HEMOGRAMA

AUTOMATIZADO
Lic Mara J.Ojeda
Ctedra de Hematologa
FCBYF-UNR
2015

AUTOMATIZACIN del HEMOGRAMA

Mayor eficiencia ya que permite procesar un gran N de muestras

Incremento de la productividad en el laboratorio

Exactitud y Precisin

Capacidad de medir nuevos parmetros innovadores

Bioseguridad

COMPONENTES BSICO DE UN CONTADOR

HEMATOLGICO

Todo conteo celular comparte tres pasos bsicos :

Dilucin de la sangre
Toma de una cantidad medida de muestra
Enumeracin de partculas

PRINCIPIOS GENERALES DE DETECCIN

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IMPEDANCIA (RESISTENCIA) ELECTRNICA

PRINCIPIO DE COULTER
Clulas malas conductoras de electricidad
El principio de impedancia en el recuento de clulas
se basa en la deteccin y medicin de cambios en la
resistencia elctrica producida por las clulas
cuando atraviesan una pequea abertura.
Las clulas suspendidas en un diluyente conductor
de la electricidad, se hacen pasar a travs de una
apertura (orificio), el paso de cada clula individual
aumenta
transitoriamente
la
impedancia
(resistencia) elctrica entre dos electrodos que estn
situados a cada lado de la apertura causando un
cambio en el voltaje entre los dos electrodos
proporcional al cambio de la resistencia y as, al
volumen de la clula que pasa a travs de la
apertura.

LA AMPLITUD DEL PULSO DE VOLTAJE GENERADO ES DIRECTAMENTE

PROPORCIONAL AL TAMAO DE LA PARTCULA.

EL NMERO DE PULSOS ES PROPORCIONAL AL NMERO DE

CLULAS CONTADAS.
El tamao de la apertura para
los GR y PLQ es ms pequeo
para aumentar la sensibilidad
del recuento plaquetario

LO QUE PERMITE LA DISCRIMINACIN Y EL CONTEO DE CLULAS

DE TAMAO ESPECIFICO

CONDUCTIVIDAD ELCTRICA
La radiofrecuencia (RF) o la resistencia a la corriente electromagntica de alto
voltaje a veces se utiliza junto con la la resistencia a la corriente continua de
bajo voltaje.
CORRIENTE CONTINUA(CC): altura del pulso ~ volumen celular
RADIOFRECUENCIA (RF): altura del pulso ~ tamao y densidad nuclear

MTODOS PTICOS
PRINCIPIO DE LA CITOMETRA DE FLUJO
las clulas de la muestra son alineadas para que una a una pasen a travs
de la regin sensora donde interceptan un haz de luz focalizado
generando seales pticas (que corresponden a distintas parmetros
fsicos o bioqumicos de cada clula) de dispersin y fluorescencia.
las cuales son convertidas en pulsos elctricos proporcionales, digitalizadas
y almacenadas en la PC.

El nmero de pulsos generado es directamente proporcional al nmero de clulas que

atraviesan la zona de sensora (recuento celular)

SEALES DE DISPERSION

Mismo color (=l) que la luz incidente, en todas las direcciones

Nos brindan informacin sobre la morfologa de las clulas

Forward scatter, Dispersin

Frontal, FSC
Tamao Celular

Se mide en ngulo pequeo (0-5)

Side Scatter, Dispersin

Lateral , SSC
Complejidad Interna

Generalmente se mide a 90

SEALES DE FLUORESCENCIA

Fluorescencia debida a marcas exgenas

Menor E, mayor l, distinto color que la luz

incidente, en todas las direcciones, generalmente
se mide a 90

Nos brindan informacin

estructurales y funcionales.

sobre

parmetros

CD3 FITC

La citometra de flujo es una tcnica multiparamtrica: puede medir

simultneamente de 3 a 20 parmetros por clula individual.

ENFOQUE HIDRODINAMICO
Sistemas pticos
La muestra diluida es inyectada a presin en el
centro de un fluido envolvente dentro de una
cmara cnica, esto genera un flujo laminar
que logra ordenar a las clulas para que
circulan una a una por el centro del haz de luz.

Este enfoque hidrodinmico aumenta la

exactitud y precisin porque disminuye la
coincidencia y porque las clulas son alta y
uniformemente iluminadas.

COINCIDENCIA
2 o ms clulas llegan juntas a la regin
de anlisis y sean analizadas como 1 sola

ENFOQUE HIDRODINAMICO
Sistemas Impedancia (algunos)
La muestra diluida es inyectada a presin en el
centro de un fluido envolvente dentro de una
cmara cnica, esto genera un flujo laminar
que logra ordenar a las clulas para que
circulan una a una por el centro de la apertura.

Aperture
Critical Zone

El enfoque hidrodinmico aumenta la exactitud y

precisin porque:
disminuye la coincidencia
evita acumulacin de protenas
elimina errores por la recirculacin de clulas
elimina errores por la deformacin de las clulas

Otros contadores para disminuir estos errores

utilizan sistemas de limpieza, mecanismo de
retrolavado o flujo de barrido y correccin
electrnica de la coincidencia.
Seal C

Seal A

Seal B

Todo equipo automatizado, suministra dos tipos de resultados: un informe

numrico y un informe grafico.
A partir de las seales generadas por los detectores y procesadas
automticamente se presentan en pantalla las representaciones grficas de las
distintas poblaciones celulares mediante citogramas e histogramas.
Los histogramas son grficos de un solo parmetro que proporcionan
informacin sobre el nmero de clulas y la intensidad del parmetro medido
(eje X).
Citogramas o dispersogramas relacionan 2 o 3 parmetros. Intensidad del
parmetro 1 (eje Y) vs Intensidad del parmetro 2 (eje X)
HISTOGRAMA

CITOGRAMA

CONTADORES HEMATOLGICOS MODERNOS PUEDEN

COMBINAR EN UN MISMO ANALIZADOR VARIOS MTODOS DE
DETECCIN Y DE CARACTERIZACIN CELULAR
IMPEDANCIA ELECTRICA
RADIOFRECUENCIA O CONDUCTIVIDAD ELCTRICA
CITOMETRA DE FLUJO

DISPERSIN PTICA
FLUORESCENCIA
ABSORCIN DE LA LUZ (HEMOGLOBINA)
CITOQUMICA (PEROXIDASA)
LISIS SELECTIVA (Basfilos)

DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Se suele utilizar el sobrante de la dilucin con que se realiz el conteo de WBC.
Casi todos los equipos utilizan un mtodo fotomtrico
Mtodo de la Cianmetahemoglobina modificado o mtodo libre de cianuro,
En la celda de flujo de la

HGB, un LED emite un haz de 540-555 nm que

impacta con la muestra en la celda de flujo. La concentracin de la HGB se
mide por absorbancia. Esta absorbancia se compara con la de la diluyente solo
(background) que se midi antes de la adicin de la muestra.

Mtodo colorimtrico SLS - Sulfato Lauril de Sodio

Reactivo libre de cianuro
Amigable al medio ambiente
Mejores resultados de hemoglobina para muestras
con conteo de leucocitos altos
con lipemias
con protenas anormales

SLS-Hb

Grupos hidrofobicos de la molcula de SLS se une a la molcula de globina

Cambio en la configuracin
Oxidacin: Fe 2+ --> Fe 3+
Grupos hidrofilicos de la molcula de SLS se une al Fe --> SLS-Hb

RECUENTO DE GLBULOS ROJOS Y PLAQUETAS

RBC/ PLT
Impedancia (con/sin enfoque hidrodinmico)
ptico dispersin y/o fluorescencia
Impedancia y ptico
DISCRIMINADORES FLOTANTES

Para determinar cuales son los pulsos que representan los RBC y cuales son
los pulsos que representan las PLTs, los equipos utilizan los discriminadores
fijos o flotantes (que se mueven para adaptarse a las poblaciones celulares).
PLT = 2 - 30 fl (tamao entre 8-12 fl)
RBC = 25 - 250 fl (tamao entre 80-100 fl)

HISTOGRAMA DE ERITROCITOS
RBC: Approx. 25 - 250 fL

LD (Lower Discriminator): 25 a 75 fL
UD (Upper Discriminator): 200 A 250 fL .

ALERTAS PUEDEN DEBERSE:

DESVIACIN A LA IZQUIERDA
RBC fragmentos
Plaquetas gigantes
Microcitos
DESVIACIN A LA DERECHA
WBC fragmentos
Macrocitos
Crioaglutininas

Nmero relativo

HISTOGRAMA DE PLAQUETAS

PLT: Approx. 2 - 30 fL
LD (Lower Discriminator): 2 a 5 fL
UD (Upper Discriminator): 25 a 30 fL .

LD

UD

ALARMA
LRI (Low Region Interference)
Se debe a la acumulacin de datos en la
regin de 2 3 fl. Causas :
Microplaquetas
Hemlisis
Fragmentos celulares
Crioglobulinas
Inclusiones intraeritrocitarias
Residuos en la apertura

ALARMA
URI (Upper Region Interference)
Se debe a la acumulacin de datos
entre los 20 y 40 fl. Causas :
Acumulacin de plaquetas
Macroplaquetas
Eritrocitos Microcticos
Agregados plaquetarios
Eritrocitos Fragmentados

HEMATOCRITO - NDICES CORPUSCULARES

VCM DIRECTO
(volumen corpuscular medio)
Media o promedio de todos los pulsos
analizados en el intervalo de distribucin
GR.

HEMATOCRITO DIRECTO
Se mide sumando todos los pulsos
analizados en el intervalo de distribucin
GR.

Volumen
conocido

PARMETROS DERIVADOS
HCT = RBC X MCV/10
HCM = HGB/RBC X 10
CHCM = HGB/HCT X 100

PARMETROS DERIVADOS
VCM = HCT/RBC X 10
HCM = HGB/RBC X 10
CHCM = HGB/HCT X 100

CHCM DIRECTA
El reactivo de dilucin para el RBC/PLT del ADVIA 120 contiene SDS y glutaraldehdo que
torna a la clulas isovolumetricas esfricas y las fija. Eliminados as el factor de variabilidad
debido a la forma.

Macrocytic

Normocytic
Normochromic

Microcytic
28

41

HGB Concentration - CHCM

High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)

Volume - MCV

Hyperchromic

Volume - MCV

Low angle scatter 2o - 3o (Volume)

HGB Concentration - CHCM

ADE RDW
Ancho de distribucin de la curva de los eritrocitos
INDICE DE ANISOCITOSIS

Parmetro exclusivo del Hemograma Electrnico

La amplitud de distribucin eritrocitaria (RDW-Red cell Distribution Width) se

expresa como la desviacin estndar del volumen celular (SD) o como el coeficiente
de variacin (CV), el cual deriva de una frmula matemtica en la que se relaciona
la desviacin estndar y el volumen corpuscular medio.

Coeficiente de variacin alrededor de la media

(VCM) en la curva de distribucin del volumen
de los glbulos rojos

Medida directa (en fl) del ancho de la curva de

los glbulos rojos (RBC) Tomada 20% arriba de
la lnea base. A esta altura es donde se
encuentra la mayor variacin de tamaos de las
clulas.

VN RDW-SD 39-49 fl
VN RDW-CV 11-13%

RDW-SD aumentado
RDW-CV aumentado

RDW-SD disminuido
RDW-CV normal

HISTOGRAMA DIMRFICO. COEXISTEN DOS POBLACIONES

En el ejemplo: Terapia con hierro
Una poblacin correspondiente a los eritrocticos microcticos residuales y
la segunda a eritrocitos de tamao normal.

PARAMETROS PLAQUETARIOS
PLAQUETOCRITO (PCT): fraccin del volumen sanguneo total ocupada por
las plaquetas. VR = 0.15 a 0.45 %
VMP (Volumen medio plaquetario)
VR = 6.9 a 10.5 fL
PDW (PLT Distribution Width ) o ADP (ancho de distribucin plaquetaria)
Mide (fl) la amplitud de la distribucin tomada al 20%.
Medida anisocitosis plaquetaria.
VR = 15.4 a 16.8 %
P-LCR (Large Platelet Ratio) 3 discriminador fijo en 12 fL
% de de plaquetas grandes, superiores al discriminador 12 fL
VR = 15 -35 %

RECUENTO TOTAL DE LEUCOCITOS

DIFERENCIAL DE 3 COMPONENTES

HISTOGRAMA DE LEUCOCITOS

WBC: Approx. 30 - 300 fL

LD (Lower Discriminator): 30 and 60 fL

UD (Upper Discriminator): 300 fL (para monitorear errores).
RECUENTO DIFERENCIAL DE 3 COMPONENTES
Discriminator 1 (T1) - Discriminator 2 (T2)
LYM #
El recuento de linfocitos se realiza entre LD y T1
MXD#
Clulas mixtas se cuentan entre T1 y T2 (suma de monocitos, basfilos y
eosinfilos)
NEUT#
El recuento de neutrfilos se realiza entre T2 y UD

RECUENTO DIFERENCIAL DE 5 COMPONENTES (SYSMEX)

CANAL DIFF

CANAL WBC/BASO

STROMATOLYSER-4 DL & STROMATOLYSER4 DS (Colorante Fluorescente + diluyente y

STROMATOLYSER-FB (Lisis Selectiva)
lisante de GR)

CANAL DIFF
Posicin de las clulas anormales

RECUENTO DIFERENCIAL DE 5 COMPONENTES (SIEMENS)

SISTEMA PANDA
(Perox-Activity & Nuclear Density Analysis)
REACTIVO 1: Lisa GR y fija GB
REACTIVO 2: sustrato forma un precipitado negro debido a la actividad de la
Peroxidasa Celular
Scatter signal 5-15 tamao
nuclear

Seal Absorcin actividad de

la peroxidasa

Cel type

Peroxidase

Neutrophil
Eosinophils
Basophils
Lymphocytes
Monocytes

2+
4+
-1+
1+

Las clulas con alta actividad de Peroxidasa absorben ms luz.

The Baso Method

REACTIVO: lisa GR y PLQ y el CP
de los GB excepto en los Basfilos

Neu

Mo

Linf

BASOFILOS

Eo
Mo - Linf

debris

PMN
Noise

RECUENTO DIFERENCIAL DE 5 COMPONENTES (COULTER)

TECNOLOGIA VCS
VOLUME

Impedancia CC

CONDUCTIVITY

SCATTER

Medida por RF
Medida por CMF
Medida de la complejidad interna
Medida de la granularidad,
incluyendo composicin qumica y lobularidad nuclear y estructura
tamao nuclear.
de la superficie celular

VCS
Utilizando 3 fuentes independientes de energa (CC, RF y
LASER) permite el anlisis simultaneo (en el mismo canal)
de 3 propiedades de cada clula analizada.

CITOGRAMA 3D

EJE X DISPERSIN DE LA LUZ

EJE Y VOLUMEN
EJE Z CONDUCTIVIDAD

RECUENTO DIFERENCIAL DE 5 COMPONENTES (ABBOTT)

GRANULOCITOS

NUEVOS PARMETROS
PARMETROS

PARMETROS

PARMETROS

ERITROCITARIOS

LEUCOCITARIOS

PLAQUETARIOS

Recuento de reticulocitos

Granulocitos Inmaduros

Fraccin de plaquetas

Eritrocitos Nucleados

Linfocitos Atpicos

IRF (fraccin de ret

inmaduros)
Hb reticulocitaria
Eritrocitos fragmentados

Stem Cells
Malaria

inmaduras

RECUENTO DE RETICULOCITOS Y

IRF (FRACCIN DE RETICULOCITOS INMADUROS)

CANAL RETICULOCITO
RET-SEARCH (II) - (Diluyente
& tincin)

LFR = FRACCIN DE RETIC

DE BAJA FLUORESCENCIA
LMR = FRACCIN DE RETIC
DE FLUORESCENCIA MEDIA
HFR = FRACCIN DE RETIC
DE ALTA FLUORESCENCIA
IRF = MFR + HFR
INDICE DE MADURACION DE
LOS RETICULOCITOS

NORMAL

ANEMIA
REGENERATIVA

FRACCIN DE PLAQUETAS INMADURAS (IPF)

PLAQUETAS RETICULADAS

Newly produced platelets that have remains of RNA in their cytoplasm.

Reflects rate of thrombopoiesis.

ERITROCITOS FRAGMENTADOS (FRC FRAGMENTED RED CELL)

parmetros de investigacin

HB RETICULOCITARIA (CHr)
Es una medida directa de la hemoglobina presente en los reticulocitos en
sangre perifrica.
Valores de CHr menores a 26 pg. indican una inadecuada disponibilidad de hierro (Fe) para
una ptima eritropoyesis.

til para la determinacin precoz de la disminucin de los depsitos de hierro

ERITROCITOS NUCLEADOS
NRBC (nucleated red blood cells)

CANAL IMI
STROMATOLYSER-IM

NORMAL

Leucemia

SYSMEX

SIEMENS

COULTER

ABBOTT

Analizadores automatizados proporcionan informacin rpida y til del

recuento, la morfologa y la funcin celular.

LA AUTOMATIZACIN ES UN
COMPLEMENTO Y NO UN
SUSTITUTO DE LOS MTODOS
MANUALES