PRACTICA N 1

Tcnica del nmero ms probable: NMP

El nmero de microorganismos presentes en alimentos est
sujeto a normas preestablecidas por lo cual es necesario que
se cumplan con este requisito para determinar su utilizacin o
consumo. Las bacterias coliformes, los estafilococos y otras
de importancia en alimentos, pueden ser cuantificados
mediante la tcnica del NMP.

I.

Objetivos
Investigar la presencia de bacterias del grupo Coliforme
en agua de consumo humano mediante la tcnica del
Nmero Ms Probable (NMP).
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o
alimentos mediante la bsqueda de microorganismos
coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
Diferenciar los organismos coliformes totales de los
microorganismos coliformes fecales.
Aprender el procedimiento de la tcnica del NMP.

II.

Introduccin

El agua es un recurso natural necesario para el desarrollo de

un gran nmero de actividades humanas debido a que las
aguas son de composicin variada, contiene diferentes tipos
de microorganismos contaminantes. La variada poblacin de
microorganismos en el agua, proviene del suelo y de origen
intestinal, incluyendo aerbicos y anaerbicos estrictos y
facultativas as como numeroso virus. Los anlisis que se
pueden realizar al agua para controlar sus calidades como
fsicas, qumicas y microbiolgicas.

III.

Marco terico

La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de

especies bacterianas que tienen ciertas caractersticas
bioqumicas en comn (aerobias o anaerobias facultativas,
gram negativas, no esporgenas, fermentan lactosa a35c en
48 horas) y tienen importancia relevante como indicadores de
contaminacin del agua y los alimentos.
El grupo coliforme est formado por los siguientes gneros:
1. Escherichia.
2. Klebsiella.
3. Enterobacter.
4. Citrobacter.
Chromocult Agar para Coliformes: Es un agar selectivo para
la identificacin simultnea de coliformes totales y E. coli en
muestras de agua y alimentos. Gracias a la accin conjunta de
peptonas selectas, piruvato y tampon de fosfatos se garantiza
un rpido crecimiento tambien de coliformes con daos
subletales. El contenido en lauril sulfato inhibe ampliamente
el crecimiento de bacterias gram-positivas, sin tener
influencias negativas sobre el crecimiento de Coliformes. La
identificacin simultnea de coliformes totales y E. coli se
hace posible por la nueva combinacin de dos sustratos
cromgenos. El sustrato Salmon-GAL es Escondido por la
enzima beta-D-galactosidasa caracterstico de coliformes y
provoca una coloracin roja de las colonias de coliformes. La
identificacin de labeta-D-glucoronidasa caracterstica para E.
coli tiene lugar mediante el sustrato X-glucornico, cuyo
producto de escisin produce una coloracin azul de las
Colonias positivas.

IV.

Tcnica de pruebas bioqumicas

IMVIC: engloba 4 pruebas

1. INDOL:
El indol es uno de los productos de degradacin metablica
del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la
triptfanos son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptfano con produccin de indol, cido pirvico y
amonaco. La produccin de indol es una caracterstica
importante para la identificacin de muchas especies de
microorganismos. La prueba de indol est basada en la
formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona
con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este
es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El
medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano.
Procedimiento:
Inocular el caldo triptfano con el organismo en estudio e
incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este
perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared
interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia
en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de
aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba
positiva.

2. PRUEBA TSI (TRIPLE SUGAR IRON TRIPLE

AZCAR HIERRO)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite
estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir
de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin
permite la identificacin de la produccin de SH2.
Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel
de gnero en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de
diferenciar entre:
Bacterias fermentadoras de la glucosa
Bacterias fermentadoras de la lactosa
Bacterias fermentadoras de sacarosa

Bacterias aerognicas
Bacterias productoras de SH2
orgnicas que contengan azufre.

partir

de

sustancias

Procedimiento:
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para
eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. Del fondo del tubo.
Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un
movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 durante 24
horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.

3. PRUEBA DEL CITRATO

Este ensayo pone en evidencia la capacidad del
microorganismo de utilizar citrato como nica fuente de
carbono.
Estriar citrato de Simmons (contiene Azul de bromotimol
como indicador de pH).
Incubacin 48h a 37C
Reaccin (-): sin cambio (medio de color verde) E. Coli
shiguella
Reaccin (+): Crecimiento y viraje al azul (la eliminacin de
citrato alcaliniza el medio) Salmonella enterobacter
klebsiella

4. ROJO METILO

Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para

identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo
constituyen el tipo y la proporcin de productos de
fermentacin que se originan por la fermentacin de la
glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentacin
cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la
fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente
lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En
la va del butanodiol se forman cantidades menores de
cido (acetato y succinato) y los principales productos son
el butanodiol, etanol, H2 y CO2.

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo

entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para

visualizar la produccin de cidos por la va de
fermentacin cido mixto.
Procedimiento:
Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no ms
de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C
durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de
incubacin agregar unas gotas del reactivo de rojo de
metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color
rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es
suficiente para producir el viraje del indicador y el
microorganismo ferment la glucosa por la va de cido
mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el
amarillo no es considerado como positivo.

5. VOGUES PROSKAUER
En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de
fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo
de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un
producto intermediario en la produccin de butanodiol. En
medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es
oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfanaftol dando un color rojo-fucsia.
Procedimiento:
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24
horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C
durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de
incubacin transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio
y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al
40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio
al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15
minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15
minutos indica la presencia de diacetilo, producto de
oxidacin de la acetona y por lo tanto una prueba VP
positiva.

V.

Materiales y mtodos
4.1

Materiales:

Muestra de agua
Pipetas 10 mL estriles
Pipetas de 1mL estriles.
Frascos para la dilucin
Marcadores de vidrio
3 tubos con 10 mL de caldo lactosado con Campana de
Durham.
Mechero
Pectona
Bao mara.
Matraz
Tabla de lectura de NMP.

V.2

Medidas de seguridad
El laboratorio es responsable de mantener en
ambiente de trabajo seguro y unas normas de
bioseguridad respecto a la exposicin y manejo
seguro de las sustancias especificadas en este
mtodo.
Las mesas de trabajo del laboratorio deben
limpiarse antes y al final de cada uso con un
desinfectante apropiado.
Los medios de cultivos deben colocarse en las
cmaras de cultivo con su identificacin
respectivo.
Equipos de proteccin (mandil, guantes, naso
bucal, etc.)

V.3

Procedimiento

V.3.1 Obtencin de la muestra

Se desinfecto el grifo antes de abrir, nuevamente se
desinfecta el grifo y pasamos el mechero por la boca
del grifo dejamos caer el agua por 5 segundos luego
cerramos y abrimos el grifo dejando caer agua por 10
segundos y sucesivamente con otros 15 segundos.
La obtencin de la muestra tiene que ser rpida,
pasamos el mechero antes y despus de obtener la
muestra al frasco.

V.3.2 Identificacin y control de muestra

Para la identificacin de la muestra debe de
etiquetarse el frasco con la siguiente informacin:
Nmero de registro para la identificacin, fecha y
hora.
V.3.3 Preservacin de la muestra
El anlisis bacteriolgico de la muestra debe
practicarse inmediatamente despus de su toma. Se
inicia dentro de las dos horas prximas a la
recoleccin de la muestra y un ningn caso, este
lapso debe exceder las 24 horas para el agua potable
y 6 horas para otros tipos de agua para que sea vlido
el resultado del anlisis. Durante el periodo que
trascurre del anlisis.
V.3.4 Tamao de la alcuota:
Para la determinacin del nmero ms probable
(NMP), se requiere un volumen de 100 mL.

VI.

Resultados

10-1: 1
Tubos:

10-2: 0

0, 7 UFC/ CT mL

10-3: 1

Tcnica presuntiva:
MP: Coliformes Totales
Utilizamos: Caldo Lauril Sulfato
Muestra 10-1: sembramos en el tubo que contiene Caldo Lauril
Sulfato

10-1

10-1

Muestra 10-2: sembramos

10-3

10-3

En los tubos sembrados los cuales contienen caldo Lauril

sulfato son incubados para confirmar y este proceso durante
24h a una temperatura de 44C bao mara.
Presencia de gas

Tcnica confirmativa:
Sembrar en medio especfico.
Detectar E. Coli al 100% y para esto utilizamos el agar Mac
Conkey ya que es el principal para deteccin.
Agar Mac Conkey: Lactosa, cristal violeta, sales biliares.
Agar EMB: Color verde oscuro brillo metlico
Pruebas bioqumicas:
INDOL:
Degrada el aminocido triptfano al agregar 3-5 gotas
de kobac's
Formacin de una fase roja orgnica.
37C/24h

Anlisis de los resultados:

o Despus de la prctica los resultados analizados y

comprobados obtenidos en el agua se establece el
nmero ms probable en los coliformes totales es
0,7 esto quiere decir que las 3 series de 3 tubos

cada 2 fueros positivos, debido a que el agua

analizada microbiolgicamente era agua potable
que contena escherichia coli.
o Los resultados de coliformes fecales dieron 7,1 en
la muestra de agua de afuera porque hay presencia
de anillo rojo violceo esto significa positivo en la
muestra analizada.
o La muestra de agua de la universidad de Cajamarca
nos dio resultado cero porque hubo presencia de
anillo crema esto significa negativo en la muestra.

VII.

Conclusin

El agua analizada de la universidad nacional de

Cajamarca es apta para el consumo humano, pero el
agua analizada de afuera no es apta porque muestra e.
Coli.

En la prueba presuntiva todos aquellos tubos que den

positivos se proceder a realizar la prueba confirmatoria
para Coliformes totales y fecales pues en esta prueba
solo nos indica la presencia de coli en el agua pero no el
tipo.

Si se observa turbidez y produccin de gas la prueba se

considera positiva, debiendo anotar el nmero de tubos
positivos para posteriormente hacer el clculo del NMP
la cual nos indica la presencia de coli total y fecal. En la
muestra realizada obtuvimos 2 muestras.

En la lectura de la tabla del nmero ms probable el

agua de la muestra nos arroj un resultado de 7.

En las muestras de colonias se identific la presencia de

colonias con centro negro, planas con brillo metlico lo
cual indica presencia de coli fecal.

Al aplicar la prueba del indol para las muestras se

identific positivo la cual indica presencia de coli fecal
en el agua muestreada. Y al igual se muestreo el agua
de la UNC la cual arrojo un resultado negativo y 0 de coli
fecales y totales.

VIII.

DISCUSION
En la tcnica de nmeros ms probables N.M.P es
la ms identificada para determinar Coliformes
fecales
mediante
la
tcnica
presuntiva
y
confirmativa.
En la tcnica presuntiva solo se identifica en un
50% y para confirmar si existe Coliformes fecales
entonces empleamos la tcnica confirmativa; en la
cual para sembrar se utiliza el Agar Mac Conkey y
la prueba bioqumica el Indol que es la ms
eficiente para confirmar en un 100%.
Pudimos observar que la muestra en este caso de
agua no potable presento coliformes (fecales y
totales) lo cual nos indica una buena limpieza y
desinfeccin del rea de trabajo, la buena higiene e
del manipulador y el almacenamiento que tuvo el
producto para evitar precisamente este tipo de
contaminacin con estos microorganismos.

IX.

Bibliografa
Microbiologa alimentaria: metodologa analtica para
alimentos.
Norma oficial mexicana nom-112-ssa1-1994, bienes y
servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del
nmero ms probable.

CCAYAC-M-004 (2006) Estimacin de la densidad

microbiana por la tcnica del nmero ms probable,
deteccin de Coliformes totales, Coliformes fecales y
Escherichia coli por el nmero ms probable.

x.

Anexo