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978-607-607-189-2
Dispositivos polimricos
para el confinamiento
neuronal y registro
electrofisiolgico
AGRADECIMIENTOS
CAPTULO 1. INTRODUCCIN
Introduccin
Las
neurociencias utilizan tcnicas electrofisiolgicas a microescala (Dworak & Wheeler, 2009; Wagenaar et al., 2006)
y a nanoescala (nanotubos) (Patolsky et al., 2006; Cooper &
Nadeau, 2009), para estudiar el comportamiento y el nivel de
interaccin neuronal, de manera individual y colectiva (redes
neuronales). Tambin se estudian las enfermedades neurodegenerativas, sus efectos y la manera en que pueden ser erradicadas
(Society for Neuroscience, 2012).
Adems, la investigacin cientfica requiere el sacrificio de
mamferos, como ratones (World Health Organization, 2004),
para experimentos y pruebas farmacolgicas (Andersen &
Krewski, 2008; Collins et al., 2008; Gibb, 2008; Johnstone et
al., 2010). La cantidad de animales sacrificados puede llegar a
reducirse al mejorar las herramientas de trabajo in vitro.
La presente tesis introduce un dispositivo polimrico, diferente a los tradicionales dispositivos de electrofisiologa, como
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al., 1997; Erickson et al., 2008). Por otra parte, los mea pueden
registrar la aen en mltiples puntos de un cultivo neuronal
(ms de 64), pero el proceso de fabricacin de estos dispositivos
resulta complejo (Erickson et al., 2008).
El proceso de microfabricacin del dispositivo polimrico,
propuesto en esta tesis, es sencillo, econmico (en comparacin a los dispositivos tradicionales) y para operar el dispositivo, slo se requiere de un entrenamiento bsico. El cambio
de medio extracelular y la incorporacin de frmacos pueden
realizarse a travs de un sistema de perfusin o pipeteo. En esta
tesis, el procesamiento de datos tiene lugar, principalmente,
bajo el software Matlab.
El dispositivo polimrico puede realizar registros desde uno
hasta de 40 cultivos neuronales, de manera simultnea. Los
cultivos son de hipocampo y estn constituidos desde 50 000
hasta 75 000 neuronas disgregadas. Las neuronas son obtenidas de embriones de ratn con 18 das de gestacin. La aen se
registra a partir de 10 a 14 das de ser cultivadas (Fitzsimonds
et al., 1997; Morales et al., 2008).
Las neuronas de los ratones tienen la ventaja de ser muy parecidas a las humanas. Los ratones poseen arriba de 80% de genes
idnticos a los genes humanos (Waterston et al., 2002; Ceccarelli, 2008). Las diferencias genticas entre los ratones y los humanos, radica en que los ratones tienen ms genes relacionados
con el apareamiento y el sistema inmunitario (Waterston et al.,
2002). El genoma del ratn tiene 2.5 x 109 bases, mientras que
el del humano tiene 2.9 x 109 bases (Kirkness et al., 2003).
Se prefiere trabajar con neuronas del hipocampo por lo
destacable de sus funciones de aprendizaje (Rametti, 2008),
memoria (Gamon & Bragdon, 2010), configuracin espacial
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Objetivos especficos
El objetivo general est compuesto por una serie de objetivos
especficos, tanto cientficos como tcnicos:
Diseo del dispositivo:
Disear un dispositivo polimrico, cuya estructura 3D est
constituida por dos compartimentos (pozos) y un microcanal
(o microtnel). Los compartimientos confinarn el crecimiento celular. El microcanal ser el conducto que comunique un
compartimento con otro compartimento. El dimetro del microcanal tendr un valor intermedio entre el dimetro del soma
de las neuronas de hipocampo y dimetro de sus neuritas.
Microfabricacin:
Estudiar, analizar y determinar el tipo de material apropiado
para realizar una produccin en serie del dispositivo polimrico. Este material debe ser econmico, biocompatible y debe
cumplir con las caractersticas elctricas, fsicas y pticas para
mediciones electrofisiolgicas e inspecciones pticas.
Analizar y evaluar las diversas tcnicas de microfabricacin. Determinar el tipo de tcnica eficiente y eficaz para fabricar piezas
maestras (mster). Determinar el tipo de tcnica eficiente y eficaz
para realizar una produccin en serie del dispositivo polimrico y
garantizar una alta calidad en la replicacin del microcanal.
Funcionamiento del dispositivo:
Caracterizar la eficiencia de registrar la aen al utilizar seis
dispositivos polimricos de manera simultnea. Caracterizar la
eficiencia de registrar la aen al utilizar 40 dispositivos polimricos de manera simultnea. Caracterizar y comparar los resultados de registrar la aen de un dispositivo polimrico con cultivo
neuronal sembrado en los dos compartimentos, con respecto
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NEURON
Soma
Axon Hillock
Fuente: Elaboracin propia.
Mecanismos de comunicacin
Las neuronas se comunican entre s a travs de sinapsis, las
cuales pueden ser elctricas o qumicas. Las sinapsis elctricas
permite el transporte directo de iones y la propagacin del pa
a la neurona vecina (Piccolino, 1998). En cambio, las sinapsis
qumicas liberan sustancias transmisoras recibidas por los receptores postsinpticos de otra neurona.
Las clulas gliales, neuroglas o gla, tienen la funcin de
ser sustento y puente de comunicacin para las neuronas. La
proporcin de gla con respecto a las neuronas, en un ratn es
de 10:1 in vivo (Magistretti & Ranson, 2002) y 50:1 in vitro
(Evrard, 2002; Brahmachari et al., 2006).
La gla sobre el hipocampo induce neurognesis, influye en la
aen y en la fuerza sinptica, y aparece como tercer compaero en
la transmisin sinptica (sinapsis tripartita) (Moises et al., 2002).
Sin la gla las neuronas moriran con facilidad en un corto tiempo.
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[Ion]e
RT In _____
Eion = ___
FZ
[Ion]i
Eion = Potencial de equilibrio
J )
R = Constante del gas (8.31 ____
Mol*K
T = Temperatura absoluta
C )
F = Constante de Faraday(96 406 ____
Mol
Z = Valencia del in
[Ion]e = Concentracin inica extracelular
[Ion]i = Concentracin inica intracelular
La ecuacin de Nernst determina que la diferencia de potencial entre el interior y el exterior de la membrana neuronal es
de -70 mV. El interior de la membrana es la parte ms negativa.
Por convencin, el potencial en el exterior de la membrana es
definido como potencial cero.
La neurona est representada morfolgicamente por un
soma, un axn y dendritas. El soma posee forma semiesfrica
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Loose-patch
Loose-patch es una tcnica no invasiva donde la pipeta es llenada con solucin salina externa y es usada como electrodo
que se coloca sobre la membrana celular. La baja resistencia
de la conexin de la pipeta con la membrana neuronal es,
elctricamente comparable a la resistencia que el resto de
la membrana percibe del medio extracelular, por lo que la
clula apenas nota algn cambio de tipo elctrico (Barbour
& Isope, 2000).
La resistencia ideal para la punta de la pipeta es entre 1 M
y 3 M (Traub & Miles, 1991; Forti et al., 1997; Nunemaker
et al., 2003; Drongelen, 2007).
El inconveniente de la tcnica de loose-patch, es que en ocasiones genera una pequea protuberancia, en la membrana de
la clula, dentro de la zona del sellado, lo cual altera los valores
del registro de la aen (Milton & Caldwell, 1990).
Ventajas y desventajas
Las ventajas de utilizar el mtodo de loose-patch con respecto a
whole-cell consisten en que las pipetas no forman giga-sellos en
las membranas, por lo que pueden ser reutilizadas y reposicionadas varias veces sobre diferentes neuronas (Bookman et al.,
1987), se puede realizar un rpido muestreo sobre las neuronas
e incluso estimular la membrana (Barbour & Isope, 2000) a
travs de una corriente que pase por la capacitancia de contacto
(patch-capacitance). Los mejores resultados se logran a travs de
estmulos cortos (20 s).
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Los patrones qumicos se pueden crear a travs de diversas tcnicas (Dusseiller et al., 2005): soft-litografa (Kane et al., 1999;
Zhang et al., 1999; Tan & Desai, 2003), escritura directa de clula a travs de lser (Odde & Renn, 2000; Nahmias & Odde,
2006), tcnica de fotolitografa (Bhatia et al., 1992; Liu et al.,
2002), nanotecnologa con dip-pen (Piner et al., 1999; Wilson
et al., 2001) o inyeccin de protenas por sistema de impresin
(Roth et al., 2004).
La tcnica de patterning puede utilizar estructuras polimricas 3D, como paredes y surcos, para la contencin neuronal
(Mahoney et al., 2004) o electrodos planares para el registro de
la aen de cada neurona (Prasad et al., 2003).
Microislas: un ejemplo de patterning
Los cultivos en microislas (Chena et al., 2004) proveen un simplificado sistema para estudiar las expresiones de fenotipo celular,
excitabilidad, formacin de sinapsis y mecanismos regulatorios
pre- y postsinpticos (Bekkers & Stevens, 1991; Segal, 1991;
Takada et al., 2005) sin el problema de interacciones complejas
por una gran cantidad de neuronas (miles de neuronas).
Las seales que se registran de auto contacto en una microisla (figura 2) son similares a las seales de transmisin de
un cultivo con miles de neuronas (Bekkers & Stevens, 1991;
Mennerick et al., 1995; Allen, 2006).
La tcnica consiste en dirigir la adherencia y el crecimiento
de una neurona o pequeo grupo de neuronas, sobre discretas
islas (20 a 500 m de dimetro) con substrato aplicado (poliL-lisina, poli-D-lisina o colgeno) sobre una capa no adherente
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Figura 3. Vista del extremo inferior de la pipeta. Resolucin 10X. La foto muestra
la cada celular a travs de una pipeta. Los pequeos crculos son neuronas que
caen por el extremo inferior de la pipeta (anillo obscuro) hacia la placa de Petri.
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Neurochip
El neurochip es una interfaz neuroelectrnica creada por microfabricacin para contener neuronas. Los electrodos del neurochip facilitan el monitoreo y el estudio del compartimiento e interaccin
de una red neuronal bajo estimulacin (Maher et al., 1999; Zeck
& Fromherz, 2001; Fromherz, 2002; Morin et al., 2005).
Un ejemplo particular de neurochip son las neurojaulas o
microjaulas fabricadas con parylene (polmero biocompatible).
Las neurojaulas son microestructuras 3D utilizadas para atrapar el cuerpo neuronal cerca del electrodo plano (para registrar
y estimular).
La neurona puede ser depositada a travs de lser (Tokker et
al., 2006) o a travs de una pipeta (Maher et al., 1999). Posteriormente, la neurona es retenida con ayuda de unos microtneles, dentro de los cuales crecen las neuritas, estos microtneles
sirven tanto de anclaje, como de conductos, como medios bajo
los cuales, la neurona, se puede comunicar con otras neuronas.
La mortalidad en estos casos es de 35% a las dos semanas de ser
sembrado el cultivo neuronal (Erickson et al., 2008).
Propuesta de proyecto de tesis: Tecnologa dos pozos y
un microcanal
El dispositivo propuesto en esta tesis tiene como objetivos:
Establecer una interfaz elctrica estable a largo plazo (de
das a semanas) entre neuronas y electrodos in vitro, mediante el uso de microcanales que confinen axones individuales o grupos de axones.
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Figura 4. Modelo en 3D del dispositivo polimrico. Este modelo muestra las partes
que conforman el dispositivo propuesto. La base es una placa de Petri con sustrato de
poli-L-lisina. La neurona se encuentra sumergida en medio extracelular (neurobasal
ms otros aditamentos que se describen en el captulo 5). El microcanal restringe el
crecimiento de las neuritas. La seal emitida a travs del microcanal es recogida por
los electrodos, aprovechando las caractersticas conductivas del medio extracelular.
Chip de pdms
Medio
extracelular
Electrodos
Axn
Placa
de Petri
Neurona
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Axon Hillock
pdms
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Soma
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Voltaje uV
Figura 8. Registro con una matriz de seis dispositivos polimricos. Imagen del
ordenador donde se aprecia la aen de cada uno de los seis dispositivos polimricos.
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-697
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01:44:51
ch 1
ch 2
ch 3
ch 4
ch 5
ch 6
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01:54:51
01:58:11
300 V
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cin, como patch-clamp, para determinar el nivel de participacin de cada neurona dentro de una red neuronal. En
el laboratorio, ha sido acertado el sembrado de microislas,
utilizando un atomizador, de tamao reducido, para dispersar gotas de poli-L-lisina sobre placas de Petri.
4) La electrofisiologa convencional se aproxima a los cuerpos
neuronales a travs de electrodos y pinchazos que pueden
alterar las propiedades membranales y matar a las neuronas
mismas (despus de unas horas de manipulacin) (Maher et
al., 1999; Erickson et al., 2008). Por otro lado, los mea son
empleados en el estudio de la aen como una alternativa menos invasiva (Rutten et al., 2001).
5) La tcnica patch-clamp registra la aen y con auxilio de la
tcnica de patterning se puede estudiar a cada una de las
partes que conforman la red neuronal.
6) Al seguir la lnea de investigacin y los logros obtenidos bajo el grupo de E. Claverol-Tintur, en esta tesis se
propone la fabricacin de un dispositivo polimrico innovador, capaz de registrar la aen de manera no invasiva,
con una relacin de seal-ruido superior al convencional
loose-patch y hacerlo con mtodos de fabricacin industrializables. El costo del dispositivo es inferior al requerido en la produccin de los tradicionales mea.
7) El dispositivo polimrico se encuentra constituido por un
microcanal y dos pozos; este dispositivo es una herramienta prctica y sencilla para el estudio de la aen. Su principio es sencillo, simplemente se siembra el cultivo neuronal
dentro del pozo del dispositivo polimrico y despus de
una a dos semanas se puede empezar a realizar registros
de aen y pruebas farmacolgicas (por ejemplo, pruebas de
toxicologa) sobre los cultivos.
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CAPTULO 3
MICROFABRICACIN DE DISPOSITIVOS
POLIMRICOS
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Microfabricacin de la mscara
El proceso de microfabricacin por lo general se inicia con el
diseo de la mscara.
La mscara es una lmina de cristal (transparente al uv) o bien
una lmina transparente plstica (transparencia) con una figura
impresa (diseada en ordenador). La mscara se utiliza en la sala
blanca, durante el proceso de fotolitografa, para proyectar su
imagen sobre un sustrato con fotorresina y de esta manera crear
las microestructuras deseadas. Las herramientas utilizadas son:
Ordenador y software. Se requiere de al menos un ordenador estndar con software integrado, con una precisin
micromtrica, como Freehand o Autocad, para disear la
figura 2D del mster y posteriormente ser impresa en una
transparencia.
Mscara. Hoja delgada translcida con propiedades pticas uniformes y que contiene la impresin de la figura
2D del mster.
La mscara propuesta para esta tesis, est diseada con el software Macromedia Freehand 10 (figura 10) y se encuentra constituida por 40 lneas, cada una de ellas mide 10 mm de largo por
20 m de alto. La separacin entre cada una de las lneas es de
12 mm (plano vertical) y 9 mm (plano horizontal). Este tipo de
diseo es impreso en una filmina transparente (hoja de acetato).
Microfabricacin del mster
El mster es el molde principal (imagen negativa) utilizado
para fabricar las piezas polimricas con una imagen positiva.
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Figura 10. Mscara. Imagen de la mscara diseada con el software Freehand. Esta
mscara se emplea en el proceso de fotolitografa, para la creacin del mster. Las
dimensiones de cada una de las lneas son de 20 m de alto por 10 mm de largo.
Mask for master for PDMS
(20u x10mm)
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En esta tesis, para crear el microcanal con las caractersticas deseadas, se utilizan la fotorresina AZ 9260, la fotorresina
SPR220 y la fotorresina SU-8.
Fotorresina AZ 9260. Este tipo de fotorresina positiva est
diseada para trabajos de alta resolucin y grandes diferencias entre la proporcin de la base y la altura. Por lo general
se utiliza para trabajos que van desde 2 m hasta 24 m de
resolucin (Chen et al., 2007). El protocolo para la creacin del mster est en el Anexo D-1.
Fotorresina SPR220. Es una fotorresina positiva para usos
generales que crea una pelcula con un espesor de 1 a 30
m. Tambin posee excelentes caractersticas de adhesin
y de cubierta que lo hacen muy til para aplicaciones en
mems y en electrodeposiciones (Kukharenka & Kraft,
2003). El protocolo para la creacin del mster est en el
Anexo D-2.
Fotorresina SU-8. Es un tipo de fotorresina (negativa)
epoxi empleada para la microfabricacin y otras aplicaciones microelectrnicas, con la que se obtiene una
figura trmicamente y qumicamente estable (Lorenz et
al., 1997).
La resolucin con la que se trabaja va del rango de 0.5 m
hasta ms de 200 m de espesor. El protocolo para trabajar
con la fotorresina SU-8 est en el Anexo D-3. El mster que se
obtiene es un sustrato de vidrio con unas pistas de fotorresina
SU-8, de valores de 10 mm de largo, por 20 m de ancho, con
un espesor aproximado de 4 m.
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La incorporacin de ciertos compuestos dentro de la solucin electroltica pueden ayudar a mejorar la calidad de electrodeposicin (Zhu et al., 2006; Monzn et al., 2007). El empleo
de Liebelight SF-1 y Liebelight SF-2 pueden funcionar como
agentes resistentes al efecto de picadura sobre el acabado del
material electrodepositado (Lim et al., 2007).
Por otra parte, la sacarina reduce el nivel de estrs al que se
ve sometido la muestra durante el proceso de electrodepositado
(Subramanian et al., 2001) y si adems, se aade dodecilsulfato
sdico (SDS de sus siglas en ingls Sodium Dodecyl Sulfate), se
puede controlar mejor la resolucin y evitar el nivel de estrs y
de deformacin del material (Kelly & Yang, 2001).
Para la presente tesis, se utiliza el siguiente protocolo:
El mster es una pieza cuyo sustrato es de acero y su superficie est cubierta parcialmente por una fotorresina; el
mster se somete a una etapa de pre-activacin, donde la
pieza se sumerge en una solucin qumica de 50% cido
clorhdrico (HCl) y 50% agua destilada (H2O), a temperatura ambiente dentro, por un minuto.
Posteriormente, el mster se somete a la etapa de activacin
(por 3 min), donde se sumerge dentro de una solucin
qumica denominada bao Woods (compuesto qumico
con diversos cloruros cidos), a temperatura ambiente, y hamA , para
ciendo circular una corriente de densidad de 50____
cm2
garantizar una deposicin de alta calidad y buena adherencia al sustrato.
La composicin qumica del bao Woods es:
electrodeposicin de nquel
Compuesto
Frmula
Sulfamato de nquel
Ni(SO3-NH2) 4H2O
298.5 gr
Cantidad
cido Brico
H3BO3
22.5 gr
Sacarina
C7H5NO3S
1.0 gr
Dodecilsulfato
Sdico (SDS)
C12H25NaO4S
0.1 gr
Agua destilada
H2O
500.0 ml
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Base
Estructura de pozos
Tapa
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gativa del molde (figura 12). El material generalmente utilizado para esta tcnica es el polidimetilsiloxano (pdms) Sylgard
184. El protocolo para la preparacin de silicona pdms se encuentra en el Anexo D-4.
Figura 12. Modelo 3D del proceso de microfabricacin. Diagrama representativo del
proceso de fabricacin de las piezas polimricas de pdms con el microcanal, mediante
la tcnica de elastomer casting. (A) El mster es una pista de fotorresina SU-8 sobre
un sustrato de vidrio. (B) El pdms es curado sobre el mster y despus perforado (C)
a travs del microcanal para crear dos agujeros que ms tarde se convertirn en pozos
(D). La pieza polimrica de pdms es colocada sobre una placa de Petri, recubierta
previamente con poli-L-lisina (F). (G) Los electrodos son introducidos a travs de la
tapa y quedan sumergidos y suspendidos dentro del medio extracelular para realizar
registros de la aen de las neuronas. (H) y (I) Muestra de corte transversal de la pieza
polimrica final, donde el microcanal queda expuesto.
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Lucifer yellow. Es un colorante fluorescente disulfnico aninico, propuesto para ser utilizado en la corroboracin del estado del dispositivo polimrico, el cual es soluble en agua y
tiene un pico de excitacin/emisin de 428/536 nm. Se utiliza
principalmente para estudios morfolgicos neuronales, porque
contiene un grupo de carbohidratos que permite estar covalentemente conectado con las molculas que le rodean durante la
fijacin del aldehdo.
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Resultados
Los resultados de los procesos de microfabricacin se presentan
en el siguiente orden:
Microfabricacin de la mscara.
Microfabricacin del mster con diferentes fotorresinas
(AZ, SPR y SU-8) y por electrodeposicin.
Microfabricacin de las piezas polimricas.
Moldes alternativos
Caracterizacin de los dispositivo polimrico
Microfabricacin de la mscara
El diseo de la mscara con 40 lneas (figura 10) se realiza bajo
el software Freehand, las lneas tienen valores de 10 mm de largo por 20 m de alto.
Este diseo se imprime en la compaa Leicrom Taller de
Preimpressi a alta resolucin (3 500 dpi) sobre una transparencia. Los valores de las lneas impresas sobre la transparencia
oscilan entre las 16 y 17 m (figura 14), en lugar de las 20 m
como estaba diseado.
Las observaciones indican que la hoja de acetato presenta
ciertas irregularidades pticas (motas) en las zonas de la lnea
donde debera haber slo transparencia; sin embargo, estas
motas microscpicas no afectan al proceso de fotolitografa,
ya que su tamao es muy reducido con respecto al rea total
de la pista.
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Mster de fotorresina SPR sobre sustrato de acero. Este mster se encuentra formado por un sustrato de acero con una pelcula de fotorresina SPR y unas trincheras que dejan al descubierto al sustrato de acero (figura 16).
Los acabados de las trincheras con la fotorresina SPR tienen mejores resultados, en uniformidad, con respecto a la fotorresina AZ.
Mster de fotorresina SPR sobre sustrato de nquel. Este
mster est elaborado de un sustrato de nquel sobre el cual se
encuentra una pelcula de fotorresina SPR con trincheras, las
cuales dejan al descubierto la base del sustrato de nquel. Los
resultados del proceso de fotolitografa son similares a los de
fotorresina SPR sobre sustrato de acero (figura 16).
Figura 16. Trinchera de la fotorresina SPR sobre el sustrato de acero. La trinchera
tiene una desviacin estndar de 0.58 m en los bordes.
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El protocolo del Laboratorio de Electrodeposicin y Corrosin consiste en someter al mster a un periodo de activacin
de 2 min dentro de un bao Woods, con una densidad de corriente de 12 500 mA
cm2 ; luego se electrodeposita, el mster, dentro de una solucin electroltica. Para encontrar el mejor punto
de electrodeposicin, se utilizan diferentes parmetros:
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C
Fuente: Elaboracin propia.
Valor
Fuerza aplicada
500 N
Temperatura en la mquina
130 C
110 C
Tiempo de operacin
5 min
3.7 m
Profundidad marcada en el PS
2.7 m
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Figura 21. Medicin de las pistas del mster de pdms mediante interfermetro.
Este mster se encuentra constituido por una placa de pdms con pistas del mismo
material, su altura corresponde a 3.7 m y el ancho a 17 m (valor en el punto
medio del plano vertical de la pista). Este mster se usa para marcar las piezas
de ps por medio de la tcnica de hot embossing.
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Figura 22. Pieza polimrica de pdms con el microcanal formado. La imagen superior
(A, en campo claro) muestra el microcanal comunicando los dos pozos. En la imagen
inferior (B, en campo claro) se muestra el microcanal (amplificada 100 veces), donde
se aprecia su morfologa. La seccin ms abierta del microcanal mide cerca de 30 m,
mientras que la seccin menos abierta del microcanal slo mide alrededor de 10 m;
el valor de apertura promedio es aproximadamente de 20m.
B
Fuente: Elaboracin propia.
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La cantidad de das que llegan a vivir los cultivos neuronales son las mismas con ambos materiales.
Resultados fsicos:
El material Sylgard 184 es de color transparente, lo cual
facilita la inspeccin ptica de los cultivos dentro del microcanal, y posee una dureza de 50 en la escala de Shore,
con lo que no existe deformaciones del material, cuando
se realizan cortes.
El material MDX4-4210 tiene un color blanco, esto dificulta la
inspeccin ptica en el microcanal; adems, posee una dureza
de 30 en la escala Shore A, por lo que se deforma el material
cuando es sometido a procesos de cortado y de perforaciones.
Las diferencias biolgicas entre ambos materiales no son
cruciales; pero las diferencias fsicas que presenta el material
MDX4-4210 hacen que no sea considerado apto para la microfabricacin de dispositivos.
Las piezas polimricas se fabrican utilizando pdms Sylgard
184; con esto se logra obtener una matriz donde se puede replicar el microcanal de manera acertada (figura 22) y realizar
perforaciones sin problemas, como se ilustra en la figura 12. El
resultado final es una matriz de 40 pares de pozos (figura 23)
con un microcanal entre cada par de pozos.
Es necesario aplicar un proceso de limpieza a la pieza para remover las posibles partculas de suciedad que se pudieron adherir
durante el proceso de su creacin. Posteriormente se depositan
sobre una placa de ps previamente tratado con poli-L-lisina.
Una de las ventajas del pdms es que se adhiere con facilidad
a la superficie de ps y con la suficiente fuerza para mantenerse
unido, aunque la pieza est completamente volteada; siempre y
cuando, est libre de impurezas.
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Figura 23. Fotografa de la matriz de pdms. Esta matriz contiene 40 pares de pozos y un
microcanal que conecta cada par de pozos. Sus dimensiones son: 95 mm por 96 mm
por 7 mm de espesor. Cada pozo tiene un dimetro de 7 mm y el canal (no visible en la
imagen) tiene las dimensiones de 3.7 m de alto, 20 m de ancho y 1 mm de longitud.
Figura 24. Fotografa de un par de pozos y seis pares de pozos. Estos bloques son
formas alternativas en que puede ser cortada la matriz de pdms. En una placa de
Petri de 35 mm de dimetro cabe un bloque de silicona de un par de pozos (no se
muestra en la imagen) y en una placa de Petri de 60 mm de dimetro cabe
un bloque con seis pares de pozos.
Moldes alternativos
Existen otros tipos de moldes creados para la tcnica de elastomer casting, cuyos resultados para reproducir piezas polimricas
son limitados. Pero se considera importante dar a conocer estos
moldes, para demostrar que se ha escogido el mejor molde y se
podrn ver en el Anexo A.
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Figura 26. Dispositivo pdms sobre ps con lucifer yellow. La pieza de pdms est
sobre una superficie de ps y se le ha incorporado agua destilada con lucifer yellow.
En esta imagen se observa con claridad como el microcanal se comunica de manera
ntida de un pozo al otro pozo.
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Conclusiones
Las conclusiones obtenidas son:
1) Mscara. El proceso de fotolitografa se realiza con acierto
al utilizar una hoja de acetato como mscara. La presencia
de motas microscpicas sobre su superficie no alteran los
resultados.
2) Mster. Los mejores resultados, en orden de calidad descendente, para la creacin de microestructuras y adherencia al
sustrato en la fabricacin del mster son fotorresina SU-8, fotorresina SPR 220 y la fotorresina AZ 9260; respectivamente.
3) Fotolitografa. El ancho de las lneas impresas en la mscara mide entre 16 y 17 m; sin embargo, los valores de
las pistas de SU-8 sobre el sustrato de vidrio, tienen un
valor superior a las 20 m; esto indica que los rayos uv se
proyectaron con un ngulo obtuso y no de manera perpendicular, como debera ser, debido, seguramente al poco
tiempo de vida que le queda al equipo.
4) Electrodeposicin. Los resultados de electrodeposicin
son limitados y no pueden ser utilizados. En el laboratorio del pcb, la electrodeposicin de pistas de nquel sobre sustratos de nquel dan como respuesta pistas con una
morfologa homognea, pero con una adherencia pobre al
sustrato; en cambio, los resultados que se obtienen en el
Laboratorio de Electrodeposicin y Corrosin son pistas
fuertemente adheridas al sustrato, pero con irregularidades
en sus morfologas.
Un excelente proceso de electrodeposicin (pista con
forma homognea y buena adherencia) se lograra si se
empleara la misma composicin electroltica que utiliza el
76
77
78
CAPTULO 4
PROCESAMIENTO DE DATOS DE LA
ACTIVIDAD ELCTRICA NEURONAL
79
80
81
82
Deteccin automtica de pa
La manera ms prctica de procesar la informacin es a travs
de la deteccin automtica de pa o tcnica de spike sorting, la
cual consiste en identificar al nmero de neuronas participantes en los registros, gracias a diferencias entre la forma de los pa
extracelulares generados por diferentes clulas, y asignar a cada
una de estas neuronas la seal identificada (Brown et al., 2004;
Oweiss, 2010).
Slo se puede obtener informacin til si se realiza correctamente la deteccin de seales neuronales (como un algoritmo de aislamiento de pa (Buzski, 2004)) y si son agrupadas,
adecuadamente, en base a sus formas de onda (Lewicki, 1998;
Mtetwa & Smith, 2006).
Los mtodos de deteccin automtica de pa se clasifica en
dos categoras (Mtetwa & Smith, 2006):
1. Los que comparan la seal con una forma previamente
grabada para encontrar a sus semejantes (Salganicoff et al.,
1998; Hok et al., 2007), estas formas pueden representar
las condiciones de cierto tipo de experimentos, como las
seales de control, las seales bajo algn tipo de droga y las
seales despus de un lavado (Dworak & Wheeler, 2009).
2. Los que marcan un listn de corte para buscar un evento
que lo sobrepase (Drongelen, 2007), puede ser por amplitud
(Bergman & DeLong, 1992), por el valor de energa (Kim
& Kim, 2000), por los coeficientes de transformada (Nenadic & Burdick, 2005) o por la primera derivada de la seal
(Mukhopadhyay & Ray, 1998). El valor asignado al listn
de corte puede ser de 4.25 veces (Wagenaar et al., 2005), 4,5
veces (Wagenaar et al., 2006; Rolston et al., 2007), seis veces
83
84
ware de adquisicin de datos (Bacci et al., 2002) como LabView o Matlab (Drongelen, 2007; Rolston et al., 2007;
Srinivas et al., 2007).
2. Paquete de software. Proporciona una adquisicin y anlisis de datos sofisticados, pero el usuario slo puede hacer
limitadas modificaciones; aun as, son extremadamente
populares por su facilidad de uso (The Axon Guide, 2008).
Algunos de los paquetes de software que se pueden encontrar
en el mercado son:
IGOR Pro. Software para realizar grficas cientficas,
procesar datos e imgenes (Silberberg et al., 2004), y es
programable. Se puede hacer anlisis de patrones para
verificar acciones (eventos) de corriente y agruparlos en
intervalos de un minuto, para despus ser graficados e
identificar los cambios graduales en los patrones de disparo a lo largo del tiempo (Nunemaker et al., 2003). Este
producto tiene en el mercado desde 1989.
pCLAMP. Software para adquirir grabaciones electrofisiolgicas y monitorear las seales. Tambin se utiliza para hacer procesamiento y anlisis de datos (Bacci
et al., 2002; Marrero & Lemos, 2003); los resultados
pueden complementarse con el uso del test Anova en
conjunto con Bonferronis Multiple Test Comparasion
(Gomes et al., 2008).
ORIGIN. Software con un gran potencial de trabajo, ya
que importa datos (incluso de Matlab) y los analiza. Tiene
poder para hacer anlisis estadstico donde incluye Anova.
CLAMPLEX. Software para la adquisicin de datos de electrofisiologa (Mori et al., 2007).
85
Clampfit. Software que recibe la informacin de CLAMPLEX para hacer anlisis y graficar los de datos (Dworak
& Wheeler, 2009).
Neuroexplorer (Nex technologies). Software que posee un lenguaje tipo script, analiza y procesa los datos de la aen (Shafer
et al., 2008; Dworak & Wheeler, 2009; Johnstone et al.,
2010).
Axoclamp. Sistema amplificador que aumenta el valor
de la seal para la grabacin de aen electrofisiolgica.
Los datos que se obtienen pueden ser analizados despus con otro tipo de software como Matlab (Gillis et
al., 2006).
MEABENCH. Software que interacciona con la tarjeta de adquisicin de datos y anlisis en lnea (Wagenaar et al., 2005).
Criterios para el procesamiento de datos de nuestro
dispositivo polimrico
Caractersticas de la aen
El dispositivo polimrico propuesto en esta tesis, registra las
seales de las neuritas que se encuentran dentro del microcanal,
estas seales pueden provenir tanto de una neurona como de
un grupo de neuronas.
Los registros de las seales elctricas neuronales contienen
seales de origen biolgico combinado con contribuciones de
varias fuentes de ruido e interferencia.
Las seales de origen biolgico en un registro tpico pueden ser:
86
160
Voltaje [uv]
80
30
0
-30
-80
-160
00:05:08.645 00:05:08.650 00:05:08.655 00:05:08.660 00:05:08.665 00:05:08.670 00:05:08.675 00:05:08.680
Time [hh:mm:ss]
Los pa producidos por los cambios de voltaje en una neurona (figura 27).
Las rfagas de pa conocidos como bursts (figura 28).
Los potenciales de campo field potential (figura 29).
Los tipos de seales que acompaan y contaminan la informacin dentro de los registros de la aen, se identifican como
ruido (Drongelen, 2007; Scanziani & Husser, 2009) y los ms
caractersticos son:
Ruido ambiental de alta amplitud (figura 30).
Interferencia de 50 Hz con amplitud superior a los 200 V.
Seal de ruido producida por movimiento mecnico y de
alta amplitud.
87
Voltaje [uv]
450
160
80
0
-80
-160
00:06:20.500
00:06:21
00:06:21.500
00:06:22
00:06:22.500
Time [hh:mm:ss]
Voltaje [uv]
160
80
30
0
-30
-80
-160
00:08:28
00:08:28
00:08:28
00:08:28
Time [hh:mm:ss]
88
00:08:28
00:08:28
00:08:28
Voltaje [uv]
80
30
0
-30
-80
-160
00:05:30
00:05:32
00:05:34
00:05:36
00:05:38
00:05:40
00:05:42
00:05:44
Time [hh:mm:ss]
800
Voltaje [uv]
450
160
0
-160
-450
-800
00:33:08
00:33:13
00:33:18
00:33:23
Time [hh:mm:ss]
00:33:28
00:33:33
00:33:38
89
90
91
92
Tipos de registros
Dos tipos de registros se han obtenido mediante dos dispositivos polimricos prototipo:
Registros simultneos de 40 cultivos. La seal de la aen es recogida de la matriz con 40 microcanales, por medio de electrodos
de plata sumergidos en cada pozo; la seal es amplificada por el
amplificador de Multichannel Systems.
Los valores de la aen se registran dentro del ordenador con
el apoyo del software LabView bajo una frecuencia de 10 000
muestras por segundo. Los datos se almacenan en archivos que
contienen 40 segundos de grabacin (cada archivo).
Registros simultneos de seis cultivos o menos.- La aen se
recoge de una matriz con seis microcanales, a travs de los electrodos sumergidos en los pozos; la seal aumenta su valor con
el amplificador Aleria E2 Drive.
Los valores son registrados dentro de un ordenador con ayuda
del software Aleria E2 Soft, utilizando una frecuencia de 10 000
muestras por segundo. Cada archivo que se genera contiene 15
min de grabacin.
El software utilizado, para el procesamiento de datos de las
seales es:
Matlab para cuantificar los pa y graficar de los resultados.
Aleria E2 Soft para cuantificar la cantidad de bursts.
Caractersticas del algoritmo para
la cuantificacin de pa
93
94
Al multiplicar los 16 valores del listn de corte, por los nueve valores de los tiempos de duracin mxima, por los cinco
valores de los tiempos de duracin mnima, por los seis valores
de la frecuencia de corte, da un total de 4 320 combinaciones
de valores paramtricos que pueden ser considerados para procesar los registros y contar a los pa.
Resultados
Se utilizan los registros de cuatro diferentes cultivos para evaluar el algoritmo (en forma de rutina de Matlab) y para encontrar la mejor combinacin en los valores paramtricos para la
cuantificacin de la aen.
La frecuencia de corte del filtro se determina al eliminar la posible frecuencia de 50 Hz (lnea de voltaje) y su tercera armnica
de 150 Hz. Algunos de los valores paramtricos se descartan manualmente, al identificar pa falsos positivos y pa falsos negativos.
La seleccin del resto de los valores paramtricos se basa en los
que presentan menos variacin al cuantificar la aen por minuto.
Por lo tanto, los parmetros ptimos para el conteo de pa en
los registros de los dispositivos polimricos son:
Frecuencia de corte = 150 Hz.
Margen inferior = 0 ms.
Margen superior = 2.5 ms.
Listn de corte (threshold) = 170 V.
Esto quiere decir que el algoritmo ptimo para el procesamiento de datos debe de consistir en una rutina que
aplica un filtro pasa altas, con una frecuencia de corte de
150 Hz, que cuente a todas aquellas seales que valgan o
95
sobrepasan el umbral de 170 V y que tengan una duracin menor a 2.5 ms.
Conteos de pa por unidad tiempo
Al seleccionar un minuto como unidad de tiempo para el conteo
de pa, la aen se puede representar grficamente en la figura 32.
Figura 32. Spikes por minutos. Grfica que muestra la cantidad de pa por minuto
de en un cultivo neuronal tpico. El eje horizontal representa la escala del tiempo
en minutos y el eje vertical representa la cantidad de pa que el cultivo neuronal
dispara. La variacin de la aen en un cultivo va de 30% a 50%.
400
350
300
Spikes
250
200
150
100
50
0
20
96
40
60
Minutos
80
100
120
120
100
Spikes
80
60
40
20
00
50
100
150
Minutos
200
250
97
Spikes Amplitud
900
800
700
600
500
400
300
200
2
100
1
50
98
100
150
Minutos
200
250
99
Figura 35. Conteo de pa por minuto. La aen se interrumpe en el minuto 120 por un
lavado de medio extracelular. El registro de la aen se realiza bajo una temperatura de
25 C y aumenta en el minuto 500 por un aumento de temperatura a 37 C.
1000
8000
Spikes
6000
4000
2000
100
200
300
400
500
600
Minutos
100
Figura 36. Grfica con las amplitudes de los pa. Representacin grfica de las
amplitudes de los pa de la aen mostrada en la figura 36.
800
120
700
100
Spikes Amplitud
600
80
500
400
60
300
40
200
20
100
50
100
150
Minutos
200
250
Conclusiones y discusin
1) La investigacin neurocientfica suele procesar la aen considerando la forma de onda de la seal; sin embargo, los
cultivos neuronales tienden a presentar cambios de actividad y cambios en la forma de onda de las seales; algunos
de estos cambios no son justificables y se dan a lo largo del
tiempo, pero algunos otros de esos cambios si son justificables como cuando ocurre alguna perturbacin fsica, al
recibir un ligero golpe (al mover de lugar el soporte de las
clulas) u ocurre algn cambio qumico (como renovar el
neurobasal, ya sea por pipeteado o perfusin) (Abberger et
al., 2006).
101
102
103
CAPTULO 5
REGISTROS DE ACTIVIDAD ELCTRICA
NEURONAL
105
El dispositivo polimrico propuesto est diseado para poder utilizar diversos tipos de frmacos a los cultivos y poder
registrar su aen.
Cultivos celulares de hipocampo
Los cultivos celulares, utilizados en la presente tesis, son neuronas de hipocampo que requieren de 10 a 14 das de desarrollo
para poder obtener registros de aen de ellas.
Factores que intervienen en el crecimiento celular
Las condiciones comunes que afectan el desarrollo de un
cultivo celular son: fluctuaciones de temperatura en la incubadora, uso de fungicida concentrados, falta de agua dentro de la incubadora que garantice condiciones de humedad
para el cultivo, incorrecta presin osmtica en el medio (de
260 a 350 mOsmol
) (Invitrogen) y tener un nivel distinto a
kg
7.3 de pH para el cultivo celular (Potter & DeMarse, 2001).
De las causas mencionadas anteriormente, las que son ms
comunes en la mortalidad celular y por lo tanto, se debe tener
mayor cuidado son:
Hiperosmolalidad
Cuando se trabaja con cultivos neuronales en solucin salina es recomendable ajustar su osmolaridad dentro del rango
de 325 a 335 mOsmol
(Kimura et al., 1997). El ajuste de oskg
molaridad se logra incorporando NaCl o H2O (Nunemaker
et al., 2003).
106
Si el medio extracelular que se utiliza es neurobasal, la osmolaridad debe tener un valor cercano a 290 + 10 mOsmol
(Hamkg
marstrm & Gage, 1998).
La evaporacin del medio extracelular provoca cambios de
osmolaridad, causando que su valor se incremente y un aumento de aen (Claverol-Tintur, Ghirardi et al., 2005).
Cuando este incremento de osmolaridad excede de 50
mOsm (existe hiperosmolaridad), entonces el medio se convierte en letal para las neuronas (Potter & DeMarse, 2001);
esta es la causa tpica de muerte en los cultivos celulares (Morin
et al., 2005).
La presencia de gla en alta densidad sobre el cultivo celular
puede afectar el nivel osmolaridad.
Una infeccin en el cultivo
Una infeccin en el cultivo puede tener su origen en el molde empleado para contener a las clulas, en agentes patgenos
areos existentes dentro de la incubadora, en trabajar con los
cultivos dentro de un ambiente no estril o en pipetas que son
introducidas dentro del cultivo para el cambio de medio.
Objetivos del captulo
Los objetivos del presente captulo son:
1. Demostrar que el dispositivo polimrico puede registrar
cambios de aen al realizar pruebas farmacolgicas sobre
cultivos neuronales.
2. Caracterizar y comparar las tcnicas de perfusin y pipeteo para renovar el medio extracelular o para introducir
frmacos en el medio extracelular del cultivo.
107
108
109
aen espontnea
110
500
450
400
400
350
Spikes
300
250
300
200
150
200
100
50
100
0
Promedio
200
400
Minutos
600
800
1000
111
112
Figura 39. Cambio de aen. Esta imagen muestra la aen de un cultivo neuronal; al
principio la aen es en forma de bursts, donde grupos de neuronas disparan al mismo
tiempo. En el minuto 720 y 840, al renovar el medio extracelular (tcnica de pipeteo),
se trajo como consecuencia que las neuronas dejaran de disparar grupalmente (bursts) y,
empezarn a disparar de manera individual y con mayor frecuencia.
1200
1000
Spikes
800
600
400
200
0
0
200
400
Minutos
600
800
1000
Figura 40. Cambio de aen al cambiar neurobasal por solucin salina. Respuesta
obtenida al cambiar el medio extracelular neurobasal por solucin salina (despus
de cada 5 min). El eje vertical indica el nmero de pa por minuto. Las barras
representan el promedio de la aen por minuto (normalizada con respecto al
promedio total), tambin estn acompaadas con su desviacin estndar. El eje
horizontal representa el tiempo que transcurre (unidades en minutos).
Pipeteos con solucin salina
8
6
4
2
0
1
3 5 7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
glutamato y haloperidol, en diversas concentraciones, sobre los cultivos neuronales (sembrados dentro de las piezas
polimricas).
Los resultados son representados en grficas de barras con
su respectiva desviacin estndar (barras de error). Las grficas muestran el promedio de la aen de diversos cultivos neuronales antes, durante y despus de incorporar el frmaco.
Tetradotoxina (ttx)
El ttx tiene un efecto inhibitorio, la aen tiende a disminuir conforme se incorpora mayor concentracin de frmaco, ya sea a
travs de pipeteo (figura 41) o a travs del sistema de perfusin
(figura 42).
114
Figura 41. Introduccin de ttx por pipeteo. Representacin del cambio de aen
ante diversas concentraciones de ttx introducidas mediante pipeteo.
Tetrodotoxina
3
2.5
2
TTX
1.5
Control
1
0.5
0
0,01 nM
0,1 nM
1 nM
10 nM
25 nM
Figura 42. Introduccin de ttx por bomba peristltica. En esta grfica se muestra el cambio
de aen al introducir ttx mediante un sistema de perfusin con bomba peristltica.
Tetrodotoxina
7
6
5
TTX
Control
4
3
1
0
0.01 nM
0.1 nM
1 nM
10 nM
25 nM
115
Acetilcolina
La acetilcolina produce un efecto excitatriz en las neuronas del
hipocampo (figura 43).
Pentilenotetrazol (ptz)
El frmaco ptz produce un efecto excitatriz en la aen; sin embargo, en altas concentraciones, produce una saturacin en la
actividad neuronal y posteriormente provoca una reduccin de
la aen (figura 44).
Glutamato
El glutamato tiene un efecto excitatriz, pero a concentraciones
altas, ocurre algo similar como con el frmaco ptz (figura 45):
el tiempo de disparo se reduce y le prosigue un periodo de calma dando la impresin que las neuronas se inhiben en lugar de
excitarse (figura 46).
Haloperidol
El frmaco haloperidol muestra efectos de mortalidad neuronal; adems, en cuanto mayor sea la concentracin, mayor es la
disminucin de la aen (figura 47) y es irreversible.
116
5
4.5
4
3.5
3
Acelticolina
2.5
Control
2
1.5
1
0.5
0
10 M
20 M
30 M
40 M
50 M
PTZ
Control
3
2
1
0
1 mM
2 mM
4 mM
5mM
6mM
117
1.5
Control
1
0.5
0
10 M
20 M
30 M
40 M
50 M
10
15
20
Minutos
25
30
35
40
0.6
Control
0.4
0.2
0
10 M
45 M
Discusin
Todas las pruebas son realizadas en neuronas sanas, con la
finalidad de estudiar el efecto de los frmacos en la aen con
objetividad.
Todos los datos, con la respuesta de los frmacos, son presentados en grficas de barras: concentracin del frmaco contra
el nivel de aen.
Caractersticas de los electrodos
Una de las cuestiones claves en el registro de la aen, es el tipo
de electrodos que se utilizan. En electrofisiologa, el electrodo
119
120
Figura 48. aen con electrodos de plata clorificados. La grfica muestra la cantidad
de pa (eje vertical) por minuto (eje horizontal), de un cultivo neuronal al ser
registrado por electrodos de plata con una cubierta de cloruro de plata. La cubierta
fue creada a travs de la exposicin de los electrodos a leja. En esta grfica se puede
apreciar como la aen va decayendo con forme transcurre el tiempo.
3.5
x 104
Spikes
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Minutos
121
Figura 49. aen con electrodos de plata sin clorificar. Esta es la aen registrada por
12 horas con electrodos de plata sin clorificar. La aen se mantiene con la misma
variabilidad desde que comienza el registro hasta que termina.
1 200
1000
Spikes
800
600
400
200
0
0
100
200
300
400
500
600
700
Minutos
Otro tipo de electrodos con los que se realizaron pruebas, fueron electrodos de fsforo de bronce con una cubierta de bao de oro. Debido a que su grosor (2.54 mm lado
por lado) es mayor que los electrodos de plata (0.4 mm de
dimetro), los electrodos de fsforo de bronce demuestran
tener una menor sensibilidad a las vibraciones mecnicas
exteriores y poder disminuir la presencia de ruido mecnico en los registros. Sin embargo, experimentalmente se ha
demostrado que los electrodos de fsforo de bronce tienen
la desventaja de ser dainos para el cultivo celular en exposiciones superiores a 60 min.
122
123
Sin embargo, cada cultivo neuronal vara su aen de manera distinta, debido a que cada cultivo introduce un nmero particular
de neuritas dentro microcanal y forma su red neuronal particular.
Sistema de perfusin
Un sistema de perfusin tiene mejores ventajas que la tcnica manual de pipeteo; ya que un sistema de perfusin puede
controlar mejor la cantidad de nutrientes y toxinas del medio
extracelular (Jennings et al., 2004; Abberger et al., 2006).
La aplicacin del sistema de perfusin debe ser continua (24
horas), as el cultivo neuronal se acostumbra al movimiento del
medio y se garantizar que al introducir frmacos, los posibles
cambios que ocurran en la aen sean por el efecto del frmaco
mismo y no por las corrientes del medio extracelular.
Uno de los problemas que se tiene al incorporar un frmaco
de efecto temporal a travs del sistema de perfusin, es que el
sistema puede ser tan lento que las neuronas reaccionen con la
incorporacin gradual del frmaco, y que cuando se termine de
renovar el medio extracelular con la concentracin correspondiente del frmaco, entonces las neuronas no reaccionen de la
misma manera a que si hubiera renovado el medio extracelular
con la dosis del frmaco en un instante.
Conclusiones
1) Los cambios de medio extracelular causan una alteracin
en la aen durante los primeros 20 a 25 min. Despus de
124
125
126
CAPTULO 6
CONCLUSIONES
127
128
129
rona. Para este proceso sera necesario auxiliarse de las tcnicas de fluorescencias para teir los cultivos neuronales.
2) Los pozos tienen una capacidad de 100 L a 250 L, lo
que facilita que el medio extracelular sea susceptible a la
evaporacin al pasar uno o dos das sin renovarlo. Por lo
tanto el cultivo neuronal est limitado a tener que recibir renovacin de medio extracelular de manear constante
para evitar incrementos de osmolaridad.
3) La seccin de amplificacin incrementa el valor de la seal
registrada por los dispositivos polimricos. Esta seccin
puede estar constituida por un amplificador prefabricado.
La etapa de amplificacin es un amplificador prefabricado,
como Multichannel Systems, Aleria E2 Drive o un amplificador fabricado a la medida. La cantidad de canales
disponibles del amplificador limita la cantidad de registros
que se pueden realizar de manera simultnea, sobre los cultivos neuronales.
4) Los registros de la aen de un cultivo celular estn limitados a que tienen que ser en condiciones de incubadora,
es decir: alta humedad y 5% de CO2; pero esto significa
que el amplificador y el sistema de perfusin deben de
operar tambin dentro de estas condiciones. Sin embargo, la electrnica no est adaptada para trabajar bajo las
condiciones mencionadas, lo que provocar que no opere
de manera correcta a lo largo del tiempo.
5) El registro de la aen est limitado a trabajar en condiciones de apantallamiento elctrico, para evitar interferencias
de seales de ruido elctrico de 50 Hz provenientes de la
red o de otros aparatos electrnicos. Por lo que se est limitado a trabajar con el sistema de perfusin y amplificador
130
dentro de una incubadora apantallada o tener una miniincubadora dentro de una jaula de Faraday.
Contribuciones
Las aportaciones de esta tesis son:
1) Introduccin y desarrollo de un dispositivo polimrico
para el registro de actividad electrofisiolgica de bajo costo, prctico, sencillo, porttil y de fcil manipulacin.
Facilidad de que ms personas puedan realizar investigacin electrofisiolgica porque se requiere de menos
equipo, menos conocimiento tcnico, menos capacitacin
y por lo tanto menos errores.
2) Acierto en el registro no invasivo de la aen sobre neuronas
cultivadas en un dispositivo.
Acierto en la creacin y el registro simultneo de matrices de seis dispositivos polimricos y de matrices de 40
dispositivos polimricos. El registro se realiza a travs de
Aleria Biodevices para seis dispositivos y Multichannel
Systems para 40 dispositivos.
3) Aplicacin del dispositivo polimrico en investigaciones
electrofisiolgicas como material didctico, para demostraciones en tiempo real de la aen de los cultivos neuronales y del tipo de respuesta que se obtiene al ser estimuladas
por algn frmaco.
4) Reduccin del nmero de ratones sacrificados para el
estudio de electrofisiologa. Una hembra ratn preada
puede tener hasta una docena de embriones, lo equivalente a sembrar decenas de cultivos neuronales in vitro, en
131
132
rente al del ratn, como las neuronas de caracol (ClaverolTintur, Ghirardi et al., 2005).
2) La cantidad de neuronas sembradas en un pozo, van
desde 50 000 hasta 75 000 (densidad de 1 773 a 2 660
neuronas ); esto garantiza que habr neuronas cercanas
mm2
al microcanal y que sus neuritas crecern dentro del
microcanal para poder registrar la aen.
Sin embargo, esta densidad tambin puede provocar
que ms de una neurita se introduzca al microcanal y por
lo tanto se registre aen de ms de una neurona por microcanal; este tipo de acontecimiento genera dificultad para
determinar la participacin individual de cada neurona.
Por lo tanto, como proyecto futuro se propone bajar
la densidad del cultivo neuronal a 100 neuronas
mm2 (ClaverolTintur & Pine, 2002) y desplazar las neuronas del cultivo
neuronal hacia la entrada del microcanal con la tcnica de
pinzas lser (Pine & Chow, 2009).
Tambin se podra emplear la tcnica de patterning sobre
el sustrato del dispositivo polimrico (antes de ser ensamblado), para que crezcan una o dos microislas (Chena et al.,
2004) en la entrada del microcanal; de esta manera se podra
monitorear la conectividad de las neuritas y estudiar la aen
de una sola neurona o de un grupo reducido de neuronas.
3) Dentro del proceso de microfabricacin de la matriz de
pdms con 40 dispositivos polimricos, la etapa para perforar la matriz requiere de esfuerzo fsico (80 Kg de fuerza) y
de un tiempo de 10 min. Adems la base del soporte para
la perforacin de la matriz es de aluminio.
Por lo tanto, se propone que en un futuro se cambie el
material de elaboracin de la base del soporte de perfora-
133
134
135
tenido de un pozo se cambie una vez por da, lo cual equivale a 150 L por 24 horas, 2.50 L por minuto 0.04 L
por segundo.
9) Las piezas polimricas podran tener corte anatmico esbelto, donde se siga el contorno de los pozos (en forma de
nmero ocho) y de esta manera se podra reducir el material de silicona utilizado, para abaratar su costo; tambin,
existira menos superficie de contacto entre la pieza polimrica y la base de sustrato, y as se disminuira la probabilidad de que alguna impureza impidiera a la pieza polimrica adherirse completamente sobre la base de sustrato.
Las consecuencias de una falsa unin entre la pieza polimrica y la base del sustrato han provocado que el medio
extracelular se escape, dejando seco al cultivo neuronal o
que se vace parcialmente, y que el medio extracelular est
en contacto con el interior del otro pozo, creando cortocircuitos y registros de mediciones falsas.
10) El dispositivo polimrico slo registra la aen espontnea
y estimulada farmacolgicamente. Se podra trabajar en
la electrnica para que el dispositivo polimrico pudiera
aplicar estimulacin elctrica a los cultivos neuronales y
de esta manera registrar la aen estimulada elctricamente.
11) Una propuesta para mejorar el anlisis de datos es usar la
funcin sumatoria sum (Mtetwa & Smith, 2006), para aumentar el valor de los pa y hacer ms confiables los resultados.
136
ANEXOS
137
Otra desventaja que presenta el molde de MMA como posible molde maestro, es que la silicona slo se cura de manera
parcial y se observa formacin de burbujas.
Molde de epoxi.
Otro tipo de molde que se puede fabricar, siguiendo el protocolo anterior, es utilizando la resina epoxi Embed.812 (figura 50).
El problema que se presenta, es que la silicona pdms tambin reacciona con esta resina de manera como lo hace con
la resina MMA, provocando una curvatura cncava en su superficie; esto trae como consecuencias que al curar una nueva
pieza pdms sobre este molde de resina epoxi, la nueva pieza
de pdms no sea completamente plana y los bordes del microcanal no hagan buen contacto sobre la placa de Petri donde
se desea depositar.
El problema de la concavidad del material puede ser solucionado si se utiliza una base de material slido para crear el
mster, como lo es el vidrio, y de esta manera slo es necesario
que las micropistas y las columnas sean de resina (figura 51).
Si se utiliza una matriz de pdms con 80 perforaciones y 40
microcanales, y se coloca sobre una base cuadrada de vidrio de
100 x 100 x 3 mm, con la cara hacia abajo (microcanales en
contacto con el sustrato de vidrio); se pueden rellenar fcilmente los microcanales con resina epoxi Embed-812, ya que su
nivel de viscosidad baja permite acceder por capilaridad dentro
de los microcanales.
Los pozos pueden ser rellenados con resina epoxi Araldite
502, ya que su viscosidad es superior a Embed-812. Al final se
puede obtener una estructura como se muestra en la figura 51.
Desafortunadamente los pozos de las matrices de pdms (80
pares de pozos) no son completamente perpendiculares al pla-
138
Figura 50. Molde de resina epoxi. Pieza formada con base, columnas y una micropista de
resina epoxi Embed 812. Ntese la curvatura de la base de las dos columnas, lo que hace
poco til la pieza resultante en pdms tras la colada, curado y desmoldado. La curvatura
hace imposible una buena adherencia para el cultivo y registros electrofisiolgicos.
139
Figura 51. Molde mixto de vidrio y epoxi. Este molde contiene columnas y
micropistas de epoxi sobre una base de vidrio.
140
Base
Estructura de pozos
Tapa
141
Valor
Tapa
2.32 cm
Base
1.43 cm
3.67 cm
7.42 cm
Cuadro 4.
Material PS
Densidad
Valor
g
1.07 cm3
Tapa
2.48
Base
1.53
142
g
cm3
g
cm3
g
3.93
cm3
g
7.94
cm3
143
Pieza 1
Pieza 3
Pieza 7
Pieza 2
Pieza 5
Pieza 3
Pieza 6
Pieza 8
144
Figura 54. Procedimiento de uso de las herramientas. Esta imagen explica la forma
en que son utilizadas las piezas de aluminio como herramientas para el corte de las
piezas polimricas.
Pieza 4 y 5 succionan
la Silicona
Pieza 4 y 5
sern el soporte
Se apoya en la pieza
7 para realizar cortes
longitudinales
Se coloca encima la
pieza 7
145
Velocidad
5s
500 RPM
40 s
4000 RPM
Cuadro 6.
Tiempo
Velocidad
10 s
500 RPM
40 s
3000 RPM
147
148
149
Se esterilizan todos los dispositivos para contener a las clulas, con rayos uv de 15 a 20 min.
Se transporta el vial con las clulas del contenedor de nitrgeno lquido a la sala de cultivo.
Se coloca el vial en bao Mara por 2.5 min a 37 C.
Dentro de condiciones estriles se abre el vial y se extrae
slo el crioprotector y se agrega 1 ml de neurobasal dentro
del vial, se vaca el contenido en otro tubo con 2 ml de
neurobasal extra.
Con un pipeteador se agita varias veces el contenido (succionando y expulsando) para disgregar a las clulas.
El ndice de mortalidad con estas clulas es de 50%.
Anexo E-3 Recubrimiento de poli-L-lisina sobre placas
La poli-L-lisina es clave para poder sembrar los cultivos disgregados, en caso de que no se emplee este tipo de sustancia,
las neuronas tienden a agregarse entre ellas mismas, formando
grupos grandes, lo cual da como resultado que 15% de los cultivos sean tiles para realizar registros; en cambio, cuando se
utiliza poli-L-lisina el xito supera a 50%.
Procedimiento:
Se coloca el material dentro de la cabina de flujo y se esteriliza con uv por 20 min.
Se toma poli-L-lisina con una pipeta y se deposita en la
superficie de la placa de Petri.
Se llena, aparte, una placa de Petri de 35 mm con agua
estril (1 o 2 ml) y se coloca junto a las dems placas, esta
servir para mantener condiciones de humedad.
150
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171
172
Mea
mems
pa
pcb
pdms
ps
ptz
rms
rp
ttx
uv
Tridimensional
Actividad elctrica neuronal
Anlisis de varianza
Puntos por pulgada (Dots per inch)
Litografa para el moldeo electroformado (Lithography galvanoforming (electroplating) Abformung
(moulding)
Matriz de microelectrodos (microelectrode array)
Sistemas micro electro-mecnicos (Micro-electromechanical systems)
Potencial de accin
Parque Cientfico de Barcelona
Polidimetilsiloxano
Poliestireno
Pentilenotetrazol
Valor cuadrtico medio (Root mean square)
Revoluciones por minuto
Tetrodotoxina
Ultravioleta
173
NDICE
Agradecimientos ................................................................... 7
Captulo 1. Introduccin....................................................... 9
Introduccin..................................................................... 9
Motivacin ..................................................................... 10
Objetivos......................................................................... 12
Estructura de la tesis........................................................ 14
Captulo 2. Introduccin a los registros
electrofisiolgicos neuronales .............................................. 17
Introduccin................................................................... 17
Neurona.......................................................................... 18
Registro electrofisiolgico de la actividad
elctrica neuronal (aen)................................................... 22
Tcnica de patterning....................................................... 25
Microestructuras............................................................. 29
Propuesta de proyecto de tesis: tecnologa
dos pozos y un microcanal .............................................. 31
Conclusiones................................................................... 38
Captulo 3. Microfabricacin de dispositivos
polimricos.......................................................................... 41
Introduccin .................................................................. 41
Objetivos ........................................................................ 42
Materiales y mtodos....................................................... 43
Microfabricacin del mster por electrodeposicin
de nquel......................................................................... 49
Resultados....................................................................... 59
Conclusiones................................................................... 76