Estudio de la respuesta a UV-B mediada por el receptor UVR8 en la

planta modelo Arabidopsis thaliana.

Resumen Tcnico
La radiacin UV-B es un factor ambiental con efectos notables sobre las
plantas. Debido a su efecto fotoqumico y a su potencial impacto destructivo
sobre los tejidos vegetales, la UV-B es un factor relevante a ser analizado en
estudios de biologa vegetal. Recientemente se ha caracterizado a una
molcula receptora encargada especficamente de censar la radiacin UV-B,
UVR8, aunque no se conocen en detalle las respuestas en las que acta como
mediadora. Arabidopsis se utiliza comnmente como planta modelo para
estudiar los mecanismos moleculares implicados en las respuestas de las
plantas frente distintos tipos de seales ambientales y/o factores de estrs,
como puede ser la radiacin UV-B. Una idea atractiva es la de investigar genes
que se expresan diferencialmente como as tambin metabolitos que una vez
sintetizados protegen a las clulas ante episodios de estrs. Utilizando la forma
silvestre de Arabidospis y la gran cantidad de mutantes disponibles (o que
puedan generarse) se facilita el estudio de mecanismos de respuesta a seales
ambientales y factores de estrs cuyo conocimiento permitira idear plantas
que sobre-expresen o silencien genes o protenas y evaluar el posible efecto
benfico sobre la planta. En el desarrollo de este proyecto, la investigacin con
esta planta ser extremadamente til ya que resulta un modelo sencillo de
trabajo del que estn disponibles mutantes del receptor de UV-B (uvr8,
deficitario en UVR8). Se espera comprender las bases transcriptmicas,
metablicas y fisiolgicas de la respuesta a UV-B mediada por el receptor UVR8
en Arabidospsis y as aportar al conocimiento bsico que permita investigacin
aplicada futura en especies de inters comercial.
Ingls
Was recently characterized a receptor molecule specifically responsible of UV-B
sensing, UVR8, although not known in detail the responses that mediates.
Arabidopsis is commonly used as a model to study the molecular mechanisms
involved in the responses of plants against different types of signals and / or
environmental stresses, such as UV-B. An attractive idea is to investigate genes
differentially expressed as well as metabolites that once synthesized protect
cells against stress episodes. Using Arabidospis wild type and the large number
of mutants available (or that may be generated) facilitates the study of
mechanisms of response to environmental signals and stress factors and that
knowledge will allow devise plants overexpress or silence genes or proteins and
evaluate the beneficial effect on the plant. In the development of this project,
research with Arabidopsis will be extremely useful because it is a simple model
of work that are available UV-B receptor mutants (uvr8, UVR8 deficient). Are
expected to understand transcriptomic, metabolic and physiological basis of

UV-B response mediated by UVR8 receptor in Arabidospsis and so contribute to

the base knowledge that allows future applied research in commercial species.

Estado Actual de Conocimientos del tema

Se denomina ultravioleta a la radiacin electromagntica cuya longitud de
onda est comprendida aproximadamente entre 200 y 400 nm. Su nombre se
debe a que se corresponde con longitudes ms cortas de lo que el ojo humano
identifica como el color violeta. Esta radiacin es parte de los rayos solares y
produce varios efectos sobre la biosfera. Puede clasificarse en tres subtipos:
UV-A, UV-B y UV-C. La radiacin UV-A (315-400 nm), no se ve afectada por los
gases atmosfricos y representa el 95% de la energa solar ultravioleta
recibida. La UV-B (280-315 nm), es mayormente absorbida por el ozono y otros
gases atmosfricos, aunque una cierta proporcin pasa (5% del total de la
energa solar ultravioleta, 0,5% del total de energa electromagntica)
(Caldwell y Flint 1997, Krupa et al. 1998). La radiacin UV-C (200-280 nm), que
constituye la fraccin de menor longitud de onda y por lo tanto es la que posee
mayor energa por fotn, es totalmente absorbida por el ozono y el oxgeno
atmosfrico.
Para optimizar su crecimiento y supervivencia las plantas son capaces de
percibir y responder a la radiacin UV-B. La UV-B no es siempre una fuente de
dao o de induccin de estrs en los tejidos vegetales sino que tambin acta
como una importante seal ambiental regulando diversas respuestas
metablicas de defensa y desarrollo de las plantas (Brosch y Strid 2003,
Caldwell et al. 2003, Frohnmeyer y Staiger 2003, Jenkins 2009).
Varios reportes de transcriptmica muestran que la UV-B incrementa la
expresin de genes relacionados a la reduccin del estrs (Brown et al. 2005,
Casati y Walbot 2003 y 2004, Kilian et al. 2007, Pontin et al. 2010, Ulm et al.
2004). Sin embargo, a pesar de la relacin existente entre expresin de genes
y acumulacin de metabolitos, los cambios en el transcriptoma no
necesariamente se correlacionan con modificaciones en el metaboloma
(Dolzhenko et al. 2010).
El fotoreceptor de UV-B, la protena UV RESISTANCE LOCUS 8 (UVR8), ha sido
caracterizado recientemente a nivel de mecanismo de captacin (Rizzini et al.
2011), como as tambin estructural (Christie et al. 2012, Wu et al. 2012). Sin
embargo, an no se han estudiado en detalle los mltiples roles en los que
UVR8 podra participar como as tampoco en cules de las respuestas
desencadenadas por UV-B estara involucrado.
UV-B puede producir daos en forma directa sobre el ADN e inducir la
formacin de especies reactivas de oxigeno (ERO) en los tejidos, a lo que la

planta responde activando rutas metablicas para la sntesis de compuestos

antioxidantes que le sirven como protectores (Brown et al. 2005, Berli et al.
2010, Gil et al. 2012, Morales et al. 2013). La activacin de muchas de estas
vas metablicas se debe en gran parte a que UV-B provoca la disociacin de
UVR8 y los monmeros interactan con la E3 ligasa de ubiquitina
CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1), regulador central de la
sealizacin lumnica, producindose la transcripcin de genes de respuesta a
UV-B (Heijde y Ulm 2012).
Sin embargo, se sabe que no todas las respuestas de una planta a UV-B son
mediadas por UVR8; se ha propuesto que altas intensidades de UV-B estimulan
la accin de MITOGEN ACTIVATED PROTEIN KINASES (MAP-K) que activan
factores de transcripcin con efectos en la morfologa foliar (Gonzlez Besteiro
et al. 2011, Wargent et al. 2009). En vid se conoce una respuesta
transcriptmica diferencial ante altas y bajas intensidades de UV-B (Pontin et
al. 2010), aunque existe poca informacin respecto a la sntesis de diferentes
terpenos estimulada por altas y bajas intensidades de UV-B (Gil et al. 2012).
Tampoco sobre su vnculo con el metabolismo y transporte de azcares, ya
que en conjunto la luz y la disponibilidad de hidratos de carbono solubles
parecen ser factores estrechamente interrelacionados que regulan tanto la va
MVA como la ruta MEP e influyen en el metabolismo de isoprenoides de una
manera compleja y a varios niveles (Flores Prez et al. 2010). Se ha visto
tambin que UVR8 junto a SIG5 REGULATED CHLOROPLAST RNA POLYMERASE
SIGMA FACTOR mantienen la integridad de membranas fotosintticas en
Arabidopsis sometidas a elevada UV-B (Davey et al. 2012). Se sabe que los
terpenos juega un papel en la estabilidad de membranas fotosintticas
(Beckett et al. 2012) y de la clula en general (Berli et al. 2010), pero no se
conoce el posible papel regulatorio de UVR8 en este mecanismo.
Tampoco existen reportes acerca de la forma en que la sntesis
metabolitos (terpenos, polifenoles y azcares) es modulada
diversos tejidos. Asimismo, no hay informacin disponible sobre
UVR8 en la produccin de hormonas vegetales, especialmente
en la respuesta ante estreses abiticos.

de los distintos
a nivel de los
la influencia de
ABA, implicada

Formulacin y Fundamentacin del Problema a Investigar

UV-B es un factor ambiental importante para las plantas. Recientemente se ha
caracterizado al receptor que percibe esta radiacin, UVR8 (Jiang et al. 2012,
Christie et al. 2012) aunque no se conocen en detalle las respuestas en las que
acta. Debido a su efecto fotoqumico y a su potencial impacto destructivo
sobre los tejidos vegetales, la UV-B adquiere relevancia como factor a ser
estudiado en biologa vegetal.

Arabidopsis thaliana carece de valor comercial, a diferencia de otras especies

pertenecientes a la misma familia. Sin embargo, A. thaliana es la especie ms
utilizada en laboratorios de biologa vegetal. Las caractersticas que la han
hecho deseable son un ciclo de vida corto, produccin de numerosa progenie,
requiere poco espacio y es fcil de cultivar. Posee un genoma relativamente
pequeo, secuenciado en su totalidad en el ao 2000 por la Arabidopsis
Genome Initiative. Dicho genoma contiene una baja proporcin de secuencias
repetidas de ADN y puede ser manipulado mediante ingeniera gentica con
ms facilidad y rapidez que el de otras plantas. Constituye un buen modelo de
planta angiosperma y dicotilednea, siendo sus genes compartidos con muchas
otras especies genticamente ms complejas. Arabidopsis se utiliza para
estudiar los mecanismos moleculares de las respuestas de las plantas frente a
distintos tipos de seales ambientales y/o factores de estrs, como puede ser
la radiacin UV-B. Una idea atractiva es estudiar genes que se expresan
diferencialmente para la sntesis de metabolitos que protegen a las clulas.
Utilizando Arabidospis silvestre y la gran cantidad de mutantes disponibles o
que puedan generarse se facilita el estudio de mecanismos de respuesta a
seales ambientales y factores de estrs cuyo conocimiento permitir idear
plantas que sobre-expresen o silencien genes o protenas con la finalidad de
obtener un efecto benfico en la planta. En el desarrollo de este proyecto,
Arabidopsis resulta un modelo til ya que que estn disponibles mutantes del
receptor de UV-B (uvr8). En el futuro y en funcin de los resultados obtenidos,
se proseguir la investigacin en Vitis vinifera que constituye el principal objeto
de estudio de la Unidad Ejecutora de este proyecto.
Objetivos
1. Estudiar el perfil metablico (polifenoles, terpenos, azcares,
hormonas) de raz, hojas y flores de plantas silvestres (Col-0) y
mutantes (uvr8-6) de Arabidopsis sometidas a UV-B desde
germinacin hasta floracin.
2. Estudiar parmetros fisiolgicos en plantas silvestres (Col-0) y
mutantes (uvr8-6) de arabidopsis sometidas a UV-B desde
germinacin hasta floracin.
3. Estudiar la actividad de enzimas antioxidantes en plantas silvestres
(Col-0) y mutantes (uvr8-6) de arabidopsis sometidas a UV-B desde
germinacin hasta floracin.
4. Estudiar la expresin de genes ligados a la sntesis de terpenos,
sntesis y catabolismo de ABA y sntesis de polifenoles de raz, hojas y
flores de plantas silvestres (Col-0) y mutantes (uvr8-6) de Arabidopsis
sometidas a UV-B desde germinacin hasta floracin.
Hiptesis de trabajo

1. Plantas de arabidospsis silvestres (Col-0) y mutantes (uvr8) sometidas a

UV-B generan perfiles metablicos diferenciales en diferentes estadios
fenolgicos y distintos tejidos (raz, hojas, flores). Esta respuesta est
mediada por el fotoreceptor UVR8 cuando UV-B acta como una seal de
informacin ambiental (baja intensidad) y no cuando lo hace como un
factor ambiental estresante (alta intensidad).
2. Existe una respuesta fisiolgica diferencial en plantas de arabidopsis
silvestres (Col-0) y mutantes (uvr8). Esta respuesta est mediada por el
fotoreceptor UVR8 cuando UV-B acta como una seal de informacin
ambiental (baja intensidad) y no cuando lo hace como un factor
ambiental estresante (alta intensidad).
3. La actividad de encimas antioxidantes de plantas de arabidopsis es
incrementada diferencialmente en plantas silvestres (Col-0) y mutantes
(uvr8). Esta respuesta est mediada por el fotoreceptor UVR8 cuando
UV-B acta como una seal de informacin ambiental (baja intensidad) y
no cuando lo hace como un factor ambiental estresante (alta
intensidad).
4. La expresin de genes ligados a la sntesis de terpenos, sntesis y
catabolismo de ABA y sntesis de polifenoles en tejidos vegetativos y
reproductivos de plantas silvestres (Col-0) y mutantes (uvr8) de
arabidopsis expuestas a UV-B responde diferencialmente a la presencia
del fotoreceptor UVR8. Esta respuesta est mediada por UVR8 cuando
UV-B acta como una seal de informacin ambiental (baja intensidad) y
no cuando lo hace como un factor ambiental estresante (alta
intensidad).
Metodologa
Material vegetal
Plantas de A. thaliana se obtendrn a partir de semillas del genotipo silvestre
Col-0 y del mutante uvr8-6, nulo de la protena UVR8, fotoreceptor de UV-B,
que tiene como fondo gentico a Col-0. Las semillas sern sembradas sobre un
sustrato comercial para plantas de interior en macetas individuales de 0,2 L.
Durante los tres das posteriores a la siembra y luego del primer riego las
macetas se mantendrn a 4 C y en oscuridad.
Experimento
Las plantas se colocarn en el campo experimental de la Facultad de Ciencias
Agrarias (330S, 6852O y 940 m s.n.m.) y se sometern a cuatro
tratamientos. En el tratamiento UV-A UV-B las plantas sern expuestas slo
a radiacin PAR interponiendo a los rayos solares un filtro Rosco 3114 Tough
UV Filter (Rosco Laboratories, Stamford, CT, USA) que retiene tanto UV-A como
UV-B. En el tratamiento +UV-A las plantas se colocarn bajo un filtro de

polister cristal que retiene selectivamente a UV-B (Oeste Aislantes S.A.,

Buenos Aires). En el tratamiento +UV-B las plantas se colocarn bajo un filtro
de UV idntico al utilizado en UV-A UV-B, pero por debajo del mismo se
instalarn tres tubos Philips TL 100W/01 (Philips, Eindhoven, The Netherlands)
que emiten UV-B y cuyos picos espectrales se encuentran en una longitud de
onda de 311 y 313 nm. En este caso, la tasa de flujo de radiacin UV-B
comenzar a elevarse desde el amanecer, tendr un mximo de 25 W cm -2
coincidente con el medioda y a partir de all comenzar a descender hasta el
anochecer siendo nula durante las horas de oscuridad. La UV-B ser regulada
encendiendo y apagando los tres tubos suspendidos sobre las plantas que
estarn conectados a interruptores automticos y recubiertos con tela media
sombra de polietileno de alta densidad de diferente opacidad. En el
tratamiento +UV-A +UV-B las plantas sern cubiertas con un filtro que retiene
UV-B (idntico al utilizado en +UV-A) y estarn expuestas a la UV-B emitida por
los mismos tubos del tratamiento +UV-B. Los filtros se colocarn cubriendo 5
de las caras de un armazn (la inferior quedar en contacto con el piso). Para
estandarizar las condiciones de iluminacin, en todos los tratamientos se
colocarn por debajo de los filtros soportes de madera idnticos a los utilizados
en los tratamientos +UV-B y +UV-A +UV-B. La distribucin de las plantas entre
cada tratamiento ser aleatoria. El fotoperodo ser el natural para la localidad,
durante los das en los que se desarrolle el ensayo (verano, aproximadamente
16 horas de luz, 8 de oscuridad). Todas las plantas sern recolectadas en
funcin de su estado fenolgico. Para determinar los estados fenolgicos se
tendr en cuenta lo expuesto por Boyes et al. (2001). La cosecha en todos
los casos se realizar sobre el final del fotoperodo para evitar interferencia por
efecto de regulaciones circadianas (Fehr et al. 2011) y teniendo en cuenta la
fotosensibilidad de ABA, fitohormona que ser cuantificada. Inmediatamente
despus de terminados los tratamientos las plantas se separarn en diferentes
partes, se congelarn en N2 lquido y se almacenarn a -80C hasta su
procesamiento.
Anlisis de perfiles metablicos
De acuerdo al procesamiento de la muestra, para la identificacin y la
cuantificacin de los distintos metabolitos se utilizarn SPME-GC-MS, GC-MS y
HPLC-MWD. Cada muestra de tejido se homogenizar en un mortero con N 2
lquido y el tejido en polvo se dividir en dos.
Para generar el perfil de compuestos voltiles se utilizar la tcnica de microextraccin en fase slida (SPME-GC-MS) puesta a punto en el Laboratorio de
Bioqumica Vegetal del IBAM mediante el uso de fibras SPME (Supelco, 50/30
m de fase extractante Divinilbenceno/ Carboxen/ Polidimetilsiloxano)
acopladas al GC-MS (Gil et al. 2013). Inicialmente, la fibra es acondicionada a
270 C por 60 min en el inyector del GC. Luego debe colocarse en un soporte
construido manualmente que sostiene la fibra SPME mantenindola a 40 C

por 40 min en contacto con el extracto de cada muestra contenida en un vial

de color mbar para ser inmediatamente transferidas al puerto de inyeccin
del GC-MS de cuadrupolo simple Perkin Elmer Clarus 500 con un equipo autoinyector de muestras AS 2000. Un L se inyectar en una columna capilar (30
m 0.32 mm x 0.25 m, Varian CP-Wax 52CB) con el siguiente programa: 35
C por 5 min, aumento a 70 C a 3 C min -1, mantenido por 2 min y aumentado
a 165 C a 2 C min -1. El flujo de electrones se fijar en 70 eV. La identidad de
los compuestos para cada pico se establecer sobre la base de espectros de
masas y la comparacin con estndares autnticos y/o informacin de la
biblioteca NIST.
Para generar el perfil de diterpenos y triterpenos (no voltiles) se utilizar la
tcnica descripta por Gil et al. (2012), la cual consiste en la extraccin de
compuestos terpnicos utilizando como solventes la mezcla cloroformo:
metanol. Luego de una maceracin de 12 h a 4 C la muestra se agitar y
centrifugar durante 15 min a 10000 g. Se colectar el sobrenadante y ser
evaporado hasta sequedad en un Speed Vac a temperatura ambiente. El
residuo se disolver en hexano y posteriormente 1 L ser inyectado en el GCMS. La columna utilizada ser una Perkin Elmer 5-MS de 0,25 mm de espesor,
0,25 mm de dimetro interno y 30 m de largo. El programa de temperatura del
horno que contiene la columna se iniciar manteniendo a 60 C durante 1 min,
luego se incrementar la temperatura a razn de 10 C min -1 hasta alcanzar
280 C, que se mantendrn durante 22 min. Esta temperatura se mantendr
durante 10 min. El resto de condiciones y caracterizacin de compuestos se
har segn descripcin del prrafo anterior.
Para analizar monoterpenos se proceder de la misma forma que para
diterpenos y triterpenos a excepcin del programa de temperatura del horno
del GC-MS. La columna se mantendr inicialmente a 45 C durante 1 min,
luego se incrementar la temperatura en 2 C min -1 hasta alcanzar 130 C,
posteriormente se aumentar hasta 250 C a razn de 20 C min -1. Esta
temperatura se mantendr durante 10 min.
Los anlisis de ABA se realizarn segn lo descripto en Berli et al. (2010).
Muestras de 200 mg de PF se extraern con 2 mL de 80:19:1 (v/v)
metanol:agua:cido actico a 4 C. A las 12 h, se agregarn 40 ng de [2H6]ABA disueltos en 2 mL of metanol. Luego de centrifugar y evaporar el metanol
a 35 C, la fase acuosa se particionar con acetato de etilo y pasar por
columnas de Sep-Pak C18 (Waters Associates, Milford, MA, USA) primero y
OasisWAX (Waters Associates) despus. El residuo se derivatizar con CH 2N2 y
1 L disuleto en hexano se inyectar en el GC-MS con la misma columna y
condiciones como se describi para diterpenos y triterpenos. La cantidad de
ABA se calcular comparando el rea de pico de los iones deuterados 194 y
166 en relacin a su contraparte no marcada (endgena) 190 y 162.

Para la determinacin de azcares, la extraccin se realizar utilizando

metanol: agua, se agregarn 40 L de clorhidrato de metoxiamina 20 mg mL -1
en piridina seca y se mantendr 15 min a 70 C. Se aadirn 10 L de piridina
seca y 80 L de MSTFA para la derivatizacin durante 30 min a 37 C (Moreno
et al. 2011). Una alcuota de 1 L de cada una de las fracciones se inyectar en
modo splitless en un equipo de GC-MS. La temperatura de inyeccin ser de
220 C, la columna se mantendr a 100 C 30 seg, luego pasar de 100 a 200
C a 16 C min-1, y hasta 280 C a 4 C min -1, y finalmente 10 min a 280 C. El
flujo de gas portador (He) ser de 1 mL min -1, la temperatura de la interfase
250 C y el flujo de electrones se fijar en 70 eV. El CTI se controlar a partir de
los 6 min hasta el final de la corrida. La identidad de los compuestos para cada
pico se establecer sobre la base de espectros de masas y la comparacin con
estndares autnticos y/o informacin de la biblioteca NIST.
Como determinacin adicional y a pesar que no estar disponible la
informacin derivada de la espectrometra de masa dado el equipamiento a
emplear, se estudiar el perfil de antocianinas ya que permitir construir
conclusiones metablicas interesantes. 150 L de un extracto de 2 mL de
80:19:1 (v/v) metanol:agua:cido actico a 4 C se inyectarn en un HPLCMWD Dionex UltiMate 3000 equipado con una columna Chromolith Performance
C18 eluda con un gradiente de 10% cido frmico en H 2O y acetonitrilo a 1,1
mL min-1. La deteccin ser a 210 hasta 600 nm, y la cuantificacin por rea de
pico a 520 nm. La cantidad de cada antocianina se expresar usando malvidin
3-glucoside (Extrasynthese, Lyon, France) como estndar de calibracion (r 2 =
0.96). Para fenoles no antocinicos, alicuotas de los extractos se extraern con
ter dietlico y acetato de etilo. Luego de filtrar y deshidratar 30 L se
inyectarn en el HPLC-MWD con una columna Nova-Pak C18 eluda con un
gradiente de 2% cido actico en H2O y acetonitrilo a 0,9 mL min -1. La
deteccin ser a 210 to 600 nm, y la identificacin comparando el espectro UVvis y tiempos de retencin con estndares Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
La cuantificacin se realizar con curvas de calibracin de los estndares (r 2
0.94).
Extraccin de ARN total y anlisis de expresin diferencial de genes
por PCR en tiempo real
Para el anlisis de expresin de genes en tejidos vegetativos se aplicar la
tcnica descripta por Dolzhenko et al. (2010). Para verificar la integridad del
ARN ste se correr en gel de agarosa al 1 % previo tratamiento de las
muestras con ADNasa I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) .La sntesis del ADN
complementario de cadena simple se realizar utilizando la enzima
Transcriptasa reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) partiendo de 1 g de ARN
total como molde, previamente purificado mediante RNeasy Kit (Qiagen,
Valencia, CA, USA). Se cuantificarn los transcriptos mediante PCR en tiempo
real (StepOne, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). La expresin de los

genes se medir utilizando la tcnica de cuantificacin relativa con el mtodo

comparativo Ct (Ct) usando como fluorforo SYBR Green (Applied
Biosystems) y como control endgeno los siguientes genes: actina (VvACT),
factor de elongacin 1- (VvEF1-) y ubiquitina (VvUBQ). Para estudiar el
efecto de UV-B en el metabolismo de polifenoles y terpenos se analizar la
expresin diferencial de los genes que codifican para: fenilalanina amonio liasa
(PAL), cinamoil-CoA reductasa (CCR), 4-cumarato-CoA ligasa (4CL), chalcona
sintasa (CHS), flavonol sintasa (FLS), flavanona 3, 5 hidroxililasa (F35H),
antocianidin sintasa (ANS), hidroximetil-glutaril-CoA sintasa (HMGCoA),
isopentenil pirofosfato transferasa (IPP) y linalol/nerolidol sintasa. Se analizar
tambin la expresin de genes de biosntesis de ABA (familia 9-cis
epoxycarotenoid dioxygenasegene) y de catabolismo de ABA (familia ABA 8'hydroxylase (CYP707A))
Parametros fisiolgicos y actividad de enzimas
Los parmetros fisiolgicos se medirn con el equipamiento disponible en el
IBAM. Se medir fotosntesis, conductancia estomtica y fluorescencia de
clorofila para verificar la integridad del PSII.
A las plantas de los diferentes tratamientos se les cuantificar, mediante el uso
de espectrofotometra UV-Visible los pigmentos fotosintticos (clorofila y , y
carotenos) que sern medidos segn Berli et al. (2010).
Se cuantificar la peroxidacin de lpidos segn Berli et al. (2010). Este
parmetro es un buen indicador del dao oxidativo en membranas celulares.
El estudio de enzimas antioxidantes (CAT, APX, POX, SOD) se realizar segn lo
descripto en Berli et al. (2010).
La actividad enzimtica del complejo terpeno-sintasa ser medida en tallos y
hojas y en races segn lo descripto en Gil et al. (2012).
Resultados Esperados
Llevando a cabo las actividades propuestas en el presente proyecto, se
pretende avanzar en el plan de tesis doctoral del Ing. Agr. Facundo Martn
Retamales.
Se espera comprender las bases transcriptmicas, metablicas y fisiolgicas de
la respuesta a UV-B mediada por el receptor UVR8 en arabidospsis y as aportar
al conocimiento bsico que permita investigacin aplicada futura en especies
de inters comercial.
Transferencia y Beneficiarios

Sern beneficiarios los integrantes del proyecto por su capacitacin en temas

de vanguardia en biologa vegetal. La Facultad de Ciencias Agrarias de la
Universidad Nacional de Cuyo dado que este proyecto consolidar a un grupo
de docentes investigadores que se desempearn tanto en la produccin de
conocimiento cientfico como en la transferencia inmediata a alumnos de grado
y posgrado como as tambin a toda la comunidad cientfica.
La transferencia y difusin de resultados se llevar a cabo mediante
conferencias, simposios, cursos de posgrado, publicaciones en revistas
indexadas.
Equipamiento disponible
El Laboratorio de Bioqumica Vegetal del Instituto de Biologa Agrcola de
Mendoza de doble dependencia entre CCT-CONICET Mendoza y la Facultad de
Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Cuyo, que es sede central del
proyecto, cuenta con los servicios esenciales de luz, gas, agua, telfono,
conexin a Internet, campanas de extraccin de gases y mesadas de trabajo
suficientes para la ejecucin de los trabajos programados. En estas
instalaciones se cuenta con un espectrofotmetro VARIAN 50, termocicladores,
equipo
de
electroforesis
horizontal
y
vertical,
microcentrfugas,
ultracentrfugas, agitador orbital, cmara de crecimiento, cuarto de luces
climatizado, evaporador rotatorio, evaporador centrfugo de tubos, tres freezer
a -20 C y uno a -80 C, balanzas, peachmetro, campana de flujo laminar
horizontal, cuarto equipado para realizar cultivo in vitro de plantas y dems
elementos menores. El Laboratorio tambin cuenta con un equipo de GC-MS
Perkin Elmer Clarus 500 y un HPLC-MWD Dionex UltiMate 3000, de reciente
adquisicin. Todos estos equipos estn conectados a una red de seguridad
elctrica con dos UPS y un grupo electrgeno de emergencia. Adems, se
dispone de un equipo de Electroforesis Capilar de Zonas (instalado en y
compartido con el INTA EEA Mendoza). Asimismo, la firma Catena Zapata
adquiri para nuestros proyectos un medidor de radiacin UV-B y otro de
radiacin UV-A. Los invernculos de la FCA tambin estn a disposicin de las
necesidades experimentales del proyecto. En el IMBECU del CCT-CONICET
Mendoza, se encuentra un contador de centelleo QuantaSmart de PerkinElmer
(adquirido con fondos PME 244 a nombre de R Bottini). Otros Recursos
afectados para el desarrollo del Proyecto: Se dispone de un equipo de qRT-PCR
adquirido con fondo PME-PAE (IR, R Bottini), localizado en el INTA EEA Mendoza.