Tcnicas de interaccin secundaria:

fundamentos y aplicaciones.
Comisin 4
Julieta Fernndez Lynch
mjfernandezlynch@gmail.com

Tcnicas Inmunolgicas

Se basan en la reaccin de interaccin Antgeno- Anticuerpo

(alta afinidad y especificidad )

Antgeno
Cualquier molcula o fragmento molecular que puede ser reconocido por
receptores de clulas de la Respuesta Inmune.

Determinantes antignicos
o epitopes
Regin del antgeno que se combina con el sitio de unin
de los receptores linfocitarios.

Epitopes discontinuos
conformacionales

Epitopes contnuos

Estructura de los anticuerpos

Clases de Ig - determinados por el tipo de cadena pesada

El isotipo viene determinado exclusivamente por la cadena pesada de la molcula

de Ig.

Hay 5 isotipos fundamentales o clases (IgG, IgM, IgD, IgA, IgE))

Hay isotipos menores (o subclases): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgA1 e IgA2

Los individuos normales producen todos los isotipos.

Bloquean la capacidad infectiva de microorganismos

Neutralizan toxinas y enzimas.

Favorecen la eliminacin del microorganismo (fagocitosis, activacin de

complemento, ADCC).

FUNCIONES

Policlonalidad

Produccin de Ac:
Colaboracin T-B

INMUNOGLOBULINAS:
ISOTIPOS

Clasificacin de los antgenos en funcin de las clulas

involucradas en la generacin de anticuerpos

T dependientes

-B, Th
ej. protenas

T independientes
-B, no Th
ej. polisacridos,
LPS

Caractersticas de la respuesta de Acs a Ags T-dependientes

Respuesta Primaria
Se desarrolla en 1 - 2 semanas (7-10 das)
Incluye respuesta celular y de anticuerpos
Los anticuerpos predominantes son de
isotipo IgM
Los niveles de anticuerpos declinan
rpidamente

Nivel de Acs

Respuesta Secundaria (memoria)

Se desarrolla mucho ms rpido y persiste

por ms tiempo
Incluye respuesta celular y de anticuerpos
El anticuerpo predominante es de isotipo
IgG (switch de isotipo)
Aumenta la calidad de los anticuerpos
(madurez de la afinidad)

Semanas

Unin Antgeno- Anticuerpo

Unin no covalente

Unin Antgeno- Anticuerpo

La interaccin antgeno-anticuerpo es un equilibrio qumico que

puede ser explicado aplicando la Ley de accin de masas.
Las constantes de afinidad son del orden de 1010 M-1

AFINIDAD
Es la sumatoria de las fuerzas atractivas y repulsivas entre el paratope y el
epitope especfico. Se define por una constante de equilibrio (Ka), segn la
ley de accin de masas.

AVIDEZ
Es la fuerza con la que un anticuerpo multivalente se une a un antgeno
multivalente. Su valor es mayor que la suma de las afinidades.

Interaccin Antgeno-Anticuerpo
Valencia-Afinidad/Avidez
Fab

IgG/(Fab)2

IgG/Fab)2

IgM

valencia efectiva

valencia Ag

K equilibrio

104

104

107

1011

Afinidad

Afinidad

Avidez

Avidez

Anticuerpo

Afinidad/avidez

Afinidad intrnseca

Afinidad funcional

Ag

Determinacin de
grupo sanguneo
Control de calidad de
Anticuerpos
monoclonales
PCR

Ac

HAI CHAGAS
Anticuerpos anti D
Anticuerpos antidesoxirribonucleoprot.

USOS

Registro de
productos de
diagnstico in
vitro

Caracterizacin
de Anticuerpos
Terpeuticos.

Aplicacin

Historia clnica
de pacientes,
terapeutica y/o
efectos
adversos.

Control de
calidad

Si los anticuerpos son un reactivo.

Cmo los obtengo?

Qu caracterstica
tienen que presentar?

Inmungeno

Proliferan distintos clones de LB que reconocen al Ag

SUERO POLICLONAL

En un suero policlonal hay distintas Ig, provenientes de diferentes

clones, que reconocen distintos epitopes del inmungeno o el
mismo epitope pero con distintas afinidades

Tanto el Ac naranja como el rojo reconocen al

epitope naranja aunque con distinta afinidad

Hapteno
Molcula pequea que puede actuar
como epitope, pero es incapaz de
provocar por s misma una respuesta.
Ejemplos: Dinitrofenol (DNP), Vit B12, Hormonas T3 y T4.

Anticuerpos
monoclonales

Anticuerpos derivados de un slo clon de clulas B, son de carcter

homogneo . Reconocen un slo epitope idnticamente (con
igual afinidad)

Las Ig como antgenos

IgGh

Inoculo con IgG humana

Suero anti-IgGh

+ suero anti-IgGh

Reconoce IgG y cadenas

L de todos los isotipos

monoespecificidad

Los Ac monoclonales son

monoespecficos??
Monoclonal = monoespecfico??
Ac monoclonal anti-

proveniente del Ag A

Frente a B se comporta
como monoespecfico

Reconoce a C, por lo tanto

no es monoespecfico

Tcnicas Inmunolgicas
EPITOPE - PARATOPE

Interaccin
Primaria

Interaccin
secundaria

NO VISUALIZABLE

VISUALIZABLE

Resultado

cualitativo

positivo

negativo

cuantitativo

semicuantitativo

concentracin

ttulo

Interaccin primaria

Reaccin dada por un paratope y un eptope

Se deben mantener condiciones fisiolgicas
No se visualiza directamente
Ag y/o Ac monovalente
Bajas concentraciones de Ag y/o Ac (pg/ml)
Radionucledo

RIA

Enzima

EIA

Fluorocromo

IFI, IFD

Interaccin Secundaria
Es la interaccin Ag-Ac que se visualiza fcilmente

Condiciones

Ag y Ac por lo menos bivalente

Alta concentracin de Ag y de Ac (mg/ml)
Se ve influenciada por factores ambientales (Temperatura,
fuerza inica, pH) y necesita tiempo

Los Ac monoclonales, dan interaccin secundaria?

Reacciones de Interaccin Secundaria

Precipitacin
(Ag Soluble)

Aglutinacin
(Ag particulado)

Complejos
solubles

El Ag debe comportarse como bivalente o polivalente frente al suero inmune utilizado

para que as se forme la red que permite la precipitacin o aglutinacin. En otras palabras
cada molcula antignica debe tener al menos dos epitopes que puedan ser
reconocidos por los distintos Ac del suero.
Qu valencia tienen los haptenos (Hp)?

Son
monovalentes

Por s solos no dan

reacciones de
interaccin secundaria

Tcnica de Interaccin Secundaria:

Precipitacin

Prozona

Zona
equivalencia

Exceso de
antgeno

PRECIPITACIN EN MEDIO GELOSADO

* La mayora de las protenas difunden libremente a travs de poros de un gel.

* Al contactarse antgenos y anticuerpos especficos se forma una banda de
precipitacin en el punto en que ambos alcanzan equivalencia.
* Sirven para determinar la concentracin de Ags (cuantitativos) o para comparar Ags
y evaluar su pureza o para determinar isotipo de Ig especfica (cualitativos).

Inmunodifusin radial (IDR)

Doble Inmuno Difusin (DID)

YY Y YY
Y
Y
YY
Y
Y
Y

YYY
Y
Y
YY
Y
YY

Y
Y
Y
Y
YY Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
YY
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y

e m p o

Doble Inmuno Difusin

Tcnica Cualitativa
En los pocillos del agar se enfrentan los antgenos y el suero. Si existen
anticuerpos que reconocen a alguno de los antgenos se forma una banda
de precipitacin en la zona de equivalencia para ese sistema.
La posicin de las bandas permite evidenciar similitudes y diferencias entre
los antgenos segn el antisuero al que se enfrentan.

Identidad

No Identidad

Identidad
Parcial

Si Golimumab fuera un monoclonal IgG , cmo

demostrara por DID esto? (Suponga que siembra en 1
el Golimumab)

1: Golimumab
2:
3:
4:
5:
6:
7:
8:

4
2
1

8
7

Inmunodifusin radial - IDR

Tcnica Cuantitativa
En el agar se encuentra el suero monoespecfico para
la protena que se desea medir. Se realiza la
incubacin y se determina el tamao del halo de
precipitacin que se interpola en la curva de
calibracin.

Utilidad: determinacin de la conc. de inmunoglobulinas y otras protenas sricas

Cuantificacin de Golimumab

TP

AGLUTINACIN
Requisitos para que se produzca la reaccin
de aglutinacin
* Ag particulado multivalente
* multivalencia del Ac
* especificidad del Ac
* T fisiolgica
* pH fisiolgico
* Concentracin salina fisolgica

Clasificacin de las reacciones de

aglutinacin

DIRECTA

Antgenos naturalmente
particulados. Ej: GR, Bacterias

INDIRECTA

Antgenos artificialmente "

particulados. Ej: Partculas de
ltex, GR

REVERSA
Cualitativa

Anticuerpos unidos a partculas.

Ej: Partculas de ltex, GR

Semicuantitativa

AGLUTINACIN DIRECTA

Sistema ABO
Descubiertos en 1901 por Karl Landsteiner
4 fenotipos principales (A, B, AB, O)

Utilidad Aglutinacin Directa

Tipificacin de GR: Sistema ABO

GENOTIPO

FENOTIPO (grupo)

Ac Presentes
(isoaglutininas)

AA/A0

anti B

BB/B0

anti A

AB

AB

Ninguno

anti A y B

Bombay

Ninguno

anti A, B y H

TP

Tipificacin

AGLUTINACIN DIRECTA
SEMICUANTITATIVA

Ttulo: Valor relativo que indica cuntas veces puedo diluir el suero
para que siga dando reaccin positiva, en este caso con
capacidad de aglutinar

Titular un suero anti D de formulacin comercial (GR Rh +)

TP

Indirecta o Pasiva Antgenos artificialmente " particulados.

+
GR

Latex

Antgeno

+
Anticuerpo
CONTROLES

MUESTRAS
1

Suero (1/4)

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

Diluyente

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

GR sensib.
GR no sensib.
Control (+)
Control (-)

10

11

20 ul

20 ul

20 ul
20 ul
20 ul
20 ul
20 ul
20 ul

Control de calidad de Kit de HAI para la deteccin de anticuerpos anti T. cruzi

TP

CONTROLES

MUESTRAS
1

Suero (1/4)

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

Diluyente

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

20 ul

GR sensib.

11

20 ul

20 ul

20 ul
20 ul
20 ul

GR no sensib.

10

20 ul

Control (+)

20 ul

Control (-)

muestra
1
2

3
4

20 ul

10

11

AGLUTINACIN REVERSA

AI: Deteccin de Ac anti desoxirribonucleoprotenas, AR: Deteccin PCR

TP

AGLUTINACIN REVERSA
1 Sensibilizacin de GR

Partculas LATEX
o GR

Anticuerpos
Especficos

Partculas sensibilizadas

2 Reaccin de Aglutinacin

+
Muestra incgnita
(Antgeno Soluble?)

Utilidad Deteccin de Ag soluble multivalentes

Ej: Deteccin de hCG en orina , HBsAg en suero,

Cryptococcus neoformans, E.coli enteropatgena en LCR

Malla de Aglutinacin

Sistema Rh

Comprende ms de 40 Ag. que se ubican en:

la superficie de GR y sus precursores en M.O.
pero no en otras clulas, secreciones o fludos
orgnicos.
Estos Ag. son protenas, de todos ellas, 5 son los ms
importantes: D,E,e,C,c
El orden de su poder inmunolgico en forma
decreciente es: D, c, E, e, C. Las variantes ms dbiles
del D se llaman Du.

ACTIVIDAD ANTIGNICA INTENSA SLO EL Ag D

Rh+: INDIVIDUO CON aglutingeno D
Rh-: INDIVIDUO SIN aglutingeno D-SIN aglutinina anti-D
(diferencia con el sistema ABO)

TIPIFICACIN SE REALIZA CON SUERO ANTI-D

Diferencias entre Ac de los

sistemas ABO y Rh
SISTEMA ABO

SISTEMA Rh

IgM
Naturales
Aglutinantes
Completos
Carbohidratos

IgG
Inmunes
No aglutinantes
INCOMPLETOS
Polipptidos

No pueden difundir y carecen de Receptores en placenta

SEGUIMIENTO DE LA MADRE
PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA

1 Fase

+
Suero Materno
(tiene Ac AgD?)

GR
Rh +

GR sensibilizados con
Ac maternos AgD

2 Fase

+
SUERO DE COOMBS

Malla de aglutinacin

ANLISIS DEL BEB

PRUEBA DE COOMBS DIRECTA

GR beb
(estn sensibilizados
con Ac AgD
maternos?)

Anticuerpos anti
inmunoglobulinas humanas
- SUERO DE COOMBS Malla de aglutinacin

Cmo puede prevenirse la

Isosensibilizacin Rh materno-fetal?
Se puede prevenir casi completamente con el
uso de Inmunoglobulina anti-Rho (D)
1 dosis preparto (300mcg), semana 28. Seguimiento
con Prueba Coombs Indirecta
(Positiva: indica dosis adecuada)
1 dosis posparto, dentro de las 72 hs

1 dosis en hemorragia fetal (aborto, amniocentesis,

muestreo vellosidades corinicas)

Deteccin de Anticuerpos generados por Drogas

Efecto adverso (poco

frecuente):
- Antibioticos
(penicilina,
cefalosporinas)
- Antiinflamatorios
no esteroideos
(diclofenac)
- Quinina
- Oxalplatino

Anemia hemoltica
autoinmune inducida por
drogas (DIIHA)

Cmo podramos determinarlo?

Droga

Coombs directa

La muestra son los GR del paciente

Suero paciente