase slida
sensibilizada com anticorpos anncade1a pesada da lgM
(cadeia 1-1). Os soros em teste so incubados, capturando
todos os lgM da amostra. A seguir, incuba-se com anrgeno solvel e posteriormente com preparaes de anticorpos especficos para o antgeno, marcados com enzima. Como nos demais testes, aps lavagem dos poos
para retirada dos componentes no fixadas, o substrato
enzimtico adicionado e a intensidade da cor lida em
especuofotmeuo, sendo diretamente proporcional
concentrao do anticorpo (lgM) pesquisado.
59
~-<
Lavagem
>
:)
Fase slido
+ ontgeno
Complexo
ontgeno-onticorpo
Anticorpos
do amostro
>->->--
Complexo ontgeno - anticorpo

- onti-imunoglob ino
Adio de
cromgenos
i>--
Lavagem
>
Anti-imunoglobino
marcado com peroxidose
>->-- ~
>--
Complexo ontgenoanticorpo

- onti-imunoglob ino marcado
Lavagem
c::=~>
Formao de precipitado
Figura 6.10 - Pesqutsa de amtcorpos pelo metdo imunoenzi mtico indirero: amostra de soro ou plasma incubada em microplacas contendo antgenos fixados. para deteco de anticorpos especficos. Aps lavagem para retirada de anticorpos no
fixados. so adicionados anticorpos anriimunoglobulina humana conjugados com enztma. Aps incubao e posterior lavagem
para retirada dos anticorpos no ligados. ad iciona-se o substrato da enztma conJugada e a reao revelada pela mudana de
cor. A imensidade da cor diretamenre proporcional concentrao do anncorpo pesquisado.
Medida da avidez de lgG
Em algumas sicuaes clnicas, especialmente

no diagnstico de infeces em gestantes, rornase ril a medida da avidez das lgGs sricas pelos
antgenos. sabido que lgGs mais recentes apresentam menor avidez que aquelas produzidas h mais
cem po. Assim. a avaliao da avidez das lgGs circulantes pode contribuir para considera r o processo
infeccioso como agudo ou no. A tcnica envolvida
na medida da avid ez envolve a realizao do reste
imunoen zimtico em duplicata. Um teste realizado de forma convencional. enquanto no outro.
ac rescentada uma etapa de adio de soluo que
favorece a dissociao do imunocomplexo. Q ua nto
maior a estabilidade da interao antgeno-ancicorpo. maior resistncia ao da soluo dissociante.
A medida do ndice de avidez feita pela razo:
leicu ra do teste com soluo dissociante I le icura
do cesce co nvencional. Se o ndice (razo x 100) for
maior que 60%, admite-se alta avidez. Se inferior a
30%. co nsidera-se baixa avidez. Valores intermedirios so inconclusivos.
60 [ Medicina laborarorial para o clnico
Mtodos imunoenzimticos para

deteco de antgenos
J os ensaios de imunoenzimticos para pesquisa de ancgenos podem ser conduzidos por mcodos de captura (ou
sanduche). de competio com anticorpo marcado e de
competio com antgeno marcado. Entretanto, por apresentarem sensibilidade moderada. tm sido substitudos
por outras mecodologias. como a quimioluminescncia.
O mcodo de captura o mais adorado para pesquisa de antgenos polivalentes. As placas (fa se slida) so
sensibilizadas com anticorpo especfico para o amgeno
a ser testado. Aps incubao da amoscra com a fase
slida. lava-se o sobrenadame. A seguir, incuba-se novamente com amicorpo especfico marcado com uma
enzima. Faz-se a segunda lavagem. A reao revelada
com a adio de um subscraco e a atividade enzimtica
final (taxa de degradao desse subsuaco pela enzima)
direcameme proporcional concentrao inicial do antgeno na amostra testada.
No mcodo de competio com amicorpo marcado, a fase slida sensibilizada com antgenos. Adicionase a amostra teste e amicorpos marcados com enzima.
Os anticorpos se ligam tanto aos antgenos da amostra,

quanto aos da fase slida. A densidade ptica encontrada inversamente proporcional concentrao inicial
do antgeno na amosua testada.
No mwdo de competio com antgeno marcado, a fase slida tambm sensibilizada com anticorpo
especfico para o ancgeno a ser testado. Adiciona-se a
amosua teste e o conjugado (antgeno-enzima). A densidade ptica encontrada inversamente proporcional
concentrao inicial do antgeno na amoscra testada.
Vantagens: sensibilidade e especificidade elevadas, rapidez, preciso, estabilidade dos reagentes, objetividade
da leitura e possibilidade de automao.
Desvamagens: a atividade enzimtica pode ser afecada por constituimes plasmticos. Comparada com os radioimunoensaios, a mensurao da atividade da enzima
pode ser mais complexa e com menos sensibilidade do
que a mensurao dos radioistopos. Possibilidade de
ocorrncia de efeito gancho (ver captulo 59) no mtodo
de capwra, comum nas dosagens hormonais.
Aplicao: o mtodo de ELISA o mais empregado na
prtica da soroimunologia laborawrial. Sua proliferao
pode tambm ser atribuda ao emprego de anticorpos
monoclonais e antgenos recombinantes especficos.
RA DIOIMUNOENSAIOS
Berson et a/. foram os pioneiros nesse mtodo em
1956, em pesquisas envolvendo anticorpos anciinsulina.
O radioimunoensaio (RIA), que era muito utilizado na
prtica laboratorial, acualmeme vem perdendo espao
para outros mtodos que utilizam marcadores no radioarivos, ficando sua atuao cada vez mais restrita em
atividades de pesquisa.
O princpio do mtodo praticamente o mesmo visco nas reaes imunoenzimcicas, variando apenas a marcao molecular que, no caso, consiste de componentes
radioativos em vez de componemes enzimticos. A medio da reao feita por contadores de radioatividade.
Vrios radioiscopos podem ser utilizados, sendo os istopos com 1125 (vida mdia de 57.5 dias) e 1131 (vida mdia de
8 dias) os mais empregados. Diferentes variaes do mtOdo foram desenvolvidas, emre elas o ensaio imunorradiomuico (IRMA), descrito inicialmente por Miles e Hales,
em 1968, utilizado na deteco de antgenos proricos.
Di agnsrico im unolgico: princpios e rcnicas
Vantagens: elevada sensibilidade para a anlise quantitativa das reaes anrgeno-ancicorpo, facil idade de conjugao do iscopo, permite medidas rpidas e precisas,
derecra sinais sem orimizao e estabilidade contra fawres interferentes no ensaio. Mesmo em preparaes no
purificadas, apresenta limiar de deteco na ordem de
nanogramas ou picogramas. Omro pomo positivo est
na deteco de pequena concentrao de analitos, mesmo quando o volume da amostra bastante escasso.
Desvantagens: cusro elevado, vida mdia curra
dos reagentes e necessidade de proteo no uso de
radioistopos.
Apl icaes: na toxicologia, farmacologia, endocrinologia, sorologia, etc. Pode ser utilizado para quantificar
drogas, marcadores tumorais, hormnios, alrgenos,
antgenos e anticorpos virais, bacterianos, fngicos, etc.
Adorado tambm para pesquisas, em deteco de novos antgenos.
ENSAIOS IMUNOQU IMIOLUMINESCENTES

Entende-se por q uimioluminescncia o fenmeno no qual ocorre emisso de luz eletromagntica
(inclusive ultravioleta ou infravermelho) a partir de
reao qumica. A reao de imunoquimioluminescncia outra variao dos imunensaios, muito semelhante aos imunoenzimoensaios, porm muito
mais sensvel, na q ual a fosfatase alcalina (conjugada a
anticorpos antiimunoglobu lina humana) acua hidrolisando um substrato quimioluminescenre e gerando
um prod uto instvel, o qual aps estabilizao gera
emisso de ftons (amplificados). Os ensaios imunoquimiolu minescemes so geralrrente automatizados
e a leirura se d em aparelhos chamados lum inmetros, emendendo-se por luminometria a medida da
luz emitida por composros quimiolum inescentes.
Os agentes quimioluminescentes mais comuns so
luminol, isolum inol, luciferina (presente nos vaga-lumes), derivados de acridina, indol. Em 1989, Bronstein
desenvolveu um substrato quimioluminescenre (admantil 1.2-dioxietano-fosfaro) para a fosfatase alcalina que, ao contr rio dos demais, no necessita de
molcula adicional para a emisso de luz quimioluminescente. Atualmente, novos marcadores esto
em escudos e, por apresentarem alta sensibilidade, os
61
ensaios imunoquimioluminescenres vm se rornando cada vez mais rotineiros.

Vantagens: elevada sensibilidade, linearidade da curva dose-resposta (emisso de luz tende a ser proporcional concentrao do analito em anlise), rapidez (sinal
gerado em poucos segundos e pode permanecer por
vrias horas), custo mais baixo (pouca concentrao de
reagentes), procedimento simples, possibilidade de aumentar a sensibilidade com uso de amplificadores.
Desvantagens: reaes oxidativas, como as do lumina i, podem sofrer interferncia de inmeros fatores
presentes no sistema, aumentando a inespecificidade
do exame.
Aplicao: pela alta sensibilidade so amplamente
empregados na dosagem de hormnios. antgenos. viraminas e marcadores tumorais.
ENSAIOS IMUNOFLUORIMTRICOS
Esse mtodo muito semelhante ao ensaio imunoquimioluminescente, exceto por empregarem substratos
fluorignicos que, aps ser estimulado por um comprimento de onda de excitao timo, h emisso de fluorescncia mxima. Essa fluorescncia captada por fluormetro equipado com um multiplicador de ftons. A
intensidade da fluorescncia direramente proporcional
concentrao inicial de antgeno ou anticorpo pesquisado na amostra testada.
Vantagens: praticamente as mesmas dos ensaios
imunoquimioluminescentes. Os sinais gerados so superiores aos observados nos ensaios imunoenzimticos.
Desvantagens: pode haver presena de substncias
interferentes na amostra. emitindo luz fluorescente, falseando os resultados.
Aplicao: semelhante dos ensaios imunoquimioluminescentes.
REAO DE WESTERN-BLOT
um mtodo sorolgico no qual possvel identificar as fraes do preparado antignico reconhecidas pelos anticorpos do paciente. Isco . nos ensaios descritos
acima, os anticorpos do pacientes eram incubados com
homogeneizados antignicos, geralmente complexos,
62
compostos de diversos componentes proticos. Para a

tcnica de western-blot. a preparao antignica previamente submetida eletroforese em gel de poliacrilamida. de alta definio, a fim de separ-la em diferentes
bandas, de acordo com seus tamanhos e cargas. Posteriormente, todo o contedo prorico presente no gel
transferido para a folha de nitrocelulose, mantendo-se
conservado o perfil eleuofortico. Dessa forma, a folha
de nitrocelulose contm o preparado antignico apresentado sob a forma de bandas proricas individualizadas.
Essa fira de nitrocelulose sensibilizada submetida a um
processo semelhante ao da reao de ELISA Isto , aps
ser incubada com soro diludo do paciente e lavada,
reincubada com anticorpos antiimunoglobulina humana
marcados com enzima. Substrato cromgeno adequado
adicionado e. ao sofrer ao da enzima. muda de cor e
colore as bandas nas quais houve reconhecimento pelos
anticorpos do paciente (Figura 6.11).
A reao de western-blot foi e ainda amplamente
utilizada na confirmao do diagnstico da infeco
pelo HIV. Variaes da tcnica original foram desenvolvidas. Uma das mais promissoras e mais empregadas a
utilizao de antgenos recombinantes no lugar do extrato antignico bruto proveniente de lisado de clulas
infectadas. Essa variao conhecida como imunoblot
recombinante (RIBA- recombinant immunoblot assay) e
rem sido bem aceita pelos laboratrios devido pureza
do antgeno e conseqente facilidade de leitura.
Vantagens: elevada sensibilidade e especificidade.
Desvantagens: resultados qualitativos, cusco elevado.
TESTES RPIDOS
So geralmente testes de triagem que produzem
resultados em, no mximo. 30 minutos, sem utilizao
de equipamentos. So tambm chamados de testes remotos. pelo faca de poderem ser realizados distante do
laboratrio (a beira do leito, ambulatrio, trabalhos de
campo). Existem atualmeme inmeros testes rpidos no
mercado para deteco de antgenos e anticorpos em
amostras biolgicas. produzidos por vrios fabricantes e
utilizando diferentes princpios tcnicos. Geralmente, os
restes rpidos so qualitativos. de metodologia simples e
acondicionados em embalagens individualizadas. permitindo a resragem individual das amostras.
A) Etapa de produo da fita de nitrocelulose contendo as fraes proticas antignicas

Separao
eletrofortico dos
protenas com
formao de bandos
Aplicao
em gel de
poliocrilomido
Transferncia
eltrico poro
membranas de
nitrocelulose
c:=::~>
c:=====~>
c:=::~>
?>
Eletroforese em gel
de poliocrilomido
SDS-PAGE
Extraio
ontignico em
soluo
Gel de poliocrilomido contendo os

bandos proticos
Folho de nitrocelulase contendo os

bandos proticos
B) Etapa da reao de western-blot
--
Anti-imunoglobulino
humano marcado
com enzima
Amostro do paciente
Adio de
substrato
<::===:::::J
Leitura Final
lmunocomplexo
Formao do
reoo ontgenoanticorpo
Tiro de nitrocelulose
contendo os
bandos proticos
Figura 6.11 - Reao de western-blot: Inicialmente, o preparado antignico submetido eletroforese em gel de poliacrilamida.
para separao das diferentes protenas de acordo com seus pesos moleculares. e posteriormente rransferido para membrana de
nitrocelulose acravs de corrente eltrica. Posteriormente, realizada reao imunoenzimtica na fira de nitrocelulose contendo
as diferentes bandas amignicas.
Utilizam como suporte slido para os antgenos fixados diferentes materiais como membranas de celulose ou nylon, ltex, microparrculas ou carreias plsticas.
Entre os mais adorados est o dipstick, que emprega
matriz de nitrocelulose como suporte. Para deteco
da reao, utiliza-se corante coloidal, enzimas ou ouro
coloidal. Nos kits para deteco de antgeno, usa-se um
anticorpo de captura, ligado membrana, e um anticorpo marcado especfico para esse antgeno. j nos kits
para deteco de anticorpo, emprega-se um antgeno
ligado membrana e um anticorpo antiimunoglobulina
especfico marcado.
Vantagens: rapidez do resultado, simplicidade da tcnica, fcil interpretao, elevado valor preditivo negativo.
Desvantagens: so testes principalmente de triagem

e seus resultados so apenas qualitativos.
IMUNOFENOTIPAGEM POR
CITOMETRI A DE FLU XO
Diferentemente dos mtodos descritos, que so utilizados geralmente na deteco de antgenos ou anticorpos solveis presentes em lquidos biolgicos, a imunofenotipagem por citometria de fl uxo. em laboratrios
clnicos, tem sido adorada essencialmente nos estudos
de caracterizao fenotpica de clulas em suspenso,
principalmente leuccitos do sangue perifrico e clulas
63
da medula ssea. Qualquer clula ou parccula em sus-
CONSIDERAES FINAIS
penso medindo 0,2-SOjJm de camanho pode ser analisada no cirmerro de fluxo. Clulas de cecidos slidos
devem ser desagregadas para permitir sua anlise. Como
Nas ltimas duas dcadas, os mrodos sorolgicos

passaram por importantes avanos que resultaram na
o prprio nome indica, crara-se de um mmdo de feno-
disponibilizao de restes de alta sensibilidade, especi-
tipagem celular realizada a partir de anticorpos que reconhecem antgenos presemes na superfcie celular. Para
ficidade e reprodutibilidade. Emrecanro, mesmo com a

utilizao de amicorpos monoclonais, anrgenos recom-
ranro, anticorpos (em geraL so empregados anticorpos
binames, peprdeos sintticos, marcadores especficos e
monoclonais, disponveis comercialmente) enconcram-
sensveis, o reste sorolgico essencialmente biolgico,
se marcados com fluorocromos, que absorvem uma luz
no possuindo a preciso das reaes qumicas puras.

sempre bom recordar que anticorpos no possuem
incidence e emitem outra luz de comprimenw de onda

maior e especfico. H diversos fluorocromos, cada um
com seu padro panicular de absoro e emisso de
luz, o que possibilita a utilizao simultnea de vrios
amicorpos, cada um conjugado com um diference fluorocromo. O emprego clnico mais comum da imunofenoripagem por ciromerria de fluxo est na contagem
de linfcims T CD4+ circulantes no moniroramento da
infeco pelo HIV (ver captulo 44) e no diagnstico e
classificao imunolgica de leucemias e linfomas (para
maiores detalhes ver captulo 4).
De maneira simplificada, pode-se dizer que o citmerro de fluxo uma combinao de um contador auromtico de clulas, similar ao empregado na realizao
auromarizada de hemograma (vide captulo 4), com um
derecror de fl uorescncia. Isso permite a determinao
simultnea de mltiplas propriedades fsicas das clulas
examinadas: tamanho, complexidade interna
de fluorescncia.
e emisso
No cirmetro, a suspenso de clulas previamente

incubadas com as preparaes de anticorpos fluorescentes colocada em tubos de ensaio, de onde aspirada e
levada at uma cmara onde um feixe de luz laser incide
sobre cada clula individualmente, permitindo a anlise
individual de cada clulas, em suas diferences propriedades. As alteraes no feixe de luz induzidas pela clula
so detectadas por diferences sensores e transformadas
em impulsos elrricos convertidos em sinais digitais, podendo oferecer os resultados em diferences formas de
anlise, cais como hiswgramas, dot-plot, entre outros. O
sistema ptico permite identificar as clulas pelo seu tamanho e sua complexidade interna e o sistema de filtros
permite a idemificao da fluorescncia emitida.
especificidade absoluta e que diferences agemes infecciosos podem compartilhar determinames antignicos
Emo, a deteco de amicorpos exclusivameme especficos para algum ageme especfico uma meta praticamente impossvel de se atingir. Enfim, a interpretao de
um reste sorolgico depende principalmeme da situao
clnica envolvida e do paciente individualmeme. Isso porque a produo de anticorpos no indivduo particular e
varivel: cada paciente rem seu perfi l de resposta imune,
resultado de sua genrica e de sua experincia imunolgica prvia. Assim, os exames sorolgicos s podem ser
interpretados luz de informaes clnicas.
REFERNCIAS
Burris (A, Ashwood ER, Bruns DE. Tierz Texrbook of
Clinical Chem1srry and Molecular D1agnosrics. 4 th ed. Sr.
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64 [ Medicina laboraro rial para o clnico ]1-- - -- - -- - - - - - - - -- - -- -- - - - - - - - --
Edi/berto Nogueira Mendes

Paula Prazeres Magalhes
Guilherme Birchal Coi/ares
07
,
DIAGNOSTICO GENETICO:
PRINCPIOS E TCNICAS
A descrio da estrutura da molcula de D A h

cerca de 50 anos, por Watson e Crick, constituiu o
pomo de partida para o desenvolvimento de diversas
tcnicas de estudo de cidos nuclicos, cujas aplicaes, no campo da bioanlise e do biodiagnsrico, so
virtualmente ilimitadas. De faro. pde-se testemunhar,
nos ltimos 25 anos, um avano sem precedentes na
compreenso de diferentes fenmenos biolgicos,
que expandiu nosso conhecimento sobre as bases
moleculares das doenas e. ao mesmo tempo. forneceu. aos profissionais da rea de sade, novas maneiras para estabelecer o diagnstico e o prognstico e
monirorar o curso das mesmas.
Os mrodos de genrica molecular. ou seja. o
conjunto de tcnicas que empregam cido nuclico
como alvo. vm sendo paulatinamente incorporados
prtica mdica, particularmente nas diversas reas da Medicina Laboratorial. Caractersticas como
simplicidade. rapidez. confiabilidade, sensibilidade
e especificidade conferem. aos mtodos genricos.
posio de destaque no campo do diagnstico laborarorial. Tais mtodos possibilitam a caracterizao,
inclusive de mutaes e polimorfismos. e a anlise da
expresso gnica. tanto no que se refere ao hospedeiro como. no caso de doenas infecoosas, ao agente
etiolgico do processo.
O objetivo deste captulo apresemar os pnncpios gerais e as aplicaes das tcnicas de gentica molecular mais
comumeme empregadas no diagnsnco laboratonal.
ESTRUTURA E FUNO DE CIDOS NUCLICOS
odos nucl1cos so macromolculas que consistem de subun1dades denominadas nucleotdeos.

constitudas por uma pentose, uma base nitrogenada e um gru po fosfato. Dois tipos de pentose podem ser observados. ri bose e desoxirribose, que diferem pela presena/ausncia de um grupo hidroxila
na posio 2' do anel do acar. As bases nltrogenadas, ligadas pos1o 1' do anel da pentose, podem
ser pmm1dinas (CitoS111a, timina e uracila) ou punnas
(adenina e guanina). que possuem, respectivamente,
um e dois anis heteroccl icos de carbono e nitrognio. Ligado s posies 5' e 3' de pentoses adjacentes e, portanto, responsvel pela formao da cadeia
polinucleotdica. encontra-se o grupo fosfato. que
confere carga negativa macromolcula. O nucleotdeo terminal de uma das fitas de cido nuclico
apresenta o grupo 5' livre; na outra extrem idade, o
grupo 3' encontra-se livre. Convencionou-se que a
seqncia de nucleocdeos da fita deve ser apresentada no sentido 5'-3'.
Existem dois tipos de cidos nuclicos, cido desoxirribonuclico (DNA) e cido ribonuclico (RNA).
que apresentam diferenas estruturais e funcionais. O
DNA responsvel pelo armazenamento e pela transmisso da informao gentica e o RNA est envolvido no processo de sntese protica, tambm denominado rraduo.
O DNA uma molcula de fica dupla, cuja pencose a desoxirribose e cujas pirimidinas so citosina
e timina. As cadeias que consticuem a molcula so
antiparalelas, ou seja, a orientao de uma das ficas
5'-3' e da fica complementar 3'-5'. O pareamento enue as firas, para formao da dupla hlice. mamido
por ligaes entre bases nicrogenadas complementares (A-T e C-G) e interaes entre pares de bases
adjacentes. (Figura 7.1)
extremidade 5'
PRINCIPAIS TCNICAS DE GENTICA

MOLECULAR APLICADAS AO DIAGNSTICO
Diversos mtodos que analisam DNA ou RNA podem ser empregados no diagnstico laboratorial. sendo
agrupados em duas caregorias. Os mrodos baseados
em amplificao so, na maioria das vezes, mais sensveis, permitindo a deteco de pequena quantidade do
cido nuclico alvo e, portamo, so especialmente teis
para realizao de diagnstico a partir do espcime clnico. Embora a quantidade de cido nuclico necessria
seja consideravelmente maior, os mtodos que no envolvem amplificao so utilizados. na prtica, em diversas situaes, inclusive na confirmao da identidade de
produtos amplificados.
TCNICAS QUE NO ENVOLVEM AMPLI FICAO

DE CIDOS NUCLICOS
(
cu,
o-~-o
0 11
~~v ~ .
O= r-o
~
o
Os dois mcodos de gentiCa molecular que no

envolvem amplificao mais utilizados na prtica laboracorial so hibridizao e anlise com endonucleases de
restrio. Ambos possuem numerosas aplicaes, sendo
particularmente teis na conduo de investigaes de
natureza epidemiolgica.
Figura 7.1 - Represemao esquemtica de molcula de DNA. (Cotostna; G - guanina; A - adenosina: T - tinna).
Hibridizao
O RNA, que apresenta citosina e uracila como

bases pirimdicas e ribose como acar, uma molcula de fita simples, mas exibe diversas regies de
fita dupla, em decorrncia do pareamento entre bases
nicrogenadas complementares (A-U e C-G). Existem
trs tipos principais de RNA: mensageiro, transportador e ribossmico, que so uanscritos de DNA. O
RNA mensageiro carreia a informao codificada no
DNA para a sntese protica. o RNA transportador
responsvel pelo carreamento do aminocido a ser
1ncorporado na cadeia polipepcdica em formao e
o RNA ribossmico um consticuinte estrutural dos
ribossomos, organelas complexas que catalisam a craduo da informao gnica em uma seqncia de
aminocidos. (Figura 7.2)
Hibridizao um conceito fundamenta l na bioqumica de cidos nuclicos. A tcnica baseia-se na

propriedade de pareamento entre seqncia alvo e
sonda. A sonda uma cadeia curta de nucleotdeos
complementar seqncia de interesse e pode ser sintetizada in vitro ou obtida pelo tratamento de uma cadeia polinucleotd ica com endonucleases de restrio.
Para permitir a deteco dos hbridos. a sonda deve
ser marcada. Essa marcao pode ser feita com ISWpo radioativo, que torna o mtodo mais sensvel. mas
apresenta os riscos inerentes manipulao de material radioacivo, ou com subscratos quimioluminescentes ou cromognicos, que so reagentes mais estveis,
facilitando a padronizao e a reprodutibilidade do
mtodo. A forma de deteco varia de acordo com o
tipo de marcao empregada.
66
anti c odon
S
GCGGAUUUAOCUC~AGCGCCAGA CUGAAYAY CUGGAGGUCCUGUG
CAC AG AAUUCGCA -
3'
Figura 7.2 -Representao esquemtica de molcula de RNA rransportador (A- adenina; C - cirocinina; G - guanina; U - uracila)
Em linhas gerais, a hibridizao envolve as seguintes

etapas, apresentadas esquemacicamente na Figura 7.3:
ligao do cido nuclico alvo a uma membrana; desnaturao da fira dupla de cido nuclico, quando for o
caso; adio da sonda em condies de cemperacura e
fora inica adequadas; remoo do excesso de sonda
no hibridizada e dececo da seqncia hbrida.
A hibridizao pode ser empregada em diversas sicuaes, visando, na maioria das vezes, a invescigao de
semelhanas entre molculas de cidos nuclicos de di-
ferentes origens. Sondas de DNA ou de RNA podem ser

ucilizadas para dececo de seqncias complementares; podem ser obcidos hbridos DNA/DNA. DNA/RNA
ou RNA /RN A. Devido facil idade de processamento
inicial, de armazenamento e de rransporre do maceria!, bem como possibilidade de anlise simulcnea de
numerosas amostras, a hibridizao parcicu larmente
adequada para escudos epidem iolgicos que envolvem
obceno de macerial em locais que no dispem de
infra-escrucura adequada.
gel
membrana
Transferncia d o
acido nuc lico do gel

paro o membrana
sonda marcada
d eteco do alvo
1 -d
Figura 7.3 -Representao esquemtica de tcnica htbridizao.
Diagnstico genrico: princpios e rcnicas
67
A tecnologia de microarray, um tipo particular de hibridizao mais recentemente desenvolvido, emprega sonda
marcada ligada a um suporte slido ao qual as amostras
teste so adicionadas. Por ser uma tcnica miniaturizada, requer pequenos volumes de reagentes, o que reduz
o cusco do teste. Os microarrays so manufaturados por
diversos fornecedores, que utilizam diferences supones
slidos, encre os quais o vidro, o mais comumeme empregado. A metodologia ainda no se encontra disponvel na
imensa maioria dos laboratrios de diagnstico.
Anlise com endonucleases de restrio
Endonucleases de restrio so enzimas produzidas por

microrganismos, que reconhecem pequenas seqncias palindrmicas especficas de nucleotdeos e clivam a molcula
de cido nuclico. O tratamento de cidos nuclicos com
tais enzimas gera fragmentos de diferences tamanhos, de
acordo com a distncia entre os stios de clivagem presentes
na molcula. O perfil de restrio da amostra pode ser revelado por eletroforese em gel do produto da reao.
Para investigao do perfil de restrio, pode ser empregado DNA obtido di retamente da amostra ou DNA
amplificado por reao de polimerizao em cadeia (PCR).
Existe uma ampla gama de endonucleases de restrio disponveis no mercado; a escolha das enzimas pode ser feita
com base na seqncia do alvo em questo ou de maneira
aleatria. O nmero de enzimas utilizado em determinado
teste pode variar de acordo com o propsito do estudo e
o emprego de diferences enzimas aumenta o poder discriminatrio do mtodo.
Em sntese, a tcnica consiste em submeter a amostra de
DNA clivagem por endonuclease(s) de restrio nas condies fsico-qumicas adequadas para que a reao ocorra.
O produto da digesto enzimtica , ento, discriminado
por eletroforese em gel. A comparao entre os perfis de
restrio obtidos permite a investigao de semelhanas
entre cidos nuclicos de diferences origens (Figura 7.4).
limitao a sensibilidade baixa, ou seja, resultados falsonegativos podero ser obtidos quando a quantidade de
cido nuclico alvo no for adequada. O desenvolvimento de mtodos que envolvem amplificao, em especial
PCR, contribuiu para a soluo deste problema e incrementou a utilizao de mtodos de gentica molecular
no diagnstico laboratorial.
Apesar de a PCR ser a estratgia de amplificao
de cidos nuclicos mais util izada, outras metodologias tm sido desenvolvidas. Alm da ampli ficao
do cido nuclico alvo, elas podem envolver ampli ficao da sonda (oligonucleotdeo) ou do sinal (marcador da sonda). Esse grupo de mtodos apresenta,
como principal vantagem, a combinao de sensibilidade e especificidade elevadas, sendo util izado,
especialmente, nas reas de Oncologia e de doenas
infecciosas e hereditrias. Kits d iagnsticos que empregam algumas dessas tcnicas vm sendo amplamente comercializados.
PCR
PCR uma reao qumica simples, pr-omovida

in vitro, que combina os princpios de hibridizao com
aqueles de replicao de cidos nuclicos. Permite a amplificao exponencial de seqncias genmicas de interesse, sendo considerado um mtodo de diagnstico
extremamente sensvel e especfico.
A
Digesto por endonuclease

Exemplo: EcoR 1
3'- C - T - T - A - A
5'- C
lA- A- T- T - C - 3'
sitio de reconhecimento
~ Eletroforese em gel
-1-t--- Padro de restrio
TC NICAS QUE ENVOLVEM AMPLI FICAO DE

CIDOS NUCLICOS
Embora as tcnicas que no envolvem amplificao

do alvo apresentem especificidade elevada, sua principal
t G - 5'
Figura 7.4 - Representao esquemtica da anlise empregando

enzima de restrio.
68 ( Med icina laboratori al para o clnico Jr-~~~~~~------------~~~~~~~~~~~-
Para a realizao da PCR, alguns consEiwinces so

fundamentais: a) o molde (DNA), ao qual se liga o
par de primers; b) os primers, usualmente seqncias
curtas de DNA de fita simples (15 a 25 nucleotdeos),
cada um deles complementar a uma das fitas de DNA
molde; c) os desoxi rribonucleosdeos trifosfaEados
(dNTPs), que so adicionados de maneira complementar seqncia do molde; d) a DNA polimerase
termoescvel, usualmente Taq DNA polimerase, que,
aps ligao dos primers, catalisa a adio de desoxirribonucleotdeos s fitas em formao. A concentrao de cloreto de magnsio, outro reagente essencial,
influencia o desempenho da tcnica, podendo ser
ajustada para tornar adequadas a especificidade e a
sensibilidade da reao.
Cada ciclo de amplificao inclui trs etapas: desnaturao, anelamento e extenso. A desnaturao o perodo no qual a fita dupla de DNA desfeita. O processo
promovido pela exposio do material temperatura
de aproximadamente 95C. Durante a fase seguinte, os
primers ligam-se a regies homlogas no DNA molde.
Esta etapa ocorre em temperatura mais baixa, influenciada pela seqncia de bases niuogenadas dos primers.
No perodo de extenso, promovida em torno de 72(.
temperatura ideal para ao da Taq DNA polimerase,
ocorre formao da cadeia complementar de DNA.
cujo tamanho determinado pela posio de anelamento dos pnmers.
Os produtos da reao ou amplicons, produzidos em
quantidades extremamente elevadas (cerca de 2n, n = nmero de ciclos de amplificao), o que diminui de forma
significativa o limite mnimo de deteco, podem ser evidenciados pelo emprego de diferentes tcnicas, incluindo
eletroforese em gel. colorimetria, fluorimetria e quimioluminescncia, entre outras (Figura 7.5).
A aplicao da PCR, sem dvida o principa l avano
tcnico recente na rea de Gentica Molecular, tem revolucionado o conhecimento relativo aos organismos
vivos. O impacto da tcnica afeta rodos os campos da
Biologia, tanto na rea bsica como aplicada, sendo empregada para diagnstico clnico, esrudo de doenas
hereditrias e anlise forense, entre outros. Merece destaque sua utilizao no campo das doenas infecciosas,
para a compreenso da relao entre microrganismos e
hospedeiro, o diagnstico etiolgico e a investigao de
resistncia a drogas antimicrobianas. A tcntca utiliza-
Diagnstico gentico: princpios e tcnicas
da para deEeco de um alvo especfico, o que implica

a necessidade de se conhecer previamente a seqncia
da regio a ser investigada. A PCR um procedimentO
de execuo simples, cujo resultado pode ser obtido de
forma rpida.
Diversas modificaes que aumentam a aplicabilidade da tcnica tm sido desenvolvidas. Entre elas, podem
ser citadas PCR multiplex, nested PCR, arbitrarily-primed
PCR (AP-PCR), reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) e
PCR em tempo real.
A PCR multiplex a variao na qual mais de um
par de primers includo na reao, o que permite a
deteco de diferentes alvos. A principal lim itao da
tcnica a dificuldade de padronizao, decorrente
da utilizao simultnea de primers com propriedades qumicas e fsicas distintas. Em conseqncia da
possibilidade de deteco de mltiplos alvos em uma
mesma reao, a PCR multiplex torna a relao custo/
benefcio mais favorvel.
Nested PCR envolve o uso de dois conjuntos de primers, empregados em reaes seqenciais. O amplicon
produzido na primeira reao utilizado como molde
na segunda. As vantagens desta tcnica so sensibilidade e especificidade aumentadas, em decorrncia do
nmero elevado de ciclos de amplificao e do uso de
um conjunto de primers que se anelam a regies do
produto amplificado na primeira reao, respectivamente. As principais desvantagens so o custo elevado
e a necessidade de mani pulao do produto amplificado na pri meira reao.
AP-PCR emprega primer que se liga a alvos aleatrios na molcula de DNA produzindo fragmentos de
diferentes tamanhos. semelhana da anlise com endonucleases de restrio, a tcntca til para a deteco
de semelhana entre genomas de diferentes origens.
RT-PCR utiliza RNA como alvo. Na primeira fase da
reao, DNA complementar (cDNA) produzido pela
ao da enzima transcriptase reversa. A seguir, este DNA
empregado como molde para amplificao, como descrita anteriormente para PCR convencional. Encomra-se
disponvel, atualmeme, uma DNA polimerase termoestvel que, em condies adequadas, possui tambm atividade de uanscriptase reversa. As principais aplicaes
da tcnica incluem o estudo da expresso gnica e o
diagnstico de doenas infecciosas por vrus cujo genoma constitudo por RNA.
69
amplicans do tamanho
esperado
...,
DNA (lia dopla) /
se~
r egio o
a m p li fic ado
I
\,
llllllllr..
I
...
S.:::J'-....
i
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...
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PRIMEIRO C ICLO
extens o
anelomen to
SEGUNDO CICLO
""'/
\
?
llllllllr..
I
...
s..,=:J
=TERCEIRO CICLO
Figura 7.5 - Representao esquemc1ca de PCR.
A PCR em tempo real um mrodo que alia s

vantagens da PCR tradicional a capacidade de quantificar o DNA alvo. ou seja. permite avaliar, por exemplo. a carga de microrgan1smos infecranres. t uma
tecnologia recentemente desenvolvida. baseada na
deteco e quantificao de uma molcula repner
fluorescente. cuja concentrao medida a cada ciclo
da reao. Para deteco e quantificao do produw
amplificado. duas abordagens so usualmente empregadas: sondas ou corantes intercalantes que se ligam
ao amplicon. Embora o cusw ainda seja um fawr limitante para o emprego dessa merodologia. a PCR
em tempo real apresenta duas grandes vantagens: diminuio da chance de contaminao, uma vez que
o amplicon detectado durante a reao. e rapidez
com que o resultado obtido.
Seqenciamento
O seqenciamento de cidos nuclicos reconhecido, atualmente, como uma tcnica fundamental no

campo da Gentica Molecular. Porm. sua aplicao ainda limitada pelo custa elevado.
A determinao da ordem exata dos nucleotdeos
que constituem os cidos nuclicos possibilita o conhecimento profundo do genoma dos organismos. A partir
desse conhecimenco. possvel o desenvolvimento de
70 [ Medicina laboratoria l para o clnico
primers e sondas para utilizao no diagnstico de uma

ampla variedade de doenas. a seleo de estratgias
adequadas para a obteno de seqnoas de interesse
para emprego na tecnologia de DNA recombiname. o
reconhecimento de mutaes e do seu significado. a
comparao entre diferences seqncias visando estudos filogenticos. o esclarecimento da etiopawgenia de
diversas doenas e o desenvolvimento de estratgias
para preveno. controle e tratamenco das mesmas. entre outras numerosas aplicaes.
O conhecimento da seqncia de nucleotdeos
de um determ inado gene elucida no apenas sua estrutura. mas tambm permite deduzir a seqncia de
aminocidos codificados. Alm disro. por comparao
com genes previamente descriws. novos genes podem
ser mais facilmente localizados no genoma e ter suas
funes deduzidas com base na similaridade entre as
seqncias dos mesmos.
O seqenciamento de DNA realizado por PCR. empregando-se o mtodo de terminao de cadeias. que
consiste em utilizar. em adio aos precursores habituais
(dNTPs). didesoxirribonucleosdeos trifosfacafos (ddNTPs). Esses compostos so semelhantes aos dNTPs. mas
desprovidos do grupamento hidroxila na posio 3', stio
de ligao ao nucleotdeo adjacente e. portamo. fundamental para o alongamento da cadeia.
Para execuo da tcnica. quatro misturas de reao so preparadas. Todas contm tampo. DNA
]1---- - - - --
Reao em cadeia da ligase (lCR)
molde, DNA polimerase e os quatro dNTPs e a cada

uma delas acrescentado um nico ddNTP. Quando o ddNTP incorporado cadeia em formao,
ocorre interrupo da sntese de DNA. Os producos
da reao so submetidos eleuoforese em gel desnacurante de poliacrilamida, em paralelo, o que permite a deteco de uma srie de bandas seqenciais
que identificam molculas nas quais a sntese de DNA
foi interrompida na posio correspondente incorporao do ddNTP. A seqncia de DNA obtida a
parcir da leicura da banda de menor peso molecular
e. assim, seqencialmenre at a banda de maior peso
molecular (Figura 7.6). Primers ou ddNTPs marcados
com iscopos radioativos ou com fluorforos podem
ser empregados.
Os avanos tecnolgicos permitem que. acualmenre,
a reao seja realizada em um nico cubo, empregando
ddNTPs marcados com fluorforos d1ferences. Alm
disco. os eqUipamentos ma1s modernos so docados de
sistemas de deteco que d1spensam execuo de eleuoforese em gel de poliacrilamida.
O princpio bsico da LCR, mcodo que envolve amplificao do oligonucleotdeo (sonda). a ligao entre
dois oligonucleocdeos adjacentes catalisada por uma
DNA ligase cermoescvel. Os oligonucleocdeos anelamse de forma especfica s regies alvo das fitas de DNA.
A seguir. so unidos entre si pela ao de duas enzimas:
fragmento Scoffel de Taq DNA polimerase e DNA ligase
termoestvel. Os fragmentos resultantes da ligao entre
os oligonucleotdeos so. ento. empregados como molde para amplificao nos ciclos subseqenres.
A tcnica extremamente til no screenmg de mutaes de pomo relacionadas com resistncia a drogas amimicrobianas e com alteraes de propriedades associadas
pacogenicidade microbiana, emre outros. Embora seja mais
acurada com a utilizao das duas enzimas. a reao pode
ser realizada empregando-se apenas a DNA ligase rermoestvel. Neste caso. os oligonucleotdeos anelam-se a regies
adjacentes da f1ta alvo e a enzima catalisa as ligaes covalemes que uniro os pares de oligonucleocdeos entre s1.
T
T
G
~t
c
Figura 7.6 - Representao esquemnca de seqenoamento de odo nuclico.
Diagnstico gentico: princpios e tcnicas
71
Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)
APLICAES CLNICAS DO DIAGNSTICO

GENTICO
NASBA um sistema de amplificao isocrmica

do alvo que utiliza trs enzimas: cranscriprase reversa, RNase H e T7 RNA polimerase. Na primeira fase
da reao, um primer contendo scio de ligao para
a T7 RNA polimerase liga-se ao cido nuclico alvo.
A seguir, a u anscriprase reversa catalisa a sntese de
cDNA e, ento, a RNase H degrada a fira molde de
RNA, o que possibilita o anelamenro do segundo primer. Na seqncia, a arividade de DNA polimerase da
cranscriprase reversa caralisa a sntese de uma cpia
do cDNA comendo o stio de ligao da T7 RNA polimerase. Essa enzima produz grande quantidade de
cpias de fitas simples de RNA iguais ao alvo, que serviro como molde nos ciclos subseqentes da reao.
Quando o molde DNA, o processo o mesmo, excero pela necessidade de um ciclo inicial de desnaturao ames da adio das enzimas. O mrodo envolve caprura em suporte slido e deteco com sonda
marcada. Uma das grandes vantagens da tcnica
a sensibilidade excremamenre elevada. Sua principal
aplicao a quantificao de RNA virai na infeco
pelo vrus da imunodeficincia humana e a caracterizao de amostras do vrus resistentes a drogas.
Branched DNA (bDNA)

Branched DNA um sistema de amplificao
extremamente sensvel, que se baseia em mltiplos
ciclos de hibridizao de cidos nuclicos seguidos
por uma nica etapa enzimtica durante a fase de
dereco. Inicialmente, o ligonucleordeos de caprura ligados a uma fase slida hibridizam-se ao alvo e
imobilizam o mesmo. Na seqncia, oligonucleotdeos bivalentes de deteco ligam-se a regies do alvo,
servindo tambm como subscraros para hibridizao
do bDNA, que caprura oligon ucleordeos marcados
com uma enzima. Entre as vanragens do mrodo,
podem ser citadas a obceno de dados quantitativos, a menor possibilidade de contaminao e a facilidade do processamento inicial do espcime clnico,
que dispensa remoo de inibidores enzimticos, e
da manuteno do mesmo.
O desenvolvimento das tc nicas de gentica molecular represemou grande avano na propeducica laboratorial para diagnscico e acompanhamento de doenas
de diferences categorias, como as de etiologia infecciosa,
oncolgicas e de natureza hereditria. Sensibilidade e especificidade elevadas, rapidez de execuo e possibilidade de utilizao de uma ampla gama de espcimes biolgicos para anlise, incluindo material fixado em parafina,
representam im portantes vamagens dessas tcnicas.
O diagnstico gentico de doenas infecciosas tem sido
cada vez mais ucilizado, represemando uma imponame
alternaciva s tcnicas convencionais, muicas vezes crabalhosas e de execuo demorada. Tais mcodos podem ser
empregados no apenas para deteco de agentes infecciosos, mas cambm para sua quantificao, sua caracterizao
gentica e pesquisa de resistncia a amimicrobianos.
Tcnicas de gentica molecular so particularmente
teis quando microrganismos no cultivveis, de difcil
cultivo ou de crescimento lemo, como vrus e micobactrias, so os agentes do processo. Entretanto, o mtodo
no perm1ce o isolamento de microrganismos para outros
estudos. Emre as tcnicas de diagnstico gentico, PCR
a mais amplamente utilizada. Embora apresente as vantagens mencionadas, possui algumas limitaes importantes.
Na maioria das vezes, os primers utilizados so especficos,
razo pela qual resultados negativos no excluem infeco por outro microrganismo e resultados positivos no
excluem infeces mistas. Devido possibilidade de deteco de quantidades nfimas de microrganismos, a positividade do reste no significa, necessariamente, identificao
do ageme etiolgico da infeco. Como detecta material
gentico, possvel a obteno de resultados positivos na
presena apenas de microrganismos inviveis ou larentes
que, naquele momento, no esto envolvidos na etiopatogenia do processo. Assim, o emprego de PCR no adequado em algumas situaes especficas, como avaliao
da eficcia do tratamento de pacientes com tuberculose.
A PCR encontra-se incorporada prtica clnica para
o diagnstico de hepatites virais, in feco por HIV e HPV,
uretrites, cervicites, tu berculose e ciromegalovirose. Existem diversas variaes de tcnica que permitem, entre
outros, avaliao de carga virai e de resposta ao trata-
72 [ Medicina laboratorial para o clnico ]f-- - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
mento com antimicrobianos especialmente em pacientes com infeco por HIV, hepatites e ciwmegalovirose.
Outra possibilidade de aplicao das tcnicas de
gentica molecular na abordagem do paciente com
doena infecciosa a deteco de resistncia do
agente etiolgico a antimicrobianos. importante
salientar que a ausncia do gene no significa suscetibilidade droga, uma vez que a resistncia pode
ser conferida por outros mecanismos. Alm disco, a
presena de um gene de resistncia no indica necessariamente sua expresso. Apesar dessas limitaes, a
alterao da amibioticoterapia deve ser considerada
quando genes de resistncia so detectados. A pesqu isa de genes de resistncia particularmente til
quando a realizao de testes de suscetibil idade no
possvel ou dificultada pelo tempo de gerao do
microrganismo. Uma das principais indicaes desta
pesquisa fornecer subsdios para a escolha de esquema teraputico para tratamento de pacientes
com tuberculose. quando h suspeita de resistncia
aos tuberculostticos habitualmente empregados.
Vrios genes de resistncia a antimicrobianos tm
sido estudados, entre eles rpoB, relacionado com resistncia a rifampicina, e katG, inhA e ahpC. associados resistncia isoniazida.
Tcnicas de gentica molecular so teis tambm no
diagnstico e acompanhamento de doenas oncolgicas. A rransformao maligna das clulas requer. geralmente, ativao mltipla de proto-oncogenes ou desregulao de genes supressores de tumor. Por meio destas
tcnicas possvel identificar oncogenes e mutaes em
genes supressores de tumor. Para se atingir esses objetivos, podem ser utilizados PCR. empregando-se primers
para deteco de alguns oncogenes. e seqenciamento,
para pesquisa de mutaes.
Entre vrias possibilidades, tais mtodos podem ser
utilizados para auxiliar no diagnstico diferencial entre
linfoma folicular e hiperplasia folicular de tecido linfide
por meio da deteco, por PCR, de rearranjos do gene
bcl-2; da leucemia mielide crnica pela deteco do
segmento bcr!abl resultante da translocao (9;22); de
cncer de mama e ovrio por meio de seqenciamento de brcA1 e brcA2 para pesquisa de mutaes; e de
carcinoma medular da tireide e neoplasia endcrina
mltipla, pelo seqenciamento dos exons 10, 11. 13, 14 e
16 do gene ret, para pesquisa de mutaes.
Diagnstico gentico: prin cpios e tcnicas
Estes mtodos apresentam vantagens sobre a determinao do caritipo, que requer a obteno de clulas
em diviso. Alm disto, tcnicas de gentica molecular
so mais sensveis, uma vez que o mtodo convencional
no detecta anormalidades submicroscpicas. Por outro lado. como os mtodos genticos so direcionados
para a pesquisa de uma anormalidade especfica, resultados negativos no excluem a presena de alterao.
Ainda, a cariotipagem detecta variaes numricas de
cromossomas, como trissomias e monossomias, que
no so identificadas por PCR.
A pesquisa de alteraes genticas associadas ao cncer no recomendada para rastreamento da doena na
populao geral. j que o cusco-benefcio desfavorvel
e o diagnstico pode levar a sofrimento desnecessrio.
Alm disto, as medidas a serem adoradas caso uma alterao associada a risco elevado para o desenvolvimento
de neoplasia seja detectada no esto estabelecidas. Um
exemplo que ilustra esta situao a deteco de mutaes em brcA1 e brcA2. Embora tais alteraes genticas
estejam presentes em apenas aproximadamente 2,5%
das mulheres com cncer de mama, esto associadas
transmisso hereditria da neoplasia, que apresenta
padro autossmico dominante de herana e risco de
desenvolvimento do tumor superior a 50% em indivduos com at 50 anos de idade. podendo atingi r valores
prximos de 90% a partir da stima dcada de vida. Deste modo, a deteco dessas alteraes poderiam levar a
conduta radical. como a mastectomia profiltica. Assim,
tornam-se fundamentais estudos epidemiolgicos mais
profundos relativos ao tema.
Deteco de alteraes genticas pode ser util izada. ainda, como marcador prognstico e no acompanhamento de tratamento de pacientes com neoplasias
diversas. Nessas situaes, a importncia da deteco
de marcadores genticos de cncer j est mais bem
estabelecida. Por exemplo. a presena de translocao
(12;21) em pacientes com leucemia linfoblstica aguda
est relacionada com mel hor prognstico e resposta adequada quimioterapia convencional e algumas
mutaes do p53 esto associadas a prognstico pior
em alguns tumores gastrintestinais. de bexiga. pulmo,
ovrio, mama e prstata. Informaes mais detalhadas
sobre o uso de tcnicas de gentica molecular no diagnstico e acompanhamento de leucemias encontramse nos captulos 29, 30 e 31.
73
Com a elucidao do genoma humano, tm sido

descobertas diversas alteraes genticas relacionadas
a doenas hereditrias. Mrodos de gentica molecular
so cada vez mais empregados para deteco dessas alteraes na prtica clnica, entre eles, seqenciamento
de cido nuclico, PCR e hibridizao. Quando a PCR

utilizada, primers especficos para a mutao procurada e para o gene selvagem devem ser empregados para
identificar-se a presena do gene murado em homozigose ou heterozigose. Como exemplo, pode ser citada a
fibrose cstica; o quadro j foi associado a mais de 1.000
mutaes e, geralmente, os testes genticos so capazes
de detectar apenas as mais comumente relatadas.
Outras aplicaes de tais mtodos na rea de doenas genticas incluem o diagnstico da sndrome
do X frgil, de hemocromarose hereditria, de disrrofia
muscular Duchenne/Becker e de ataxia espinocerebelar.
bem como deteco de mutaes nos genes da metilenotetrahidrofolaro redutase, da protrombina e do fator
V de Leiden, associadas trombofilia. e nos genes pkd1
e pkd2, relacionados doena renal policstica aurossmica dominante.
importante ressaltar que, devido narureza irreversvel das alteraes provocadas, sempre importante
o aconselhamento pr e ps-reste visando avaliar o paciente e informar as indicaes do ensaio, o significado
da presena das alteraes em homozigose e em hererozigose para a doena pesquisada, a necessidade ou no
de acompanhamento clnico e psicolgiCo ps-teste, os
possveis riscos de transmisso da doena ou da alterao gentica para os descendentes e a necessidade de
avaliao posterior de outros membros da famlia.
Os mtodos de gentica molecular so aplicados no
diagnstico de paternidade. O teste pode ser realizado
por meio da amplificao, por PCR, de regies denominadas short tandem repeats, caracterizadas pela presena de nmero varivel de repeties de um segmento de
crs a sere pares de bases localizadas cm diversos loci cm
regies no traduzidas do genoma humano. Cada indivduo apresenta dois alelos de tamanhos variveis em cada
um desses loCI. O diagnstico feiro a partir da anlise de
12 a 25 /oo e comparao dos alelos do filho com os maternos e com os do suposw pai. Os resultados so analisados em softwares que consideram a freqncia dos
alelos encontrados na populao local e liberados como
probabilidade de paternidade que, quando confirmada,
74
geralmente atinge valores superiores a 99,99%. Mrodos semelhantes podem ser usados em percia criminal
para investigao de materiais biolgicos. na tentativa de
identificar um indivduo suspeiw.
Apesar da grande utilidade das tcnicas de gentica
molecular no diagnstico e acompanhamenro de doenas de diferences etiologias, sua aplicao na prtica

mdica , ainda, pouco difundida. O custo desses testes
ainda tido como um faror limitante para sua utilizao.
Deve-se lembrar que os benefcios do mtodo gentico
de diagnsnco, entre eles rapidez e acurcia, podem contribuir para uma relao custa-benefcio mais favorvel.
possibilitando reduo da necessidade de outros exames
complementares, instituio de tratamento mais eficaz
e diminuio do nmero e da durao de internaes.
Outros fawres limitantes, talvez mais importantes que
o cusw elevado, so o desconhecimento das tcnicas e
de suas aplicaes e a falta de pessoal capacitado. Assim,
fundamental que se promova maior disseminao de
informaes referentes a indicaes e benefcios da incluso de tcnicas de gentica molecular na abo rdagem
laboratorial do paciente.
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]1-- - - - - - - -- - - -- - - - - - - - -- - - -- - - - -
Guilherme Birchal Cofiares

Lucienne Frana Reis Paiva
Hyllo Baeta Marcel/o jnior
08
MICROBIOTA INDIGENA
O ser humano isento de germes somente enquan-
tes de seu metabolismo, e colabora com os mecanismos
to habita, em condies normais, o tero materno,
de proteo antiinfecciosa, mas, tambm, constitui um
tornando-se colonizado por microrganismos a partir do
reservatrio de microrganismos potencialmente pato-
momento do nascimento. Em contara com o meio ex-
gnicos. Alm disso, conhecendo a microbiota indgena,
terior, as superfcies corporais so colonizadas principal-
possvel interpretar melhor os resultados de culturas,
valorizando ou no o isolamento de determinados mi-
mente por bactrias e, em menor escala, por fungos
protozorios. Essa coleo de microrganismos que habi-
crorgan ismos em determinados stios.
tam o corpo comumente denominada de "microflora

normal". Outros termos muito usados so "flora normal", "microbiota indgena" e "microbiota autctone".
MICROBIOTA INDGENA
De todos, os mais corretos so "microbiota indgena" e

"microbiota autctone", pois inferem uma coleo de
Mecanismos regulatrios do hospedeiro (fatores
microrganismos que so nativos do corpo. "Flora" e "mi-
autgenos) e fatores externos (alognicos) so respon-
croflora" so conotaes botnicas infelizes, derivadas
sveis pela presena de determ inados microrganismos
dos tempos em que as bactrias e outros m icrorganis-
no corpo e pela elimi nao de o utros. Diferenas bio-
mos eram considerados semelhantes s clulas vegetais.
qumicas e fisiolgicas em diferentes regies do corpo
A m icrobiota indgena habita a superfcie da pele, a ca-
(temperatura, pH, potencial de oxirreduo, osmola-
vidade oral, o t rato respiratrio superior, o trato diges-
ridade, nutrientes, receptores na superfcie de clulas
tivo e os tratos urinrio e genital, variando qualitativa e
epiteliais, entre outros) proporcionam ambientes pro-
quantitativamente nos diversos locais.
pcios para determinados microrganismos e desfavo -
O nmero de microrganismos presentes na m icro-
rveis para outros. A capacidade de adeso a superf-
biota indgena chega a superar o nmero de clulas
cies do corpo, que clula-especf ica e rel acionada
de seu prprio hospedeiro. Enquanto um adulto hu-
expresso de adesinas, um dos principais requisitos
mano constitudo de aproximadamente 1013 clulas
para a colonizao.
eucariticas, as suas superfcies podem ser colonizadas
A microbiota pode ser classificada em transitria
pelo total de 1014 clulas microbianas procariticas e
ou residente. A m icrobiota residente praticamente
eucariticas.
constante em determinada topografia e faixa etria.
O conhecimento da microbiota importante porque
Aps seu estabelecimento, e em condies normais,
ela exerce aes benficas para o hospedeiro, decorren-
no al terada; e quando isto ocorre, prontamente
resrabelecida por si s. Esr firmemente aderida aos

receptores reciduais acravs de ligaes covalentes, hidrognio-inicas. entre outras, s podendo ser removida pela morte microbiana ou alteraes no recepcor.
Os nossos tecidos representam seu habitat natural e
quando o equilbrio mantido, no provoca doenas,
atuando como barreira amiinfecciosa. A microbiota
uansitria pode colonizar tecidos temporariamente
por algumas horas. dias ou semanas, no sendo restabelecida por s1 s. A sua imerao com os recepcores teciduais reversvel, podendo ser removida. Geralmente. origina-se do meio amb1ente ou de outros
tecidos do hospedeiro e no representa problema se
a microbiota residente permanecer inalterada, mas
pode originar doenas na sua alterao.
A 1nterao da microbiora com os tecidos altamente especfica e determinada por facores locais do
hospedeiro, como especificidade dos receptores, suprimento sangneo, nutrientes, temperatura, umidade.
pH. potencial de oxirreduo, presena de enzimas e
anticorpos lgA. Os fatores ambientais. como o tipo de
dieta, hb1tos de higiene. polu1o, saneamento bsico.
utilizao de anrimicrobianos ou anti-spticos e hospitalizao, tam bm influenciam na constituio da microbiota indgena.
Cada parte do corpo contendo suas caractersticas
estruturais e microbianas pode. por definio, ser considerada um ecossistema. Como cada ecossistema abriga
uma m1crobiora caracterstica, a microbiora indgena humana pode ser dividida em m1crobiota da pele, do trato
respiratrio superior. cav1dade oral. microbiota gasrrinrestinal e do trato geniturinrio.
MICROBIOTA DA PELE
A m1crobiora da pele constituda principalmente
pelos Staphylococcus spp. coagulase negativos. sendo
Staphylococcus epiderm1d1s a espcie mais freqente.
Outros cocos Gram posmvo podem ser encontrados.
entre eles: Micrococcus. Peptococcus saccharolytlcus.
Streptococcus viridans e Enterococcus. Outro importante membro da microbiota da pele o Staphylococcus
aureus, presente em cerca de 20% das pessoas. podendo estar relaoonado a infeces como impetigo. foliculite e furunculose. Bastonetes Gram positivo tambm
76 [ Medicina laboracorial para o clnico
podem ser encontrados habicando normalmeme a pele

humana e so representados pelos difrerides aerbicos (Corynebactenum sp e Brev1bactenum sp) e pelos
difterides anaerbicos. Bastonetes Gram negativo so
raramente encontrados como membros da microbiota
da pele, a no ser em pacientes hospicalizados. O Quadro 8.1 lista os microrganismos mais freqentemente
isolados da pele. O conhecimento dessa microbiora se
faz importante j que microrganismos da pele podem
aparecer como contaminantes de culturas de diversos
materiais, como nas uroculturas, hemoculruras e culturas de secrees diversas.
MICROB IOTA DO TRATO RESPIRATRIO

O trato respiratrio inferior estril abaixo da carina.
As vias areas superiores so colonizadas predominamemente por cocos Gram positivo, sendo Staphylococcus
aureus e Staphylococcus ep1derm1dis as espoes ma1s
isoladas. Bastonetes Gram positivo, como os difterides. tambm podem ser encontrados com freqncia .
O Quadro 8.2 lista os principais microrganismos da
microbiota do trato respiratrio superior. t importante ressaltar que microrganismos considerados patgenos primrios. como Streptococcus pyogenes, Neisseria
memng1tidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus
mfluenzae. podem ser isolados nessa topografia. normalmente como componentes da microbiota.
MICROBIOTA DA CAVI DADE ORAL

A cavidade oral apresenta grande densidade
microbiana. comparada apenas da m1crobiota intestinal. Microrganismos anaerbios estritos como
bacterides. Fusobacterium e Veillonella superam numericamence as espcies facultativas. Streptococcus
mutans. presentes normalmente na microbiora oral,
podem contribuir para a formao da placa dentria, possibilitando o desenvolvimento da crie. Os
microrganismos mais comumente encontrados na
cavidade oral humana esto listados no Quadro 8.3.
importante ressaltar que microrganismos presentes
na microbiota o ral podem representar importantes
contaminantes de culturas de escarro.
Quadro 8.1 -Microrganismos comumenre dereclados na pele humana

Cocos Gram positivo
Slophylococcus
oureus
5 ounculores
S cop,s
S cohntt
S. epidermidis
S. hoemolyticus
S. hominis
S socchoroltticus
S. soprophyticus
Bastonetes Gram
positivo
Coryneboctenum
Jei erum
S. Xyfosus
C ureo/yt1Cum
Micrococucus luteus C mmullsstmum
M.lyloe
Proprombocterium
M. nishinom1yoensis ocnes
M. krislinoe
P. ovidum
M sP.denlorius
P. gronulosum
M. roseus
Breviboctenum
M. vorions
eptdermidts
S. simulons
S. worner
Bastonetes Gram
negativo
Leveduras
Malossezio furfur
Acinetobocter
JOhnsonii
Aracndeos
Demodex
folliculorum
Modrflcado de lannod .. GW Normal M rcroflora1
Quadro 8.2 - M1crorgamsmos comumente detectados no trato respiratrio superior

Poro anterior das
normas
Stophylococcus
epidermidis
S. oureus
Corynebocterium sp
Mod fiCado de: Tannock GW
Nosoforinge
Orofaringe
Stophylococcus
Todos os do nosofonnge, m01s.
eprdermidis
Streptococcus ongmous
S. constellotus
S oureus
S. inlermedius
Coryneboctenum spp
S soguis
Moroxello cororrholis
Hoemophdus nfluenzoe S. oro/is
S. mitis
Nersse1i0 meningitidis
S. ocidomintmus
N . mucoso
N . sicco
N subflovo
S.
S.
S.
S.
S.
S.
S.
S.
S
morbillorum
salivorius
uberis
gordonir
mutons
cricectus
rattus
sobnnus
crrsto
S. pneumonioe
S. pyogenes I< 10% do
populao humanal
Hoemophilus potarn
fluenzoe
Mycoplosmo solivorius
M. oroles
ormal Mcroflora 2
Quadro 8.3 - M1crorgamsmos comumenre detectados na cav1dade oral de seres humanos

Bastonetes G rom positivo
e bactrias filamentosos
Actinomyces :srae/1;
A. viscosus
A. noeslund11
Eubacterium olocto/ylicum
E. saburreum
Lactobocillus cosei
Bifidobocterium denltum
Corynebocterium mafruchotii
Propronibocterivm sp
Rothto dentoconoso
Bastonetes Grom negativo
Prevotelo meloningogemco
P intermedio
P. loescheii
P. denticolo
Porphyromonas gingivolis
P. assocharo/ytica
P. endodontalis
Fusobacterium nucleatum
F. naviforme
F IUSSII
F peridoncticum
F. olocis
F sulci
Leptotrichio buccalis
Selenomonos sputigeno
S. flueggei
Copnocytophaga ochracea
C spvtagena
C. gingivolis
Compylabocter rectus
C. curvus
Veillonello p01vulo
V otyprca
V dispor
Modrfcado de Tannod. G\V 1\orma MICroflora 2
M ICROBIOTA GASTRINTESTINAL
O esfago normalmente contm apenas microrganismos provenientes da microbioca oral e dos alimentos.
Microbiota indgena
O estmago. devido ao baixo pH, no abnga microrganismos em condies no rmais. No JntescJno, a populao bacteriana aumenta no sentido cfa lo-caudal,
sendo que na ampola retal podem ser encontradas at
77
1012 UFC por grama de fezes. O bolo fecal
consticu-
ressaltar que Candida albica ns, agente causador d e
do principalmente por microrganismos anaerbios es-
vaginites, pode estar presente como parte da micro-
tri tos numa relao de aproximadamente 1.000 bact-
biora indgena vaginal.
rias anaerbias estritas para cada anaerbio facultativo.

Os principais anaerbios encontrados so bacterides,
Fusobacteriumm spp., Clostridium spp. e lactobacilos. En-
Quadro 8.5 - Gneros bacterianos comumente encontrados no lavado vaginal de humanos
tre os facultativos, destacam-se as enterobactrias, como
Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp e Pro teus

spp. O Quadro 8.4 lista os principais microrganismos encontrados no bolo fecal.
Quadro 8.4 - Gneros bacterianos comumente encontrados nas fezes humanas
Cocos Gram positivo anaerbios
Bocteroides
Condido
Corynebocterium
Eubocterium
Gordnerello
Loctobocillus
Mycoplosmo
Propionibocterium
Stophylococcus
Streplococcus
Ureoplosmo
Mod1ficado de: Tannock, GW: Normal Microflora
Acidominococcus
Bocleroides
Bifidobocterium
Clostridium
Coprococcus
Enterobocter
Enterococcus
Escherichio
Eubocterium
Klebsiello
Loctobocillus
Megomonos
Meghosphoero
Methonobrevibocler
Methonosphoero
Peplostreptococcus
Proteus
Ruminococcus
Veillonello
IMPORTNCIA DA MICROBIOTA INDGENA
A microbiota indgena, quando em equilbrio e na

ausncia de fatores que comprometem a imunidade do
hospedeiro, apresenta vrios efeitos benficos, atuando
Mod1fcado de: Tannock, GW: Normal M icroflora
na prpria defesa antiinfecciosa e contribuindo na nutrio do hospedei ro.

Certos membros da microbiora intestinal so capa-
MICROBIOTA DO TRATO GEN ITURINRIO
zes de sintetizar vitaminas K, B12, folato, piridoxina, biorina e riboflavina, participando da nutrio do hospedeiro.
O trato urinrio superior estril at 1 cm da
Apesar disso, com exceo da vitamina K, as quantida-
uretra distal. O meato uretral e o segmento distal
des produzidas so muito pequenas em relao quan-
da uretra so geralmente colonizados por micror-
tidade presente numa dieta balanceada.
ganismos da pele. O trato genital feminino colo-
Na defesa, a microbiota age impedindo o esta-
nizado por m icrorganismos dife rentes, dependendo
belecimento de microrganismos exgenos possivel-
da poca de vida. Ao nascimento, devido ao de

hormnios maternos, o epitlio vaginal est rep leto
mente patognicos, a partir de diversos m ecanismos, como competio por nutrientes, produo
de glicognio, substrato para a proliferao de lac-
de bacteriocinas o u modificaes ambientais, que
tobacilos. Com a queda dos nveis hormonais, aps
desfavorecem a colonizao de patgenos. Bact-
algumas semanas de vida ocorre diminuio do gli-
rias do gnero
Bifidobacterium presentes no clon
cognio do epitlio vaginal, os lactobacilos desapa-
de crianas em aleitamento materno produzem um
recem, o pH vaginal torna-se neutro, o que permite
ambiente adverso para infeco por patgenos en-
Streptococcus
a proliferao de m icrorganismos anaerbios como
tricos. Bacteriocinas produzidas por
Bacteroides spp. Na puberdade, a partir da menarca,

durante todo o perodo frtil, ocorre colonizao
do grupo viridan s presentes na microbiota da orofaringe impedem a colonizao por Streptococcus
vaginal por lactobacilos em conseqncia da pro-
pneumoniae, Streptococcus pyogenes e bastonetes
duo de hormnios sexuais. Outros microrganis-
Gram negativo, pOtencialmente patognicos. A mi-
mos encontrados na microbiota vaginal da mulher
crobiota vaginal apresenta efeito similar d e prote-
em idade frtil esto listados no Quadro 8.5. Vale
o contra infeces. devido produo de cido
78 [ Medicina laboratorial para o clnico ] 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - -- -
lrico pelos Lactobacillus spp, por meio do merabolismo do glicognio presente no epitlio vaginal.
A produo de cido ltico ajuda a manter o pH
vaginal cido (aproximadamente 4.5), o que dificulta a presena de enterobactrias patognicas. Alm
disso, a produo de perxido de hidrognio pelos
Lactobacillus spp. tem ao antimicrobiana direta
e, em associao com a mieloperoxidase, libera on
cloro, outro potente germicida.
Modificaes da microbiota indgena induzidas pelo
uso de antibioticoterapia de largo espectro podem levar a alteraes na defesa do hospedeiro, evidenciado
pelo aparecimento de infeces. Candida albicans da
microbiota indgena pode multiplicar-se intensamente,
causando micoses superficiais nas regies oral e genital
aps o uso de antimicrobianos. Colite pseudomembranosa resultado da proliferao de Clostridium difficile
devido presso seletiva decorrente do uso intensivo de
antimicrobianos.
Outro mecanismo pelo qual a microbiota indgena
auxilia a defesa contra infeces a induo da produo de imunoglobulinas, como lgA e lgG, pela estimulao antignica. Animais isentos de germes tm
sistema mononuclear-fagocitrio pouco desenvolvido
e baixos nveis sricos de imunoglobulinas. Assim, muitas bactrias consideradas no-patognicas podem ser
letais para animais criados em condies completamente asspticas.
que pode levar perironire e formao de abscessos

intra-abdominais relacionados presena de anaerbios e enterobactrias intestinais. Streptococcus do
grupo Viridans, presentes normalmente na cavidade
oral, podem atingir a circulao sangnea devido a
traumas diversos (por ex. exrrao dentria) e colonizar valvas cardacas previamente lesadas, levando
endocardite bacteriana.
Alm disso, microrganismos da microbiota podem
causar infeces diversas em pacientes com comprometimento de seus mecanismos de defesa. Assim, a maior
parte das infeces hospitalares causada por espcies
da microbiota humana autctone.
O desenvolvimento de uma doena infecciosa depende particularmente do modo de interao entre
parasito e hospedeiro, o que, por sua vez, depende de
fatores relacionados aos microrganismos, s defesas do
hospedeiro e ao ambiente no qual ocorre a infeco.
Classicamente, os microrganismos so distribudos em
patognicos e no-patognicos, de acordo com sua
capacidade de produzir doena. Essa diviso se torna
muitO difcil medida que a ocorrncia da doena no
depende apenas da capacidade do microrganismo de
produzir leso, mas tambm da capacidade do hospedeiro em evitar a infeco. Microrganismos classificados
como no-patognicos podem induzir doenas graves
em pacientes imunocomprometidos. Sendo assim, rodo
microrganismo que coloniza um ser vivo deve ser considerado potencialmente patognico.
MICROBIOTA COMO FONTE DE

AGENTES INFECCIOSOS
RESGATE DA IDIA CENTRAL DO CAPTULO
Em contrapartida aos efeitos benficos, a microbiota indgena pode atuar como reservatrio de microrganismos potencialmente patognicos para o
hospedeiro. Muitos microrganismos presentes normalmente na microbiota do hospedeiro podem causar infeces oportunistas nos seus stios indgenas,
como mencionado no desequilbrio pela ao de antimicrobianos ou quando atingem locais diferentes de
seu local natural de colonizao. Assim, a maioria das
infeces do trato urinrio causada por enterobactrias da microbiota do trato digestivo, que atingem
o trato urinrio por via ascendente. A perfurao do
clon libera material fecal na cavidade abdominal, o
O ser humano apresenta microbiota indgena variada que, quando em condies de equilbrio, desempenha funes benficas, auxiliando na defesa contra
infeces. Apesar disso, pode atuar como reservatrio
de microrganismos potencialmente patognicos, levando ocorrncia de infeces, principalmente, em
situaes em que os mecanismos de defesa antiinfecciosa se encontram prej udicados. Mudanas constitucionais da microbiota, como ocorrem nos casos de
hospitalizao e uso abusivo de antimicrobianos, levam, muitas vezes, seleo de microrganismos mais
patognicos e resistentes, favorecendo ainda mais o
desenvolvimento de infeces.
Microbiota indgena
79
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09
Bruno Horta Andrade

Stella Sala Soares Lima
Wanessa Trindade Clemente
INVESTIGAO LABORATORIAL DO
PACIENTE COM INFECO DO
TRATO RESPIRATRIO INFERIOR
Infeces do eram respiratrio infenor (ITRI) so uma

das prinopais causas de morte associada a processos infecciosos no mundo e, apesar do avano na deteco de
patgenos, ainda permanecem controversos os critrios
clnicos e propeduticas para definto do diagnstico.
Com a crescente complexidade de pacientes portadores de infeces respiratrias e a melhoria da assistncia
sade. houve maior demanda de arsenal propedutico
elaborado. Por outro lado, a disponibilidade e custo-efetivtdade dessas novas tcnicas devem ser considerados
na escolha da propedutica. Acresa-se que a abordagem
laboratonal das ITRI no visa somente tdennftcao do
agente etiolgico, mas tambm auxtlta na definio de
gravidade e documenta a presena de co-morbidades.
Entre as ITRI, sero abordadas neste ca ptulo as pneumonias adquiridas na comunidade (PAC}, as associadas
asstsrncia sade (PAAS), a aspergilose e a pneumocistose pulmonar. Embora discuttdas dtsttntamence, destaca-se que, na prttca

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Medicina Laboratorial para o Clínico 01 - 03

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Lucia na de Gouva Viana

rologia, bacteriologia, m icologia). moniwramento de

A Pawlogia Clnica, recentemente denominada

Nest e contexro, o pawlogisra clnico desempenha

Medicma Laborawrial. uma especialidade mdica

um papel voltado tanto para a relao com os m-

que pode ser definida como a rea que conduz e in-

dicos-assistentes, como consulcor, quanto atividades

terpreta restes laboracoriais, aplicando mewdologias

t cnicas e relativas gesto laborarorial.

qumicas, fsicas, imunolgicas, mo rfolgicas, gen-

No Brasil, o mdico parologista clnico passa por

ricas, encre oucras, em diversos materiais biolgicos.

formao q ue inclui, alm dos seis anos regu lamenta-

Os objecivos principais da especialidade na assistncia

res do curso superior em Med1cina. mais crs anos de

sade so diagnosticar o u excluir doenas, definir

residncia mdica. credenciada pela Comisso Nacio-

marcadores prognsticos, acompan har as repercu s-

nal de Residncia Mdica, sendo um ano em clnica

ses terapu ticas ou verificar a existncia de fatores

mdica e dois anos em laboratrio clnico. O ttulo

de risco para agravos sade humana.

de especialista pode ser obtido tambm po r mdicos

A especialidade rem se cornada cada vez mais

atuantes em laboratrios clnicos a parrir de exame

complexa, em funo da rpida evoluo tecno lgica,

ministrado anualmente pela Sociedade Brasileira de

o das mecodologias analticas e dos instrumentos de

O mercado de trabalho para o parologista clnico

apoio na operac ionalizao da assistncia laborarorial.

se encontra principalmente em laborat rios de hospi-

A colaborao de o urros profissionais, alm daqueles

tais, centros diagnsticos, clnicas especializadas com

cirando-se: farmacuticos-bioqumicos, biomdicos,

si no e pesquisa. Ressalta-se que a Medicina Labora-

bilogos, qumicos, entre outros. A s reas especficas

rorial cresce cada vez mais no que se refere impor-

de aruao, no contexm da Medicina Laborarorial,

tncia cientfica e na sua utilizao para a wmada de

das informaes geradas pelo seror de diagnstico

microbiologia (esta, por sua vez, subdividida em vi -

2 [ M edicina laboratorial para o clnico

na rea de anlises clnicas, patologia clnica e citologia.

Diversos analitos ap resentam significativa vanaao

na, cido nco, haproglobina, rransferrina. carecolaminas

red uo na concentrao de colesteroi- HDL e elevao

Perodo neonatal, infncia e idade avanada

Alteraes repentinas na postura corporal podem

Alguns exames sofrem interferncia da d1eta qual o

Uso de drogas teraputicas ou de abuso

Cons1dera-se boa prtica laboratonal o registro, no

Introd uo Medicina Laboratorial

A coleta de sangue deve ser realizada em local dis

Representa a causa mais comum de re1e1o de

A lipemia decorrente do estado ps-prandial pode

Na aplicao do tOrniquete por tempo supenor a

12 semanas 28 semanas 32 semanas

Capac,dade de ligao do ferro

Tempo de trombaplostmo parcial otivodo

~dicina laboratorial para o clnico

Esra corresponde s alceraes cclicas da concentrao de determinado parmeuo em funo do rempo. O

Tal sicuao justifica o registro, por parce do laboratrio