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1. Introduccin
Las enzimas son generalmente protenas de alto peso molecular (15.000 < MW <varios
millones de daltons) que actan como catalizadores. Recientemente, se ha demostrado
que algunas molculas de ARN tambin son catalticas, pero la gran mayora de las
reacciones celulares estn mediadas por catalizadores de protenas. Molculas de ARN
que tienen propiedades catalticas son llamados ribozimas. Las enzimas son
catalizadores biolgicos especficos, verstiles, y muy eficaces, dando como resultado
velocidades de reaccin mucho ms altos en comparacin con reacciones catalizadas
qumicamente en condiciones ambientales. Se conocen ms de 2000 enzimas. Las
enzimas se nombran aadiendo el sufijo -asa hasta el final del sustrato, tal como
ureasa, o la reaccin catalizada, tales como alcohol deshidrogenasa. Algunas enzimas
tienen una estructura simple, tal como una cadena polipeptdica plegada (tpico de la
mayora de enzimas hidrolticas). Muchas enzimas tienen ms de una subunidad.
Algunas enzimas de protenas requieren un grupo no proteico para su actividad. Este
grupo es o bien un cofactor, tales como iones metlicos, Mg, Zn, Mn, Fe, o una
coenzima, tal como una molcula orgnica compleja, NAD, FAD, CoA, o algunas
vitaminas. Una enzima que contiene un grupo no proteico se llama una holoenzima. La
parte proteica de esta enzima es la apoenzima (holoenzima = apoenzima + cofactor o
coenzima). Las enzimas que se producen en varias formas moleculares diferentes, pero
catalizan la misma reaccin, se llaman isoenzimas. Algunas enzimas se agrupan para
formar complejos enzimticos. Las enzimas son sustrato especfico y se clasifican de
acuerdo con la reaccin que catalizan. Las principales clases de enzimas y sus
funciones se enumeran en la Tabla 3.1.
2. Como las enzimas trabajan
Las enzimas disminuyen la energa de activacin de la reaccin catalizada por la unin
del sustrato y formando un complejo enzima-sustrato. Las enzimas no afectan a la
variacin de energa libre o la constante de equilibrio. La figura 3.1 ilustra la accin de
una enzima desde el punto de vista activacin-energa. Por ejemplo, la energa de
activacin para la descomposicin de perxido de hidrgeno vara en funcin del tipo
de catlisis. La energa de activacin de la reaccin no catalizada en 20C es de 18
kilocaloras por mol (Kcal / mol), mientras que el valor para E catalizado
qumicamente (por platino coloidal) y catalizada enzimticamente (catalasa)
descomposicin son 13 y 7 Kcal / moles, respectivamente. Es decir, la catalasa acelera
la velocidad de reaccin en un factor de alrededor de 10 8. El lector debe notar que este
gran cambio en la tasa de cambio relativamente pequeo en energa de activacin se
debe a la dependencia exponencial de la tasa sobre la energa de activacin. En este
caso, la relacin de las tasas es exp (-7000/2*293)/exp (-18.000/2*293).
An no se entienden completamente los aspectos moleculares de la interaccin
enzima-sustrato.
Esta interaccin vara de un complejo enzima-sustrato a otro. Diversos estudios
utilizando de rayos X y espectroscopia Raman han revelado la presencia del complejo
enzima-sustrato (ES). La interaccin entre la enzima y su sustrato es por lo general por
las fuerzas dbiles. En la mayora de los casos, las fuerzas de van der Waals y enlaces
de hidrgeno son responsables de la formacin de complejos ES. El sustrato se une a
un sitio especfico en la enzima conocida como el sitio activo. El sustrato es una
molcula relativamente pequea y cabe en una cierta regin en la molcula de enzima,
que es una molcula mucho ms grande. El modelo ms simple que describe esta
Despejo ES
Un grfico de 1/v frente a 1/ [S] se obtiene una lnea recta con una pendiente de
Km/Vm y el eje y de intercepcin de 1/Vm, tal como se representa en la Fig. 3.5. Un
grfico de doble recproco da buenas estimaciones sobre Vm, pero no necesariamente
en el Km. Debido a que el error sobre el recproco de un punto de datos no es
simtrica, el lector debe tener cuidado en la aplicacin de anlisis de regresin
(mnimos cuadrados) para dichos grficos. Los puntos de datos a bajas concentraciones
de sustrato influyen en la pendiente y la interseccin ms que las altas
concentraciones de sustrato.
3.3.2 Grfico EadieHofstee
La ecuacin
puede reordenarse como: 3.14
Un grfico de v en funcin de V/ [S] resultado en una lnea de pendiente -Km y el eje y
en el origen de Vm, como se muestra en la Fig. 3.6. Diagramas Eadie-Hofstee pueden
estar sujetos a errores grandes, ya que ambos contienen coordenadas u, pero hay
menos sesgo en los puntos a baja [S].
3.3.3 Grfico Hanes-Woolf
Reordenando la ecuacin
obtenemos 3.15
Un grfico de [S] /v frente a [S] da como resultado una lnea de pendiente 1/Vm y el eje
y en el origen de Km/Vm, como se muestra en la Fig. 3.7. Esta trama se utiliza para
determinar con mayor precisin Vm.
3.3.4 Cintica por lotes (discontinuo). El curso temporal de la variacin de [S] en una
reaccin enzimtica por lotes puede determinarse a partir de:
Un grfico de 1/t ln [S0]/ [S] versus {[S0] - [S]}/t resulta en una lnea de pendiente
-1/km e intercepto de Vm/Km.
3.3.5 Interpretacin de Km y Vm
Mientras Km (o K'm) es un parmetro intrnseco, Vm no lo es. Km es nicamente una
funcin de los parmetros de velocidad y se espera que cambie con la temperatura o el
pH. Sin embargo, Vm es una funcin del parmetro de velocidad k2 y el nivel de la
enzima inicial, [E0]. Como [E0] cambia, tambin lo hace Vm. Por supuesto, k2 se puede
calcular fcilmente si [E0] se conoce. Para las preparaciones de enzimas altamente
purificadas puede ser posible expresar [E0] en trminos de mol/L o g/L.
Cuando la enzima es parte de una preparacin en bruto, su concentracin es en
trminos de "unidades". Una "unidad" es la cantidad de enzima que da una cantidad
predeterminada de la actividad cataltica bajo condiciones especficas. Por ejemplo,
una unidad sera la formacin de un mol de producto por minuto a un pH y
temperatura especificada con una concentracin de sustrato mucho mayor que el valor
de Km. La actividad especfica es el nmero de unidades de actividad por cantidad de
protena total. Por ejemplo, un lisado celular crudo podra tener una actividad
especfica de 0,2 unidades / mg de protena que, tras la purificacin puede aumentar a
10 unidades / mg de protena. Slo las enzimas que permanecen catalticamente
activas sern medidas. La enzima puede ser desnaturalizada si se desarrolla o tiene su
forma tridimensional alterada por pH extremos o la temperatura durante la
purificacin. La enzima desnaturalizada no tendr actividad.
Ejemplo 3.1 Para medir la cantidad de glucoamilasa en una preparacin de enzima
cruda, se aade 1 ml de la preparacin enzimtica en bruto que contiene 8 mg de
protena a 9 ml de una solucin de almidn 4,44%. Una unidad de actividad de
glucoamilasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 mol de glucosa por
min en una solucin de 4% de almidn Lintner a pH 4,5 y en 60C. Experimentos
velocidad inicial muestran que la reaccin produce 0,6 mol de glucosa / ml-min. Cul
es la actividad especfica de la preparacin de enzima en bruto?
Solucin: La cantidad total de glucosa producida es de 10 ml * 0.6 mol de glucosa/ mlmin o 6 mol de glucosa por min. La actividad especfica es entonces:
Vm debe tener unidades como mol producto / ml-min. Ya que Vm = k2*E0, las
dimensiones de k2 deben reflejar la definicin de unidades en E0. En el ejemplo
anterior, tuvimos una concentracin de enzima de 8 mg de protena / 10 ml de solucin
*0,75 unidades / mg de protena o de 0,6 unidades / ml. Si, por ejemplo, Vm = 1 mol /
ml-min, a continuacin, k2 = 1 mol / ml min dividido 0,6 unidades / ml o k2 = 1,67
mol / unidad- min
3.4 Modelos para cintica enzimtica ms compleja.
3.4.1 Enzimas alostricas
Algunas enzimas tienen ms de un sitio de unin de sustrato. La unin de un sustrato a
la enzima facilita la unin de otras molculas de sustrato. Este comportamiento se
conoce como alostrico o unin cooperativa y enzimas reguladoras muestran este
comportamiento. La expresin de la velocidad en este caso es:
Figura
Un grfico de 1/v frente a [S] da como resultado una lnea con pendiente 1/Ksi*Vm y la
interseccin de 1/Vm.
La concentracin del sustrato resultante en la tasa de reaccin mxima se puede
determinar estableciendo dv/d [S] = 0. La [S] max est dada por:
Ejemplo 3.2
Los siguientes datos se han obtenido para dos concentraciones de enzima iniciales
diferentes para una reaccin catalizada por la enzima.
a. Encontrar km
Ejemplo 3.3
La hidrlisis de la urea por la ureasa es una nica reaccin parcialmente comprendida y
muestra la inhibicin. Los datos para la hidrlisis de la reaccin se dan a continuacin.
Donde v = moles / l-min y I es la concentracin molar de inhibidor.
a. Determinar la constante de Michaelis-Menten (K m) para esta reaccin.
b . Qu tipo de reaccin de inhibicin es esto? Corroborar las respuestas.
c . Sobre la base de la respuesta a la parte b, cul es el valor de Ki?
3.5 Efectos del pH y temperatura
3.5.1 Efectos del pH. Ciertas enzimas tienen grupos inicos en sus sitios activos, y
estos grupos inicos deben estar en una forma adecuada (cido o base) para funcionar.
Las variaciones en el pH del medio resultan en cambios en la forma inica del sitio
activo y cambios en la actividad de la enzima y por lo tanto la velocidad de reaccin.
Los cambios en el pH tambin pueden alterar la forma tridimensional de la enzima. Por
estas razones, las enzimas son nicamente activos en un cierto intervalo de pH. El pH
del medio puede afectar a la velocidad mxima de reaccin, Km, y la estabilidad de la
enzima. En algunos casos, el sustrato puede contener grupos inicos, y el pH del medio
afecta a la afinidad del sustrato a la enzima.
El siguiente esquema puede ser usado para describir la dependencia de pH de la
velocidad de reaccin enzimtica para ionizar enzimas.
3.53
Donde Vm es la velocidad mxima de reaccin por unidad de rea de superficie
externa y kL es el coeficiente de transferencia de masa lquida. Esta ecuacin es
cuadrtica en [Ss], la concentracin de sustrato en la superficie. Se puede solucionar
analticamente, pero la solucin es engorrosa. Adems, el valor de [Ss] no es
susceptible de dirigir la observacin experimental.
La ecuacin 3.53 puede resolverse grficamente como se muestra en la Fig. 3.18.
Dicha trama tambin hace que sea fcil de visualizar los efectos de los cambios de
parmetros tales como la velocidad de agitacin, cambios en la concentracin de
substrato en masa (granel), o carga de la enzima.
Figura 3.18. Solucin grfica de cantidad de reaccin por unidad de superficie para la
enzima inmovilizada sobre un catalizador no poroso. La curva A resulta a partir del
conocimiento de los parmetros cinticos basados en soluciones intrnsecas y la carga
de la superficie de la enzima (lado derecho de la Ec. 3.53). La lnea B es la ecuacin de
transferencia de masa (lado izquierdo de la ecuacin. 3.53). La interseccin de las dos
lneas es la velocidad de reaccin, u, que puede ser sostenido en el sistema. Se
muestran las respuestas para dos concentraciones de sustrato en masa diferentes.
Cuando en el sistema est fuertemente limitada la transferencia de masa, [Ss] = 0, ya
que la reaccin es rpida en comparacin con la transferencia de masa, y
Los procesos utilizados para producir estas enzimas industriales tienen mucho en
comn con nuestros ltimos debates sobre los procesos para fabricar protenas a partir
del ADN recombinante.
Figura 3.23. Un diagrama de flujo para la produccin de una enzima extracelular.