GRADO EN QUMICA

METODOLOGAS AVANZADAS EN QUMICA ANALTICA

Curso 4

GRADO EN QUMICA
Anexo
Tema 6: Ejemplos
biosensores
electroqumicos
METODOLOGAS
AVANZADAS
EN QUMICA
ANALTICA
Curso 4
Susana Campuzano Ruiz
susanacr@quim.ucm.es

Curso 201-2015
Curso 2015-2016

UCM

Metodologas
Sensores
integrados

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

Partculas
magnticas (MBs)

UCM

Biosensores enzimticos
ANALITOS

SUSTRATOS ELECTRDICOS

Glucosa
Fructosa
Hipoxantina/Teofilina
Lactosa
Lactulosa
Polifenoles
c. D-y L-lctico
c. Mlico
Glicerol
Etanol
H2O2

AuE
GCE
Au-acero inoxidable

MUESTRAS
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Leche
Miel, etc.
Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

SAMs de alcanotioles
Membrana de dilisis

i, A

t, s

UCM

Determinacin de antibiticos -lactmicos

Nueva plataforma para inmovilizacin de bioreceptores con His-tag

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Mtodo de cribado rpido para sulfonamidas, tetraciclinas y cefalosporinas

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Magnetoinmunosensores para S. aureus

S. aureus

ProtA-HRP

Anti-ProtA
ProtA-MBs

Au/SPE
Imn

Muestras de leche inoculadas

Nivel de contaminacin,
cfu mL-1

[S. aureus] encontrada,

cfu mL-1

Recuperacin , %

10

(11.2 0.9)
(n = 6)

(112 10)
(n = 6)

100

(106 8)
(n = 6)

(106 8)
(n = 6)

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

LEGISLACIN
103 cfu mL-1

UCM

Inmunosensores impedimtricos para E. coli

Sulfo-LC-SPDP
+

anticuerpos
tiolados

Biosensores impedimtricos:

Lectinas
(ConA)
Con A

Determinacin de E. coli en muestras de agua inoculadas

MUESTRA

[E. coli], cfu mL-1

Agua de grifo

(11 2) (n = 6)

Agua del ro Eresma

(12 2) (n = 6)

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Magnetogenosensores para E. coli

PCR asimtrica directa (DaPCR)

Magnetogenosensores

Amplicn de cadena
sencilla biotinilado

DNA
genmico

Cultivo
bacteriano
1.0104 cfu mL-1
1/100

H2O2

0.0

1 2 3 4 5 6 7 8
-i, A

-0.5

1078 bp

Amplicons DaPCR:
sterilized H2O

-1.0

1353 bp
872 bp
603 bp

No es posible
cuantificar!!!

-1

1/100 cfu mL
-1
100 cfu mL
4
-1
1.0x10 cfu mL

-1.5

326 bp

50

100

t, s

150

200

cfu: unidades formadoras de colonias

Sensibilidad: capacidad de detectar 1 cfu de E. coli en 100 mL

(Regulacin Europea N 1441/2007: Agua potable libre de E. coli en 100 mL)

DISPOSITIVO DE ALARMA PARA CONTROL DE CALIDAD DE LAS AGUAS

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Genosensores integrados para uropatgenos

Identificacin y cuantificacin

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

Resistencia a antibiticos

UCM

Genosensores integrados para uropatgenos

Identificacin de aislados clnicos

-i, nA

EC: Escherichia coli

KP: Klebsiella pneumoniae
PA: Pseudomonas aeruginosa
EA: Enterobacter aerogenes
PM: Proteus mirabilis
SM: Serratia marcescens
EH: Enterobacter hormaechei
AB: Acinetobacter baumannii

El sensor es capaz de detectar los aislados clnicos de E. coli (EC) con 100% de sensibilidad y
selectividad en slo 45 min.
Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Genosensores integrados
Determinacin electroqumica de pre-rRNAs Deteccin rpida de la
resistencia bacteriana a antibiticos

Comparacin entre cepas de E. coli susceptibles (EC103) y resistentes (EC135, EC139, and EC197) a
ciprofloxacino (CIPRO).
Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Magnetogenosensores para S. pneumoniae

S. pneumoniae

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Magnetogenosensores para S. pneumoniae

Validacin clnica: muestras en placa

Relacin

Sealamperomtricamuestra
Sealamperomtricablanco

Sensibilidad

Relacin seal/blanco

1.92

7.55
1.15

Identificacin
microbiana

Magnetogenosensor

Especificidad

Sp

N-Sp

Total

Sp

72

75

N-Sp

25

32

Total

79

28

107

Sp: S. pneumoniae; N-Sp: S. pneumoniae

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

AUC = 0.94

Sensibilidad: 91%
Especificidad: 90%

UCM

Bioparche electroqumico para etanol en sudor

Estimulacin de sudor

Ingesta de alcohol
Medida puntual: 5 min
Medida continua: 6-8 h

0.7
0.6
0.5

i, A

0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.0

0.1

0.2

0.3

0.4
-1

[Etanol]sangre, g L

I.L. = (0.0005-0.6) g/L

[etanol]sangre 71 % [etanol]sudor
Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Magnetoinmunosensores duales para biomarcadores cardiovasculares

NT-proBNP

Diagnstico ms fiable y objetivo

CRP

Parameter

CRP

NT-proBNP

LOD, ng mL-1

0.47

0.47

Punto de corte

1000

1.0

Tiempo de ensayo: 60 min

Suero de referencia para CRP contaminado con NT-proBNP

CRP
-200

i, nA
-400
-600

NT-proBNP
0

50

100

150

200

t, s

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

[Marcador cardiaco]aadido

[Marcador cardiaco]encontrada

CRP, 1 g mL-1

(1.02 0.04) g mL-1

NT-proBNP, 1 ng mL-1

(1.0 0.1) ng mL-1

(n = 6, = 0.05)

UCM

Chip de microfludica para determinacin de cTnT

Sistema de microfluidica

Curva de calibrado y caractersticas analticas

50.0

1) Modificacin de MBs
2) Captura de las MBs modificadas
3) Cronoamperometra (0.10 V)

40.0
30.0

ic, nA
20.0
10.0
0.0
0.0

0.2

0.4

0.6

[cTnT], ng mL

0.8

1.0

Parmetro

Valor experimental

IL, ng mL-1

0.05 1.0

LOD, ng mL-1

0.03
20.0

RE
AE

-1

WE
ImE

0
-1
1 ng mL

10.0

RE: electrodo de referencia

AE: electrodo auxiliar
ImE: electrodo de inmovilizacin
WE: electrodo de trabajo

Muestras de suero
contaminadas

i, nA 0.0
-10.0

-20.0

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

50

100

t, s

150

200

UCM

Magnetoinmunosensor para fibringeno basado en nanobodies

Cncer de vejiga
Ab humano

Ab camello

Nanobodi

His6 tag en C-terminal

Fusionado a MBP en N-terminal

Parmetro
LOD, g

mL-1

Competitivo
directo

Competitivo
indirecto

0.49

0.044

Valor de corte [Fib ]plasma : 4.66 mg mL-1

Estndar internacional ([Fib] = 2.7 mg mL-1)

Competitivo directo
[Fib]

Competitivo indirecto
[Fib]

(2.8 0.1) mg mL-1

RSDn=9 = 6.9 %

(2.6 0.2) mg mL-1

RSDn=9 = 9.1 %

Tratamiento de muestra mnimo, tiempo ensayo: 90 min

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Magnetoinmunosensor para ErbB2

Hiperexpresada en el 2025% cnceres de mama invasivos

ErbB2-negativas: MDA-MB-436
ErbB2-bajas: MCF-7

Determinacin en lisados celulares

ErbB2-altas: SK-BR-3

[ErbB2], pg/g lisado

Lisado
celular

Magnetoinmunosensor*

ELISA**

Determinacin en clulas intactas

MCF-7

67 14

69 15

MCF-7

MDA-MB-436

64 6

65 12

SK-BR-3

205 23

198 12

*2.5

20

g de lisado celular; **0.25 g de lisado celular

0.25

0.20

-i, A

SK-BR-3

0.15

0.10

0.05

Clulas

N receptores/clula 10-3

MCF-7

22 2

MDA-MB-436

4.7 0.5

SK-BR-3

530 60

*17.500

0.00
0

MCF-7

MDA-MB-436 SK-BR-3

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

Clulas

UCM

Genosensor integrado para gen TP53

Strep-HRP
Biotin

i, nA
b)

a) No target

a)

t, s

rGO-CMC

a) No target

Sondas de captura tipo horquilla: - Dual modification (5-Biotin, 3-NH2)

- spp53 (20 nts)
- lcpp53 (33 nts)

TP53: region of the wtTP53 gene

1-m: missense mutation in codon 175 (G A)
Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Genosensor integrado para gen TP53

Clulas epiteliales no tumorales
MCF-10A: wtTP53

RNAt
Primers
especficos

RT
DNA Pol

Clulas cancergenas

Buffer +
dNTPs
MCF-7: wtTP53

cDNA

SK-BR-3: 1-m TP53

RT
0.12

Identificar el estado del gen TP53 en clulas

0.10

0.08

-i, A

La respuesta equivalente a la del SNP ocurre

slo para las clulas SK-BR-3

0.06

0.04

0.02

5.0 ng L-1 cDNA

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

0.00

TP53

1-m

MCF-10A MCF-7

SK-BR-3

UCM

Magnetosensores para miRNAs

antiMBP-HRP
Strep-HRP
Biotin
antimiR
target miR
Chitin-MBs

Strep-MBs

p19

i/A

Magnet
Medida
amperomtrica

t/s

p19: bioreceptor de
captura

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

p19: bioreceptor de
deteccin

UCM

Magnetosensores para miRNAs

Imn

SPC
E

Suspensin
de MBs
Conector

Clula
electroqumica

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Magnetosensores para miRNAs

Determinacin de RNAt (0.5 g) de lneas celulares

1.0 nM
miR-21

RNAt
MCF-7

Deteccin fiable del miR diana en 100 ng de RNAt

(3.0104 clulas MCF-7)
Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

RNAt
MDA-MB-231

RNAt
MCF-10A

RNAt Hela

Clulas

[miR-21] amol/ng RNAt

MCF-7

18 (1.1107 copias)

MDA-MB-231

10 (6.0106 copias)

UCM

Magnetosensores para miRNAs

Determinacin en RNAt (1.0 g) de tejidos y citologas

T: Tejidos cancergenos de mama

NT: Tejidos normales adyacentes de mama
C: Citologa mamaria
Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

* : Quimioterapia antes de ciruga

UCM

Magnetosensores para miRNAs

Deteccin simultnea de miR-21 y miR-205
Identificacin inequvoca de subtipos de cncer de mama (TNBC)
Strep-HRP

antimiR-21
p19

miR-21

antimiR-205

miR-205
Biotin

Chitin-MBs

WE2

nA
cathodici,current

WE1

miR-205
miR-21

SPdCE

[antibiotics]
Tiempo,
Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM

Magnetosensores para miRNAs

Lneas celulares

Clulas de cncer de mama

metastsicas:
-MCF-7: ER+/PR+
-SK-BR-3: ER-/PR-MDA-MB-231: clulas TNBC

500

miR-21
miR-205

-i, nA

400
300
200

Clulas epiteliales no tumorales:

-MCF-10A

100
0
MCF-10A MDA-MB-231

MCF-7

SK-BR-3

Tejidos frescos
2000

miR-21
miR-205

Muestra

-i, nA

1600

1200

Clulas/
Tejidos

800

400

0
NT

T1

T2

T3

T4

T5

Deteccin simultnea en 15 min !!

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

Tipo

miR-21

miR-205

Tumoral

Normal

ER+/PR+

ER-/PR-

UCM

Magnetosensores para miRNAs

Tejidos humanos de mama parafinados (PTFE)
miR-21
miR-205

1200

miR-205

-i, nA

900

600
miR-21

300

0
NT

T1

T2

T3

T4

T5

ErbB2+

T6

T7

T8

ErbB2-

miR-21 y miR-205 in todas las muestras T comparadas con las NT

Diferencias estadsticamente significativas entre los niveles de expresin de miR-21 en tejidos T ErbB2+ y ErbB2Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM
Magnetosensores para determinacin simultnea de protena IL-8 y su mRNA asociado
Los cnceres de cabeza y cuello representa el sexto tipo de cncer ms comn en el
mundo y son responsables de 560,000 nuevos casos y 300,000 muertes/ao.

IL-8: Citocina proinflamatoria que promueve la angiognesis, la tumorigenicidad y

metstasis de numerosos tumores.
Se ha demostrado que en el cncer oral existe concordancia entre los niveles salivares
de la protena IL-8 y su mRNA asociado.

Saliva como fluido diagnstico

Mtodo de coleccin no invasivo

Fcilmente manipulable
Barato
Conservacin y transporte sencillo
Correlacin con niveles en sangre

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

600 pg mL -1 de protena IL-8:

valor de corte para discriminar
pacientes con cncer oral de
individuos sanos

UCM
Magnetosensores para determinacin simultnea de protena IL-8 y su mRNA asociado

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM
Magnetosensores para determinacin simultnea de protena IL-8 y su mRNA asociado

REACTIVIDAD CRUZADA

Mezclas: Protena IL-8 + mRNA IL-8

Mezcla

[IL-8], pg mL -1

[IL-8 mRNA], nM

600

2.5

600

2.5

2,500

2,500

2.5

Factible la determinacin simultnea

de ambos biomarcadores!!

SELECTIVIDAD
4000

9.0

-1

00 pg
IL-8 protein
pg mL
mL-1 protena
IL-8
-1
2,500 pg mL
IL-8
2,500
mL-1 protena
IL-8 protein

15000

12000

3000

2000

-i, nA

S/N

-i, nA

6.0

Selectividad adecuada para

el anlisis de ambos
biomarcadores

9000

6000

3.0
1000

3000

0
Buffer
Buffer

-1

2,500
pg mL
mL-1
2,500 pg
IL-6
IL-6

-1

44
44g
g mL
mL-1
lysozyme
lisozima

0.0
-1

10
10 g
g mL
mL-1
LPO
LPO

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

0
Blank
Blanco

PM
Target

1-m
1-m

NC
NC

UCM
Magnetosensores para determinacin simultnea de protena IL-8 y su mRNA asociado
CARACTERSTICAS ANALTICAS EN MUESTRAS DE SALIVA SIN DILUIR CONTAMINADAS
10000
3000

6000

-i, nA

-i, nA

8000

4000

2000

1000

2000
0
0

1000

2000

3000

4000

-1

5000

[IL-8 protein],
[Protena
IL-8],pg
pgmL
mL-1

[IL-8 mRNA],
nM
[mRNA
IL-8], nM

IL-8 protena

mRNA IL-8

LR

241.3 5,000 pg mL -1

0.69 7.5 nM

0.9992

0.9955

Pendiente

(1.47 0.02) nA mL pg -1

(361 12) nA nM -1

LOD

72.4 pg mL -1

0.21 nM

LQ

241.3 pg mL -1

0.69 nM

RSDn=5, %

8.3 (600 pg mL-1)

8.4 (2.5 nM)

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

UCM
Magnetosensores para determinacin simultnea de protena IL-8 y su mRNA asociado

ANLISIS DE MUESTRAS DE SALIVA SIN DILUIR

-MUESTRAS DE SALIVA CONTAMINADAS-

Parmetro

Protena IL-8

mRNA IL-8

No hay diferencias significativas entre

diferentes muestras de saliva Calibrado
universal para todas las muestras de
saliva analizadas

[Media]

600 pg mL -1

2.5 nM

[Biomarcador]

(615 28) pg mL -1

(2.3 0.2) nM

Recuperacin, %

102 5

94 7

RSDn=7, %

5.0

7.7

Magnetobiosensor

ELISA

Voluntario

[IL-8], pg mL-1

RSDn=3, %

[IL-8], pg mL-1

RSDn=3, %

(320 36)

4.5

(306 33)

5.0

(328 26)

3.2

(339 55)

6.6

(352 45)

5.2

(336 44)

5.2

(314 34)

4.3

(330 65)

7.9

(363 10)

1.1

(370 33)

3.6

(323 28)

3.5

(319 63)

8.0

(264 43)

6.6

(245 46)

7.6

Metodologas Avanzadas en Qumica Analtica

-MUESTRAS DE SALIVA DE
INDIVIDUOS SANOSResultados por debajo del valor de
corte (600 pg mL -1) y concordantes
con los que se obtienen empleando
la metodologa ELISA convencional