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Taller N-1

1. Seleccionar un artculo
2. Seleccionar una tcnica
3. Preparar los conceptos de la tcnica seleccionada: fundamento,
aplicaciones, ventajas y desventajas
4. Proponer un ejemplo de un experimento donde utilizara la tcnica
seleccionada por qu y para qu.
Desarrollo:
1. Seleccionar un artculo:

2. Seleccionar una tcnica: PCR en tiempo Real o PCR cuantitativa.


3. Fundamentos de la tcnica: La PCR en tiempo Real o PCR
cuantitativa es una tcnica cuyo objetivo es obtener una gran cantidad
de copias de un fragmento de ADN de inters, partiendo de una
pequea muestra. Se lleva a cabo gracias a un termociclador (que tiene
la capacidad de hacer incidir sobre una muestra gracias a un haz de Luz
con una longitud de onda determinada y detectar la fluorescencia
expresada por el flourocromo excitado).

Esta tcnica se caracteriza por tener varios ciclos (25-40 veces), de igual
manera a su vez se distingue por tener varias etapas al igual que la
PCR convencional:
1. Desnaturalizacin (95C): separa las dos hebras del DNA molde de
doble hlice.
2. Anillamiento (Menor o igual 60 C): Unin de primer a la secuencia
complementaria, Taq polimerasa extiende cada primer, provee el
grupo de su extremo 3` por la polimerizacin de dNTP`s
3. Extensin (60-72 C): Elongacin de la cadena mediante la DNA
polimerasa.
Requerimientos:
-ADN molde
-Par de cebadores o primers especficos
-dNTP`s
-Tampn de reaccin adecuado
-ADN polimerasa termoestable
En esta tcnica se emplea un molde de ADN, un par de cebadores o
primers especficos, dNTP`s, una tampn de reaccin adecuado y una
ADN polimerasa termoestable. A la anterior mezcla se le agrega una
sustancia que posee un florforo (los sensores del termociclador
excitan al flourforo para medir la generacin de los productos
especficos).A esta tcnica se le conoce como PCR en tiempo-real o
PCR cuantitativa ya que la anterior medicin se realiza luego de cada
ciclo de amplificacin (PCR inmediato o de manera simultnea).
En conclusin la PCR en tiempo real surgi para resolver el problema de
la cuantificacin de la tcnica de la PCR, es por eso que en esta tcnica
se emplean sondas marcadas con fluorocromos y sondas de hidrlisis
que son oligonucletidos que presentan flourocromos en ambos
extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del fragmento
de ADN que se quiere amplificar. A diferencia de la PCR comn, la PCR
en tiempo real es una tcnica netamente cuantitativa.
Aplicaciones: Los principales usos son:
-Diagnstico: Enfermedades
genticas, entre otras.

infecciosas,

cncer,

anormalidades

-Usos Microbiolgicos: Seguridad y deterioro de alimentos, riegos


microbiolgico, calidad del agua, entre otras
-Usos en investigacin: Mediciones cuantitativas de la transcripcin y
expresin gnica.
-Deteccin de Fito patgenos: Ejemplo Phytophthora ramorum y sondas
taqman.
-Deteccin de Organismos genticamente modificados
Ventajas:
-Proporciona informacin cuantitativa
-Mayor sensibilidad frente a la PCR tradicional lo que disminuye los
falsos negativos
-Rapidez y menor probabilidad de contaminacin con lo que disminuye
los falsos positivos
-El hecho de que los datos sean tomados en la fase exponencial del
proceso permite y asegura que ningn componente pueda estar
limitando el proceso de amplificacin
4. Proponer un ejemplo de un experimento donde utilizara la tcnica
seleccionada por qu y para qu.
Camila es una mujer de 23 aos, trabaja y vive con tu pap, debido a
que su madre muri cuando ella era pequea por causas desconocidas.
Desde hace varios das Camila presenta una rara sintomatologa en su
cuerpo y organismo que la tiene algo alterada y preocupada, pues no
era comn. Ha presentado sntomas distintos, pero nunca acaban, como
diarrea, vomito, acompaado de una gran ansiedad por comer, se siente
constantemente deshidratada, fiebre, malestar general, cansancio
extremo, y debilidad en sus extremidades, algo bastante extrao es que
el color de sus ojos y piel se han alterado pues nota un cambio muy
drstico en ellos, su estatura est disminuyendo y con ella algunas
partes de su cuerpo como manos, pies y nariz. Desde entonces decidi
acudir al mdico sin embargo, a pesar de varios exmenes y controles
con distintos especialistas, no ha obtenido resultado sobre su rara
enfermedad.
Hace unos das, Camia decidi pedir unas vacaciones e irse de viaje con s
su padre al pueblo en donde naci su madre, pues tena en mente que el
estrs y otros factores del medio ambiente podan estar asociados a ello. Al
llegar una vieja amiga de su madre al verla sorprendida le dijo, la misma

enfermedad de tu madre y la bisabuela de ella Nunca nadie supo de qu se


trataba a pesar de los medicamentos y tratamientos que se le dieron, pero era
los mismos rasgos de tu enfermedad
Qu habr ocurrido a Camila, y que tiene en comn con su madre y con
algunas personas de su familia, pero nunca nadie pudo diagnosticar? Qu
hacer?
Podramos estar hablando de alguna enfermedad hereditaria que nunca fue
estudiada o que nunca ha sido descubierta. EL proceso a seguir, seria extraer
una muestra de ADN de Camila, y determinar qu tipo de enfermedad padece
Camila, pues si no es estudiada y analizada, podra seguir transmitindose de
generacin en generacin.
La tcnica usada es PCR en tiempo Real, pues mediante ella, el gen en estudio
puede ser fcilmente amplificado con los partidores adecuados y
posteriormente secuenciado, logrando as determinar si Camila porta alguna
mutacin que logre explicar la presencia de esta rara enfermedad.
Referencias Bibliogrficas:
-Watson, J, D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R
(2004).Molecular Biology of the Gene (Fifth edition edicin). San Francisco:
Benjamin Cummings.
-http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/pcrtiempo.pdf
-http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/realtime_pcr.pdf
-Bustin,S.A. 2005a. Real-Time PCR. In: Encyclopedia of Diagnostic Genomics
and Proteomics M.Podda & J.Fuchs, editors. Marcel Dekker.New York, p.
1131-1135.

-Bustin,S.A. 2005b. Real-Time Reverse Transcription PCR. In: Encyclopedia of


Diagnostic Genomics and Proteomics M.Podda & J.Fuchs, editors. Marcel
Dekker.New York, p. 1131-1135.

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