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ABSTRACT
Experiments with laboratory animals, mainly mice, has been fundamental
advances in the field of biomedicine and Immunology. This paper's main
objective is to know the correct technique of manipulating the mouse (Mus
musculus) Balb / c in the laboratory type, and thanks to that achieved the
collection, observation and quantification of macrophages and splenocytes. In
this assay have been developed handling techniques, routes of administration
and autopsy in male laboratory mice six weeks of age, weighing had a
variation from the first week to the second with a reduction of 15.29%.
Peritoneal fluid macrophages subsequently with RPMI 1640 medium and
incubation conditions of 37 C and 5% CO2 for four hours was obtained.
Macrophages was observed in the inverted microscope with a cell count
j
obtained in the mouse A 5.5 * 10 ^ 6, mouse B 2.25 * 10 ^ 6 in the mouse C
and 1.5 * 10 ^ 6 cells / mL. Subsequently splenocytes of the spleen was
obtained and the observation was made in inverted microscope and camera
cell count Neubaer. Counting splenocytes resulted averaged 8.75 * 10 ^ 5 cells
/ mL.
Key words: Immunization, splenocytes, macrophages.
j
INTRODUCCIN.
La experimentacin con modelos
animales inici antes de los aos
1600 y se utiliz para estudios de
anatoma, fisiologa e histologa.
Actualmente, la investigacin con
animales sigue siendo de gran
importancia en diversas reas de
estudio, como: investigacin en
cncer
y
enfermedades
infecciosas, sanidad humana y
animal, desarrollo de procesos
biotecnolgicos,
investigacin
genmica,
neurociencias,
farmacutica
y
ensayos
inmunolgicos (Granados-Ziga,
2010). A pesar de la dificultad que
representa
extrapolar
los
resultados obtenidos a humanos,
la experimentacin con animales
representa varias ventajas, como:
fcil
manipulacin,
alta
fecundidad,
bajo
costo
y
reproducibilidad (Salguero et al.,
2007).
Mus musculus como modelo
experimental La especie ms
utilizada
en
la
investigacin
cientfica
es
el
ratn
(Mus
musculus). Posee un pequeo
tamao, peso adulto de 25-30 g. El
olfato es muy desarrollado y tiene
un sentido muy agudo de la
audicin y el tacto. Las funciones
de la cola son termorregulacin y
equilibrio. Son animales de hbitos
nocturnos La determinacin del
sexo se realiza observando la
distancia ano-genital, que en los
machos
suele
ser
aproximadamente el doble que en
las hembras (Santos, s.f.).
El ratn se sujeta con firmeza por
la base de la cola y se coloca una
superficie rugosa donde pueda
j
macrfagos
son
clulas
del
sistema
inmune
que
poseen
capacidad fagoctica y microbicida;
por lo tanto, desempean un rol
importante en la inmunidad antiinfecciosa. Se derivan de los
monocitos de la sangre, despus
de su migracin a travs del
torrente circulatorio. Son clulas
especializadas que se encuentran
en
la
mayora
de
tejidos
conjuntivos y en rganos, como:
hgado
(clulas
de
Kupffer),
sistema nervioso central (clulas
microgliales)
y
pulmones
(macrfagos alveolares). Adems
de
ingerir
microbios,
los
macrfagos
ingieren
clulas
muertas del anfitrin, secretan
citocinas, actan como clulas
presentadoras de antgenos (CPA)
y promueven la angiogenia y
fibrosis (Abbas, Lichtman & Pillai,
2012).
Los Esplenocitos segn Garca
(1994) los esplenocitos son clulas
del sistema inmune que se
encuentran principalmente en el
seno del bazo. Se encargan de
reconocer y fagocitar clulas
sanguneas
envejecidas
o
malformadas y microorganismos.
La cmara de Neubauer se emplea
para el conteo de clulas en un
medio lquido. Est adaptada al
microscopio de campo claro o de
contraste de fases. Est formada
por un portaobjetos de cristal en
cuyo tercio central se encuentran
tres plataformas de las cuales la
central, que est situada 0,1 mm
por debajo de las laterales,
presenta
una
cuadrcula
subdividida en 9 cuadrados de 1 x
1 mm cada uno (1 mm2 ). Para
facilitar el conteo celular, cada
MATERIALES Y MTODOS.
Modelo animal
Se emple ratones de laboratorio
machos de aproximadamente seis
semanas de vida, cuyo peso
promedio inicial fue de 15.86 g.
Durante
el
perodo
de
experimentacin los animales se
mantuvieron
bajo
condiciones
controladas de alimentacin, cuya
dieta
estuvo
basada
en
zanahorias, gelatina sin sabor y
agua.
Manipulacin
Para la manipulacin de los
ratones se emple la tcnica de
restriccin a mano descrita en
Ziga et al., 2001 y Hedrich,
2004. En la figura 1 se observa el
mtodo de sujecin de los ratones
utilizado en los ensayos.
Se sujet el ratn por la base de
su cola y se coloc en una rejilla
donde pueda sostenerse. Se
j
agarr un pliegue de piel en la
parte posterior del cuello (cerca de
las orejas). Se fij la piel floja a lo
largo de la espalda y la cola del
ratn. Se coloc al ratn con el
lado ventral hacia arriba y se
atrap la cola entre el dedo anular
y meique.
Figura 2. Inmunizacin
intraperitoneal del ratn con
tioglicolato. (Llamuca, 2015).
Necropsia.
Control de peso
Se pes cada ratn dos veces por
semana por un periodo de dos
semanas. En la siguiente figura se
puede observar el procedimiento
empleado para determinar el peso
de los ratones
Inmunizacin.
Mediante la va de administracin
intraperitoneal
se
inyect
aproximadamente 0,2 ml de una
solucin tampn denominada PBS
(Phosphate
Buffered
Saline).
Posteriormente, se administr 0,2
ml de tioglicolato fluido de
concentracin 30 mg L-1 mediante
va intraperitoneal, con la finalidad
de estimular los macrfagos del
ratn. En la figura 2 se observa la
administracin de tioglicolato.
j
midi las
rganos.
dimensiones
de
los
Obtencin y observacin
macrfagos
interperitonealmente.
de
Obtencin y observacin
macrfagos alveolares.
de
Obtencin y observacin de
macrfagos de la mdula sea.
Para la obtencin de macrfagos a
nivel de la medula sea, se cort
las cabezas del fmur y se
centrifug a 1000 rpm por 3
minutos, el pallet se mezcl con 1
mL de RPMI. Se prepar una
disolucin de 90 L de bluetripan y
10 L de la muestra, y se procedi
a observar en la cmara de
Neubauer.
Obtencin,
conteo
observacin de esplenocitos
Doce
das
despus
de
la
inmunizacin con tioglicolato se
sacrific tres ratones mediante la
tcnica de dislocacin cervical. Se
realiz la diseccin del ratn y se
extrajo el bazo. Posteriormente se
coloc el bazo en una caja Petri
con medio RPMI y se tritur con el
pistn de una jeringa estril, hasta
j
obtener fragmentos pequeos. A
continuacin se filtr el medio con
una gasa en tubos Falcon. Se llev
los tubos a centrifugacin a 1200
rpm por 8 minutos a una
temperatura ambiente. Debido a
que existe contaminacin por
glbulos rojos se aadi el buffer
lisis y se realiz aspiraciones
sucesivas por minuto, luego se
centrifug nuevamente por 10
minutos.
A
continuacin,
se
elimin el sobrenadante y el pellet
fue resuspendido en 5ml de medio
RPMI. Se tom 10 l del medio y se
diluy en 90 l de azul Tripn. Para
realizar el conteo se emple una
cmara de Neubauer. Se coloc 10
l de esta dilucin en el orificio de
la cmara, para distinguir las
clulas vivas de las muertas. Se
coloc la cmara de Neubauer en
el microscopio ptico a 40X y se
procedi a realizar el conteo de
esplenocitos. En la siguiente figura
se ilustra las regiones de la
cmara.
C . C=
Donde:
C.C.= concentracin celular, F.D.=
factor de dilucin, Vo =volumen
final.
Se coloc una concentracin
celular de 5x106 esplenocitos en
una alcuota de 200 uL en cinco
pocillos
de
una
P96
y
posteriormente
se
llev
al
microscopio invertido para la
observacin de esplenocitos.
RESULTADOS
Pesos de los ratones
Los pesos de los ratones se
tomaron a los das 0, 5, 7 y 12. En
la siguiente tabla se observa el
peso promedio de los ratones
durante las dos semanas de
experimentacin.
Peso de ratones vs. Tiempo
No.
rat
n
Tiempo
en das
15
5
0
13,2
14,6
15,5
13,8
12
12,7
13,9
14,3
13,5
12
12,5
D
F
Peso ratn
(g)
17
14,4
18,8
16,5
15,3
%
dismi
nuci
n
12,00
13,01
10,07
15,29
j
12
Tota
l
13,9
26,06
Promedio
inicial:
15,86
15,29
Supervivencia
Nmero de ratones
1
0
10 15
Sobrevivencia
Tamao de rganos
En la Tabla 3 se presenta la
medida de los rganos (cerebro,
corazn,
bazo,
pulmones
e
intestino) de los ratones 0, 5,7 y
12 que fueron sacrificados el
quinto da para realizar el cultivo
de macrfagos.
Tiempo (das)
j
D
Cerebro
Intestino
Bazo
Corazn
Pulmones
1
36
1,5
0,9
1,2
6000000
4000000
Numero de macrofagos
2000000
Obtencin y
macrfagos
observacin
de
Se
observ
los
macrfagos
adheridos en la caja Petri y teidos
con azul de Tripn. Adems se
observ restos celulares en la
mayora
de
cultivos
de
macrfagos. En la tabla 4 se
muestra el conteo de macrfagos
(clulas/ mL) existentes en el
lquido peritoneal y mdula sea
del ratn A, C y D.
N0
Ratn
A
C
D
0
RATONES
Observacin de macrfagos.
Se realiz una tincin a los
macrfagos con azul Tripn y se
observ mediante microscopio
ptico e invertido.
Clulas/mL
MACROFAGOS
5,5*10^6
2,25*10^
6
1,5*10^6
Liquido
peritoneal
Mdula
sea
Liquido
peritoneal
j
Figura 7. Macrfagos alveolares del
ratn. Observado en microscopio
invertido. Aumento 40x. (Torres,
2015).
Macrfag
Observacin y cuantificacin
de esplenocitos.
Se observ los esplenocitos en la
caja Petri y teidos con azul de
Tripn. Adems se observ restos
celulares en la mayora de cultivos
de macrfagos. En la tabla 4 se
muestra el conteo de macrfagos
(clulas/ mL) existentes en el
lquido peritoneal y mdula sea
del ratn A, C y D.
Clulas/mL
ESPLENOCI
TOS
1*10^6
7,5*10^5
8,75*10^5
1000000
500000
Numero de esplenocitos
0
Ratones
para los
DISCUSIN
Segn Soriguer & Lpez (1986)
citado por Medarde (2013) el
comportamiento social de los
ratones
vara
notablemente
dependiendo de la disponibilidad
de recursos alimenticios. Cuando
la disponibilidad de alimento es
abundante, los ratones tienden a
formar grandes grupos donde el
comportamiento agresivo no es
frecuente.
Adems,
existen
diferencias de comportamiento
entre machos y hembras, siendo
los machos ms territoriales y
agresivos.
En el presente ensayo todos los
ratones fueron sacrificados por
dislocacin cervical; por lo tanto,
no
se
observ
muertes
ocasionadas por comportamiento
violento, a pesar de que todos los
ratones
eran
machos.
Probablemente, no presentaron
conductas violentas debido a que
la disponibilidad de alimento y
espacio fue adecuada para cada
una de las especies. El peso
aproximado de un ratn de 6
semanas de vida es de 15-18g
(Pierce, 2009). El peso promedio
inicial de los ratones fue de 15.86g
(Tabla 1), lo cual est dentro del
intervalo
establecido
por
la
bibliografa. Sin embargo, si se
analiza el peso inicial de cada
ratn hasta la ltima semana del
experimento, se puede determinar
claramente que el peso promedio
de los ratones presenta una
variacin, con una reduccin del
15,29%. Segn Roitt (2008), el
tioglicolato es un estmulo no
inmunolgico
que
induce
la
j
Se determin las dimensiones del
bazo, intestino, corazn, pulmones
y cerebro, ya que segn Ziga et
al. (2001) son los rganos de
mayor
inters
en
las
investigaciones biomdicas. Las
medidas de los rganos fueron
semejantes entre los dos ratones
analizados; al igual que las
medidas del cerebro. (Tabla 3).
Segn Martnez (2008) existen
muestras de esplenocitos totales
aislados
mediante
la
misma
tcnica de esta prctica, que dan
como
resultado
25x106
esplenocitos/mL. Sin embargo en
los
resultados
obtenidos
se
observ
una
concentracin
promedio
de
8,75*10^5
(Clulas/mL) esplenocitos viables.
Probablemente una de las causas
que influenci en estos resultado
es que no se emple condiciones
totalmente estriles durante el
procedimiento (Porras et al.,
2003). Adems debido a la falta de
prctica de los estudiantes, el
tiempo de preparacin de la
cmara de Neubauer con la
suspensin celular, para llevarla al
microscopio ptico fue muy largo,
pudiendo ocurrir lisis celular.
CONCLUSIONES
El ratn (Mus musculus) es el
modelo animal ms empleado en
la investigacin biomdica. La
aplicacin correcta de tcnicas de
manipulacin,
vas
de
administracin
y
necropsia,
asegura en gran parte la fiabilidad
de
los
procedimientos
y
resultados.
j
que no se realiz el procedimiento
bajo condiciones estriles.
RECOMENDACIONES
Los ratones de experimentacin
deben mantenerse en un bioterio
bajo
condiciones
estriles
y
controladas.
El investigador debe tomar las
medidas
de
bioseguridad
pertinentes al manipular ratones,
como el uso de guantes y mandil.
Las tcnicas de manipulacin
deben
ser
empleadas
con
precisin para evitar mordeduras o
comportamientos violentos del
ratn.
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