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Determinacin de la capacidad inmunolgica a travs de la evaluacin serolgica

1. NDICE..
2. MARCO TERICO.
3. OBJETIVO E HIPTESIS....
4. MATERIALES Y MTODOS
5. RESULTADOS..
6. DISCUCIN
7. GLSARIO
8. BIBLIOGRAFA..

INTRODUCCIN
La leptospirosis es una enfermedad causada por la bacteria Leptospira
interrogans, la cual ha afectado a individuos de diferentes especies, entre ellas, a
los bovinos.
En este proyecto se presentar un anlisis minucioso sobre la respuesta inmune
que genera la vacuna polivalente, leptos 10, para bovino experimentando en
conejos. Mediante una evaluacin serolgica se mostrar la cantidad de
anticuerpos producida por la bacterina.
A travs de la ejecucin de diversos pasos, tales como la conservacin de los
conejos en condiciones adecuadas, la inoculacin, y finalmente el sangrado, se
permitir observar el progreso de la respuesta inmune ya mencionada.
De esta manera se obtendr informacin que le brinde a la poblacin herramientas
para reconocer y combatir la leptospirosis en el ganado bovino y as, poder evitar
prdidas econmicas.
Por otro lado, tambin se busca provocar cierto inters para iniciar nuevas
investigaciones con las que se pueda lograr un avance cientfico.

MARCO TEORICO
La leptospirosis procede del griego lepto (fino) y spira (espiral), se define como
una zoonosis ocasionada por una bacteria helicoidal aerobia Leptospira
interrogans, perteneciente al gnero Leptospira descubierta por A. Weil en 1886.
Son bacterias delgadas y mviles gracias a un mecanismo flagelar que presentan
contenido en una envoltura externa, su forma delgada hace que generalmente se
visualicen fcilmente al microscopio con iluminacin oscura y en preparaciones
lquidas, a diferencia de las otras bacterias. As tambin muestran una longitud de
10 a 20 micras y se manifiestan enganchadas por los extremos. Giran
constantemente en el eje de su axis por lo que sus extremos en gancho parecen
lazos, a excepcin de algunas formas virulentas que son completamente rectas.
Bajo ciertas condiciones nutricionales, las leptospiras pueden ser extremadamente
largas y pueden perder la caracterstica de dividirse, por lo que crean cadenas
largas con conexiones flexibles.
Se diferencian por su composicin diversa de cidos nuclecos y otros
componentes qumicos, as como los nutrientes que metabolizan y el hbitat
natural donde se desarrollan. Abordando de manera especfica su composicin
qumica, existen la idea de que todas las leptospiras son iguales excepto por sus
serovares antignicos especficos pero se contrapone al hecho de que presentan
diversas composiciones nuclecas y qumicas.
Todas son susceptibles a las influencias ambientales que se presenten as como a
los medios donde se desarrollan, por mencionar que la mayora no completa su
crecimiento y crece de manera lenta o pierden su movilidad y algunas tienen un
desarrollo nulo si se presentan superficialmente en colonias en un medio denso
slido. A su vez, en este medio es cuando se fijan confiables caractersticas
serolgicas y se aborda la superposicin de constitucin antgena, por eso es que
gracias a los anlisis de gentica molecular se sabe que las leptospiras pueden
adquirir informacin gentica por sistemas fagocticos en un tipo tipo de leptospira
con plsmido largo.
Los factores que determinan la supervivencia de la espiroqueta dependen de las
condiciones del agua y suelo; el factor que rige la persistencia del microorganismo
es la humedad, as como temperatura templada (25 C), un pH neutro (de 6 a 8) y
presencia de materia orgnica. Con estos elementos propicios, la bacteria tiene un
periodo de vida de 15 das en receptculos de agua.

Las curvas de crecimiento de la leptospira sigue el tpico patrn de crecimiento

bacteriano, teniendo un periodo adaptacin, crecimiento exponencial, fase
estacionaria y fase de declinacin, con la nica excepcin de que su escala de
tiempo es ms larga.

A) Periodo de adaptacin: las bacterias se adaptan a las condiciones de

crecimiento. Es el perodo en el que las bacterias individuales se encuentran
madurando y no tienen an la posibilidad de dividirse. Durante la fase de
adaptacin del ciclo de crecimiento de las bacterias, se produce la sntesis de
ARN, enzimas y otras molculas.
B) Periodo de crecimiento exponencial: caracterizado por la duplicacin celular. El
nmero de nuevas bacterias que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a
la poblacin actual. Si el crecimiento no se limita, la duplicacin continuar a un
ritmo constante, por lo tanto el nmero de clulas de la poblacin se duplica con
cada perodo de tiempo consecutivo. Para este tipo de crecimiento exponencial, la
representacin grfica del logaritmo del nmero de clulas frente al tiempo genera
una lnea recta.
C) Periodo de meseta: la tasa de crecimiento disminuye como consecuencia del
agotamiento de nutrientes y la acumulacin de productos txicos. Esta fase se
alcanza cuando las bacterias empiezan a agotar los recursos que estn

disponibles para ellas. Esta fase se caracteriza por un valor constante del nmero
de bacterias a medida que la tasa de crecimiento de las bacterias se iguala con la
tasa de muerte bacteriana.
D) Periodo de declinacin: las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren.
En condiciones de laboratorio la leptospira comienza a crecer exponencialmente
en unas 6-8 horas, en condiciones in vivo con un hospedador se reporta la misma
tasa de crecimiento, siempre que se cuenten con los nutrientes necesarios, la
leptospira alcanza su periodo de meseta alrededor de 4-7 das en laboratorio,
dentro de un hospedador puede variar pero es mucho ms lento, debido al
sistema inmunolgico del hospedador en cuestin y diferentes variables de las
cuales no se puede tener control como en el laboratorio, dichas variables
perjudican al crecimiento de la leptospira haciendo que la tasa de meseta se
alcance hasta que la infeccin este muy avanzada dentro del husped y esto
puede tardar semanas, incluso meses.
Los brotes de leptospira suelen ser facilitados por desastres naturales tales como
inundaciones y huracanes, por lo que se puede entender que en los pases con
alta actividad agrcola y ganadera, abundancia de naturaleza y animales
reservorios, no existen medidas de control ambiental ya que la supervivencia de la
bacteria es a largo plazo y resulta en epidemias de alto ndice de mortalidad.
La poblacin de mantenimiento de la leptospira reside en una o varias especies de
fauna silvestre que actan como reservorio contino de un serovar, destacando a
los roedores, quienes actan como portadores; la bacteria persiste en sus tbulos
renales sin evidencia de enfermedad y es excretada por medio de la orina;
teniendo las condiciones adecuadas puede contaminar el ambiente.
La leptospira se clasifica segn el estado de serovar, un serotipo o serovar es una
forma de clasificar los tipos de antgenos que se encuentran presentes en la
membrana celular del microorganismo patgeno tomando en cuenta que
provienen de la misma especie, dando diferentes respuestas inmunolgicas
dependiendo del antgeno.
En el caso de la leptospira se han identificado ms de 200 serovares patgenos, el
modo frecuente de transmisin y de inters en bovinos es el caso de
serovariedades adaptados. La amplia gama que se tienen de serotipos y
serovariedades se debe principalmente a la capacidad que tienen los
microorganismos, como las bacterias, de mutar o de usar su plsmido para
codificar alguna protena especfica que les sirva para crear una resistencia
cuando se encuentran bajo un estrs qumico o fsico.

El serogrupo de L. bataviae fue reportado por primera vez en 1976 aislada en

Indonesia, el serogrupo ha sido aislado tambin en Argentina, Panam, Brasil,
Puerto Rico y Filipinas; tanto en animales silvestres como humanos, casi siempre
identificada mediante absorcin Cruz-aglutinina, se observa el anticuerpo
monoclonal, polimorfismo en longitud de fragmentos de restriccin y anlisis de
reaccin en cadena de polimerasa. El aislante (cepa 37 SBF) es antignicamente
similar en referencia con Paidjan y por lo tanto pertenece al serotipo paidjan.
Laphitzondo, D. et al. (2) determinaron en el ao 2009, a partir de orina de una
vaquillona abortada con elevadas prdidas tacto-paricin, un aislamiento de L.
interrogans serogrupo Sejroe, en el que estn incluidos los serovares wolffi y
hardjo.
La serovariedad L. ballum es aislada usando el mtodo de MLST, proceso
propuesto por Ahmed en 2006, que es incluida por la importancia que presenta el
serogrupo L. borgpetersenii que es ampliamente reconocida por la prevalencia en
ratas que presentan leptospirosis. Aunque la clasificacin por serogrupos ya no es
utilizada taxonmicamente, tiene importancia en laboratorio y objetivos
epidemiolgicos.
La falta de aislamientos crea una elevada tasa de serologa positiva al serovar
wolffi similar a hardjo.
La serovariedad cancula es reconocida por causar dao renal, al provocar
lesiones como nefritis o esclerosis renal destruyendo nefronas ocasionando que
muchas de los productos de desecho del metabolismo como urea y la creatinina
se acumulan. En la cavidad oral se presentan ulceras al desarrollarse como
resultado de un efecto de las toxinas urmicas en las membranas mucosas.
La serovariedad Icterohaemorrhagiae produce lesiones hepticas, originando un
trastorno agudo caracterizado por la acumulacin de pigmentos biliares en los
canalculos y ductos hepticos debido a la inclusin de estos por restos celulares.
EL grado de icteria est directamente relacionado con el nivel de obstruccin ms
que por el dao en los rganos.
La serovariedad Pamona produce tambin hemolisinas responsables de un cuadro
clnico de hemoglobunuria en el ganado bovino, equino y porcino.
La serovariedad L. Bratislava es una importante causa de falla reproductiva
porcina en Europa, este serovar ha sido aislado de fetos abortados.
Entre las serovariedades ms comunes que afectan al ganado bovino se
encuentran las ya mencionadas y algunas otras como hebdomadis, bratislava,

pyrogenes, grippotyphosa, pomona, que en conjunto se identifican en la

leptospirosis.
Se debe a la trasmisin horizontal directa, la cual consiste en la entrada de
leptospira por va inhalatoria o conjuntiva debido a la dispersin de la orina o
mordedura de animales infectados, con un periodo de incubacin de 4 a 10 das.
La leptospira patgena, invade la corriente sangunea y se disemina por todo el
cuerpo incluyendo el Sistema Nervioso Central y el humor acuoso. Parece ser que
existe un mecanismo de accin favorable en algunos rganos como: hgado,
riones, corazn y tambin en tejido msculo esqueltico.
La leptospirosis es una enfermedad generalizada de curso agudo y de distribucin
mundial, algunos signos en ganado lechero y ovino pueden ser: aparicin
repentina de agalactia, ictericia y hemoglobinuria, meningitis y fallo renal agudo.
La leptospirosis crnica debe considerarse en los siguientes casos: aborto,
mortinatos, nacimiento de animales dbiles, infertilidad y fallo renal crnico. La
localizacin y la persistencia de leptospiras en el rin y en el tracto genital de los
machos y las hembras son dos secuelas microbiolgicas crnicas importantes de
la infeccin por leptospiras que presentan problemas de diagnstico concretos.
Los animales infectados crnicamente pueden ser portadores durante toda la vida
y servir de reservorios de la infeccin para otros animales y para los humanos.
(OIE, 2008)
El primer caso de leptospirosis fue reportado cientficamente en 1915 por Adolf
Weil en Heidelbrg, Las correlaciones clnicas destacan que los mismos sntomas
se presentaron en la antigua Asia, con una enfermedad que nombraron La Fiebre
del Verano, esta se daba principalmente en los cultivos de arroz, los cules eran
merodeados por roedores.
A partir de 1920 se documentan los descubrimientos de leptospirosis, por ejemplo
la leptospirosis anicterica, lisis por aglutinacin, inmunizacin activa, animales
portadores, fases del proceso de infeccin y diferenciacin serolgica.
Mas adelante se descubri el fenmeno de adhesin que contribuy a la
diferenciacin de la Leptospira icterohaemorrhagiae y la L. canicola, as como
otros tipos como L. grippo-ryphosa, L. andamana, L. australis, L. Bataviae y L.
Hyos que ayud a diferenciar tambin los tipos de patologas asociadas y la
distribucin mundial de stas.
Desde principios del siglo XVIII, se han mejorado las medidas de vacunacin
como intento de ampliar el nmero de enfermedades susceptibles a la prevencin.

Podra esperarse que las influencias claramente identificadas de ocupacin, clima,

geografa y organizacin social en aspectos de leptospirosis hara prevencin fcil.
En consecuencia a esto, se le brinda importancia a la vacunacin, utilizacin
suspensiones de agentes infecciosos, en este caso, fragmentos de bacterias
inactivados trmica o qumicamente; incapaces de reproducirse, que se
administran a individuos sanos. Al ser inactivas no producirn la enfermedad en el
husped ni el contagio pero se es susceptible a contraerla sin la vacuna, as pues
el objetivo es inducirles inmunidad activa protectora contra esta y eliminar su
poder patgeno.
La sangre fluye a travs de los vasos sanguneos y del corazn y est compuesta
por clulas y lquido. En el lquido (plasma) se encuentran en forma disuelta
sustancias nutritivas, productos de la degradacin metablica, hormonas, pretinas,
molculas de seal del sistema inmunitario, vitaminas, electrolitos y tambin
gases. La sangre es el medio de transporte de estas sustancias y de las clulas
sanguneas y los vasos sanguneos son la va de transporte (Welsch, 2010).
La fraccin celular de la sangre incluye una lnea de clulas eritroides o eritrocitos,
varias lneas de clulas leucocitarias: lo granulocitos, neutrfilos, eosinofilos; los
monocitos, los linfocitos y por separado una lnea de clulas de la serie
megacariocitica o plaquetaria(Bello, 2000).
El trmino inmunidad se refiere a la proteccin frente a las enfermedades
infecciosas, el conjunto de clulas responsables de la inmunidad constituye el
sistema inmunitario, y a su respuesta en grupo coordinada a la introduccin de
sustancias extraas se le llama respuesta inmunitaria.
La defensa contra los microbios est mediada por las reacciones tempranas de la
inmunidad innata y las respuestas tardas de la inmunidad adaptativa. La
inmunidad innata constituye la primera lnea de defensa contra los microbios, sus
principales componentes son: barreras fsicas y qumicas, clulas fagocticas,
clulas dendrticas y linfocitos citolticos naturales; protenas sanguneas,
miembros del sistema del complemento y mediadores de la inflamacin, y atocinas
reguladoras.
Al contrario que la inmunidad innata, surge una inmunidad como respuesta a la
infeccin y se adapta a ella, se denomina inmunidad adaptativa. sta se refiere a
una especificidad frente a molculas diferentes y una capacidad de memoria con
la cual responde de manera intensa a exposiciones repetidas. Tiene la capacidad
de distinguir entre diferentes microbios y molculas, por esto tambin se denomina
inmunidad especfica y sus principales componentes son linfocitos con sus
respectivos anticuerpos.

Existen dos tipos de respuestas inmunitarias adaptativas, inmunidad humoral e

inmunidad celular, en las que intervienen componentes diferentes del sistema
inmunitario.
La inmunidad humoral recibe el nombre de anticuerpos, producidas por unas
clulas denominadas linfocitos B. Los anticuerpos reconocen los antgenos
microbianos, neutralizan la infecciosidad de los microorganismos y los m arcan
como una diana para su eliminacin por diversos mecanismos efectores. La
inmunidad humoral es el principal mecanismo de defensa contra los microbios
extracelulares y sus toxinas, debido a que los anticuerpos segregados pueden
unirse a ellos y contribuir a su destruccin. Los propios anticuerpos estn
especializados, y cada tipo diferente puede activar unos mecanismos efectores
distintos. La inmunidad celular queda a cargo de los linfocitos T. Los microbios
intracelulares, sobreviven y proliferan en el interior de los fagocitos y de otras
clulas del anfitrin donde los anticuerpos circulantes no los tienen a su alcance.
La defensa contra estas infecciones corresponde a la inmunidad celular, que
fomenta la destruccin de los microorganismos residentes en los fagocitos o la
desaparicin de las clulas infectadas para suprimir los reservorios de la infeccin
(Abbas, 2012). Ambas respuestas, contra antgenos extraos poseen una serie de
propiedades:

Las respuestas inmunitarias son especficas frente a los distintos antgenos

y, frente a las diversas porciones de un solo complejo protenico, de un
polisacrido o de cualquier otra macromolcula. Los elementos de tales
antgenos que son reconocidos especficamente se denominan eptopos.
Esta especificidad obedece a que cada linfocito expresa receptores de
membrana capaces de discernir diferencias sutiles en la estructura de dos
eptopos distintos. Esta propiedad caracteriza a reconocer un nmero
elevado de antgenos. Existen muchos clones distintos de linfocitos que
difieren en la estructura de sus receptores para el antgeno y, por tanto, en
su especificidad frente a los antgenos, lo que sirve para aglutinar un
repertorio total sumamente diverso.
La exposicin del sistema inmunitario a un antgeno extrao favorece su
capacidad para responder de nuevo a ese mismo antgeno. La memoria
inmunitaria se debe a que cada exposicin a un antgeno genera clulas
memoria especfica frente al antgeno de vida larga, que son ms
numerosas que los linfocitos T vrgenes especficos frente al antgeno que
haba antes de la exposicin al antgeno.
Los linfocitos especficos frente a un antgeno experimentan una
considerable proliferacin tras exponerse a un antgeno. El trmino
expansin clonal designa u n aumento de la cantidad de clulas que

expresan receptores idnticos frente al mismo antgeno y, por tanto, que

pertenecen a un clon.
Son diferentes las clases de microbios que desencadenan la inmunidad
humoral y la celular, o las fases de la infeccin por las que pasa el mismo
microbio y cada tipo de respuesta inmunitaria protege al anfitrin contra esa
clase concreta de microorganismo. Incluso en la propia respuesta
inmunitaria humoral o celular, puede variar la naturaleza de los anticuerpos
o de los linfocitos T generados segn la clase de microbio.
Todas las respuestas inmunitarias normales declinan con el paso del tiempo
despus de su estimulacin por el antgeno, con lo que el sistema
inmunitario recupera su estado basal de reposo, situacin llamada
homeostasis.
Una de las propiedades ms destacadas del sistema inmunitario normal en
cualquier individuo es su capacidad para reconocer muchos antgenos
extraos (ajenos), responder a ellos y eliminarlos sin reaccionar contra las
sustancias antignicas del mismo individuo (propias).

Estas caractersticas de la inmunidad adaptativa son necesarias para que el

sistema inmunitario cumpla su funcin normal en la defensa del anfitrin.
Las vacunas por bacterias inactivadas generalmente son bien toleradas. Son
menos inmunogenas que las vacunas vivas, precisando sustancias que
incorporadas al antgeno hacen ms efectiva la respuesta inmune conocidas como
adyuvantes.
A su vez, la vacuna se subdivide como polivante, debido a que se elabora con ms
de un antgeno bacteriano para estimular una respuesta inmune contra varias
serovariedades de forma simultnea que comnmente infectaran al organismo.
Esta bacterina polivalente est constituida por anatoxinas propias que se purifican
a partir de los cultivos y se destoxifican por la accin del calor o el formol. Son en
general vacunas que proporcionan una inmunidad prolongada, generando
fenmenos de memoria inmunolgica con las revacunaciones y estimulan la
inmunidad humoral, sta puede ser transferida va placenta o por suero. No
obstante, la leptospira puede persistir en el tracto renal, cerebro y genitales en los
animales y en lugares como en la cmara del ojo en seres humanos y animales
conduce una infamacin alrgica, hipersensibilidad y eventual ceguera en equinos.
La primera inmunoterapia se trat con xito en Japn y Alemania despus el
hallazgo de leptospiras, utilizando antisueros en conejos y caballos. La
quimioterapia se limit a la sfilis de la terapia arsenical, la evidente analoga entre
los orgenes de espiroquetas de la sfilis, enfermedad conducida al juicio de la
misma arsenical y otros compuestos de metales pesados para la leptospirosis.

Dentro de la clasificacin segn el mtodo de obtencin del antgeno, el trmino

antgeno tiene varias connotaciones. La primera es conceptual como
componente de las leptospiras que interacta con un anticuerpo, ya sea por
respuesta innata o adquirida. Este antgeno se caracteriza por aglutinacin,
tomando en cuenta el fenmeno molecular al reaccionar con el anticuerpo; el
antgeno presenta una reaccin gracias al anticuerpo que hace que las leptospiras
se cohesionen.
La segunda hace referencia a la localizacin anatmica del antgeno en la
leptospira, en esta clasificacin podemos encontrar clasificaciones como flagelar,
superficial, etc. Otra clasificacin importante se refiere a las propiedad
fisicoqumicas, como termoestable o acidorresistente, etc.
Una ltima e importante clasificacin abarca preparados antignicamente activos
usados para serologa, investigaciones inmunolgicas y para inmunizacin. Se
diferencia a las vacunas que no utilizan tcnicas de recombinacin de ADN, si no
por antidiotipo contra molculas peligrosas como endo o exotoxinas.
La reaccin principal de la leptospira ante algn anticuerpo es aglutinamiento; eje
central que envuelve las preguntas sobre su especificidad, clasificacin y
taxonoma, agentes inmunizantes y control epidemiolgico.
Sin excepcin alguna, los antgenos participantes son inmunoquimicamente
similares o se relacionan y derivan del LPS1, que es el principal componente
antignico que contribuye a la aglutinacin.
La aglutinacin se presenta cuando una suspensin de leptospira viva motil es
mezclada con una cantidad apropiada de cadena homloga antisuero. Las
leptospiras se vuelven hipermtiles en pocos segundos y se tornan adhesivas
entre s, ya en sus largos ejes o en la parte central, son incapaces de liberarse
despus de entrar en contacto. Los grupos de leptospira se unifican en un mismo
cuerpo, donde los ocupantes se enredan con fuerza mientras que el nmero de
reas de contacto incrementa. Cada leptospira se flexiona vigorosamente para
entrar contacto con otras leptospiras, sin embargo conforme se van aglutinando
pierden motilidad. Eventualmente despus de un par de horas y dependiendo de
la concentracin de inmunoglobulina, la aglutinacin de leptospira se concentra en
estancamientos densos, bolas altamente refractiles y relucientes, con un centro de
donde salen en forma radial o en franjas de hilos de individuos unidos como una
cuerda floja.

1 Lipopolisacrido presente en la membrana de la leptospira

La Tcnica de Aglutinacin Microscpica (MAT) es una prueba serolgica

estndar. Los antgenos seleccionados para la utilizacin de esta tcnica debe
incluir solo las cepas que contiene la bacterina que se utiliza en la inoculacin. El
mtodo de esta tcnica consiste en la utilizacin de un suero, el suero se activar
con las distintas cepas que contenga la bacterina.
Existe la posibilidad de diferenciar las diversas aglutinaciones de los antgenos
mediante la prueba MTA y su correspondiente antisuero. Los diferentes patrones
de aglutinacin son dependientes de los diversos componentes de LPS en la
superficie de la leptospira. Dichos componentes son dependientes as mismo de el
tipo de medio en el cual se creci el cultivo de leptospira, nutrientes, temperaturas,
grado de adaptacin al medio, etc.
Por su clasificacin sanitaria, esta se basa en los objetivos epidemiolgicos que se
pretende alcanzar con la aplicacin a la poblacin, debe proporcionar proteccin
colectiva, llamada inmunidad de grupo, que contribuye a romper la cadena de
transmisin. Esta inmunidad colectiva es la que protege a la comunidad del riesgo
de una epidemia, confiere proteccin indirecta a los individuos no vacunados y
puede eliminar la enfermedad cuando su tasa es suficiente para interrumpir.
Se anexa la vacuna a analizar que cumple con todas las caractersticas ya
mencionadas:
VACUNA COMERCIAL
SUSPENSION INYECTABLE
Bacterina para prevenir la leptospirosis en bovinos y porcinos
FORMULA:
Suspensin de Leptospira que incluye las siguientes serovariedades: L. hardjo, L.
bataviae, L. canicola, L. icterohaemorrhagiae, L. grippotyphosa, L. pomona, L.
tarassovi, L. wolffi, L. ballum y L. serjoe, inactivadas y adsorbidas en adyuvante
oleoso.
DESCRIPCION:
Bacterina elaborada con cepas de Leptospira de comprobada antigenicidad, lo que
garantiza una mejor proteccin en zonas endmicas. Contiene 9 serovariedades
de mayor seroprevalencia e induce una respuesta inmune slida y altamente
especfica contra cada serovariedad incluida.
Previene abortos y problemas reproductivos originados por la infeccin de
Leptospira. Al ser inactivado permite la vacunacin de todos los animales del hato,

a partir de los tres meses de edad, inclusive hembras gestantes y lactantes.

Protege a los becerros antes de que disminuyan los anticuerpos maternos y de
que sean huspedes potenciales de la bacteria.
DOSIS:
Bovinos y porcinos: 2 ml.
VIA DE ADMINISTRACION: Subcutnea
MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES
(Inoculacin y extraccin de sangre)

3 conejos estriles.
12 jeringas.
Algodn.
Alcohol.
Suspensin inyectable de bacterina comercial que incluye los siguientes
serovares: L. hardjo, L. botavie, L. cancula, L. icterohaemorrhagie, L.
tarassovi, L. wolffi, L. ballum, L. grippotyphosa, L. sejroe, L. ponoma.
6 tubos de ensaye.
Aserrn.
Alimento para conejo de la marca purina.
Agua.
Bata
Cubre bocas
Guantes
Xilol
Trapo
Bolsas para desechos biolgicos

(Titulacin)

microscopio ptico
asa bacteriolgica
porta objetos
diluyente PBS
micropipeta de 12 canales
campana de flujo laminal
vial
pluma
masking tape

tubo de ensaye
mechero
solucin PBS(Buffer)
Cajas multiporos rotuldas

(Centrifugacin)

Muestras a centrifugar
Centrfuga
Camisas
Jerigna con agua

MTODOS
Se debe conservar a los conejos en una zona aislada y en condiciones de
limpieza, alimentacin y observacin durante el periodo de 48 das, para as
evaluar correctamente la bacterina que ser aplicada durante el periodo ya
mencionado, con lo cual se busca valorar la respuesta inmune que presentan los
conejos al ser inoculados con dichas bacterina, finalizando con un sangrado total.
Jueves 15 de octubre de 2015
Primera inoculacin: se carga al conejo por la base del cuello tomando solo la piel
y con la otra mano sosteniendo su cadera, se traslada
al cuarto de
procedimientos para aplicarle la primera dosis de la bacterina, esta se debe aplicar
de la siguiente manera:
Se utiliza una turunda para esterilizar el rea a manipular, se introduce la
aguja a 45 con el bisel orientado hacia arriba, se espera que con esto el
contenido sea distribuido completamente, teniendo en cuenta que es una
inyeccin subdrmica. Se retira la aguja y se toman las medidas de
seguridad correspondientes.
Posteriormente se traslada al conejo a su jaula cuidadosamente. Y queda en
observacin durante 15 das.
Jueves 29 de octubre de 2015
Se toma la primera muestra de sangre con el objetivo de evaluar la respuesta
inmune, esta se debe realizar de la siguiente manera:
Se traslada a los conejos al cuarto de procedimientos uno por uno
posteriormente se sujetan con un trapo de tal manera que queden
inmovilizados haciendo un amarre en el cuello y cubriendolos con la parte

distal del trapo asemejando una envoltura, exhibiendo slo la cabeza para
as tomar la muestra de sangre de una de sus orejas, preferentemente la
oreja izquierda. En la oreja seleccionada se esteriliza el rea a manipular
con una torunda con alcohol y un vasodilatador llamado xilol.
Para obtener dicha muestra se extrae una pequea cantidad de sangre de
la vena central auricular, ya obtenida la muestra se retira la aguja con la que
se pinch y se deposita la sangre en un tubo de ensaye con un goteo
continuo sobre la pared del tubo y al finalizar el vaciado se sella con un
tapn de hule.
En la oreja manipulada del conejo se presiona con una torunda seca
esperando a que pare el sangrado, se aplica vaselina para evitar
resequedad en la oreja.
Para finalizar se regresan los conejos a sus respectivas jaulas. Este
procedimiento se realiza con los tres conejos.
Terminada la manipulacin se da un periodo de 15 das
recuperacin a los animales.

para brindar una

Ya obtenida la muestra se lleva al laboratorio de leptospira, en este se dejan las

muestras en incubacin durante 30 minutos a una temperatura de 29C en la
estufa, pasado este tiempo es trasladada al refrigerador, el cual se encuentra a -9
C durante 24 horas, esto con el fin de producir un choque de temperaturas, dando
como resultado la contraccin del coagulo que a su vez soltar ms suero.
Jueves 5 de noviembre de 2015
Segunda dsis: Se realiza el mismo procedimiento que en la dsis anterior
seguido de la inoculacin, se deja al conejo en observacin durante 7 das.
Viernes 6 de noviembre de 2015
Centrifugado de la muestra de sangre
La centrifugacin es un mtodo de separacin de mezclas, para fines de sta
investigacin el inters recae en los componentes sanguneos y en su separacin.
Para llevar a cabo este proceso se necesita una centrfuga, el prcincipio bsico de
la centrifugacin consta de girar en el eje propio a una velocidad alta medida en
Revoluciones/minutos, lo cual crea una fuerza que separar a los componentes de
la mezcla en diferentes capas dependiendo de las densidades que tengan dichos
componentes. Debido a esto es primordial que al utilizar el equipo se coloquen
siempre muestras pares dentro de la lmina fenestrada en la cual se colocan los
tubos, esto es necesario ya que adems deben colocarse en forma
contraesquinada y en espejo, esto es imaginando un ecuador que atraviese toda

la placa, debe haber el mismo peso de cada lado del ecuador, para balancear la
lmina, ya que al girar a una velocidad tan alta de no estar completamente
balanceado el equipo puede daarse ,el proceso no dar resultados certeros ya
que la separacin no se llevar a cabo corretamente o pueden romperse los tubos
que contienen las muestras dentro de las camisas.
Para este proceso se debe tener las muestras previamente separada (proceso
descrito previamente)
El proceso de centrifugado se llevo en 3 partes principalemente como se describe
a continuacin:
1) Se colocan los tubos de ensaye, que continen el cogulo, dentro de las
camisas, estructuras cilndricas de metal, y se contraponen en una vscula
previamente calibrada. Con la jerigna llena de agua se taran las camisas
hasta lograr un equilibrio en la vscula.
2) Se colocan las camisas ya taradas, y con la muestra, dentro de los
fenestres de la placa interna del equipo, despus se cierra la tapa superior
y se programa para girar a 1800 revoluciones/min durante 15 a 20 minutos,
este tiempo es el recomendado para evitar la lsis de la membrana celular
de los componenetes en la sangre.
3) Se retiran las muestras centrifugadas y se colocan en una gradilla, se
observan diferentes capas, en el fondo un botn rojo que son todos los
eritrocitos, posteriormente una capa blanca que contiene las plaquetas y
lnea blanca, por ltimo una capa transparentosa-amarillenta que contiene
las proteinas, las cuales en este caso son de nuestro inters ya que
contienen el complejo antgeno-anticuerpo creado por la bacterina y los
anticuerpos del conejo. Se debe extraer con una pipeta este contenido,
para despus purificarlo y quedarnos con nuestras protenas de inters.
Se deja en refrigeracin durante el tiempo pertinente para poder realizar la primera
titulacin, en nuestro caso se dej en refrigeracin 17 das
Mircoles 18 de noviembre de 2015
Se toma la segunda muestra de sangre con el objetivo de comparar la evaluacin
de la respuesta inmune con la primer titulacin, esta se debe realizar de la misma
manera que el sangrado anterior.
Se lleva al laboratorio de leptospira y de igual manera se deja encubar por 30 min,
se mantiene en refrigeracin para posteriormente pasar a centrifugarlo.
Jueves 19 de noviembre de 2015

Centrifugacin de las muestras sanguneas: Se realiza el mismo procedimiento

que el utilizado en la centrifugacin anterior.
Se dejan en refrigeracin durante el tiempo pertinente para poder realizar la
segunda titulacin, en nuestro caso se dej en refrigeracin 7 das .

Lunes 23 de noviembre de 2015

Ttulo (primer sangrado)
Se busca enfrentar al suero con las distintas serovariadades (las 10 contenidas
en la vacuna contra las 9 existentes en el laboratorio 2. Se llevan a cabo diluciones
dobles seriadas del suero problema, donde se espera encontrar una respuesta
antgeno-anticuerpo, los pasos a seguir son:
Se rotula la caja multiporos en donde se realizar el ttulo
Se toma una porcin del suero y se diluye 1:10 en un tubo de ensaye
Se toman la micropipeta de 12 canales y se les coloca a los 4 pozos
las siguientes cantidades de diluyente PBS.3
Pozo 1
Nada

Pozo 2
50 ml

Pozo 3
50 ml

Pozo 4
50 l

Se toma la dilucin 1:10 de la cual se absorben 50 ml y se vaca en el

primer pozo, despus del primer pozo se toma 50 ml de la dilucin y se
mezcla con la del segundo pozo obteniendo una solucin 1:20 , del
segundo pozo se toman 50 ml de la dilucin ya mezclada y se vierte en
el tercer pozo, del tercer pozo se toman 50 ml de la dilucin ya
mezclada y se vierte en el cuarto pozo.
Se lleva a la campana de flujo laminal, en esta se le colocan 50 ml de
los antgenos a cada pozo por medio de una micropipeta.
Se deja incubar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cmara
hmeda.

2 En laboratorio no se tiene la serovariedad balum.

3 Solucin salina amortiguada por fosfatos

Se observa la reaccin en el microscopio, para esto se debe prender el

mechero, se esteriliza el asa bacteriana, se toma una porcin del
contenido del vial y se coloca en el porta objetos.
Se proporciona un valor a esa prueba.
Se proporciona un ttulo

Mircoles 25 de noviembre
Titulacin (segundo sangrado): se realiza el mismo procedimiento que el del titulo
anterior.

Objetivo
Conocer y analizar la respuesta inmune por la aplicacin de una bacterina
comercial.
Hiptesis
Mediante la aplicacin de dos dosis de una vacuna se aumentar gradualmente el
volumen de anticuerpos.
Si se consigue un aumento de anticuerpos especficos en el torrente sanguneo
entonces se comprobarn los principios de la respuesta inmunitaria, lo cual,
demostrar la efectividad de la vacuna.
Justificacin
La leptospirosis bovina es una enfermedad de distribucin mundial que repercute
en prdidas econmicas ganaderas, para prevenir esto se brinda importancia a la
vacunacin y el proceso fundamental de generar una memoria inmunitaria antes
de que la enfermedad se genere.