Seminarios en espaol 2011

Posible diagnstico de malaria usando el analizador hematolgico modelo

XE-2100 de Sysmex
Diapositiva 1: Esta presentacin se ha desarrollado para nuestros usuarios en Amrica Latina y el Caribe
y es parte de una serie que divulgar tanto material educativo como de investigacin a travs de
internet. Al final de cada presentacin, el participante tendr opcin de tomar un examen. Sysmex
entregar un certificado a los participantes que obtengan el 80% o ms de respuestas correctas.
Diapositiva 2: Los usos o aplicaciones clnicas descritas en esta presentacin o publicacin, no han sido
aprobados por la Administracin de drogas y alimentos de Estados Unidos de Amrica (FDA por sus
siglas en ingls). Es responsabilidad de cada laboratorio validar cualquier aplicacin no aprobada por la
FDA para el uso en la rutina clnica. El instrumento de Sysmex modelo XE-2100 es un auto analizador
multi paramtrico y cuantitativo para diagnstico In Vitro, el cual fue desarrollado para clasificar
elementos en sangre anti coagulada.
Diapositiva 3: La siguiente presentacin titulada Posible diagnstico de malaria usando el analizador
hematolgico XE-2100 de Sysmex ser presentada por German Campuzano-Zuluaga quien es Mdico
investigador en el grupo de malaria de la Universidad de Antioquia en Medelln, Colombia y en el
Laboratorio Clnico Hematolgico, en la misma ciudad. Tiene varios aos de experiencia en el rea de
diagnstico de malaria con especial nfasis en la deteccin de malaria con auto analizadores de
hematologa. En el ao 2010 public un estudio sobre la deteccin de malaria con el analizador
automtico XE-2100 de Sysmex y ms recientemente una revisin de la literatura sobre la deteccin de
malaria con varios analizadores de hematologa, incluido el XE-2100.
Diapositiva 4: Buenos das a todos. He sido amablemente invitado por la corporacin Sysmex en
Amrica para hablarles hoy sobre el posible diagnstico de malaria usando el auto analizador de
hematologa modelo XE-2100 de Sysmex. Les hablar tambin sobre la investigacin realizada en
Colombia sobre este tema entre los aos 2008 y 2010. Con relacin a este trabajo, mis afiliaciones son
con el grupo malaria de la Universidad de Antioquia en Medelln Colombia y el laboratorio clnico
hematolgico en la misma ciudad.
Diapositiva 5: Antes de continuar con la presentacin, para efectos de clarificar conflictos de inters, he
recibido honorarios de Sysmex como presentador para esta actividad educativa. La investigacin que les
mostrar fue cofinanciada entre el grupo malaria de la Universidad de Antioquia y el Laboratorio Clnico
Hematolgico. La corporacin Sysmex no particip en esta investigacin de ninguna manera y tampoco
aport fondos.
Diapositiva 6: El contenido de la presentacin es el siguiente: primero comenzar hablando sobre el
problema de la malaria, dar un breve resumen de la enfermedad. Luego algunas generalidades sobre el
diagnstico de la malaria con nfasis en la importancia del diagnstico parasitolgico. Luego entrar en
el tema que nos concierne hoy que es el posible diagnstico con auto analizadores de hematologa
basados en citometra de flujo en concreto el XE-2100 de Sysmex. Terminar con algunas perspectivas a
futuro sobre esta estrategia del diagnstico de malaria y algunas conclusiones.
Diapositiva 7: Empecemos con el problema de la malaria.
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Diapositiva 8: Mientras hablamos, aproximadamente 3mil millones de individuos estn en riesgo de la
enfermedad. Esto es aproximadamente la mitad de la poblacin mundial. La carga de malaria como
enfermedad, es principalmente en pases tropicales en vas de desarrollo, donde impone una gran carga
econmica en estos pases tanto como en el mundo. No se nos olvide que antes de la mitad del siglo
pasado, antes de la iniciativa de la OMS de erradicar la malaria, esta enfermedad se poda adquirir en
lugares de Europa como Italia y en Estados Unidos de Amrica. En este momento est confinada a pases
en vas de desarrollo. Hay un inters renovado en el control y la eliminacin de la malaria. Como parte
de los logros del milenio, se ha propuesto reducir el nmero de casos y muertes reportadas para el ao
2000, en un 50% para el ao 2010 que ya pas y actualmente reducir el nmero de casos en un 75% o
ms para el ao 2015. Desafortunadamente estamos an lejos de lograr estas metas. Para el ao 2009 el
nmero de casos de malaria, se estim en 225 millones que est dentro del rango esperado de los
ltimos 10 aos y el nmero de muertes para este mismo ao, se estim en 781 mil casos que
representa un decremento significativo de los aos previos. Por ejemplo, para el ao 2000 hubo 985 mil
casos.
Diapositiva 9: Para una breve revisin de lo que es la enfermedad, recordemos que la malaria es
transmitida por el mosquito Anopheles, que se encuentra principalmente en reas templadas y clidas.
Hay cuatro especies de Plasmodium que infectan exclusivamente humanos. En orden de incidencia e
importancia epidemiolgica estn: P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malarie. Hay que recordar que el
Plasmodium tiene un ciclo tisular en el hgado que es muy importante para P. vivax y P. ovale debido a
que estos parsitos presentan estadios de latencia llamados hipnozoitos, que son los responsables de
recrudescencias cuando no se tratan adecuadamente con Primaquina y se deben tener en cuenta al
momento de evaluar y manejar estos pacientes. El ciclo eritrocitario explica los sntomas clnicos de la
enfermedad. Cuando los parsitos completan cada ciclo, hay liberacin de citocinas, de contenido de
parsitos que es lo que genera lo que se conoce como paroxismos malricos. Tambin es importante
tener en cuenta que los parsitos de la malaria presentan estadios de maduracin que son
morfolgicamente distintos y esto permite hacer un diagnstico parasitolgico por microscopa y puede
tener algunas implicaciones en el diagnstico por citometra de flujo como veremos ms adelante.
Diapositiva 10: A continuacin har una breve revisin sobre los mtodos diagnsticos de malaria.
Diapositiva 11: Primero, la presentacin clnica es poco confiable. Se habla de una presentacin clsica
de la malaria, pero en realidad la presentacin es variable. Hay que tener en cuenta dos situaciones para
la presentacin clnica. La primera es la parasitemia o carga de parsitos que el paciente tiene y la otra
es la inmunidad del paciente hacia la malaria. Pacientes con alguna inmunidad tienden a presentar
parasitemias mayores y menos sntomas. Requieren muchos ms parsitos para presentar sntomas y
pueden tener infecciones un poco ms crnicas. Los sntomas de malaria severa con manifestaciones
severas de la misma, tienden a ser menores. El caso contrario, pacientes sin inmunidad, pacientes que
pueden ser turistas en zonas endmicas por ejemplo, que son infectados por el parsito, tienden a
presentar sntomas con parasitemias menores y hacer manifestaciones de malaria severa ms
fcilmente. Tambin puede haber la situacin de co-infeccin, por ejemplo el caso de neumona e
infecciones de vas respiratorias altas que confunden las manifestaciones de la malaria y pueden ser
difciles de distinguir. Tambin malaria mixta donde hay usualmente dos especies de Plasmodium como
falciparum y vivax que estn en un mismo husped y pueden generar patrones de fiebre o picos febriles
complejos e incluso fiebres continuas y otros casos donde hay varias cepas de una sola especie de
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Plasmodium por ejemplo P. falciparum que infecta en diferentes momentos y genera frecuencias o
patrones de fiebre complejos y lo cual hace difcil distinguirlo desde un punto de vista clnico.
La probabilidad pre prueba para malaria tambin va a influenciar la consideracin clnica de la
enfermedad. Es diferente evaluar un paciente que viene de la zona endmica que sabemos que si tiene
fiebre es posible que tenga malaria. A estos pacientes generalmente se les pide una gota gruesa rpido y
el diagnstico se hace ms fcil. Ahora, pacientes que vienen de zonas no endmicas, puede ser ms
difcil sospecharlo y ms an si no han viajado recientemente a zonas endmicas, el diagnstico se
puede obviar y estos pacientes pueden ser diagnosticados ms tardamente.
Los pacientes de zona no endmica que en algn momento viajaron a una zona endmica, tuvieron la
enfermedad y fue manejada en ese momento y por alguna circunstancia no se les dio el tratamiento
adecuado; pudieron haber tenido un aclaramiento de la enfermedad y la resolucin de los sntomas.
Estos pacientes pueden presentar una recrudescencia de la enfermedad, dada por los hipnozoitos,
estadios latentes de Plasmodium vivax que estn en el hgado, que meses o incluso aos despus,
pueden generar manifestaciones clnicas de la malaria. Por eso, estos diagnsticos se pueden escapar si
uno no los considera en pacientes que provienen de zonas no endmicas y que han viajado a zonas
endmicas as sea hace varios aos. Por eso, la clave para el diagnstico es tener un alto grado de
sospecha y siempre interrogar sobre viajes, as sea recientes o no recientes de aos anteriores. Sin
embargo, siempre va a haber error en la prctica clnica. Es muy difcil que estos diagnsticos sean
detectados en todos los casos. Debemos tener estrategias para manejar esto.
Diapositiva 12: Sobre el diagnstico de laboratorio para la malaria, mencionar que la microscopa ha
sido el mtodo de diagnstico estndar por ms de 100 aos. Hay dos formas de hacerlo. La primera es
la gota gruesa que concentra la muestra por un factor de 20 a 30 capas, favoreciendo as la sensibilidad
analtica del mtodo. Sin embargo la morfologa de las especies de malaria se puede ver alterada y eso
dificultar el diagnstico parasitolgico y especie por el personal poco entrenado. El frotis de sangre
delgada, no concentra la muestra pero es el mtodo preferido para diagnosticar e identificar la especie y
el estadio de la especie que infecta al paciente. El lmite inferior de deteccin de la gota gruesa est en
un rango entre 4 y 100 parsitos por microlitro y su sensibilidad diagnstica est entre 60% y 98% y su
especificidad entre el 85% y 99%. Estos rangos dependen principalmente de la experiencia del
microscopista que est haciendo el procedimiento. El acuerdo inter observador tambin vara de
estudio a estudio. Este estudio reportaba 88%. Otro problema con este mtodo diagnstico es que toma
tiempo, aproximadamente 10 minutos para evaluar los 200 campos que se deben evaluar como mnimo.
Esto puede ser un problema en centros o laboratorios en zonas urbanas donde hay un alto flujo de
muestras. Otros mtodos diagnsticos son las pruebas rpidas, que son mtodos basados en
inmunocromatografa que detectan antgenos del Plasmodium. Los ms conocidos son: la protena rica
en histidina 2, la LDH del Plasmodium y la aldolasa. Las pruebas rpidas de diagnstico actualmente son
la estrategia ms importante para el diagnstico junto con la microscopia impulsadas por la OMS y
tienen gran utilidad en zonas donde el acceso a microscopa es limitado. La reaccin en cadena de la
polimerasa en aos recientes, se ha convertido en un importante mtodo diagnstico, probablemente el
ms sensible de todos. En algunos casos se le llama el estndar de oro en investigacin. Cuando se ha
comparado la microscopia con PCR, se ha encontrado que la sensibilidad de la microscopa puede
disminuir en un 50%. Otros mtodos de diagnstico como la microscopa por fluorescencia, buffy coat
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cuantitativo o la serologa, son rara vez utilizados en el laboratorio de rutina y son usados ms como
mtodos de investigacin o en estudios epidemiolgicos.
Diapositiva 13: Las implicaciones para el manejo del diagnstico son varias. Aqu mencionar las ms
importantes. Primero, es que el tratamiento es especfico por especie. Para P. falciparum debemos
tener en cuenta que la gran mayora de las cepas de P. falciparum son resistentes a la cloroquina. Al
tratamiento actual se le conoce como terapia combinada a base de Artemisinina o ACT que es ms
costoso. Por eso se debe hacer un diagnstico adecuado para poder dar los tratamientos a quienes lo
necesitan. Hay un lmite de costo en esta situacin. En el manejo de P. vivax y P. ovale, se debe tener en
cuenta la situacin de los hipnozoitos y se les debe administrar Primaquina por 14 das. Tambin se
deben tener en cuenta los casos de malaria mixta, donde el tratamiento se debe dar para las dos o ms
especies infectantes y as prevenir ya sea malaria severa por falciparum o permanencia de hipnozoitos
por P. vivax o P. ovale. Cabe mencionar que el diagnstico de malaria mixta no es fcil, requiere
personal altamente entrenado para esto y muchas veces utilizar PCR. El diagnstico retardado de
cualquier enfermedad, incluida la malaria, necesariamente tendr complicaciones, aumento de la
mortalidad y un peor pronstico. Un ejemplo de esto es un estudio hecho sobre mortalidad en viajeros
que retornaban a Estados Unidos que haban sido infectados por malaria publicado en el 2004 y que
recopil datos desde 1963 hasta el 2001. Encontraron que el 67.8% de los pacientes no fueron
diagnosticados en la primera visita y que de todos los casos que hubo de mortalidad, el 17.9% fueron
diagnosticados en la autopsia. El error que existe alrededor del diagnstico de malaria es alto. No se est
considerando la enfermedad y nos hace pensar cmo podemos detectarla de forma ms temprana.
Cabe mencionar que el diagnstico es importante porque el manejo de la enfermedad y el pronstico
van a depender de lo rpido y adecuado que se haga esto.
Diapositiva 14: Comenzar a hablar sobre el posible diagnstico de malaria con auto analizadores de
hematologa basados en citometra de flujo.
Diapositiva 15: La deteccin de malaria por citometra de flujo utiliza varios mtodos. Puede usar
marcacin de cidos nucleicos con fluorescencia, como se muestra aqu, o los patrones de dispersin de
luz generados por la presencia de hemozoina o el tamao de los parsitos. Este mtodo de deteccin,
tiene una alta sensibilidad analtica por ejemplo para los auto analizadores Sysmex. Estos grafican
aproximadamente 32 mil eventos por anlisis y deteccin con citometra de flujo experimental, se han
podido hacer detecciones de parasitemias por debajo de 0.001%. Lo importante de la citometra de flujo
es que permite un diagnstico parasitolgico si el instrumento est bien calibrado para hacerlo. Algo
ms que se debe tener en cuenta, es que lo que detecta la citometra de flujo son corpsculos y las
caractersticas de stos que hay en la sangre. Por eso logra diferenciar leucocitos, eritrocitos y
plaquetas. Los parsitos tambin son corpsculos, tienen caractersticas propias como cromatina,
hemozoina y tamao que generan un patrn particular en citometra de flujo. Esto se puede aprovechar
para el diagnstico.
Diapositiva 16: Antes de continuar con la presentacin, mencionar algunos hallazgos de malaria
utilizando auto analizadores que vienen de unos aos atrs. Las alteraciones conocidas en el
hemograma encontradas en pacientes con malaria son la trombocitopenia y anemia. En nuestro estudio
encontramos que la trombocitopenia tena una sensibilidad del 60% y una especificidad del 82% y para
la anemia una sensibilidad del 43% y una especificidad del 79% para el diagnstico de malaria. Estos
hallazgos carecen de la suficiente especificidad o sensibilidad para diagnosticar malaria y de forma
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aislada no seran muy tiles. Desde los aos 90s se han publicado mltiples casos con varios auto
analizadores donde se reportan hallazgos asociados a malaria o alteraciones en las mediciones normales
del auto analizador producidas por parsitos de malaria. Un caso que fue publicado en 1992 reporta la
aparicin de pseudoreticulocitosis de 5.59% con un analizador R-1000 de Sysmex. Tambin se han
reportado picos extras en los histogramas de glbulos blancos, de las plaquetas y de los eritrocitos. Aqu
muestro los histogramas de un equipo Sysmex para plaquetas. El de arriba es un histograma de un
paciente sano y el de abajo, es el histograma de un paciente con P. falciparum. Pueden observar que los
dos histogramas son muy diferentes y que el de P. falciparum muestra mltiples picos. Son histogramas
en general errticos. Para los auto-analizadores Cell-Dyn se ha reportado la aparicin de eventos en uno
de esos dispersogramas con altos valores de dispersin lateral de luz despolarizada. Son los eventos en
color morado mostrados en el dispersograma de la derecha. Bsicamente son monocitos que tienen
valores de lobularidad como un monocito pero que generan seales de alta dispersin lateral como si
fueran eosinfilos. Se piensa que la dispersin lateral se genera por la hemozoina como mostrar a
continuacin. Se sabe que muchos de los eventos anormales generados por la malaria en mltiples auto
analizadores, son producto de la presencia de hemozoina dentro del parsito o dentro de macrfagos
que han fagocitado estos cristales. Recordemos que el parsito digiere la hemoglobina y se produce algo
conocido como la alfa hematina, que es un producto que ejerce un estrs oxidativo sobre el parsito
adems de ser txico. El parsito, para evitar ser destruido por esta sustancia, produce los cristales de
hemozoina que tambin se conoce como beta hematina. Estos cristales de hemozoina se pueden
observar por microscopia como inclusiones color mbar o negras dentro de macrfagos o dentro de
parsitos y se van acumulando en la vacuola del parsito a medida que este madura. Los cristales de
hemozoina, como la mayora de los cristales, tienen una propiedad de anisotropa. Esto causa un
fenmeno de birrefringencia cuando un haz de luz impacta sobre ellos. En los citmetros se ha
encontrado que generan una seal de luz despolarizada lateral alta como consecuencia de su
anisotropa y esta es la base por la cual se pueden detectar estos cristales por citometra de flujo.
Diapositiva 17: Aqu presento un estudio que mostr esto. En el panel 2, estn las poblaciones de
leucocitos y en la regin superior izquierda est libre de eventos. Si vemos el dispersograma 1, los
eventos de malaria se empiezan a verse en la regin marcada como R1 o PMC. Segn los parmetros
para este dispersograma, estos eventos corresponden a eventos de tamao similar o caractersticas del
ncleo similar a monocitos pero con patrones de dispersin lateral de luz despolarizada similares a
eosinfilos o incluso mayor. Se ha encontrado que estos eventos corresponden a la imagen o clula que
se muestra a la izquierda que es un monocito con un cristal de hemozoina como lo pueden observar en
color caf oscuro.
Diapositiva 18: Para el auto analizador XE-2100 de Sysmex, estos son los primeros reportes de casos que
se dieron a conocer. Ambos reportaban el fenmeno de pseudoeosinofilia y dispersogramas del
diferencial alterados como se muestra aqu. El dispersograma del diferencial, como ustedes saben,
separa los linfocitos en color rosa, los monocitos en color verde, los neutrfilos en color azul cielo y los
eosinfilos en color rojo, basado en mediciones de dispersin lateral y fluorescencia. Podemos ver aqu
sealado que hay dos grupos de eosinfilos. Este es un paciente con malaria por P. vivax en donde se
generan dos grupos de eosinfilos. Los autores pensaban que estos eventos podan ser producidos por
neutrfilos que haban fagocitado hemozoina y que estaban generando seales de dispersin lateral alta
por la hemozoina que estaba dentro de ellos, generando as el grupo de eosinfilos dobles. Ambos casos
fueron publicados en Corea e incluyeron pocos pacientes.
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Diapositiva 19: Para el ao 2008 se publica el primer estudio grande de desempeo diagnstico tambin
en Corea, titulado Deteccin de malaria con el XE-2100 de Sysmex utilizando pseudoeosinofilia y un
dispersograma anormal del diferencial. En el panel central podemos ver las caractersticas del estudio
que incluy 463 pacientes de los cuales 144 tenan malaria por P. vivax y el grupo control tena 242
pacientes con fiebre y 77 con bacteremia. Su definicin de malaria detectada por el Sysmex fue:
pseudoeosinofilia mayor del 5% y/o un dispersograma anormal del diferencial. Compararon estos
hallazgos con microscopia que fue su estndar de oro. Encontraron que la sensibilidad fue del 69.4% y la
especificidad del 100% en presencia de uno o ambos de estos dos hallazgos. En el panel inferior
podemos ver el desempeo para cada uno de estos parmetros de forma independiente. Para
pseudoeosinofilia sola, su sensibilidad fue del 38.9% y su especificidad se mantuvo en un 100% como se
indica en la columna en rojo. Para la alteracin en el diferencial la sensibilidad fue del 52.1% y tambin
se mantuvo su especificidad en 100%.
Diapositiva 20: Este es un ejemplo de las alteraciones encontradas en el dispersograma del diferencial
obtenidas del estudio de Huh en Corea. Podemos ver un dispersograma normal marcado con la letra A
con las poblaciones de glbulos blancos bien diferenciados. Las otras imgenes muestran
dispersogramas de pacientes con Plasmodium vivax. Podemos ver que todas las alteraciones se
encuentran en la zona de granulocitos y son relativamente variables. Por ejemplo hay fusin de los
grupos de neutrfilos y eosinfilos. Hay codificacin con diferente color por ejemplo el gris como vemos
en la figura B o todo azul en la figura E, hay aparicin de grupos dobles de eosinfilos y neutrfilos
como podemos ver en la figura C y la fusin de todos los grupos como se puede ver en casi todos los
pacientes con Plasmodium vivax. Tambin notemos que las alteraciones asociadas a malaria aparecen
en el rango inferior de fluorescencia lateral. Si vemos, casi todos estos eventos tienen valores de
fluorescencia lateral muy bajos, mucho ms bajos de los que uno esperara para los granulocitos si lo
comparamos con los normales. Es especialmente evidente en la figura B que es un grupo gris en la parte
inferior del grupo principal de granulocitos.
Diapositiva 21: Dos aos ms tarde tambin en Corea, Yoo y compaa condujo un estudio basado a
nivel poblacional para probar el desempeo diagnstico de los parmetros ya mencionados en el
estudio de Huh. Podemos observar las caractersticas del estudio en el panel central. Un total de 1801
pacientes de los cuales 413 tenan malaria por Plasmodium vivax y el grupo control al parecer estuvo
compuesto por un grupo mixto de muestras de pacientes que atendan al hospital Ilsan que es donde se
hizo el estudio. Evaluaron los criterios propuestos por Huh que fue ms de 5% de eosinofilia o
alteraciones en el diferencial y lo compararon contra microscopa o PCR como diagnstico estndar de
malaria. El diagnstico de malaria por estos criterios en este estudio mostr una especificidad similar a
estudios anteriores cerca al 100% y una sensibilidad que baj al 46.2%. En el panel inferior podemos ver
los dos criterios utilizados y su desempeo. Para la pseudoeosinofilia su desempeo permaneci muy
similar al estudio anterior con 39% de sensibilidad y 100% de especificidad. Sin embargo para el
dispersograma del diferencial, la sensibilidad cay de un 52% en el estudio de Huh a un 15% en el
estudio de Yoo. La especificidad se mantuvo cercana al 100%. Qu puede explicar esta discrepancia?
Existen varias posibilidades. Es un hecho que la variable definida como anormalidad en el dispersograma
del diferencial, carece an o careca en ese momento, de consenso y esas anormalidades son evaluadas
por observadores humanos y puede haber sesgo de observador en estas evaluaciones. Una posibilidad
es que la sensibilidad reportada en el estudio de Yoo sea debida a que el personal que evalu los
dispersogramas fuera menos entrenado que en el estudio de Huh. Otra es que hayan utilizado
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criterios mucho ms estrictos que hayan provocado que muchos pacientes no hayan sido clasificados
como pacientes con malaria basados en este criterio. De manera contraria, las evaluaciones en el
estudio de Huh pudieron haber sido ms liberales y muchos pacientes haber sido diagnosticados con
malaria basados en este criterio del diferencial ms fcilmente. Si observamos el panel inferior,
podemos ver la probabilidad predictiva positiva y negativa de la prueba. La probabilidad predictiva
positiva es buena e indica que una muestra que salga positiva, muy probablemente vendr de un
paciente que tenga malaria. Ahora, valor predictivo negativo carece an la magnitud para hacer de sta
una prueba tamiz e indica que aproximadamente el 14% de las muestras negativas no sern
diagnosticadas adecuadamente con malaria.
Diapositiva 22: Qu aportan estos estudios realizados en Corea? Primero y lo ms importante es que
nos muestran la capacidad del auto analizador XE-2100 para detectar malaria, en este caso con el uso de
la pseudoeosinofilia o alteraciones en el rea de granulocitos del dispersograma del diferencial. Tambin
debemos aprender de estos estudios que podemos mejorar para trabajos futuros como el que hicimos
en Colombia. Lo primero es que debemos lograr un consenso en la definicin de lo que significa tener
alteraciones en el diferencial asociadas a malaria, debemos definir esto bien. Lo segundo es que
debemos garantizar que la evaluacin de los dispersogramas se haga de forma enmascarada para evitar
posibles sesgos de revisin, lo cual hicimos en Colombia. Debemos ver que tan reproducible es la
evaluacin de estos dispersogramas a travs de diferentes personas y ver cmo integrar este mtodo o
esta forma de evaluar dispersogramas para detectar malaria dentro de la rutina normal de un
laboratorio. En cuanto a la pseudoeosinofilia, cabe mencionar que requiere microscopia, que una forma
para darnos cuenta si hay pseudoeosinofilia es a travs de las alarmas que el instrumento ya tiene. Por
ejemplo las alarmas de eosinofilia o las alarmas de anormalidades en los dispersogramas de los
leucocitos. Los autores en Corea, han mencionado que la pseudoeosinofilia mayor del 5% sirve para
diagnosticar malaria. En el estudio de Colombia encontramos que este porcentaje se acerca ms al 20%.
Estos hallazgos mencionados para los estudios hechos en Corea, aplican para Plasmodium vivax, que fue
la especie con la que ellos trabajaron. Nosotros hablaremos de P. falciparum en nuestros estudio.
Diapositiva 23: A continuacin les hablar de la experiencia de investigacin que tuvimos en Colombia
el diagnstico de malaria con el auto analizador XE-2100. El ttulo del artculo publicado donde se
muestra el producto de esta investigacin fue el diseo de criterios diagnsticos para malaria con el XE2100 fue un estudio realizado con el grupo de malaria de la Universidad de Antioquia y el Laboratorio
clnico hematolgico. Fue publicado en el ao 2010 en el American Journal of Tropical Medicine and
Hygiene. Nuestro objetivo fue desarrollar, validar y probar la exactitud diagnstica de varios modelos
diagnsticos para Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum. Quisimos desarrollar modelos que
dependieran del observador de forma similar a los estudios previos donde un observador evaluara los
dispersogramas. Pero tambin quisimos disear y evaluar modelos que no dependieran del observador,
es decir, que utilizaran variables numricas, ya sean del dispersograma o de los datos crudos obtenidos
del auto analizador.
Diapositiva 24: Para orientarlos hacia el lugar donde hicimos la investigacin, este es un mapa de
Colombia que se encuentra ubicada al norte de Sudamrica y en color rojo pueden observar el
departamento de Antioquia que es la regin poltica donde llevamos a cabo el estudio.
Diapositiva 25: Este es un mapa de Antioquia con el detalle de las cuatro municipalidades donde se
recolectaron las muestras que fueron Necocli, Turbo, El Bagre y Zaragoza. Estos 4 municipios son de alta
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incidencia de malaria, principalmente por Plasmodium vivax aunque tambin se encuentran casos de
Plasmodium falciparum especialmente en El Bagre. El laboratorio clnico hematolgico ubicado en
Medelln, que fue donde se analizaron las muestras con el XE-2100, est aproximadamente a 250 km sur
como se muestra en la parte baja del mapa. Todas las muestras fueron enviadas a este lugar por correo
areo rpido.
Diapositiva 26: Esta es una fotografa area de Necocli, la localidad en Urab donde se recolectaron la
mayor cantidad de muestras para el estudio. Tiene una poblacin de 48,679 habitantes con una
incidencia anual de Plasmodium vivax de 2634 casos y para Plasmodium falciparum de 246 casos. Esto
es para que tengan una idea del problema de la malaria en estas regiones.
Diapositiva 27: En esta diapositiva se muestra la estrategia o metodologa que empleamos para la
recoleccin de muestras y anlisis de datos. Este fue un estudio de corte transversal que significa que la
prueba que estamos evaluando, que es el diagnstico por Sysmex, se recolecta en el mismo momento
en que se hace el diagnstico de malaria. Es decir, la sangre que se obtiene en el tubo para evaluar por
el XE, se obtiene en el mismo momento que se hace la gota gruesa y no se hace ningn tipo de
seguimiento en los pacientes. Fue un estudio para evaluar una prueba diagnstica y se utiliz un
muestreo consecutivo. Es decir, se incluy todo paciente que fuera ingresando a los puestos de
diagnstico de malaria de forma consecutiva, es decir, a medida que llegaban, se incluan en el estudio.
Se hizo una seleccin de dos grupos como ms adelante explicar. Los grupos control fueron pareados
con el grupo de pacientes con malaria por edad, 6 aos, es decir, por cada paciente que tena malaria,
se inclua un control que tuviera la misma edad 6 aos. Por ejemplo si un paciente tena 20 aos,
incluamos un paciente en el grupo control que tuviera entre 14 y 26 aos. Esto lo hicimos con el fin de
tener poblaciones similares y controlar posibles confusores asociados a la edad. Utilizamos controles
febriles, esto porque queremos que la presentacin clnica de la malaria sea similar en el grupo control
con enfermedades que provoquen fiebre, mialgias, escalofros, similar a lo que uno puede esperar en un
paciente con malaria y que la forma de diferenciarlos sea por medio de una gota gruesa. Los pacientes
en este estudio tuvieron ms de 13 aos de edad para buscar que el hemograma fuera similar en todos
en trminos de edad, es decir, un hemograma esperado para un adulto o una persona biolgicamente
adulta. Para el anlisis primario incluimos 158 pacientes distribuidos de la siguiente manera: 65 en P.
vivax, 30 en P. falciparum, 63 pacientes febriles. Para el grupo control de validacin, utilizamos 161
pacientes. A la derecha est el diagrama de flujo que muestra como llevamos a cabo la seleccin de
pacientes. En el nmero 1 aparecen los pacientes que ingresan al puesto diagnstico de malaria en la
zona endmica. Se les hace una gota gruesa, si es positiva en el nmero 2 indicado en el diagrama, se
colocan dentro del grupo positivo para malaria, ya sea P. falciparum o P. vivax. Si fueron negativas,
indicado con el nmero 3, entonces se incluyen en el grupo de pacientes febriles. Ahora, para el grupo
de pacientes febriles solo incluimos a los pacientes que fueron remitidos por mdicos, con el fin de
lograr que los pacientes incluidos en el grupo febril en realidad tuvieran algn sndrome febril
considerado clnicamente y evitar meter en este grupo a pacientes que vena por voluntad propia al
puesto diagnstico de malaria y podan estar sanos, no haban tenido una evaluacin por un mdico. En
el nmero 4 se indica como a todas las muestras de sangre se analizan en el XE-2100. Posteriormente en
el nmero 5 se muestra como se hace el anlisis de datos para obtener los modelos que a continuacin
les mostrar. En el lado derecho se muestra la estrategia de validacin, donde el nmero 1 indica
muestras de pacientes sanos de una zona endmica y una zona no endmica, que luego fueron
combinadas con el 60% de las muestras de pacientes febriles que se recolectaron en la zona endmica.
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Eso por un solo grupo control de 161 pacientes que inclua: sanos de zona endmica, sanos de zona no
endmica y pacientes febriles de zona endmica. Este grupo control fue comparado con un grupo de
pacientes con malaria que fue seleccionado de un 60% del grupo inicial utilizando los anlisis primarios
del estudio. Este grupo se seleccion de un 60% con el fin de incluir algo de variabilidad en los anlisis y
verificar que el modelo siga siendo vlido a pesar de la variabilidad que generamos al incluir solamente
al 60% del grupo inicial. Esta variabilidad es importante porque nos permite concluir que no importa los
pacientes que yo ingrese, independientemente de si tienen valores extremos o no, cuando se valida el
modelo, dichos valores no van a modificar los parmetros obtenidos y su capacidad de predecir malaria,
va a continuar siendo muy similar; no se ver afectado por valores ni extremos ni bajos que me pueden
explicar un modelo que de inicio es bueno y luego en la validacin resulta no ser tan bueno.
Diapositiva 28: Esta tabla muestra que los grupos son similares. Aqu los grupos se ven en color verde
empezando con los grupos de malaria, Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum, el grupo de febriles
y el grupo de control compuesto. Al menos para las variables que hay aqu, que son sexo, edad, rea de
residencia, etnicidad y tiempo medio de evaluacin de la muestra, todos los grupos son similares. Esto
nos garantizar que en los anlisis, los resultados que obtengamos no van a ser producto ni de
diferencias en sexo, en edad, ni diferencias tnicas, ni diferencias en el tiempo de procesamiento de
muestras.
Diapositiva 29: Aqu comenzamos a ver el algoritmo por el cual nos guiamos para hacer el anlisis de los
datos obtenidos del XE-2100 y luego la construccin de modelos para el diagnstico de malaria.
Diapositiva 30: Empezamos con el nmero 1 que es la seleccin de variables para el desarrollo del
modelo.
Diapositiva 31: La estrategia que utilizamos para extraer variables de los dispersogramas, consisti en
tres fases. Inicialmente evaluamos 208 imgenes de manera abierta, es decir, sabamos el diagnstico
de los pacientes a los que correspondan las imgenes para tratar de ver que alteraciones se repetan en
los diferentes dispersogramas y empezar a tener una idea de las zonas que delimitaramos para clasificar
estas variables. La segunda estrategia fue generar unas imgenes resumen que consista en sumar varias
imgenes de un solo grupo como lo mostrar ms adelante y la ltima estrategia que utilizamos fue
estas imgenes resumen, sobre expresar los pixeles que la componan y as tener una mejor idea de las
regiones donde estaban apareciendo las alteraciones asociadas a malaria.
Diapositiva 32: Aqu se muestran todos los dispersogramas obtenidos con un XE-2100. Son
dispersogramas obtenidos de un paciente febril y estn en trminos generales, normales.
Diapositiva 33: Esta diapositiva muestra 3 dispersogramas de un paciente con Plasmodium vivax. Son los
3 dispersogramas que muestran la mayora de alteraciones, el del diferencial, WBC/BASO y el RET-EXT.
De ahora en adelante me referir solo a estos 3 dispersogramas, pues como ya mencionaba, son los que
ms alteraciones muestran. Aqu podemos ver alteraciones en el diferencial con fusin de los grupos de
granulocitos donde se ve un cambio a eventos grises, eventos en la zona baja de fluorescencia en el
dispersograma WBC/BASO podemos ver la aparicin de un grupo de eventos azules en la parte baja del
rango de fluorescencia lateral y hacia el centro del rea de la dispersin lateral de luz. En el RET-EXT
vemos eventos grises con un patrn lineal que tienen valores de fluorescencia lateral alta y con
dispersin frontal baja similar a las plaquetas.
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Diapositiva 34: La segunda estrategia que utilizamos se muestra en esta dispositiva. Consiste en la
construccin de imgenes resumen para cada grupo incluido en el estudio. Para esto utilizamos
Photoshop CS3 y lo que hicimos fue con cada imagen para cada paciente de los dispersogramas
obtenidos, generamos una capa a la cual asignbamos un 2% de opacidad. Luego sobreponamos 50
capas de 50 pacientes, perfectamente una encima de otra de un 2% de opacidad. Esto generaba una
imagen que sumaba un 100% de opacidad, una imagen compuesta para ese grupo de pacientes. Una
imagen compuesta para pacientes con P. vivax, con P. falciparum, febriles y pacientes sanos. Esto est
representado en la imagen con las flechas amarillas que muestra como se sumaran esas 50 imgenes.
Diapositiva 35: Estas son las imgenes resumen obtenidas para el grupo de pacientes febriles. Noten
que los grupos de clulas aparecen con menos pixeles, aparecen con mejor resolucin. Esto es debido a
que estamos viendo una imagen compuesta de 50 pacientes. La suma de pixeles en cada una de estas
zonas, es lo que genera las imgenes.
Diapositiva 36: Esta es la imagen resumen obtenida para el grupo de pacientes con P. vivax.
Inmediatamente podemos ver la aparicin de anormalidades en el diferencial con fusin de los grupos
de granulocitos, aparicin de grupos dobles de neutrfilos y eosinfilos como lo indican las flechas y
aparicin de eventos en la zona baja de fluorescencia. Tambin vemos la aparicin de eventos azules en
el dispersograma WBC/BASO que ya haban sido vistos en el anlisis abierto de las imgenes. Para el
RET-EXT el grupo de eventos grises que habamos mostrado previamente no se ve fcilmente. La
explicacin para esto es que los eventos en esta zona son ms dispersos y la suma de pixeles para estos
eventos dispersos, es menos probable. Es menos probable que los pixeles se antepongan uno sobre otro
y generen una imagen compuesta. Por eso en la imagen resumen no es fcil verlos. Para esto
requerimos una nueva estrategia que fue la tercera y que consisti en la creacin de la imagen resumen
con edicin de niveles donde se expresaban todos los pixeles contenidos en las 50 imgenes que
componan la imagen resumen inicial.
Diapositiva 37: Aqu pueden ver la imagen resumen con niveles editados para el grupo febril que
muestra gran nmero de pixeles en todos los dispersogramas. Para el caso del dispersograma RET-EXT,
la parte que est marcada con el crculo, muestra donde estaran los eventos que esperaramos para P.
vivax. Hay relativamente pocos eventos.
Diapositiva 38: Aqu podemos ver la imagen resumen con niveles editados para Plasmodium vivax e
inmediatamente salta a la luz que en todos los dispersogramas se muestran mucho ms eventos en
trminos generales, independientemente del rea, incluyendo la parte donde apareceran los linfocitos
atpicos en el diferencial que es la parte color magenta con altos niveles de fluorescencia, la zona de
granulocitos indicada con la flecha donde hay una fusin de los grupos de neutrfilos y eosinfilos, un
cambio de color por los grupos grises que aparecen frecuentemente y el aumento de eventos en la zona
baja de fluorescencia. El grupo azul en el WBC/BASO lo mismo, un aumento de pixeles en general en
este dispersograma tambin y la aparicin de eventos grises en la zona indicada por el crculo que se
asocian a malaria y que haban sido difciles de ver en la imagen resumen normal. Es de notar que el
aumento de pixeles en general en estos dispersogramas no es normal y debe indicar o debe llevar al que
est evaluando estos dispersogramas a considerar alguna patologa puede ser malaria y en este caso
deben evaluar el extendido de sangre perifrica.

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Diapositiva 39: Esta diapositiva muestra el resultado de estos anlisis que les acabo de mostrar y las
reas que finalmente delimitamos para las variables utilizadas en la construccin de modelos. Para las
variables categricas seleccionamos 17 de las cuales finalmente incluimos 10 en los modelos
diagnsticos y para las variables continuas o numricas, que fueron conteos de pixeles, seleccionamos 7
de las cuales solo una fue incluida en los modelos finales que fue la variable de conteo de pixeles en el
dispersograma WBC/BASO aqu indicada con el nmero III.
Diapositiva 40: Aqu se muestra la variable que corresponde al conteo de pixeles indicada con la flecha
roja en el dispersograma WBC/BASO. El conteo de pixeles en esta rea, estuvo significativamente
aumentado en el grupo de Plasmodium vivax. Esto lo podemos ver primero en el histograma de
distribucin de frecuencias para pixeles que ven a la derecha. Las barras azules indican pacientes
febriles, podemos ver que la mayora de ellos tienen menos de 10 pixeles. Las barras naranja son P.
vivax y vemos que la mayora de ellos tienen ms de 10 pixeles e incluso cientos de ellos. Para P.
falciparum tambin vemos que la mayora de ellos tienen menos de 10 pixeles pero algunos de ellos
tienen entre 10 y 20 pixeles. La tabla muestra la mediana para pixeles de cada grupo. Para el grupo febril
hubo una mediana de 2, para P. vivax una mediana de 63 y para P. falciparum una mediana de 4. Siendo
significativas las diferencias entre medianas para ambos grupos de pacientes con malaria y pacientes
febriles aqu indicado en las celdas verdes. La sensibilidad para diagnstico de P. vivax con esta variable
teniendo en cuenta ms de 7 pixeles en esta rea, fue de 96.8 % y una especificidad del 93.9%.
Diapositiva 41: Esta diapositiva muestra la siguiente fase del anlisis de datos y consecucin de variables
indicado con el nmero 3. Fueron las variables numricas obtenidas directamente del XE-2100,
inicialmente fueron 115 y fueron obtenidas utilizando el software T-converter. De estas 115 finalmente
evaluamos 45 que consideramos eran importantes para el anlisis como les mostrar a continuacin.
Diapositiva 42: Aqu podemos ver una versin simplificada de la forma en que analizamos los datos y
desarrollamos los modelos de diagnstico para malaria. Para esto utilizamos un mtodo de anlisis
conocido como regresin logstica para modelar las variables obtenidas del XE-2100. Los detalles de este
mtodo estadstico, estn ms all de esta presentacin y para aquellos interesados en ver como se hizo
el anlisis de estos datos, pueden encontrar en el artculo publicado o en la literatura que hay al
respecto. Es suficiente mencionar aqu que estos modelos combinan varias variables, en este caso, las
del XE, para obtener una probabilidad de malaria. Estas variables pueden ser una o varias y la
probabilidad de malaria obtenida estar entre 0 y 1. Luego, para definir positivo o negativo para malaria,
obtenemos un punto de corte ptimo para esa probabilidad utilizando un anlisis de curva ROC. Una vez
establecido el punto de corte, analizamos el desempeo diagnstico para positivo o negativo para
malaria segn este criterio de corte y obtenemos las medidas de desempeo diagnstico respectivas.
Diapositiva 43: Aqu vemos el modelo observador-dependiente para P. vivax, que consiste en la
capacidad de detectar malaria visualmente con los dispersogramas que sabemos muestran las
alteraciones asociadas a malaria, en este caso el diferencial, WBC/BASO y el RET-EXT. Podemos ver las
alteraciones ya mencionadas fusin del grupo de granulocitos en el diferencial, cambio de color de estos
eventos, muchas veces al gris, aumento de los eventos en el rango bajo de fluorescencia en el caso del
dispersograma WBC/BASO la aparicin del grupo de eventos azules y en el RET-EXT estamos viendo los
eventos grises con patrones lineales y altos valores de fluorescencia. La capacidad de diferenciar malaria
utilizando la inspeccin visual de estos dispersogramas en nuestro estudio, tuvo una reproducibilidad
buena. Se muestra que tuvo un kappa inter evaluador de 0.92 que es muy alto si consideramos que
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basta con tener 1.0 y el desempeo diagnstico de este criterio fue el siguiente: una sensibilidad del
96.9% y una especificidad de 93.6% para diferenciar malaria simplemente al evaluar de forma visual
estos dispersogramas
Diapositiva 44: Esta diapositiva muestra otro modelo observador-dependiente denominado el score
malrico. Para obtenerlo se obtuvo con las variables categricas de los dispersogramas modelamos a
travs de la regresin logstica la probabilidad de tener o no malaria. Las variables que fueron incluidas
aqu fueron 10 del dispersograma del diferencial, es decir, presencia o ausencia de ciertas alteraciones
que a continuacin les mostrar y la presencia de 7 o ms pixeles en el rea de conteo en el
dispersograma WBC/BASO. Si el score o puntaje era mayor de 4, la muestra sera clasificada como con
malaria. En este caso la alteracin en el diferencial cada una da un punto y la alteracin en el WBC/BASO
da 3 puntos. Cualquier combinacin que sume 4 es positiva para malaria. La sensibilidad de este score
malrico es de 95.4% y la especificidad de 95.2%.
Diapositiva 45: Este es un ejemplo de cmo se aplicara el score malrico. En la parte baja donde dice
gua, se muestran los lmites donde uno encontrara las alteraciones en el diferencial asociadas a
malaria. Hay una lnea o un lmite verde, hay otros lmites blancos y unos nmeros. Cada nmero de
estos corresponde a los nmeros que estn en la parte de encima que van de 1 a 10; cada nmero
explica una alteracin en el diferencial. Al lado derecho donde dice gua, dice febril, esta es la imagen
resumen del grupo febril sobrepuesta con la gua para las alteraciones. Podemos ver que el grupo de
granulocitos, en este caso neutrfilos y eosinfilos, se encuentran dentro de estos lmites. Cuando
cualquiera de estos grupos se sale de los lmites, empezamos a tener alteraciones asociadas a malaria,
que es lo que se describe en los nmeros del 1 al 10 en la lista superior. Lo que vemos a la derecha son
tres casos de Plasmodium vivax donde se aplica el score malrico. A continuacin mencionar las
alteraciones ms evidentes sin aplicar punto por punto el score malrico que ya ha sido calculado para
cada uno de ellos. El primer caso present 9 anormalidades en el dispersograma del diferencial. La ms
llamativa siendo el cambio de color a gris de los granulocitos, la fusin de todo el grupo de granulocitos
y tenemos tambin la aparicin de un gran nmero de eventos azules en el dispersograma WBC/BASO.
Este paciente tendra ms de 4 puntos en el score malrico y sera positivo para malaria. En el caso
nmero dos podemos observar que tiene 5 anormalidades. Las ms llamativas en este caso son el
cambio de color en el grupo de neutrfilos y la tendencia a fusionarse los grupos de neutrfilos y
eosinfilos; lo mismo en el WBC/BASO tambin hay un aumento de pixeles azules oscuro. Este paciente
tambin tendra ms de 4 puntos en el score malrico y sera clasificado como positivo. El tercer
paciente presenta 9 anormalidades en el dispersograma del diferencial, la ms llamativa siendo la fusin
del grupo de granulocitos, el cambio de color para los neutrfilos y la aparicin de eventos en el rango
bajo de fluorescencia y en el dispersograma WBC/BASO tambin vemos la aparicin de un gran nmero
de eventos azules lo cual hara que este paciente tambin fuera clasificado como positivo por el score
malrico.
Diapositiva 46: A continuacin mostrar los modelos no observador-dependientes, mostrados con las
siglas N-OD. El primer modelo es el N-OD1 que utiliza solamente variables obtenidas del anlisis crudo
del XE-2100. Las variables incluidas en este modelo fueron el delta DIFF/WBC, el LYMPH-Y y el
plaquetocrito. El delta DIFF/WBC es la discrepancia entre el conteo de leucocitos en el canal del
diferencial y el canal WBC/BASO. El LYMPH-Y es la media de eventos codificados como linfocitos en el
eje Y del cual hubo un aumento en pacientes con Plasmodium vivax. El plaquetocrito es una medida de
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trombocitopenia que es de esperar en pacientes con Plasmodium vivax. A la derecha vemos un grfico
que muestra la capacidad de discriminacin de este modelo entre pacientes con Plasmodium vivax y
pacientes febriles. En este caso, los pacientes febriles aparecen como AFS. Aparece tambin en el grfico
el punto de corte establecido para el modelo para diferenciar entre pacientes positivos y negativos y
vemos que la capacidad de discriminacin del modelo es muy buena. La sensibilidad de este modelo fue
de 94.3% y la especificidad de 95.1%. El modelo N-OD2 utiliza variables nuevas que son los conteos de
pixeles en varias reas de los dispersogramas junto con variables ya obtenidas de los anlisis del XE2100. Las variables incluidas en este modelo para P. vivax fueron: el conteo de plaquetas pticas y el
conteo de pixeles en el rea de conteo del dispersograma WBC/BASO como ya se haba mostrado
previamente. La capacidad de discriminacin de este modelo, se muestra en la grfica de la derecha. Se
puede observar que tiene muy buena capacidad de discriminacin entre pacientes febriles y con P. vivax
si utilizamos el punto de corte mostrado aqu que es de 0.42. La sensibilidad de este modelo fue de
96.8% y la especificidad fue de 96.8%.
Diapositiva 47: Aqu se muestra la imagen resumen con niveles editados del diferencial, obtenida para
el grupo de pacientes febriles y podemos ver que hay un aumento en el nmero de pixeles en trminos
generales, sin embargo si lo comparamos con P. vivax.
Diapositiva 48: Aqu tenemos la imagen del grupo de P. vivax, la imagen resumen que muestra un
aumento significativo de pixeles mayor que el observado para el grupo de pacientes febriles y esto
podra explicar la discrepancia entre el conteo de leucocitos en el canal DIFF y el conteo de leucocitos en
el canal WBC/BASO. Esto debera producir una alarma en el equipo de dispersograma anormal de
leucocitos. La variable LYMPH-Y presenta un aumento en el nmero de eventos en la parte de valores
altos en el eje Y o de valores altos de fluorescencia lateral. Estos eventos produciran una seal de
Other que se podra ver en el instrumento. En la parte inferior se muestra el modelo N-OD2. Las
plaquetas pticas fueron utilizadas en este modelo pero cabe mencionar que las plaquetas medidas por
impedancia tambin pueden funcionar dentro de este modelo con ajustes leves para los parmetros del
modelo. Tambin se muestra con una flecha, la zona del conteo de WBC/BASO III.
Diapositiva 49: Estos son los modelos no observador-dependiente obtenidos para Plasmodium
falciparum. En el primer modelo, N-OD1, se incluyeron las variables: ancho de distribucin de
eritrocitos, LYMPH-Y similar a P. vivax y el conteo de plaquetas pticas. A la derecha vemos el grfico
donde se discrimina entre el grupo de P. falciparum y el grupo de febriles con un nivel de corte de 0.29
indicado por la lnea horizontal roja. La capacidad de discriminacin es buena, sin embargo no es tan
buena como Plasmodium vivax y la sensibilidad del modelo es de 93% y la especificidad de 81%. Para el
modelo N-OD2 para Plasmodium falciparum las variables obtenidas fueron el conteo de plaquetas
pticas que es de esperar por la trombocitopenia producida por la malaria, el ancho de distribucin que
sera producto de la anisocitosis que tambin sera de esperar en esta infeccin, y de nuevo el conteo de
pixeles en el rea especificada para el dispersograma WBC/BASO. A la derecha vemos la capacidad de
discriminacin de este modelo entre el grupo de pacientes con Plasmodium falciparum y los pacientes
febriles con un punto de corte de 0.37 indicado por la lnea horizontal roja. La sensibilidad de este
modelo fue de 86% y la especificidad fue del 90%. Es decir, mejora un poco con respecto al modelo NOD1 para Plasmodium falciparum, probablemente como producto de la inclusin de la variable del
conteo de pixeles en el WBC/BASO. Para aquellos interesados en la aplicacin de estos modelos, los
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Seminarios en espaol 2011

parmetros requeridos para el clculo de las probabilidades para malaria para cada uno de ellos, se
pueden encontrar en nuestro artculo y as podrn calcular estos modelos en sus laboratorios.
Diapositiva 50: A continuacin, unos ejemplos de cmo se aplicaran estos modelos. Aqu se muestra la
imagen de un paciente infectado con Plasmodium vivax y la aplicacin de los modelos observadordependientes. El primero sera el reconocimiento del patrn de Plasmodium vivax que es
inmediatamente evidente si observamos el dispersograma del diferencial con la aparicin de eventos
grises, fusin del grupo de granulocitos, luego el dispersograma de WBC con la aparicin de eventos
azules y el dispersograma RET-EXT con la aparicin de eventos grises en la parte de fluorescencia alta y
dispersin frontal baja. El score malrico para este paciente, fue de 3 puntos para la presencia de
eventos azules en el WBC/BASO y de 9 puntos para la aparicin de anormalidades en el DIFF. Ambos
criterios, ya sea el patrn de P. vivax o el score malrico, fueron positivos para este paciente.
Diapositiva 51: Esta es la aplicacin del modelo N-OD1 para Plasmodium vivax, es uno de los modelos
que proponemos en nuestro trabajo y como les mostr anteriormente, incluye 3 variables que son el
Delta DIFF/WBC, plaquetocrito y LYMPH-Y indicados con colores en la ecuacin del modelo.
Diapositiva 52: Si calculamos este modelo para este paciente en particular al obtener los valores
indicados con crculos de colores, para el Delta DIFF/WBC siendo 1486, para plaquetocrito sera 10 y
para LYMPH-Y sera 676, obtendramos que la probabilidad de malaria para este paciente sera 1, como
se puede ver en un crculo discontinuo a la izquierda. Esto estara por encima del lmite de corte para el
modelo que es de 0.42. Esto podra generar una alarma que llevara a observar al microscopio la
muestra y el resultado de esto, llevar a la toma de decisiones clnicas como el tratamiento del paciente.
Diapositiva 53: Esta es la aplicacin del segundo modelo para Plasmodium vivax, el N-OD2. Se observa la
ecuacin del modelo y las variables del conteo de plaquetas pticas y el conteo de pixeles en el rea
especificada en WBC/BASO. Del lado derecho observamos que el punto de corte es mayor a 0.42. Esta
es una grfica actual del modelo. En el eje X podemos observar que se encuentra el conteo de pixeles en
el WBC/BASO que va de 0 a 30, en el eje Z est el conteo de plaquetas que va de 0 a 400 y en el eje Y
est la probabilidad de P. vivax que va de 0 a 1.
Diapositiva 54: Este paciente en particular tuvo 8 pixeles en el rea de conteo del WBC/BASO y 160,000
plaquetas por el conteo ptico de las mismas.
Diapositiva 55: Observamos que la interseccin en el plano del modelo entre el conteo de pixeles y el
recuento de plaquetas, genera una probabilidad de prediccin para malaria de 0.65 indicada con la
flecha roja, que est por encima del valor de corte para el modelo que es de 0.42. En este caso, la
muestra podra ser llevada a microscopa y el diagnstico de malaria podra resultar de esto. Despus de
haber diseado estos modelos, surge la pregunta sobre el origen de estos eventos anormales que
estamos detectando con el XE-2100 de Sysmex y en especial que puede estar generando los eventos que
estamos viendo en los dispersogramas.
Diapositiva 56: Para esto hicimos algunos anlisis en nuestro trabajo. Fueron unos anlisis exploratorios
principalmente para tratar de determinar que podra estar generando estos eventos. Para el caso de la
variable LYMPH-Y, indicada con un crculo en el rea donde estn los eventos codificados como
linfocitos en color magenta, encontramos que haba una relacin significativa pero moderada, indicada
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con un R2 de 0.2 entre anillos y esquizontes de Plasmodium vivax y la presencia de estos eventos. No es
posible decir si son estas formas de parsitos las que generan los eventos o si es algn otro fenmeno
asociado a la presencia de estos eventos como por ejemplo la presencia de leucocitos cargados con
hemozoina que podra tener una relacin directa con las parasitemias de anillos. Es algo que habra que
explorar en otros trabajos. En la parte inferior observamos el nmero de anormalidades registradas en
el rea de granulocitos del diferencial. Estas anormalidades mostraron una correlacin moderada.
Podemos ver el R2 de 0.36 y significativamente explicada por la presencia de trofozoitos maduros. Esto
podra explicarse por la presencia de hemozoina que se empieza a acumular en los trofozoitos maduros
y podra estar generando una seal de dispersin lateral alta como se ha visto en otros trabajos. Los
eventos tienden a estar en un rango de fluorescencia baja y esto podra estar dado por la menor
cantidad de cromatina que tienen los parsitos en relacin a los leucocitos.
Diapositiva 57: Para los eventos encontrados en el rea de conteo de pixeles del WBC/BASO, hubo una
correlacin moderada indicada con un R2 de 0.4 y explicada principalmente por la presencia de
trofozoitos maduros y esquizontes. De nuevo, esto se puede explicar por la acumulacin de hemozoina
en estos parsitos maduros, que genera una seal de dispersin lateral relativamente alta comparada
con el resto de leucocitos que estn indicados en color azul cielo, que tienen una seal de dispersin
frontal relativamente baja que podra ser explicada por sus tamaos mucho ms pequeos que el de los
leucocitos.
Diapositiva 58: Para el RET-EXT hay una asociacin significativa mostrada con un R2 de 0.58 y la
presencia de trofozoitos maduros de Plasmodium vivax. Estos tienen cromatina y tamaos que pueden
oscilar entre un tamao similar al de un eritrocito o un tamao un poco menor al de un linfocito. Estas
dos caractersticas de los trofozoitos maduros pueden explicar la presencia de eventos en el RET-EXT,
que tienen valores altos de fluorescencia que pueden estar generados por la cromatina y tienen valores
de dispersin frontal, o sea tamao, similar a los eritrocitos o a plaquetas. En el caso de eritrocitos
pueden ser parsitos intraeritrocitarios. En el caso del tamao similar a plaquetas, pueden ser
fragmentos de parsitos que estn siendo detectados. Otra posibilidad, es que estos eventos sean
fragmentos de hemozoina o cristales de hemozoina libres que generen una seal que est siendo
detectada por el detector de fluorescencia lateral. Pero esta hiptesis todava hay que confirmarla.
Diapositiva 59: Qu hay sobre los macrfagos cargados con hemozoina y la deteccin de estos por el
XE-2100? Nosotros pensamos que es muy probable que estos macrfagos cargados con hemozoina
estn generando anormalidades que aparecen en el equipo Sysmex. Es probable que algunas de las
alteraciones que estamos viendo en el diferencial sean producto de estos eventos. Por ejemplo, el
aumento en el LYMPH-Y pensamos que podra ser producto de estos eventos ya que stos, tienden a
tener un poco ms de dispersin lateral que sera explicada por la presencia de hemozoina en los
monocitos. Sin embargo, solo son especulaciones y habra que hacer trabajos especialmente diseados
para determinar la presencia o ausencia de estos eventos en estas reas de los dispersogramas.
Diapositiva 60: Esta diapositiva muestra un caso especial que tuvimos en nuestro trabajo que nos da
todava ms informacin sobre la posible naturaleza de los eventos detectados en el DIFF. Es el caso de
un paciente que tuvo malaria por Plasmodium falciparum y mostr alteraciones en el DIFF similares a
Plasmodium vivax. Ningn otro de los pacientes con Plasmodium falciparum mostr alteraciones de este
tipo. La caracterstica de este paciente es que a diferencia del resto del grupo, este paciente tena 1613
gametocitos por microlitro comparado con la moda del grupo que era de 0. Esto nos lleva a pensar que
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Seminarios en espaol 2011

los eventos en esta zona, probablemente son producto de la alta gametocitemia que tena este paciente
y concuerda con lo que habamos encontrado para P. vivax. Son parsitos maduros ricos en hemozoina
que bien pueden estar generando una seal de dispersin lateral como la que se observa aqu, similar a
lo que hemos encontrado en Plasmodium vivax y trofozoitos maduros y esquizontes.
Diapositiva 61: Para comenzar a finalizar, comentar algunas posibilidades que esta estrategia de
diagnstico de malaria puede tener.
Diapositiva 62: La deteccin de malaria a prueba de fallas es una aplicacin interesante de esta
estrategia de deteccin de malaria. La ley de Murphy establece que cualquier cosa que pueda salir mal,
saldr mal. En este caso el equipo mdico puede fallar si un diagnstico de malaria no es considerado,
no se solicita la gota gruesa para su diagnstico y puede haber complicaciones derivadas de esto. Una
estrategia de deteccin oportuna que proponemos, es la implementacin de alarmas de malaria a
futuro. Sin embargo para poder hacer esto, se requiere que estas alarmas sean validadas en una
poblacin con mltiples patologas y logre diferenciar realmente, entre la presencia de malaria y otras
patologas que usualmente generan alarmas como neoplasias u otras infecciones y de esta forma, hacer
que la alarma sea eficiente en la deteccin de la malaria. Se report un caso en el 2007 en Hungra,
publicado en el Journal de Sysmex de la deteccin de un paciente con malaria mixta por P. vivax y P.
malariae que fue detectado accidentalmente por el hallazgo de alteraciones en el dispersograma DIFF y
que derivado de esto se realiz un examen de gota gruesa y se le diagnostic malaria oportunamente.
Diapositiva 63: Para concluir, debemos tener en cuenta que un diagnstico parasitolgico oportuno
para malaria es vital y va a determinar un manejo adecuado y disminucin de las complicaciones. Esto es
lo que nos lleva a disear este tipo de estrategias de diagnstico de malaria. Hemos encontrado que la
deteccin de malaria por medio de mltiples auto analizadores hematolgicos, no solamente el XE2100, pareciera ser especfica y tener una sensibilidad moderada. Sin embargo an existen importantes
deficiencias metodolgicas en muchos de estos estudios y se requerira todava ms informacin para
poder implementar esta estrategia de diagnstico. El mecanismo de deteccin para malaria por
citometra de flujo, es conocido y se sabe que la hemozoina juega un papel importante. En el caso de la
deteccin por el sistema XE-210, an no se conoce con certeza pero tenemos buena evidencia que
sugiere que lo que el equipo est detectando, son formas de parsitos maduras de Plasmodium vivax
que son ricas en hemozoina.
Diapositiva 64: Para el XE-2100 de Sysmex, hay por lo menos 6 series de casos y 3 estudios de
desempeo diagnstico publicados. La presencia de pseudoeosinofilia se asocia a malaria y sta la
podemos ver en las alarmas de eosinofilia o dispersograma anormal de leucocitos. Estas alarmas nos
deben llevar a hacer un extendido de sangre perifrica por la posibilidad de tener esta infeccin.
Tambin sabemos que existen anormalidades importantes en el dispersograma DIFF. Para detectarlas,
se requiere de personal entrenado en la identificacin de estas anormalidades. Esto se logra despus de
ver varias imgenes con estas alteraciones. Tambin se puede aplicar el score malrico, que recordemos
utiliza 10 anormalidades en el dispersograma DIFF y la presencia de 7 o ms pixeles en el rea de conteo
de pixeles del dispersograma WBC/BASO con 4 puntos siendo positivo para malaria. Necesitamos utilizar
la misma definicin de malaria en estos dispersogramas, para poder garantizar que haya
reproducibilidad a travs de los estudios y poder ver que tan tiles son realmente a nivel poblacional.

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Seminarios en espaol 2011

Diapositiva 65: Desde nuestra investigacin, sugerimos reconsiderar la capacidad de diagnstico de
malaria utilizando el XE-2100. Sugerimos que la mejor forma de lograr esto es a travs de la utilizacin
de variables numricas continuas que se obtienen por mediciones directas hechas por el citmetro. Esto
permitira a futuro desarrollar una alarma para malaria que fuera automatizada y que nos permitiera
hacer un diagnstico oportuno de malaria. Esto sera algo similar a lo que se ha logrado hacer en el caso
de neoplasias hematolgicas
Diapositiva 66: Para esto hemos diseado unos modelos de diagnstico que utilizan variables continuas
que podran ser la base para el diseo de una alarma a futuro en auto analizadores de hematologa.
Tenemos los modelos N-OD1, que recordemos utilizan las variables crudas del anlisis del XE-2100 y que
podran ser potencialmente extrados y calculados utilizando un software intermedio de laboratorio.
Recordemos de todas formas, que estos modelos requeriran ser validados en diferentes muestras de
pacientes con mltiples alteraciones hematolgicas. Tenemos tambin los modelos N-OD2 que adems
de las variables crudas que proporciona el XE-2100, tambin utiliza el conteo de pixeles en el
dispersograma WBC/BASO. Los eventos en esta rea estn relativamente aislados, lo cual nos da una
oportunidad de hacer un anlisis mucho ms exacto y libre de ruido de eventos asociados a malaria.
Adems es aplicable a ambos, Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum. Proponemos la posibilidad
de que la deteccin en esta zona o en zonas anlogas a sta, futuros auto analizadores podra ser la base
para una alarma para malaria.
Diapositiva 67: Algunos de los hallazgos reportados para el auto analizador XE-2100, podran
potencialmente ser aplicados para los auto analizadores XS-1000i y el XT-2000i, ya que estos comparten
tecnologa similar. Sin embargo repito, estos modelos deben ser validados para estos equipos antes de
ser implementados. Para el desarrollo futuro, recordemos que los parsitos tienen un patrn especfico
de detectado por citometra de flujo y esto puede ser aprovechado para el diseo e implementacin de
alarmas todava ms especficas y sensibles para malaria en futuros auto analizadores. La citometra de
flujo tambin tiene una sensibilidad analtica o lmite inferior de deteccin mejor que la microscopa y
esto tambin podra ser utilizado como una ventaja o fortaleza de esta estrategia de deteccin de
malaria y que los modelos que hemos propuesto en esta presentacin, deben ser validados en otras
poblaciones que tengan mltiples trastornos hematolgicos que podran potencialmente confundir o
modificar el desempeo diagnstico de los modelos.
Diapositiva 68: Ya para concluir, el paso adelante que proponemos, estara ya en manos de la industria
que estara encargada de desarrollar e implementar estas alarmas en analizadores nuevos. Yo pensara
que el principal incentivo para el desarrollo de esta estrategia de diagnstico o deteccin de malaria,
sera integrar la investigacin sobre este mtodo de deteccin con analizadores hematolgicos dentro
de la iniciativa global para controlar y eventualmente, eliminar la malaria del planeta.
Diapositiva 69: Muchas gracias por su atencin.

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