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Bioqumica Experimental II LOT2006

Prof. Eleonora

Teoria da Prtica: Fermentao


Introduo
Conceito
O termo fermentao no sentido mais amplo possvel pode ser definido como todo o processo no
qual microrganismo catalisa a converso de uma substncia em um determinado produto, ainda
passvel de sofrer oxidao. Se tal transformao leva formao de um excreta, til e
economicamente vantajoso, poder ser utilizada industrialmente. A fermentao industrial ento a
explorao racional da atividade metablica do microrganismo.
Consideraes gerais sobre os processos fermentativos
As fabricaes de vinho, cerveja, po e queijo so utilizadas pela humanidade desde antes da era
crist. O conhecimento sobre os microrganismos, sua nutrio e reproduo , entretanto,
relativamente recente. A utilizao desses conhecimentos cientficos permite ento uma escolha
mais adequada de nutrientes, condies e at de microrganismos mais aptos a produzir uma dada
substncia de interesse industrial de forma econmica.
Certas substncias molecularmente complexas como, por exemplo, enzimas, antibiticos e
vitaminas, cuja obteno por sntese qumica bastante onerosa, e s vezes at impossvel, so
obtidas de forma economicamente vivel, atravs de processos fermentativos.
A indstria de fermentao encontra-se hoje em dia em expanso e os processos
fermentativos apresentam-se, algumas vezes, com possibilidade de desenvolvimento, tanto do ponto
de vista do microrganismo (agente de fermentao) - objeto de estudo da microbiologia e
bioqumica, como tambm do ponto de vista do processo em si - objeto de estudo da engenharia
bioqumica.
Classificao da fermentao
Os processos fermentativos so classificados de diversas maneiras: quanto ao tipo de processo;
quanto cintica, etc. Entretanto, do ponto de vista estritamente bioqumico pode-se classific-los
apenas como:
Anaerbicos: onde o aceptor de prtons (H+) e eltrons (e-) liberados nas reaes de oxi-reduo
que ocorrem intracelularmente um metablito (substncia orgnica).
Exemplos: fermentao alcolica, fermentao lctica.
Aerbicos: onde o aceptor de prtons (H+) e eltrons (e-) o O2 molecular.
Exemplos: fermentao actica, fermentao ctrica.

Fermentao Alcolica
1. Importncia
A fermentao alcolica importante no s na fabricao de bebidas como vinho, cerveja,
cachaa, etc., mas tambm para fabricao do lcool industrial. O etanol tornou-se, com a crise do
petrleo da dcada de 70, uma opo como combustvel. Alm disso, possvel antever sua
utilizao para formao de etileno e butadieno, matrias primas para a indstria de plsticos.
Compreende-se, ento, o enorme interesse que desperta a melhoria do processo, dos agentes de
fermentao utilizados e das condies de retificao do lcool obtido.
2. Matria Prima
As matrias primas utilizadas na indstria de fermentao alcolica so originadas direta ou
indiretamente da agricultura, ou seja, de recursos renovveis. A escolha da matria prima e outros
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aditivos para o mosto (meio de cultura que se destina operao industrial de transformao de uma
substncia em excreta til) ponto de fundamental importncia para a indstria da fermentao. A
matria prima deve conter substrato utilizvel pelo microrganismo, ser de fcil obteno e
estocagem. As matrias primas para a produo de lcool podem ser:
Sacarneas: possuem como substrato acares solveis (mono e dissacardeos), por exemplo:
Melao - (resduo da cristalizao do acar) principal substrato: sacarose
Caldo de cana - principal substrato: sacarose. O caldo de cana utilizado devido
importncia econmica do etanol.
Suco de frutas - substratos: sacarose, glicose e frutose.
As matrias primas sacarneas podem ser diretamente consumidas pelo agente de fermentao
(geralmente leveduras do gnero Saccharomyces); as leveduras so capazes de assimilar tanto
glicose como frutose e outros monossacardeos; a sacarose assimilada sofrendo uma prvia
hidrlise pela enzima invertase, existente nesses microrganismos.
Amilceas: substrato fermentvel o amido. Altos teores de amido so encontrados em razes
(batata e mandioca) e gros (trigo, milho, cevada e centeio).
As leveduras utilizadas no processo de fabricao do lcool no possuem enzimas capazes de
hidrolisar o amido. Uma das perspectivas, ainda em fase de pesquisa, a introduo de genes que
codificam essas enzimas no genoma de leveduras (objeto de estudo da engenharia gentica).
O tratamento prvio que sofrem as matrias primas amilceas denominado de sacarificao do
amido e consiste na transformao do amido em matria prima fermentvel. A sacarificao do
amido pode ser feita de varias formas:
Por via qumica: consiste na hidrlise em presena de H2SO4 5% sob presso de 2 atm, por
duas horas. H converso do amido em glicose, mas apresenta como inconveniente o alto
custo e a corroso que promove nos equipamentos; alm disso, exige neutralizao para que
possa ser utilizada e o sal resultante leva a um baixo rendimento na fermentao.
Por via enzimtica: utilizam as preparaes amilolticas presentes nos gros (malte) ou
enzimas extradas de fungos e bactrias (amiloglicosidases e amilases, respectivamente).
Celulsicas: substrato a celulose. Assim como para o amido, necessria uma hidrlise prvia
da celulose para que os monossacardeos e/ou oligossacardeos liberados possam ser assimilados
pelo microrganismo. Esta hidrlise pode ser feita:
Por via qumica: atravs de tratamento com H2SO4 a quente sob presso. um tratamento
drstico que envolve a hidrlise cida do material lignocelulsico. Utilizado industrialmente
na Alemanha e na Rssia; no Brasil os primeiros testes em escala piloto foram realizados nas
instalaes da Fundao de Tecnologia Industrial (FTI) em Lorena/SP, na dcada de 1980.
Por via enzimtica: este tratamento requer um pr-tratamento da matria prima para
aumentar a digestibilidade do substrato enzima. Em que pesem os esforos realizados,
ainda no um processo industrial.
importante ressaltar que a diversidade de bebidas alcolicas existentes no mercado
decorre, inicialmente, do tipo da matria prima utilizada (sacarnea ou amilcea) e, posteriormente,
do tratamento a que submetida bebida (destilao, tempo de maturao, etc.).
3. Agentes de Fermentao
S no final do sculo XIX foi identificado o microrganismo responsvel pela transformao do
acar em etanol. Em todos os casos as leveduras do gnero Saccharomyces so as mais utilizadas,
especificamente as da espcie S. carlsbergensis (para cerveja) e S. ellipsoideus (para vinho).
Embora na fabricao, por exemplo, de vinho caseiro se utilize a flora mista presente na prpria
uva, procura-se no nvel industrial usar linhagens puras e selecionadas. Os organismos normalmente
utilizados como agentes de fermentao so anaerbicos facultativos.
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4. Caractersticas do Processo
Temperatura: 25-30 oC Como o processo exotrmico, as dornas (equipamento onde ocorre
a fermentao) exigem sistemas de refrigerao.
pH: 4,5-5,0 Como durante o processo h produo de CO2 com conseqente queda do pH,
so necessrias correes.
Tenso de oxignio Anaerobiose ou baixa aerao.
5. Fundamento Bioqumico
O procedimento de fermentao ocorre em anaerobiose e do ponto de vista bioqumico, a produo
de etanol ocorre unicamente para que haja a re-oxidao do NADH formado na via glicoltica.
Se levedura dado como nutriente um glicdio, por exemplo, a sacarose, primeiro ocorrer
a hidrlise da sacarose glicose e frutose e posteriormente a absoro dos monossacardeos. Se o
glicdio for glicose, como o caso da prtica, ocorre logo a absoro. Os glicdios transportados
entram na via glicoltica.
2 ATP
Glicose 2 cidos pirvico
2 NADH+H+
O NADH+H+ formado re-oxidado:
2 CO2
O
2 H3 C C C
OH
cido pirvico

O
pi ruvat o
d escarboxi l ase

l cool
d esi drog enase

2 H C C OH

2 H3 C C
H

H H
2 NA DH+H+

acetaldedo

H H

2 NAD+
etano l

Portanto: Glicose 2 EtOH + 2 CO2


Isto :
1 mol
2 moles + 2 moles
Esta a equao de Gay-Lussac, que permite o clculo do rendimento da fermentao. O
rendimento de um processo fermentativo pode ser definido como sendo a quantidade de produto
obtido em relao quantidade de matria prima introduzida na dorna, ou quela consumida no
processo (P/S ou P/S0).
Como parte do acar consumido resulta em produtos secundrios, no possvel atingir o
rendimento Gay-Lussac P/S de 0,511. Pasteur, no laboratrio, em condies ideais, conseguiu
atingir o mximo de 95-96% do rendimento terico, P/S = 0,485; definindo o chamado
rendimento Pasteur, valor muitas vezes tomado como referncia para os clculos de rendimentos
industriais. As operaes industriais no so realizadas com os cuidados adotados por Pauster;
portanto, o rendimento Pasteur de 100% tambm no atingido.
De qualquer forma, o clculo do rendimento largamente utilizado pelas indstrias de
fermentao alcolica, lctica, actica, acetonobutlica, ctrica, etc. No aplicvel, entretanto, aos
produtos das fermentaes biossintticas como antibiticos e vitaminas, onde no se conhece com
exatido a proporo e os substratos utilizados diretamente para a sntese.
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Outros parmetros importantes so:


Eficincia do processo fermentativo - relao percentual entre o peso do produto realmente
obtido no processo fermentativo e o peso do produto previsto estequiometricamente (peso
terico)
Eficincia da instalao industrial - relao percentual entre o peso do produto obtido aps as
fases de fermentao, recuperao e purificao e o peso terico do produto previsto
estequiometricamente.
Produtividade - quantidade de produto formado por unidade de tempo e de volume de meio (g
de produto/L. h)
Industrialmente a concentrao de glicdios presentes avaliada utilizando o Densmetro de
Brix, em cuja escala 0o corresponde gua pura e 100o corresponde a uma soluo de sacarose de
100 g/100 mL. Os valores obtidos so dados em peso de slidos em suspenso por 100 mL de
volume. J o lcool formado avaliado por meio do Alcometro de Gay-Lussac em que 0o
corresponde gua pura e 100o corresponde ao etanol anidro. Os valores obtidos so dados em
volume de lcool por volume de meio.
Aps a fermentao as clulas so separadas do mosto por decantao, centrifugao, etc. e
reutilizadas em um novo processo fermentativo, por um dado nmero de vezes.
6. Destilao
A destilao uma operao industrial que permite a separao de componentes de uma mistura por
uma sucesso de vaporizaes e condensaes; o composto mais voltil se concentra no vapor.
Tratando-se de indstria de bebida alcolica, esta operao poder existir ou no,
dependendo do tipo de bebida que se deseja fabricar. Bebidas como vinho e cerveja so chamados
bebidas fermentadas e no sofrem destilao, apresentando um teor alcolico mais baixo que as
chamadas bebidas destiladas (entre 3-5% para cervejas e cerca de 9-12% para vinhos). As bebidas
destiladas como, por exemplo: cachaa, rum, usque, gim, so obtidas por destilao do mosto aps
a fermentao. A destilao diferente para cada caso, mas, em geral, lenta para evitar que haja
arraste de produtos secundrios que altere o sabor e cheiro da bebida. A concentrao de etanol
nestas bebidas mais elevada e est situada para cachaa entre 45 e 50%.
No caso de fabricao do lcool industrial, esta operao de destilao importante e muito
complexa. A separao da mistura Et-OH: H2O realizada em colunas, com refluxo, e a operao
recebe ento o nome de retificao. A coluna alimentada com o vinho (nome genrico do mosto
j fermentado) a ser fracionado e o fracionamento vai depender de uma srie de fatores, entre eles, a
altura da coluna - um aumento do tamanho facilita a separao. No entanto, o etanol e a gua
formam um azetropo de mnimo (uma mistura que apresenta uma composio de 95% de etanol e
5% de gua com um ponto de ebulio prprio) e, caso se disponha de uma boa coluna de
retificao, esta ser a composio do destilado obtido. O enriquecimento em etanol desta mistura
requer outro tipo de tratamento em etapa posterior. O resduo obtido aps a destilao denominado
vinhoto (ou vinhaa).
Referncias:
Manual de Cursos Prticos em Bioqumica.
Departamento de Bioqumica, Instituto de Qumica, UFRJ.
Fundamentos de Bioqumica Experimental.
Jos Raul Cisternas, Jos Varga, Osmar Monte. 2 ed., Editora Atheneu, So Paulo, 2001.
LEHNINGER - Principles of Biochemistry
David L. Nelson, Michael M. Cox. Fifth Edition. W. H. Freeman and Company, New York, 2008.

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Roteiro de Prtica: Fermentao Alcolica


1. MATERIAL

Mosto utilizado: meio YED (1,4% de extrato de levedo; 14% de glicose)


Agente fermentativo: Fermento Fleischmann - suspenso a 67% (p.u./v)
Soluo de glicose padro: 10 mol/mL
cido 3,5-dinitro saliclico (DNS) em soluo alcalina
Fluoreto de sdio (NaF) 0,05 M
Banho termostatado
Espectrofotmetro
Balana
Destilador
Centrfuga
Banho de gelo

2. OBJETIVO
Calcular a eficincia de uma fermentao de glicose por clulas de S. cerevisiae atravs da
medida da produo de etanol e de CO2 e do consumo de glicose.
Verificar o poder de inibio do NaF (inibidor da enolase) no processo fermentativo.
3. PROCEDIMENTO
3.1. Produo de etanol, produo de CO2 e consumo de glicose.
a) Em um erlenmeyer de 250 mL preparar 100 mL de meio YED 10%, contendo 20% (p.u./v) de
clulas (10 mL meio YED + 90 mL de H2O + 20 g de fermento).
Agitar, anotar o tempo e imediatamente retirar uma alquota de 3,0 mL para tubo de centrfuga.
Pesar rapidamente o frasco.
b) Centrifugar a alquota previamente retirada e transferir o sobrenadante para outro tubo.
Centrifugar novamente o sobrenadante, transferir para o tubo de ensaio e conserv-lo em banho
de gelo. Enquanto isto, o mosto inoculado deixado em banho 28C, sendo agitado
vigorosamente a intervalos de 10 minutos.
c) Aps 1 hora de fermentao, agitar bem e pesar o frasco para calcular a quantidade de CO2
desprendido.
d) Centrifugar cerca de 50 mL do meio fermentado e caso o sobrenadante permanea turvo,
centrifugar novamente.
e) Pegar 10 mL do sobrenadante e colocar no compartimento para amostra do destilador, adicionar
em seguida 10 mL de H2O e 0,5 mL de NaOH 0,1 N (o hidrxido de sdio colocado para evitar
a destilao de alcois superiores). Fechar o sistema e recolher os 8 mL iniciais do destilado que
contero todo o etanol presente na amostra. Completar este volume a 10 mL com exatido.
f) Determinar no destilado o teor de etanol pelo mtodo do dicromato.
g) Diluir uma alquota dos sobrenadantes (tempo inicial e tempo final de fermentao) e determinar
a quantidade de glicose consumida pelo mtodo do DNS.
Sugesto para as diluies: tempo inicial: diluio de 10 a 100 vezes
tempo final: sem diluio ou diluio de 10 vezes
h) Calcular o rendimento e a eficincia da fermentao a partir da quantidade de CO2 produzido em
relao quantidade de glicose consumida.
i) Efetuar os mesmos clculos do item anterior (3.1h), a partir da quantidade de etanol produzido.

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3.2. Inibio da fermentao por fluoreto de sdio (NaF)


a) Em um erlenmeyer de 250 mL preparar 100 mL de meio YED 10%, contendo 20% (p.u./v) de
clulas e 0,05M de NaF (10 mL meio YED + 85 mL de H2O + 20 g de fermento + 5 mL de
soluo NaF 1 M).
Agitar, anotar o tempo e imediatamente retirar uma alquota de 3 mL para tubo de centrfuga.
Pesar rapidamente o frasco.
b) Seguir o mesmo procedimento da etapa anterior a partir do item 3.1b.
c) Calcular o grau de inibio provocado pelo fluoreto de sdio aps 1 hora de fermentao.
d) Interpretar os resultados obtidos.

3.3. Montar uma tabela que contenha todos os resultados obtidos.

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Determinao de Acares Redutores pelo Mtodo do 3,5-Dinitro Salicilato


(DNS)
1. REAGENTES

Soluo padro de glicose (10 mol/mL)


Amostras retiradas no tempo inicial e no tempo final de fermentao
cido 3,5 dinitrosaliclico em soluo alcalina (DNS)
Banho termostatado a 100 oC
Espectrofotmetro

2. PROCEDIMENTO
A. Construo da curva padro de glicdios redutores
Sensibilidade do mtodo qumico: 1-20 moles de glicose
1. Seguir o protocolo abaixo utilizando a soluo padro de glicose (10 mol/mL)
Tubo
B
1
2
3
4
5

Sol. Glicose
(mL)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1

H2O dest.
(mL)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
-

Reagente DNS
(mL)
1
1
1
1
1
1

Absorbncia
(540 nm)

Concentrao
(
)

2. Aps a adio dos reagentes, agitar e aquecer a 100 oC por 5 minutos, resfriar e adicionar 13 mL
de gua destilada.
3. Usando o tubo B como branco de reao, determinar as absorbncias a 540 nm.
4. Lanar em grfico as leituras de absorbncia x concentrao de glicdios e determinar o
coeficiente angular e o fator da reta obtida.
5. Verificar quais os limites de sensibilidade do mtodo para a aparelhagem utilizada.

B. Determinao da concentrao de glicose nas amostras da fermentao


Utilizando a curva padro obtida, os mesmos reagentes e o mesmo espectrofotmetro, determinar
a concentrao de glicose nas alquotas dos sobrenadantes dos tempos inicial e final de
fermentao.

Tubo
Branco
Tempo inicial
Tempo final

H2O
destilada
(mL)
1
-

Diluio Amostra
da
(mL)
amostra
1
1

Reagente
DNS
(mL)
1
1
1

Absorbncia
(540 nm)

Concentrao
(
)

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Determinao do lcool pelo Mtodo do Dicromato

1. REAGENTES
Soluo padro de dicromato de potssio: 33,816 g de K2Cr2O7 dissolvidos em gua e
completados a 1 litro
H2SO4 concentrado
H3PO4 a 85%
Indicador: 0,5 g de sal de brio do cido 4-difenilamina-sulfnico dissolvido em 100 mL de H2O.
Utilizar o sobrenadante.
Soluo de sulfato ferroso amoniacal: 135,1 g de FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, 20 mL de H2SO4
concentrado so dissolvidos em gua e completados 1 litro.
2. PROCEDIMENTO
a) 10 mL da soluo de dicromato so colocadas em 3 frascos cnicos, adicionando-se, em
seguida, 5 mL de H2SO4 concentrado, resfriando-se em gua de bica corrente.
b) Colocar em cada frasco 5,0; 2,5 e 1,0 mL do destilado, respectivamente, e completar o volume a
5,0 mL com gua, quando for o caso.
Para o destilado do frasco contendo fluoreto de sdio basta fazer a alquota de 5 ml.
c) Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 minutos para o etanol ser quantitativamente levado a
cido actico.
d) Aps os 15 minutos, adicionar 165 mL de gua destilada, 18 mL de cido fosfrico e 0,5 mL da
soluo do indicador.
e) Titular com sulfato ferroso amoniacal at a cor da soluo mudar de prpura para verde e anotar
o volume consumido (n).
f) Para o ensaio em branco adicionar 5,0 mL de gua destilada em lugar da amostra e repetir o
procedimento. Anotar o volume consumido (N).

3. REAO
2 Cr2O7 -2 + 12 Fe 2+ + 14 H+ 4 Cr 3+ + 12 Fe 3+ + 14 H2O
2 Cr2O7 -2 + 3 C2H5OH + 16 H+ 4 Cr 3+ + 3 C2H4O2 + 11 H2O

4. EXPRESSES PARA O CLCULO DO CONTEDO DE ETANOL


A = 2 (1- n/N)

quando se usa 5,0 mL do destilado

A = 4 (1- n/N)

quando se usa 2,5 mL do destilado

A = 10 (1- n/N)

quando se usa 1,0 mL do destilado

A = concentrao de etanol na amostra original (%)