Histologa

Microscopa

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Tipos de microscopios
1.- Microscopio ptico
2.- Microscopio de campo oscuro
3.- Microscopio de contraste de fase
4.- Microscopio de interferencia
5.- Microscopio de luz polarizada
6.- Microscopio de fluorescencia
7.- Microscopio de barrido
8.- Microscopio de luz ultravioleta
9.- Microscopio electrnico

1.- Microscopio ptico (usado en clases prcticas)

El estudio de la estructura de los seres vivos se inici utilizando tan slo los sentidos, especialmente
la vista. Sin embargo el hombre posee una capacidad sensorial limitada, escucha sonidos emitidos
de una determinada frecuencia, gusta y huele substancias que tienen concentraciones dadas, y su
vista le permite visualizar elementos de un determinado tamao.

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El microscopio ptico costa de dos partes principales:

1.- Parte mecnica
a) Pie o soporte: sirve como base del microscopio y se encuentra ubicada la fuente de luz.
b) Platina: superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En el centro se encuentra un orificio
que permite el paso de la luz. Sobre la platina hay un sistema de pinza o similar, para sujetar el
portaobjetos con la preparacin, y unas escalas que ayudan a conocer qu parte de la muestra se est
observando. La platina presenta 2 tornillos, generalmente situados en la parte inferior de la misma,
que permiten desplazar la preparacin sobre la platina, en sentido longitudinal y transversal
respectivamente.
c) Tubo: cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Constituye el soporte de oculares y
objetivos.
d) Revlver portaobjetivos: estructura giratoria que contiene los objetivos.
e) Tornillo macromtrico o de enfoque grosero: sirve para obtener un primer enfoque de la muestra
al utilizase el objetivo de menor aumento. Desplaza la platina verticalmente de forma perceptible.
f) Tornillo micromtrico o de enfoque fino: sirve para un enfoque preciso de la muestra, una vez
que se ha realizado el enfoque con el macromtrico. Tambin desplaza verticalmente la platina,
pero de forma prcticamente imperceptible. Es el nico tornillo de enfoque que se utiliza, una vez
realizado el primer enfoque, al ir cambiando a objetivos de mayor aumento.
2.- Parte ptica: tres sistemas de lentes:
a) Ocular: son los sistemas de lentes ms cercanos al ojo del observador, situados en la parte
superior del microscopio. Son cilindros huecos provistos de lentes convergentes cuyo aumento se
resea en la parte superior de los mismos (normalmente 10X en los microscopios que se utilizarn
en esta prctica). Dependiendo de que exista uno o dos oculares, los microscopios pueden se mono
o binoculares.
b) Objetivo: son sistemas de lentes convergentes que se acoplan en la parte inferior del tubo,
mediante el revlver. En esta estructura se pueden acoplar varios objetivos (ordenados de forma
creciente segn sus aumentos, en el sentido de las agujas el reloj). Un anillo coloreado es distintivo
de los aumentos de cada objetivo, que tambin van reseados en el lateral del mismo. Algunos
objetivos no enfocan bien la preparacin al aire, y se deben de utilizar con un aceite de inmersin
(normalmente van marcados con un anillo rojo). Estos objetivos de inmersin no se utilizarn
normalmente en estas prcticas. La imagen que ser observada por el usuario tendr un aumento
total calculado por la multiplicacin entre el aumento del objetivo y el del ocular. Los objetivos son
la parte ms crtica del sistema, ya que de ella depende la calidad de la imagen. Slo el objetivo
tiene poder de resolucin. Su funcin es resolver la imagen y disminuir las aberraciones.

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c) Condensador: sistema de lentes convergentes que capta los rayos de luz y los concentra sobre la
preparacin, de manera que proporciona mayor o menor contraste. Se regula en altura mediante un
tornillo. El condensador tiene en su parte inferior al diafragma iris.
Fuente de iluminacin: en los microscopios a utilizar, el aparato de iluminacin est constituido
por una lmpara halgena de bajo voltaje (12V) situada en el pie del microscopio. La luz
procedente de la bombilla pasa por un reflector que enva los rayos luminosos hacia la platina.
Diafragma: sobre el reflector de la fuente de iluminacin. Abrindolo o cerrndolo permite graduar
la intensidad de la luz. La apertura de este diafragma es crtica en la formacin de la imagen.
Cuando el diafragma del condensador se abre lo suficiente como para igualar su apertura numrica
con la de la lente objetiva, se obtiene una iluminacin incoherente, que permite una mayor
resolucin pero menor contraste y profundidad de foco. Si se cierra parcialmente el condensador se
logra un aumento de contraste y de profundidad de foco, pero se reduce la resolucin del sistema en
un 30% aproximadamente (iluminacin coherente). .Bajo el diafragma se encuentra un anillo porta
filtros. El filtro de color azul (luz da) es el ms ya que reduce el exceso de rojo y amarillo que
producen las ampolletas corrientes.
El ojo humano slo puede resolver estructuras de aproximadamente 0,1mm (100um). La mayora de
las clulas son de dimensiones muchsimo menores, y requieren de todo el poder resolutivo del
microscopio para poder ser estudiadas.
El trmino poder de resolucin (PR) expresa la capacidad de un sistema ptico de discriminar
detalles muy fino, de distinguir o resolver dos puntos muy cercanos entre si. El PR es inversamente
proporcional al lmite de resolucin (d) que es la menor distancia que debe existir entre dos puntos
para que estos puedan ser individualizados como unidades separadas.

PR = __1__
d

El PR depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de las aperturas numricas del objetivo y
el condensador (el ocular slo acta aumentando la imagen del objetivo, no mejora el poder de
resolucin).
El mximo PR que se puede obtener es de 0,2 um, pero en los preparados de rutina habituales rara
vez excede de 0.5 um.
Los detalles resueltos se deben aumentar lo suficiente para poder ser observados sin esfuerzo, lo
cual se logra con el aumento adicional del ocular. Para obtener el mximo PR, de alrededor de 0,2
um., se requiere un aumento de unas 1000-1400 veces, dado que el PR del ojo, a la distancia normal
de observacin (25 cm.), es de aproximadamente 0,2 mm.(aumento til mximo). Como regla

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mnemotcnica vale que, para evitar el aumento vaco (deterioro progresivo de la imagen) nunca se
debe emplear mayor aumento que 1000 veces la apertura numrica del objetivo. Por lo general, en
el objetivo estn grabados el aumento y el valor de la apertura numrica. Adems, se suele
especificar la longitud del tubo y el espesor del cubreobjetos (en mm.) para el cual esta corregido el
objetivo.
Si consideramos dos objetos luminosos muy pequeos e igualmente brillante, cada uno nos
proporciona una imagen, que no es puntual, sino un disco central brillante rodeado de uno o varios
anillos difusos de luz llamados discos de Airy . Si acercamos estos dos puntos, llega un momento
en el cual se sobreponen. El punto exacto de sobreposicin depende de varios factores, ente ellos la
agudeza visual del observador. Se a propuesto que los discos de Airy se resuelven como unidades
separadas cuando las distancias entre los centros es superior al radio del primer anillo oscuro de
difraccin.
La difraccin ptica se debe a la interferencia entre ondas que han viajado por caminos levemente
diferentes, a travs de un sistema ptico.

Difraccin: se produce cuando la onda "choca" contra un obstculo o penetra por un agujero. La
mayor difraccin se produce cuando el tamao del agujero o del obstculo es parecido a la longitud
de onda de la onda incidente.

Refraccin: se da cuando la onda pasa de un medio a otro y se producen cambios en la velocidad y

en la direccin de propagacin.
Los ndices de refraccin del portaobjeto, cubre objeto y del aire provocan un desvo de la luz
incidente. Al colocar un medio de mayor ndice de refraccin como el aceite de inmersin, entre
cubreobjeto y la lente frontal, se neutraliza el efecto de la refraccin de la luz, obtenindose una
imagen de mayor nitidez.
El limite de resolucin en directamente proporcional a la longitud de onda e inversamente
proporcional a la abertura numrica de la lente objetiva. Si se desea aumentar el poder de resolucin
y obtener mayor informacin existen dos caminos: aumentar la apertura numrica o disminuir la

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longitud de onda. En relacin a la primera posibilidad existen limitaciones, incluso mejorando el

diseo de las lentes. Por esta razn, el esfuerzo de los investigadores se ha centrado en la segunda
alternativa.
Formacin de la imagen:
La luz posee una naturaleza dual, y puede ser entendida al mismo tiempo como una partcula y
como una onda. La comprensin de este comportamiento, as como de algunas caractersticas de la
luz, es importante para entender el proceso de formacin de la imagen en un microscopio, y cmo
manejando ciertos parmetros fsicos podemos obtener imgenes ms ntidas y de mayores
aumentos.
La luz posee una determinada longitud de onda y viaja en el espacio con una determinada
velocidad. Cuando la luz llega a una superficie que separa dos medios transparentes una parte de
ella se refleja volviendo por el mismo medio en que se propagaba, y otra parte en cambio es
refractada, penetra en el segundo medio y cambia su direccin y velocidad. Esto ocurre cuando la
luz llega por ejemplo a una lente. Si sta es convergente, los rayos se juntan en un punto, el que
corresponde al foco, la distancia entre ese punto y el centro de la lente es la llamada distancia focal.
Como ya vimos, la velocidad de la luz es diferente en el vaco que en otros medios. Esta diferencia
de velocidad puede compararse mediante el ndice de refraccin, que corresponde al cuociente entre
la velocidad de la luz en el vaco y la velocidad de la luz en un medio determinado en el que sta
incide.
Mientras ms se acerca un objeto al ojo, ms detalles de l pueden ser distinguidos, pero hay una
distancia lmite a la que se pueden acercar los objetos, y sobre esa distancia, ya no se distinguen los
objetos con claridad, y se hace necesario el uso de lentes o lupas para aumentar el objeto en estudio.
El aumento de una lente est dado por el lmite de cercana a la que pueden llevar los objetos en el
ojo humano y por su distancia focal. Si se quiere aumentar an ms una imagen, se pueden colocar
dos lentes en serie (objetivo y ocular en el caso de microscopio comn), y el aumento final logrado
ser entonces el producto del aumento de cada uno de ellos.
Si tiene en un microscopio un objeto a observar, los rayos de luz reflejados o emitidos por el objeto
que se sita fuera de la distancia focal de un lente (objetivo) al pasar por el objeto son refractados y
enfocados en un plano que se ubica ms all de la cara opuesta de la lente obtenindose una imagen
real que es invertida y de tamao distinto (mayor) al del objeto original. Esta imagen intermedia
acta como objeto para la lente ocular, y se encuentra situada de manera tal, que la imagen formada
por el objetivo cae en la distancia focal (la distancia focal es la distancia que existe entre el foco
principal de la lente y su centro geomtrico). De esta forma el ocular proporciona una imagen final
que es virtual (dada por la proyeccin de los rayos), de mayor tamao e invertida con respecto al
objeto. A medida que el objeto se acerca al foco la imagen obtenida es ms grande.
La capacidad del microscopio ptico para revelar detalles estructurales depende de la absorcin
diferencial de la luz con las diferentes estructuras celulares, y de la intensidad de luz visible que
llega al observador.

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La celular vivas tienen un alto contenido de agua y por lo tanto sus estructuras producen poca
difraccin, siendo difcil ser visualizadas al microscopio de luz corriente; en estos casos se
recomendara, por ejemplo, un microscopio de interferencia.

Manejo y enfoque del microscopio

1.- El desplazamiento del microscopio debe realizarse tomndolo por el asa con una mano y con la
otra sustentando el pie, puesto que de otra forma puede desequilibrarse la charnela. Debe colocarse
sobre una mesa evitando las vibraciones durante la observacin.
2.- La platina debe colocarse en la posicin ms baja, lo ms distante del objetivo posible, y se
coloca la preparacin en la platina.
3.- Una vez dispuesta la preparacin sobre la platina con la muestra en el centro, utilizando el
revlver y sin tocar el objetivo se elige el objetivo de menor tamao y por tanto de menor aumento.
4.- Si se va a trabajar con objetivos en seco (no el de inmersin) y con preparaciones sin teir el
condensador no es necesario, por ello, se debe colocar en la posicin ms baja, lejos de la platina,
para que no haya un exceso de luz sobre la preparacin. En caso contrario, se procede a la inversa.
5.- A continuacin se debe regular la distancia de las lentes oculares ajustndola a los ojos.
6.- Seguidamente procede al enfoque. El enfoque de la imagen se efecta con los tornillos estriados
de las cremalleras que mueven a las lentes objetivos hacia arriba y hacia abajo por encima de la
preparacin. El tornillo de enfoque grueso o Macromtrico mueve a las lentes en incrementos
mayores que el tornillo de enfoque fino o Micromtrico.
Para realizar el enfoque se procede de la siguiente forma: Desplazar la platina con el tornillo
Macromtrico, mirndola desde fuera, hasta que est cerca del objetivo. Mirando por los oculares,

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se empieza a separar muy lentamente con el Macromtrico hasta que se percibe la imagen. A partir
de entonces, ser el micromtrico el que se usar para apreciar los detalles y los planos de la
preparacin. En caso del uso del objetivo de inmersin, se coloca previamente una gota de aceite de
cedro sobre la preparacin, desplazando la platina hasta que el objetivo se sumerge en el aceite,
operando como en el caso anterior.
7.- Una vez enfocado, se graduar con el diafragma la cantidad de luz requerida, incluso se puede
variar ligeramente la altura del condensador si ello mejora la calidad
de la imagen.
8.- A continuacin se desplaza la platina con una mano o mediante los tornillos adosados a la
platina en todas las direcciones para recorrer la muestra mientras que con la otra mano se rectifica
continuamente la posicin del tornillo micromtrico. Antes de pasar a objetivos de mayor aumento.
Conviene seleccionar la zona de la preparacin que se quiere observar y, para ello, se debe centrar
en el campo de visin que ofrece el microscopio, pues de otra manera, con objetivos de mayor
aumento, es muy probable que se pierda el capo elegido.
9.- Terminado el examen de la muestra se baja la platina y se quita la preparacin. A continuacin
se desconecta de la fuente elctrica y se cubre el microscopio con la funda protectora.

2.- Microscopio de campo oscuro.

El microscopio de campo oscuro se utiliza para analizar partculas pequeas, que presentan muy
escaso contraste con la microscopia ptica o que se encuentran en el lmite del poder de resolucin
o por debajo de este. Para la microscopia de campo oscuro se emplea un condensador especial, el
cual impide que llegue luz directa al objetivo, de manera que solo incide en esta lente la luz
desviada o esparcida por las pequeas partculas que se desea investigar. stas se observan
luminosas sobre un fondo oscuro. Ejemplo para determinacin de la espiroqueta de la sfilis.

Treponema

3.- Microscopio de contraste de fase.

Los tejidos no coloreados producen muy escaso contraste, dado que no absorben cantidades
importantes de luz sin embargo, producen cierto retardo en las longitudes de onda, de acuerdo con

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la densidad ptica variable de los tejidos, en decir, los distintos ndices de refraccin. Este retraso
produce cierto desfasamiento entre ellas. Mediante el microscopio de contraste de fase es posible
transformar estas diferencias no visibles, en diferencias de amplitud, en decir, que las diferencias de
refraccin entre los componentes del tejido se transforman en diferencias de intensidad que pueden
ser captadas por el ojo humano. De esta manera es posible transformar en visibles componentes de
de las celular vivas que, de otra manera, solo se observan en tejidos muertos y teidos. Ejemplo
fibroblastos de cultivo de tejido.

Clula epitelial

4.- Microscopio de interferencia.

Construido sobre la base de principios similares al microscopio de contraste de fase, dado que
tambin utiliza diferencias de fase producidas por la luz que atraviesa el objeto, logra dividir la luz
de una nica fuente en dos haces luminosos, de los cuales uno se enva a travs del objeto y el otro
no se altera, por lo que acta como has de referencia. Despus se vuelven a unir ambos haces, que
interfieren entre si del mismo modo que en el microscopio de intercambio de fase. El has que
atraves el objeto sufre un retraso respecto al has de referencia, es decir, sufre una modificacin de
fase. Dado que el retraso es funcin del ndice de refraccin y del espesor, el valor del retraso se
puede emplear para determinar la masa por unidades de superficie del preparado y, en
consecuencia, la masa de los elementos celulares individuales (clula pilosa del odo).

Clula

5.- Microscopio de luz polarizada.

Los componentes cristalinos y fibrosos del material biolgico poseen una orientacin caractersticas
de las molculas. En consecuencia, cuando se ilumina el objeto con luz polarizada plana (luz que
slo vibra en un plano), sta se divide en dos componentes con distinta velocidad, en decir,
desfasados entre si. Se habla de estructuras birrefringentes o anistropas (sin movimientos). En

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contraste, se denomina estructuras istropas a las que no dividen luz polarizada, por lo que el
ndice de refraccin en igual en todas direcciones.
Se diferencia del microscopio ptico por tener dos filtros polarizantes. Uno de ellos el polarizador,
se encuentra antes del preparado y el otro, el analizador, esta ubicado por detrs. El polarizador
transforma la luz en polarizada plana antes de llegar al objeto, mientras que el analizador se utiliza
para registras la modificaciones de la polarizacin de la luz que ha atravesado el preparado.
Mediante el microscopio de luz polarizada es posible obtener informacin respecto a las estructura a
nivel molecular y para el estudio de clulas vivas. Si la sustancia analizada en monorefringente, el
campo de microscopio se ve oscuro, y si es birrefringente aparece iluminado.

Depsito amiloide

6.- Microscopio de fluorescencia.

Determinada sustancias fluorescen, es decir, tienen la particularidad de irradiar luz de otra longitud
de onda (color) al ser iluminadas. La luz irradiada siempre presenta una longitud de onda mas larga
que la original. Algunos componentes biolgicos, como por ejemplo, la vitamina A tiene
fluorescencia natural, mientras que otros la adquieren al ser tratadas con determinados colorantes
fluorescentes, por ejemplo fluorescena.
En el microscopio de fluorescencia se ilumina el preparado con intensa luz de la longitud de onda
capaz de activar el colorante fluorescente empleado. Esto se lleva acabo mediante un filtro del color
adecuado que se coloca por debajo del condensador: as se filtra la luz antes que incida en el
preparado. Adems, se coloca un filtro por encima del objetivo con un color correspondiente a la
longitud de onda de la luz que emite el colorante utilizado cuando fluoresce. Las estructuras
fluorescentes se destacan entonces en color sobre fondos oscuros, como fuentes luminosas, por lo
que es posible visualizar estructuras de dimensiones mucho ms pequeas que el poder de
resolucin del microscopio comn.

Helicobacter pylori

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Microscopa 10

7.- Microscopio de barrido.

La luz emitida en el microscopio de fluorescencia desde zonas del preparado ubicadas por encima y
por debajo del plano focal pueden restar nitidez a la imagen. Mediante el microscopio de barrido se
impide esta tendencia, dado que se excluye la luz no emitida por el plano focal. El preparado se
ilumina por un rayo lser que barre todos los puntos del plano focal, mientras que la luz emitida por
el preparado atraviesa una hendidura muy estrecha que detiene la luz emitida por otros niveles,
distintos del plano focal. De esta manera se logra obtener la informacin necesaria para formar una
imagen bidimensional que se registra sobre una pantalla de televisin. Al recoger con una
computadora una serie de imgenes de distintos planos focales es posible reconstruir una imagen
tridimensional del objeto, por ejemplo islotes de langerhans del pncreas.

Espermatozoide acercndose al ovocito

8.- Microscopio de luz ultravioleta.

Con el empleo de luz ultravioleta con longitud de onda de alrededor de 250 nm., es decir, casi la
mitad de la luz visible que utiliza el microscopio ptico es posible duplicar el poder de resolucin.
Su sistema ptico suele de estar construido de en cuarzo, permitiendo el paso de la luz ultravioleta,
que es invisible. En consecuencia, la formacin de la imagen se registra en una pelcula fotogrfica.
La principal importancia de este microscopio es que los cidos nucleicos absorben la luz
ultravioleta de determinada longitud de onda (260 nm.), por lo que se pueden detectar con facilidad.

Dermis

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Microscopa 11

9.- Microscopio electrnico.

La construccin del ME representa un verdadero logro en cuanto a incremento del aumento y del
poder de resolucin. En principio se debe a que reemplaza la luz visible, de longitud de onda de
alrededor de 500 nm., por un haz de electrones de longitud de onda del orden del 0,005 nm.. Como
los electrones no pueden atravesar las lentes de vidrio, es necesario reemplazarlas por bobinas
electromagnticas, en cuyos campos electromagnticos se modifican el trayecto del haz de
electrones de modo similar a como se refracta el haz de la luz visible en una lente de cristal. La
imagen obtenida se aumenta por una lente proyectora, que corresponde al ocular del microscopio
ptico. Dado que el haz de electrones es invisible, la imagen formada se registra por proyeccin
sobre una pantalla fluorescente o una pelcula fotogrfica.
La formacin de la imagen se debe, principalmente, a la dispersin de los electrones. As se
dispersan los electrones que colisionan con los ncleos atmicos y con sus electrones en el objeto, a
menudo de manera tal que inciden por fuera de la lente objetivo. En consecuencia, la imagen sobre
la pantalla se forma por la ausencia de estos electrones, como imagen en sombra. La dispersin de
los electrones depende del espesor del objeto y de su densidad molecular. En especial depende del
numero atmico de los tomos presentes en el objeto, dado que la dispersin obtenida es mayor,
cuanto mas elevado se el numero atmico. La mayora de los tomos de las estructuras biolgicas
tienen nmero atmico bastante bajo y contribuyen muy poco a la formacin de la imagen, por lo
que se adicionan tomos pesado a prepara los materiales

Linfocito