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Biotecnologia

ESPECTROFOTOMETRIA
1.

INTRODUO

Quando se incide um feixe de luz branca denominada policromtica sobre um prisma,


observa-se sua separao em diferentes cores, correspondentes a determinados comprimentos
de onda (Figura 1).

FIGURA 1 Espectro eletromagntico.


Na realidade, a poro do espectro eletromagntico compreendida entre 380 e 780 nm
excita a retina humana. Esta regio denominada visvel utilizada com freqncia na
determinao de inmeras substncias que formam solues coloridas.
De modo mais amplo, a espectrofotometria um processo de medida que,
basicamente, emprega as propriedades dos tomos e molculas de absorver e/ou emitir
energia eletromagntica em uma das regies do espectro eletromagntico indicado na Tabela
I.
TABELA I Caractersticas do Espectro Eletormagntico
Raios
Gama

Raios X

Ultravioleta

Visvel

Infravermelho

Microond
a

Ondas de
Rdio

Angstrom ()

10

1800

3800

7800

Nanmetro(n
m)

180

380

780

Micra ()

0.7

400

0.04

25

Centmetro
(cm)

Os nmeros indicam o limite inferior dos comprimentos de onda de cada radiao


Apesar de serem usadas diferentes unidades para medidas de comprimentos de onda, a
mais comum nas regies ultravioleta e visvel o nanmetro (1 nm = 10 -7 cm = 10-9 m); na
regio do infravermelho usa-se o micrmetro (1 m = 10 -6 m = 10-4 cm) e o nmero de onda
(cm-1). As regies de maior interesse para as anlises qumicas so as compreendidas entre
200-380 nm (ultravioleta), 380-780 nm (visvel) e 2-16 (infravermelho).
Apesar do mecanismo de absoro de energia ser diferente nas regies do ultravioleta e
do infravermelho, o processo fundamental que ocorre a absoro de certa quantidade de
energia. A energia necessria para a transio de um estado de menor energia para outro de
maior energia diretamente relacionada freqncia da radiao eletromagntica que causa
a transio. A energia absorvida dada pela expresso:
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E = hv
onde
h = constante de Planck (6,624 10-27 erg seg-1);
v = freqncia da luz incidente (ciclos por segundo, cps).
A freqncia e o comprimento de onda so relacionados por:
v = c/
onde c = velocidade da luz (2,998 1010 cm seg-1)
= comprimento de onda em cm.
As relaes bsicas entre energia (caloria/mol), freqncia e comprimento de onda so dadas
pelas seguintes expresses:
E = Nhv = Nhc/
onde
N = nmero de Avogadro;
E = energia absorvida (erg).

2.

ONDAS LUMINOSAS

As Ondas luminosas apresentam diferentes comprimentos, que podem ser longos ou curtos,
conforme mostrado na Figura 2. O comprimento de uma onda longa apresenta maior distncia
entre dois mximos consecutivos.

FIGURA 2 Comprimento de Onda (a) longa e (b) curta.


O comprimento de onda longa apresenta maior distncia entre dois mximos
consecutivos do que a curta. conhecido que uma onda luminosa apresenta pontos de picos
mximo e mnimo. A distncia entre um pico e outro consecutivo constitui o comprimento de
onda caracterstico deste feixe luminoso. O problema na anlise qumica consiste em buscar
meios para se obter luz monocromtica, isto , luz formada por um nico comprimento de
onda. Para isto, possvel utilizar-se de certos artifcios como o emprego de prismas capazes
de separar as diferentes cores do espectro e, ainda, de redes de difrao.
comum o emprego de filtros de cores diferentes para separar determinados
comprimentos de onda. Porm, o fundamento terico do fenmeno totalmente diferente dos
correspondentes aos prismas. Na realidade, um filtro de vidro, mesmo o do tipo composto,
constitudo pela associao de dois ou mais filtros de corte e que transmite uma faixa definida
do espectro, no , rigorosamente, um monocromador, porque transmite uma faixa muito
ampla do comprimento de onda. Os chamados filtros de interferncia so aqueles de pequena
faixa de emisso, transmitindo faixa de comprimentos de onda muito estreita.
Ao se incidir, por exemplo, um feixe luminoso sobre uma superfcie opaca vermelha,
esta refletir somente o comprimento de onda no absorvido, ou seja, o vermelho. Se for
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utilizada uma superfcie de cor azul, somente a luz azul ser refletida e as demais cores
absorvidas. O mesmo observado para outras superfcies opacas coloridas.
Portanto, no caso de se empregar superfcies coloridas no exemplo, vermelha e azul,
porm transparentes luz, se observar que atravessam a superfcie colorida e transparente
as cores vermelha e azul, respectivamente, ficando retidas todas as demais.
Analogamente, se forem usados dois tubos de vidro contendo solues coloridas e se
incidir um feixe de luz, como indicado na Figura 3, o fenmeno ocorrido nas superfcies
coloridas transparentes se repete, porm so as solues coloridas que absorvem os demais

comprimentos de onda.
FIGURA 3 Absoro da luz por solues coloridas.
Se interpor um filtro de cor azul entre o caminho da luz incidente (I 0) e o tubo contendo
soluo azul, como na Figura 4, observa-se que no ocorre absoro do raio luminoso
correspondente luz transmitida (I).

FIGURA 4 Absoro da Luz por filtros.


Se a soluo azul do tubo for substituda por outra de cor vermelha, o raio luminoso
ser absorvido em proporo direta concentrao apresentada pela soluo vermelha.

3.

TRANSMITNCIA E ABSORBNCIA

A relao existente entre a luz emergente ou transmitida (I) e a luz incidente (I 0),
chama-se transmitncia e o valor mximo que pode emergir 100%.
T = I / I0
Se determinada soluo no absorve energia, I e I 0 tm o mesmo valor e,
conseqentemente, T = 1.
Logo, conclui-se que uma soluo que absorva energia ter transmitncia menor que 1.
Usa-se transmitncia percentual (% T) para evitar operaes com nmeros decimais. Assim,
quando I = I0, T=100 %.
Uma expresso mais conveniente para a intensidade de absoro obtida pela lei de
Lambert-Beer que estabelece relao entre transmitncia, espessura da amostra e
concentrao das espcies que absorvem. A relao :
log10 (I0/I) = kcb = A
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onde:
k = constante caracterstica do soluto;
c = concentrao do soluto;
b = comprimento do caminho ptico atravs da amostra;
A = absorbncia.
Quando a concentrao (c) expressa em mol/l e o comprimento do caminho ptico,
em centmetro, a expresso acima torna-se:
A=cb
O termo conhecido como absortividade molar, aparecendo na literatura mais antiga
como coeficiente de extino molar. Se a concentrao de soluto, c, for definida em g/l (grama
por litro), usa-se a equao:
A = abc
onde
a = absortividade, que se relaciona com absortividade molar por

= aM
M = peso molecular do soluto.
Como a maioria das medidas fotomtricas realizada com espessura constante da
soluo, variando-se somente a concentrao, comum mencionar a Lei de Lambert-Beer
como a Lei de Beer.
A intensidade de uma banda de absoro em um espectro no ultravioleta e no visvel
usualmente expressa como a absortividade molar no mximo de absoro max ou log max.
Quando no se conhece o material que absorve, pode-se exprimir a intensidade de
absoro como:
E1% = A/cb
onde
c = concentrao em grama por 100 ml;
b = caminha ptico atravs da amostra, em centmetro.
Na Figura 5 est indicado o que ocorre ao incidir um raio luminoso sobre uma soluo.

FIGURA 5 Transmisso e absoro da luz por uma soluo.


A relao que existe entre quantidade de luz absorvida e concentrao do soluto
denominada absorbncia ou densidade ptica (DO), na literatura mais antiga.
A absorbncia proporcional concentrao de soluto e ao comprimento da espessura
da soluo pelo raio luminoso, definio que corresponde ao enunciado da Lei de Beer.
A expresso mais freqente da Lei de Beer
I =I0.10-abc
onde
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I = intensidade da luz transmitida;


I0 = intensidade da luz incidente;
a = constante de absoro do soluto ou absortividade que depende do comprimento de
onda;
b = comprimento ou espessura da soluo atravessada pela radiao, expresso em
centmetro;
c = concentrao do soluto.
A Lei de Beer tambm pode expressar-se da seguinte forma:
I/I0 = 10-abc
Aplicando-se logaritmo:
log (I/I0) = -abc
lgo (I0/I) = abc
log (100/%T) = abc
log 100 / log %T = abc
2-log % T = abc
Como (a) constante e se conhece a espessura (b) do tubo ou cubeta pelo a qual
atravessa o raio luminoso, pode-se substituir ambos os termos na expresso por K.
Assim:
2-log% T = K.c
Como a absorbncia proporcional concentrao de soluto e ao caminho ptico, o
produto K.c pode ser substitudo pela absorbncia (A), resultando a expresso:
2-log % T = A
Por esta expresso, entende-se que um valor em porcentagem de transmitncia lido na
escala do fotocolormetro pode ser facilmente transformado em absorbncia. Por exemplo:
20% de transmitncia corresponde a uma absorbncia de 0,699.
A relao entre concentrao e absorbncia linear, de maneira que possvel utilizar
tais valores para construir as curvas de calibrao ou analticas, em papel milimetrado comum.
Os valores de absorbncia medidos na maioria dos fotocolormetros so fracionrios e
de difcil leitura com exatido. Isto pode ser evitado, lendo-se a porcentagem de transmitncia
na escala 0-100% e transformando este valor em absorbncia mediante tabelas de converso
ou pela expresso A = 2 log % T.
A leitura da % T muito mais simples, mas a relao entre esta e a concentrao
logartmica, de modo que para plotar seu valor deve utilizar-se papel semilogartmico.
Os valores de absorbncia plotados em papel milimetrado, quando a Lei de Beer
obedecida, fornece uma reta perfeita, condio que no se cumpre nas curvas feitas com o %
T.
A anlise fotomtrica fundamenta-se na Lei de Lambert-Beer ou simplesmente de Beer,
que relaciona a absorbncia ou a transmitncia da energia radiante monocromtica de uma
soluo com a espessura da camada absorvente (b) e a concentrao (c), conforme
apresentado anteriormente.
A = log 1/T = abc ou A = 2-log % T
A relao indicada pelos grficos de Beer, pode ser apresentada de vrias formas,
lanando-se a transmitncia versus concentrao em papel semilogartmico ou ainda,
logaritmo da transmitncia versus concentrao ou absorbncia versus concentrao, em
papel milimetrado.
Uma relao linear em qualquer um dos grficos indica que a substncia em soluo
obedece Lei de Beer, nas condies da anlise, e pode servir de curva de calibrao para a

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determinao da concentrao de solues de mesma natureza. Atualmente, a maioria dos


equipamentos dispe de programas e expressa os resultados da determinao analtica.
A relao absorbncia-concentrao permite o clculo da concentrao de uma soluo
desconhecida pelo fator de calibrao (f) determinado pela absorbncia de uma soluo
padro (Ap) de concentrao (Cp). O fator determinado pela expresso:

Cp
Ap

Cx
Ax

Estabelecido o espectro de absoro, o comprimento de onda escolhido para a


determinao dever corresponder ao comprimento de onda de absorbncia mxima ou de
transmitncia mnima, e situar-se numa regio em que a mesma no varie acentuadamente
com o comprimento de onda.
4.

FOTOCOLORMETROS

As explicaes anteriores apontam para uma melhor compreenso dos fundamentos do uso
dos fotocolormetros, instrumentos eletrnicos destinados a permitir o clculo de
concentraes apresentadas por diferentes solues coloridas. Os fotocolormetros so
capazes de medir a quantidade de luz transmitida quando um raio luminoso incide numa
soluo colorida de concentrao conhecida ou desconhecida. Esta luz se transforma em
energia eltrica mediante o emprego de clulas fotoeltricas ou de clulas fotovoltticas
capazes de ceder eltrons em forma proporcional intensidade do feixe luminoso. O anodo
capta os eltrons emitidos e o passo seguinte medido em um galvanmetro.
Estes instrumentos utilizam luz monocromtica (Lei de Beer) e se valem para selecionar o
comprimento de onda adequado, segundo a sensibilidade do instrumento, de prismas, redes
de difrao ou filtros.Utilizam tubos de vidro ou cubetas de vidro, plsticas ou quartzo, prprias
para cada modelo de aparelho, clulas fotoeltricas e galvanmetros destinados a medir o
fluxo da corrente eltrica.
Muitos fotocolormetros utilizam o sistema de clula fotoeltrica dupla o qual anula as
desigualdades da voltagem que podem produzir-se no meio do trabalho, conforme
apresentado na Figura 6.
FIGURA 6 - Transmisso da radiao luminosa.

Concentrao de soluto elevada produzir uma diferena do potencial, pois, o raio


luminoso A no encontrar obstculo no seu caminho em direo clula A.
No obstante, o raio luminoso B ser absorvido no soluto da soluo colorida, em
proporo concentrao deste. Haver uma diferena aprecivel no fluxo de corrente eltrica
medida no galvanmetro. Estes valores so observados numa escala que permite medida em
transmitncia ou absorbncia.

4.1

ESCALAS DE LEITURA

Existem fotocolormetros que apresentam duas escalas, que se correspondem


permitindo ler porcentagem da transmitncia e/ou a absorbncia, dependendo da referncia.
A leitura em % T tem a vantagem de se obter valores numa escala entre 0 e 100,
dividido em 100 partes iguais, tornando mais fceis as leituras; 100 representa o ponto zero do
aparelho. Este fato que no acontece na escala correspondente absorbncia que,
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dependendo do valor fracionrio, de difcil medida principalmente nas extremidades de


escala.
A leitura da absorbncia encontra-se invertida da % T. Onde se l 100 % de
transmitncia, encontra-se zero de absorbncia.
aconselhvel nos fotocolormetros ler % T e transformar este valor em absorbncia
por clculo, mediante o uso de tabela de converso ou pelo uso de programa adequado.
4.2

DETERMINAO DE CONCENTRAES

4.2.1 Por comparao com soluo padro


Cada tcnica requer sua prpria curva de calibrao ou analtica, embora muitos
autores aconselhem o emprego de soluo padro, de concentrao conhecida, para se
calcular a concentrao da soluo desconhecida.
Considerando-se que a absorbncia diretamente proporcional concentrao do
soluto, ao se fazer a leitura em um fotocolormetro, o valor obtido corresponder
absorbncia, logo, ficar como incgnita conhecer sua concentrao.
Para obt-la, na prtica, ser necessrio ler a absorbncia de uma soluo padro de
concentrao conhecida e a absorbncia da soluo problema.
Com os dados experimentais indicados no exemplo a seguir, determina-se a
concentrao da soluo problema (Cx):
Ax = 0,301

(absorbncia medida da soluo problema);

Ap = 0,502

(absorbncia medida da soluo padro);

Cx = ?

(concentrao da soluo problema);

Cp = 20 mg/l (concentrao da soluo padro).


Numa faixa limitada de concentrao, onde a Lei de Beer obedecida, pode-se escrever
que:

Ax C p
Cx
A
x Cx
Cc
Ap
Ap
Substituindo-se os valores numricos, tem-se:

Cx

0,301 20
C x 12mg / l
0,502

4.2.2 Utilizando-se curvas de calibrao


Quando se trabalha com solues padro se faz uso da relao entre concentraes e
absorbncias. Entretanto, nem sempre tais solues podem se manter estveis e sua
preparao diria demanda grande perda de tempo. por isso que, com mais freqncia, se
recorre ao uso de curvas de calibrao, que facilitam e simplificam enormemente o trabalho no
laboratrio.
Para obter-se uma curva padro prepara-se soluo da substncia problema numa faixa
de concentrao prxima do valor esperado, considerado normal.
Com os valores obtidos no fotocolormetro, constri-se a curva de calibrao plotandose as leituras de transmitncia ou de absorbncia na ordenada e as concentraes na
abscissa.
A curva traada em papel milimetrado comum com as leituras expressas em
absorbncia linear desde que a Lei de Beer seja obedecida.
Sempre que o procedimento experimental for idntico ao utilizado para confeccionar
uma curva, pode-se determinar a concentrao de uma soluo desconhecida desde que se
conhea sua absorbncia.

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4.2.3 Condies para Construo de Curvas de Calibrao


As condies de trabalho para elaborao da curva com solues padro devem ser
mantidas em relao soluo problema.
Se a curva for construda com diluio de 1/10, por exemplo, a soluo problema dever
ser diluda a 1/10. Se para construir a curva foi utilizado papel de filtro faixa azul com perodo
de espera de 15 minutos e temperatura de 37C, submeter a soluo-problema a condies
idnticas.
A curva dever compreender faixas teis, ou seja, valores situados abaixo daqueles
normais, dentro do normal e acima do normal, do elemento ou substncia pesquisada.
A curva dever ser traada numa faixa de concentrao da substncia que siga a Lei de
Beer. De preferncia, utilizar a faixa do espectro na qual a energia radiante seja absorvida ao
mximo a fim de se obter maior grau de sensibilidade. Ocasionalmente, pode-se efetuar a
medida em comprimento de onda diferente daquele em que h o mximo de absoro (ou
mnimo de transmitncia) para obter linearizao, aumento da faixa de trabalho ou eliminao
de interferncias.
Anotam-se os valores das leituras, e usando papel milimetrado plotar na ordenada a
absorbncia e as concentraes na abscissa.

5.

ESPECTRO DE ABSORO

Para avaliar a regio espectral correta, deve-se elaborar a curva de absorbncia


espectral, tambm denominada espectro de absoro, que consiste em relacionar as
absorbncias ou transmitncias na ordenada e os respectivos comprimentos de onda na
abscissa, conforme indicado na Figura 7, onde a linha pontilhada corresponde ao branco.

FIGURA 7 Espectro de Absoro.


Pela Figura 7 observam-se dois picos. O primeiro apresenta absorbncias em 430 nm,
que no deve ser escolhido para as medidas, por que o branco apresenta grande absorbncia
neste comprimento. Por este fato, recomenda-se a medio em 640 nm, que apresenta maior
sensibilidade e praticamente sem influncia do branco.
Os mtodos colorimtricos e espectrofotomtricos talvez sejam os mais
freqentemente usados e importantes na anlise quantitativa. Eles se baseiam na absoro da
luz visvel ou outra energia radiante pela soluo.
A quantidade de energia radiante absorvida proporcional concentrao do material
absorvente na soluo. Assim, pela medida da absoro da luz, ou outra energia radiante,
possvel determinar-se quantitativamente a substncia absorvente presente.
O espectro de absoro de uma substncia representado pelo grfico obtido
lanando-se na ordenada a transmitncia ou a absorbncia da soluo, e na abscissa, a
variao do comprimento de onda nos limites da regio do espectro eletromagntico
considerado, como a do visvel, por exemplo, entre 380 e 780 nm. Os comprimentos de onda
relacionados neste grfico, referem-se aos comprimentos da onda central das bandas
espectrais limitadas pelo monocromador.

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Esta banda poder abranger uma faixa de ondas com diferenas de 5 a 50 nm,
caracterizando a largura efetiva da banda espectral que depende, essencialmente, disperso
do sistema e da abertura da fenda de sada do monocromador.
O espectro de absoro til para comparaes qualitativas (bandas de pequena
largura permitem a caracterizao de faixas estreitas de absoro ao longo da regio
espectral); quantitativas (bandas espectrais largas determinam faixas de absoro mais
homogneas para as medies); e para ajuste de valores nominais dos comprimentos de onda
indicados no espectrofotmetro.

6.

DESVIOS DA LEI DE BEER


As condies que devem ser respeitadas para cumprimento da lei de Beer so:
a) luz monocromtica, que significa, de um comprimento de onda determinado;
b) meio homogneo, ou seja de igual ndice de refrao em todas direes;
c) ausncia de reaes indesejveis entre molculas do soluto e molculas do solvente.

7.

DIFERENAS ENTRE ESPECTROFOTMETRO E FOTOCOLORMETRO

Os espectrofotmetros so equipamentos de composio avanada que utilizam


prismas ou redes de difrao na seleo da regio desejada do espectro eletromagntico.
Muitos deles fazem medies nas pores do espectro correspondentes ao ultravioleta (UV),
visvel (VIS) e infravermelho (IV). Na realidade estes aparelhos so absorcimetros, pois
medem energia radiante absorvida.
Os fotocolormetros ou fotmetros so aparelhos de construo simples que utilizam
filtros compostos para selecionar pores do espectro a serem utilizadas.
Os espectrofotmetros e fotocolormetros diferem entre si quanto a maior ou menor
sensibilidade e faixa de trabalho. Os espectrofotmetros so empregados na faixa
compreendida entre 200 e 1000 nm. Os fotocolormetros em geral trabalham na zona do
visvel (380-780nm).
Quanto fonte luminosa, ambos aparelhos, utilizam lmpadas de mercrio ou tubos de
descarga de hidrognio ou tambm lmpadas de filamento de tungstnio.
Para a separao dos diferentes comprimentos de onda, os espectrofotmetros utilizam,
exclusivamente, prismas ou redes de difrao. Nos fotocolormetros so usados filtros, que so
mais baratos e, s vezes, prismas ou redes de difrao.

8.

ESPECTROSCOPIA DE ABSORO ULTRAVIOLETA

A radiao eletromagntica de comprimento de onda mais curto que a luz visvel e mais
longo que os raios X chamada de luz ou radiao ultravioleta (UV). Esta luz, invisvel para o
olho humano, conhecida tambm como luz negra. A regio UV do espectro foi descoberta em
1801 por John Ritter no transcurso de experincias fotoeltricas.
A luz UV geralmente dividida em regies denominadas de ultravioleta prximo (400300 nm), afastado (300-200 nm) e no vcuo (200-4 nm). Estes ltimos comprimentos de
ondas, so particularmente prejudiciais para a vida por serem fortemente absorvidos pela
atmosfera e pela camada de oznio da Terra.
A luz UV produzida em alguns processos que geram transio da luz visvel em
tomos, no qual, um eltron de um estado energtico de alta energia retorna para um estado
energtico de menor energia.
A absoro na regio do UV e do visvel depende da estrutura eletrnica da molcula. A
absoro de energia quantizada e conduz passagem de eltrons de orbitais do estado
fundamental para orbitais de maior energia em um estado excitado. Para muitas das
estruturas eletrnicas esta absoro ocorre em uma poro pouco acessvel do ultravioleta. Na
prtica, a espectrometria no UV limitada, na maior parte, aos sistemas conjugados.
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A seletividade da absoro no UV uma vantagem, entretanto, uma vez que se pode


reconhecer grupos caractersticos em molculas de complexidade bastante varivel.
Os efeitos biolgicos da luz UV inclui bronzeamentos e queimaduras pelo sol. Exposio
excessiva tem sido ligado ao desenvolvimento de cncer na pele e catarata. A regio
ultravioleta afastada tem a capacidade de destruir certas classes de bactrias. Por esses
motivos, usada para esterilizar alguns gneros alimentcios e equipamentos mdicos.

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