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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA


CINCIAS FARMACUTICAS
MICROBIOLOGIA

5 Relatrio

Tcnicas de Colorao de Gram

Docente : Prof. Ilia Gilmara


Discente: Samara Detoni

Itacoatiara- AM
04/2011

SUMRIO

01.

Introduo

Pg. 03

02.

Objetivo

Pg. 03

03.

Metodologia

Pg. 04

3.1.

Materiais

Pg. 04

3.2.

Mtodo

Pg. 04

04.

Resultados e Discusses

Pg. 05

05.

Concluso

Pg. 07

06.

Referncias

Pg. 08

1. INTRODUO
A observao de microrganismos reveste-se de dificuldades no s devido sua
reduzida dimenso mas, tambm, porque estes so transparentes e praticamente
incolores. Com o propsito de estudar as suas propriedades e/ou de diferenciar os
microrganismos em grupos especficos para fins taxonmicos e de diagnstico, recorrese normalmente a tcnicas de colorao.
A colorao de Gram, desenvolvida em 1884 pelo mdico dinamarqus Christian
Gram, um dos mtodos de colorao mais aplicados em Bacteriologia. Trata-se de um
mtodo de colorao diferencial, dado que permite dividir as bactrias em duas classes
- Gram negativas e Gram positivas. , pois uma ferramenta essencial na classificao e
diferenciao de bactrias.
Esta diferenciao baseia-se na diferente estrutura e composio, nomeadamente no
diferente teor lipdico, da parede celular de bactrias Gram positivas e Gram negativas.
A parede celular das bactrias Gram negativas tem um teor em lpidos elevado na
sua membrana externa, para alm de uma camada fina de peptidoglicano que circunda a
membrana plasmtica. Em consequncia, durante o passo de diferenciao pelo lcool,
parte dos lpidos dissolvido pelo lcool, formando-se poros na parede por onde o
corante primrio (violeta de cristal) sai das clulas. Estas clulas ficam transparentes
aps o passo de diferenciao pelo lcool, sendo posteriormente coradas com o corante
secundrio (safranina).
A parede celular das bactrias Gram positivas constituda principalmente por uma
camada grossa de peptidoglicano e o seu teor em lpidos nulo ou muito baixo (em
poucas espcies bacterianas). A camada de peptidoglicano atua, assim, como uma
barreira impedindo a sada do corante primrio e estas clulas ficam coradas de violeta
escuro.
O mtodo de Gram uma das mais importantes tcnicas de colorao em
microbiologia mdica. Porm, os resultados da colorao de Gram no so
universalmente aplicveis, pois algumas clulas bacteriana coram-se fracamente ou no
adquirem cor. A reao Gram mais consistente quando usada em bactrias jovens, em
crescimento.
A reao de Gram de uma bactria pode fornecer informaes valiosas para o
tratamento da doena. As bactrias gram-positivas tendem a ser mortas facilmente por
penicilinas e cefalosporinas. As bactrias gram-negativas geralmente so mais
resistentes, pois os antibiticos no podem penetrar na camada de lipopolissacardeo.
Parte da resistncia a estes antibiticos entre ambas a bactrias gram-positivas e gramnegativas devida a inativao bacteriana dos antibiticos.

2. OBJETIVO
1) Evidenciar caractersticas morfolgicas das bactrias, classificando-as em grampositivas e gram-negativas

3. METODOLOGIA
Materias
Lminas para microscopia

leo de imerso

Lamnulas

Microscpio

Ala de platina

Bico de Bunsen

Tubo contendo soluo gua esterilizada

Corante: Cristal de violeta

Bactria gram-positiva:

Lugol

1. Estafilococcus aureus

Safranina

2. Staphylococcus saprophyticus

lcool 95%

Bactria gram-negativa:
1.

Escherichia coli

Gaze
Pisseta gua destilada

Mtodos
1)Esfregao da cultura bacteriana lquida:
Flambou-se a ala de platina, resfriou-se em um tubo com gua esterilizada. A partir da
todo procedimento foi realizado prximo da chama do bico de bunsen. Em seguida, retirou-se
uma amostra da cultura com a ala e foi depositado no centro da lmina, onde esse material foi
espalhado com a ala em movimentos circulares em um s sentido, obtendo-se assim um
esfregao de forma oval, uniforme e fino. Aps fixou-se o esfregao passando a lmina na
chama do bico de bunsen, como se cortando a chama 3 vezes, para que o material fique bem
aderido.
2)Esfregao da cultura bacteriana slida:
Flambou-se a ala de platina, resfriou-se em um tubo com gua esterilizada. A partir da
todo procedimento foi realizado prximo da chama do bico de bunsen. Em seguida, foi retirada
uma gota de gua estril e depositou-se na lmina. Foi novamente flambado a ala, resfriou-se e
assim foi coletada uma amostra da cultura slida, onde foi levada at a gua depositada sobre a
lmina. Foi homogeneizado com movimentos circulares, obtendo-se um esfregao oval,
uniforme e fino. Aps fixou-se o esfregao passando a lmina na chama do bico de bunsen,
como se cortando a chama 3 vezes, para que o material fique bem aderido.
3)Adio de Corantes:
Colocou-se a lmina com o esfregao sobre um suporte na pia. Onde foi realizada a colorao
seguindo-se a seguinte sequencia: 1- Cobriu-se a lmina com cristal violeta(Gram I) foi deixado
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agir por 1minuto. 2- A lmina foi lavada em jato fraco de gua esterilizada contida na pisseta de
forma corrente, dos dois lados. 3- Cobriu-se ento aps lavagem da lmina com lugol (Gram II),
onde foi deixado agir por 1 minuto e depois foi lavada novamente a lmina no mesmo
procedimento anterior. 5- Cobriu-se a lmina com lcool (Gram III), e esperou-se 20 segundos e
lavou-se bem a lmina. 6- Cobriu-se a lmina com safranina (Gram IV) e foi deixado agir por
30 segundos, e, novamente lavou-se a lmina. Aps a lmina foi secada do lado oposto ao
esfregao com uma gaze e, em seguida levada ao microscpio, onde foi primeiro observada na
objetiva de 10x para se ter uma viso se tem esfregao ou no. E depois de observada na
objetiva de imerso.
Observaes:
fundamental que o esfregao fique totalmente coberto com cada um dos reagentes e que o
reagente anterior seja completamente removido antes de se adicionar o seguinte.
* Este o passo fundamental da tcnica pois:
- se deixarmos atuar o descorante tempo demais este vai retirar o corante a bactrias que deviam
ficar coradas de cristal de violeta, ou seja, faz com que as clulas Gram positivo apaream como
Gram negativo.
- se o descorante atuar tempo a menos no se remove completamente os complexos formados
entre o corante primrio e o mordente e assim aparecem coradas de violeta bactrias Gram
negativo s quais o descorante no conseguiu retirar convenientemente o corante primrio.

4. RESULTADO E DISCUSSES
1)
Lmina da bactria Estaphylococcus epidermidis
Sua cepa macroscopicamente apresenta uma colorao violeta.
Microscopicamente observada depois da colorao de gram, apresentou bacilos
vermelhos, indicando assim uma contaminao.
2)
Estafilococcus aureus e Staphylococcus saprophyticus: Cocos que
apresentaram contaminao por bacilos
3)

Escherichia coli : A lmina microscopicamente apresentou bacilos pequenos


vermelhos, mas tambm bacilos grandes violetas, indicando uma cepa com
contaminao.

Meio Slido

2. Resultados obtidos com a Colorao de Gram.

Bactria
SOLUO

Gram positiva

Gram negativa

Cristal violeta

Cora de violeta

Cora de violeta

Lugol

Permanece Violeta

Permanece Violeta

lcool

Permanece Violeta

Torna-se INCOLOR

Safranina

Permanece Violeta

Tinge de Vermelho

1) corante primrio: violeta de cristal


o primeiro a ser usado e cora todas as clulas de violeta.
2) mordente: lugol - soluo de iodo
Este reagente uma substncia que forma um complexo insolvel ligando-se ao corante
primrio. O complexo resultante serve para intensificar a cor do corante, ou seja, o lugol ajuda o
cristal de violeta a penetrar nas clulas e a resistir descolorao. Nas bactrias Gram positivo
este complexo mais difcil de ser removido do que nas bactrias Gram negativo.
3) descorante: lcool etlico a 95 %
Este reagente serve de solvente de lpidos e de agente desidratante das protenas. Assim, a sua
ao determinada pela concentrao lipdica das paredes celulares microbianas.
Nas clulas Gram positivo a concentrao baixa de lpidos importante para reter o complexo
corante-mordente. Os lipidos so dissolvidos pela ao do lcool causando a formao de
pequenos poros na parede celular. Mas estes so prontamente fechados pela ao desidratadora
do lcool e como consequncia o corante primrio difcil de ser removido e as clulas mantmse violetas.

Nas clulas Gram negativo a alta concentrao de lipidos na membrana externa da parede celular
dissolvida pelo lcool, formando-se grandes poros na parede celular que no fecham
apreciavelmente durante a desidratao das protenas da parede celular. Isto facilita a libertao
do complexo corante-mordente deixando as clulas incolores.
4) corante de contraste: safranina
Este o ltimo reagente a ser aplicado e cora de vermelho as clulas que foram previamente
descoradas. Uma vez que as clulas Gram negativo ficaram descoradas elas podem agora
absorver o corante de contraste. As clulas Gram positivo mantm a cor do corante primrio.
A diferena na colorao das bactrias Gram positivo e Gram negativo deve-se
resistncia descolorao pelo lcool:

Bactrias Gram positivo: so aquelas que retm o corante inicial e aparecem coradas de
violeta.
Bactrias Gram negativo: so aquelas que perdem o corante inicial quando lavadas com
o lcool 95% e depois coram de vermelho com o corante de contrate.

Culturas Velhas:
medida que as clulas envelhecem, especialmente no caso das clulas Gram positivo,
os microrganismos tendem a perder a capacidade de reteno do corante primrio e podem surgir
como Gram variveis: umas clulas coram de violeta (Gram positivo) e outras de vermelho
(Gram negativo).

5. CONCLUSO
Ficou observado nos esfregaos que foram preparados que as bactrias do tipo gram-negativas
adquiriram uma colorao aproximada do rseo e vermelho, efeito esse relacionado com a
composio de sua parede celular.

J as bactrias que assumiram uma colorao mais violeta ou azul, caracterizaram as


bactrias ditas gram-positivas, cuja caracterstica da parede celular foi decisiva para esse
efeito dos corantes na colnia. Ou seja, as gram-negativas possuem mais lipdeos em
sua composio, e so mais permeveis, por ter menos peptidioglicanos. Assim, quando
aplicamos o lcool 95%, os lipdeos de sua parede celular so dissolvidos, perdendo-se
a colorao violeta do cristal violeta. Aplicando-se safranina, de cor avermelhada, a
bactria gram-negativa adquire a colorao desta substncia. J as bactrias grampositivas, tm menos lipdeos em sua parede celular e possuem uma camada muito mais
espessa de peptidioglicanos, sendo assim menos susceptveis de dissoluo ou
permeabilidade ao lcool 95%. Portanto, ela permanece com a colorao fornecida pelo
cristal violeta: violeta. Sendo que o lugol apenas permite a melhor visualizao do
cristal violeta.
O que fica bastante evidenciado nessa prtica que a tcnica de deteco de gram
absolutamente importante para determinarmos as caractersticas iniciais da bactria, nos
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permitindo domar melhor as potencialidades da bactria e junto de outros testes nos


possibilitando indicar melhor tratamento para o combate da colnia.

6. REFERNCIAS
FILHO, G. N. S., Microbiologia. Manual de aulas prticas. Ed.Da UFSC, 2004

TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L.. Microbiologia. 8ed. Porto Alegre
Artmed,2005.