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Introduccin
A pesar de que, como ya se ha indicado, la cromatografa es bsicamente una tcnica de
separacin, su gran capacidad para resolver muestras complejas ha conducido a utilizarla
cada vez ms como tcnica analtica. Esta utilizacin, ha conducido al desarrollo de una
instrumentacin, que utilizando siempre la separacin por elucin, puede operar en
continuo, con mayor eficacia en la separacin y con un mayor control de las condiciones
cromatogrficas para incrementar la reproducibilidad de los resultados.
Entre las tcnicas cromatogrficas utilizadas con fines analticos, la cromatografa de gases
es probablemente la tcnica de ms amplia utilizacin; ninguna tcnica analtica puede
ofrecer su capacidad de separacin o su sensibilidad a la hora de analizar compuestos
voltiles. Por otra parte, el hecho de que con esta tcnica las mezclas sean separadas en fase
gaseosa, establece los lmites de su utilizacin, que estarn marcados fundamentalmente
por la estabilidad trmica de los compuestos a separar. Por lo general, la utilizacin de la
cromatografa de gases est restringida a la separacin de compuestos con un peso
molecular menor de 1000 a una temperatura mxima de trabajo de aproximadamente 400
EC; dentro de estos lmites, como ya se ha mencionado, la nica limitacin existente ser la
estabilidad trmica de la muestra.
Para realizar una separacin mediante cromatografa de gases, se inyecta una pequea
cantidad de la muestra a separar en una corriente de un gas inerte a elevada temperatura;
esta corriente de gas, atraviesa una columna cromatogrfica que separar los componentes
de la mezcla por medio de un mecanismo de particin (cromatografa gas lquido), de
adsorcin (cromatografa gas slido) o, en muchos casos, por medio de una mezcla de
ambos. Los componentes separados, emergern de la columna a intervalos discretos y
pasarn a travs de algn sistema de deteccin adecuado, o bien sern dirigidos hacia un
dispositivo de recogida de muestras.
Detectores
Sistema de deteccin.
A continuacin se describen las caractersticas ideales del detector para la cromatografa de
gases y posteriormente se analizaran los sistemas de deteccin ms utilizados. En algunos
casos en los cromatgrafos de gases se acoplan a los instrumentos espectroscpicos como
los de infrarrojo. En estos casos el dispositivo espectromtrico sirve no slo para detectar la
aparicin de los analitos, sino tambin para identificarlos.
excitarlos para as poder obtener sus espectros de emisin atmica caractersticos. Por lo
tanto, el dtector de emisin atmica es un detector selectivo del elemento.
Detectores fotomtricos de flama (FPD)
Se utiliza de manera extensa por el anlisis de contaminantes del aire y el agua, de
plaguicidas y de los productos de la hidrogenacin de carbn.
Se trata de un detector selectivo que es sensible sobre todo en compuestos que tienen azufre
y fsforo. El eluyente de este detector se hace pasar a travs de una flama de hidrgeno-aire
a baja temperatura, la cual convierte parte del fsforo en una especie de HPO que emite
bandas de radiacin centradas alrededor de 510 y 526 nm.
Columna cromatogrfica
Al igual que sucede en todas las tcnicas cromatogrficas, la columna es el corazn del
cromatgrafo de gases. Es necesario tener siempre presente que la columna es el autentico
elemento de separacin de los componentes de la muestra; as, una mala eleccin de la
columna, una columna deteriorada o unas condiciones de trabajo inadecuadas, nunca
permitiran obtener buenos resultados aunque se disponga del mejor equipo en el resto del
cromatgrafo, siendo adems las causas citadas las responsables de la inmensa mayor parte
de los problemas que se encuentran a la hora de realizar un anlisis por cromatografa de
gases.
Una columna para cromatografa de gases, esta formada por un tubo, que puede ser de
diversos materiales (preferiblemente inertes), dentro del cual se encuentra la fase
estacionaria.
Esta puede ser un solido activo (cromatografa gas solido), o con mayor frecuencia un
liquido depositado sobre las partculas de un solido portador (columnas empaquetadas o de
relleno) o sobre las propias paredes del tubo (columnas tubulares abiertas).
Columnas empaquetadas
Las columnas empaquetadas consisten, como ya se ha mencionado, en un tubo
(normalmente de vidrio o acero inoxidable) con un dimetro interno que varia entre 2 y 5
mm y de una longitud que oscila entre 1 y 15m, arrollado de una forma adecuada para
poderse introducir en el interior del horno del cromatgrafo.
En el interior del tubo, se dispone la fase estacionaria bajo la forma de un liquido soportado
sobre un material adecuado finamente pulverizado; el dimetro de las partculas del relleno
debe ser, al menos, 10 veces inferior al dimetro del tubo, con el fin de conseguir una buena
uniformidad en su distribucin. El relleno, se encuentra confinado en el interior del tubo
por medio de tapones de algn material poroso (generalmente lana de vidrio o lana de
cuarzo) situados en los extremos.
La longitud, y consecuentemente la eficacia, de las columnas empaquetadas se encuentra
limitada fundamentalmente por la cada de presin del gas portador entre cabeza y salida de
columna.
Columnas WCOT (Wall Coated Open Tubular). En este tipo de columnas (que son
las de uso mas frecuente), la fase estacionaria se encuentra depositada formando una
pelcula liquida directamente sobre las paredes del tubo.
Columnas PLOT (Porous Layer Open Tubular). En estas columnas la pared interna
del tubo esta recubierta por una capa de un soporte adsorbente; si a su vez el soporte
esta impregnado con una fase estacionaria liquida, las columnas son denominadas
SCOT (Support Coated Open Tubular).
Es evidente que la permeabilidad de las columnas tubulares hacia los gases es mucho
mayor que la de las columnas empaquetadas (del orden de 100 veces mayor), por lo que
este tipo de columnas pueden tener unalongitud bastante grande (son muy frecuentes
columnas de 50 m) sin provocar presiones excesivamente elevadas en cabeza de columna.
El enorme uso que se hace de este tipo de columnas es debido fundamentalmente a que la
elevada eficacia que ofrecen (son frecuentes valores de 30.000 a 50.000 platos frente a los
2.000-4.000 de una columna empaquetada) permite la separacin de mezclas muy
complejas con relativa facilidad; por otra parte, la gran eficacia de este tipo de columnas
permite conseguir buenas resoluciones sin recurrir a fases estacionarias de gran
selectividad, lo que simplifica mucho el problema de la eleccin de la fase estacionaria
(prcticamente todas las separaciones se pueden realizar con tres o cuatro columnas
diferentes).
El principal inconveniente de este tipo de columnas es su pequea capacidad de carga, lo
que obliga a utilizar sistemas de inyeccin especiales para introducir pequeas cantidades
de muestra y detectores de muy alta sensibilidad. No obstante, tanto las columnas SCOT
como las WBOT de dimetros mayores de 0,5 mm (columnas Wide Bore) ofrecen una
capacidad de carga suficiente como para poder inyectar cantidades del orden de 1 l sin
utilizar un splitter con una perdida de eficacia relativamente pequea. Las columnas de
este tipo tienen una utilizacin potencial muy alta en el campo del anlisis de trazas.
Fase estacionaria
Las propiedades necesarias para una fase estacionaria lquida inmovilizada son:
1. Caractersticas de reparto (factor de capacidad ' y factor de selectividad )
adecuados al analito.
2. Baja volatilidad, el punto de ebullicin de la fase estacionaria debe ser al menos
100 C mayor que la mxima temperatura alcanzada en el horno.
3. Baja reactividad.
4. Estabilidad trmica, para evitar su descomposicin durante la elucin.
Existen como mucho una docena de disolventes con estas caractersticas. Para elegir uno,
debe tenerse en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad del analito, mayor
polaridad deber tener la fase estacionaria. Algunas fases estacionarias utilizadas
actualmente (2005) son:
reaccin por radicales libres que tiene como resultado la formacin de un enlace carbonocarbono que adems incrementa su estabilidad trmica. Otra forma es la irradiacin
con rayos gamma.
Otro tipo de fase estacionaria son las quirales, lo cual permite resolver
mezclas enantiomricas. Este tipo de fases suelen ser aminocidos quirales o algn
derivado adaptado al trabajo en columna.
Introduccin
En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna
que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las
interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y
estacionaria
A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento
(HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o
la estabilidad trmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales
lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto
peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor
gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.
HPLC preparativa
Es la tcnica escogida para aislamiento y purificacin de productos de valor en las
industrias qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologa y la bioqumica. La
cromatografa preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el
aislamiento de 1g de muestra para identificacin espectroscpica hasta el aislamiento de
un compuesto puro de una mezcla de 100 g.
Columnas y precolumnas.
Detectores.
Los detectores de HPLC deben tener un volumen muy pequeo, debe ser compatible con el
flujo permanente de un lquido, ser sensible y reproducible. Como no existe un detector
universal que sea suficientemente sensible, los tipos de detectores que se emplean
dependen de la naturaleza de la muestra. En la Tabla siguiente se enumeran los detectores
ms usados y sus caractersticas ms destacadas.
Detector de HPLC
Lmite tpicos de
deteccin de masa
(picogramos)
Rango lineal
(decenas)
Absorbancia
10
3-4
Fluorescencia
0.010
Electroqumico
100
4-5
Indice de refraccin
1000
Espectrmetro de masas
<1
FTIR
106
Dispersin de luz
106
Fotmetros y espectrofotmetros.
los que se emplea un sistema ptico invertido: la celda se irradia con luz policromtica, la
luz emergente incide en la red de difraccin y all es dispersada hacia el elemento
fotosensible, que consiste en un conjunto de fotoclulas o fotodiodos montados sobre un
chip de silicio. De esta forma se logra no solo medir la intensidad de la luz transmitida a
una dada longitud de onda, sino todo el espectro de absorcin discreto en cada intervalo.
La informacin es luego procesada por un adquisidor de datos y software.
- Otro detector de considerable aplicacin se basa en el cambio del ndice de refraccin del
solvente a causa de la presencia de molculas de analito. Se trata de un detector universal
que responde a la presencia de cualquier soluto sin selectividad alguna. Sus desventajas
son la baja sensibilidad y la imposibilidad de operar con gradientes de elucin.
Inyectores
El mtodo de introduccin de la muestra en CLAE, es de importancia capital, pues un mal
sistema de inyeccin puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatogrfica que
deterioren la eficacia del sistema cromatogrfico.
Un inyector ideal debe tener las siguientes caractersticas:
- Introducir la muestra en la columna como una banda lo ms estrecha posible.
- Ser de fcil manejo.
- Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada como en el
ensanchamiento que origina en la banda cromatogrfica.
- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de
vlvula.
Inyectores de jeringa
Inyectores de vlvula
Este sistema de inyeccin consiste en una vlvula de seis vas, dos de las cuales estn
conectadas entre s por medio de una espira ("loop"). Esta espira es un tubo de volumen
conocido, cuya misin es la de contener la muestra antes de efectuarse la inyeccin.
La introduccin de la muestra en la columna se lleva a cabo en dos etapas; la primera se
realiza a presin atmosfrica, y consiste en cargar la muestra en la espira con ayuda de una
jeringa; en la segunda, mediante un giro de la vlvula, se hace pasar el eluyente a travs de
la espira hacia la columna.
Fundamento
La cromatografa en capa fina (en ingls thin layer chromatography o TLC) es una tcnica
analtica rpida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de Qumica Orgnica. Entre
otras cosas permite: Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar
as, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificacin. Comparar muestras. Si dos
muestras corren igual en placa podran ser idnticas. Si, por el contrario, corren distinto
entonces no son la misma sustancia. Realizar el seguimiento de una reaccin. Es posible
estudiar cmo desaparecen los reactivos y cmo aparecen los productos finales o, lo que
es lo mismo, saber cundo la reaccin ha acabado. La muestra a analizar se deposita cerca
de un extremo de una lmina de plstico o aluminio que previamente ha sido recubierta de
una fina capa de adsorbente (fase estacionaria). Entonces, la lmina se coloca en una cubeta
cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente o fase mvil). A medida
que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a travs del adsorbente, se produce
un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el
adsorbente.
Adsobentes y eluyentes
Los dos adsorbentes (fase estacionaria) ms ampliamente utilizados son la gel de slice
(SiO2) y la almina (Al2O3), ambas de carcter polar. La almina anhidra es el ms activo
de los dos, es decir, es el que retiene con ms fuerza a los compuestos; por ello se utiliza
para separar compuestos relativamente apolares (hidrocarburos, haluros de alquilo, teres,
aldehdos y cetonas). El gel de slice, por el contrario, se utiliza para separar sustancias ms
polares (alcoholes, aminas, cidos carboxlicos). El proceso de adsorcin se debe a
interacciones intermoleculares de tipo dipolodipolo o enlaces de hidrgeno entre el soluto
y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a analizar y no actuar como
catalizador en reacciones de descomposicin. El adsorbente interacciona con las sustancias
mediante interaccin dipolodipolo o mediante enlace de hidrgeno si lo presentan.
dietil-ter etanol
t-butil-ter
metanol
cloroformo
cido actico
Revelado de las placas
La mayor parte de las placas de cromatografa llevan un indicador fluorescente que permite
la visualizacin de los compuestos activos a la luz ultravioleta (254 nm). El indicador
absorbe la luz UV y emite luz visible. La presencia de un compuesto activo en el UV evita
que el indicador absorba la luz en la zona en la que se encuentra el producto, y el resultado
es la visualizacin de una mancha en la placa que indica la presencia de un compuesto. En
el caso de compuestos que no absorben luz UV, la visualizacin (o revelado) del
cromatograma requiere utilizar un agente revelador. Este tiene que reaccionar con los
productos adsorbidos proporcionando compuestos coloreados.
Reveladores ms comunes para cromatografa en capa fina
Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden
revelarse mediante:
a) Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria
impregnada con un indicador fluorescente (F25a o F366), el nmero que aparece como
subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del indicador utilizado.
b) La introduccin de la placa en vapores de yodo
c) El roco con una solucin de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento
especialmente protegido y bajo una campana de extraccin de gases). Despus calentar
intensamente, por ejemplo, con un mechero hasta carbonizar los compuestos.
Adsorbentes ms comunes para cromatografa en capa fina.
a) Gel de slice (se utiliza en el 80% de las separaciones)
b) Oxido de Aluminio Almina (cida, neutra o bsica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
d) Poliamidas
Para la seleccin del adsorbente deber tomar las siguientes consideraciones:
a) Polaridad
b) Tamao de partcula
c) Dimetro
d) rea Superficial
e) Homogeneidad
f) Pureza
Factores que influyen en una separacin por cromatografa de capa fina.
a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben ms en la fase estacionaria.
b) La cromatografa debe llevarse a cabo en un rea sin corrientes de aire.
c) Limpieza de las placas. Muchas placas estn contaminadas con grasa o agentes
plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequea escala, stas deben limpiarse corriendo
primero una mezcla de cloroformo y metanol y despus dejar secar completamente antes de
aplicar la muestra.
d) Pureza de los disolventes.