ANLISIS DE TRANSCRIPCIONES RNA EN PACIENTES DE LEUCEMIA CRNICOS

MYELOID
EXTRAIGA
La naturaleza de hbrido BCR/ABL mRNA fue analizado por RT-PCR en clulas de
33 pacientes (22 machos, 11 hembras) con la leucemia crnica myeloid (CML).
B3a2 mRNA fue encontrado en 14 casos, mientras que 13 pacientes tenan
b2a2 mRNA y seis tena ambas clases de mRNA, con un predominio del tipo de
b3a2. El tipo de presente de mRNA no mostr ninguna correlacin significativa
con la edad, el nivel de hemoglobina, el nmero de leucocitos y plaquetas,
porcentaje de rfagas o basophils o la presencia de splenomegaly en el
diagnstico. No haba tambin ninguna correlacin con el sexo o la duracin de
la fase crnica. Cuando estos resultados fueron combinados con aquellos
hechos un informe por otros grupos, una asociacin significativa (P = 0.029)
fueron observados para el tipo de mRNA contra el sexo, con un predominio de
hombres en los grupos que expresan b2a2 (2.68:1) y b3a2 (1.33:1).
Concluimos que la clasificacin de pacientes segn el tipo de mRNA no
homogeneiza los datos clnicos y hematological dentro de grupos, donde la
discrepancia es grande, tampoco esto permite a una diferenciacin entre
grupos.
La Introduccin
La leucemia Crnica myeloid (CML) es una enfermedad clonal caracterizada por
la presencia del gene hbrido BCR/ABL, por lo general localizada sobre el
cromosoma de Filadelfia que es resultado del desplazamiento recproco entre
cromosomas 9 y 22. Dos tipos principales de mRNA (b2a2 y b3a2) pueden ser
producidos de este gene. Estas transcripciones, que tambin pueden ser coexpresadas por el empalmar de alternativa, se diferencian por la presencia de
BCR exon 14 (exon b3 sobre el gene hbrido). La protena 210-kDa traducida de
estos mRNAs ha aumentado tyrosine kinase la actividad, que juega un papel
crucial en leukemogenesis (Shtivelman et al., 1985; Lugo et al., 1990).
Algunos informes han sugerido un papel para exon b3 en la evolucin de CML
(Molinos et al., 1991b). La presencia de exon b3 ha sido asociada con
parmetros de sangre anormales como altas cuentas de plaqueta (Inokuchi et
1991 Al-.; Verschraegen et al., 1995; Pastor et al., 1995), un porcentaje bajo de
clulas de rfaga circulantes, y altas cuentas de leucocito (Zaccaria et al.,
1995). Alto leukocytosis es asociado con splenomegaly. Cuentas de plaqueta
elevadas (cortado = 700,000/ml) y un bazo ampliado son correlacionadas con
un pronstico malo, mientras que la parte de enfrente es observada cuando el
porcentaje de clulas de rfaga circulantes es bajo.
Estos tres parmetros (cuentas de plaqueta, difundiendo el porcentaje de
rfaga y el tamao de bazo) son usados para determinar el ndice de
pronstico Sokal (Sokal et 1984 Al-.,). Otros estudios, sin embargo, no han
mostrado ninguna asociacin significativa entre el tipo de mRNA y los
indicadores clnicos o de laboratorio de CML (Fioretos et al., 1993; Zaccaria et
al., 1993; Yin et al., 1995). En este estudio, usamos RT-PCR para investigar. el
tipo de mRNA presenta en 33 pacientes con CML y analizado la correlacin
entre los datos moleculares y el hematological y conclusiones clnicas.
MATERIAL y MTODOS

Pacientes de muestras
La sangre perifrica fue recogida de 31 pacientes con un diagnstico clnico y
cytogenetic de CML, y de dos pacientes con slo un diagnstico clnico. Todos
los pacientes fueron asistidos en el Hospital de Clnicas de Puerto Alegre. Dos
de los pacientes tenan la sangre tranquila sobre ms que una ocasin durante
la fase crnica de la enfermedad, y en tres muestras de casos fue recogida
durante el crnico y la fase subsecuente aguda. Once de los pacientes eran
hembras y 22 eran machos, con una edad tacaa de 36.5 aos (12-60 aos) en
el diagnstico. La mayor parte de los pacientes recibieron chemoterapy
convencional (hydroxyurea o busulfan), y 10 de ellos fueron tratados con el
interfern - un durante menos de 6 meses, sin la remisin karyotypic. Clulas
mononucleares estuvieron preparadas de muestras de sangre perifricas que
usan un Ficoll-Hypaque (Histopaque, Sigma la Compaa Qumica, San Louis,
MO) el gradiente. Las clulas fueron almacenadas en el nitrgeno lquido antes
del empleo.
Nucleic preparacin cida y transcripcin inversa.
El ARN total celular fue extrado de clulas congeladas con Trizol (Gibco BRL, la
Magnfica Isla, Nueva York) segn las instrucciones del fabricante. El ARN fue
suspendido de nuevo en 20 ml de agua estril trat con diethylpyrocarbonate
(DEPC, Sigma). cDNA fue generado de 8 ml de ARN total, usando hexamers
arbitrario y un primer hilo cDNA el equipo de sntesis (Pharmacia Biotech, la S
la o Paulo, SP, Brasil).
Reaccin en cadena de polimerasis (PCR)
La mezcla de reaccin contuvo 2.5 ml cDNA100 mm de cada dNTP, 10 mm TrisHCl, pH 8.3, 1.5 mm MgCl2, 2.5 U Taq polimerasis (Cenbiot/RS, Puerto Alegre
RS, Brasil) y 1 mm de cada cartilla en un volumen final de 25 ml. La cartilla de
antisentido sacada de exon a2 de ABL era 5'CTCCACTGGCCACAAAAT3 ' y la
cartilla de sentido sacada de exon b2 de M-bcr era 5'TTCAGAAGCT TCTCCCTG3
' (el Len et al., 1991). Las muestras fueron recubridas del aceite mineral
seguido de 35 ciclos de PCR en un Pharmacia thermocycler. El ADN era
desnaturalizado por al principio calentando las muestras en 93oC durante 2
minuto, y luego para 40 s en ciclos subsecuentes. Permitieron a cartillas para
templar en 60oC para 30 s y la extensin de hilo fue hecha en 72oC para 40 s,
con un paso de extensin final de 7 minuto.
Una parte alcuota (0.5-2.5 ml) de esta primera amplificacin ms lejos fue
amplificada por una segunda ronda de PCR la utilizacin de 1 mm de la cartilla
de exon b2 de M-bcr (5'TTCAGAAGCTTCTCCCTGACATCCG3 ') y exon a2 de ABL
(5'CTCCACTGGCCACAAAAT CATACAG3 ') (Trka et al., 1995). La reaccin
condiciona para esta segunda ronda de amplificacin complicada: firme con las
iniciales denaturation (2 minuto) en 93oC seguido de 35 ciclos de denaturation
en 93oC para 40 s, que templa en 60oC para 40 s, y la extensin en 72oC
durante 1 minuto con un paso de extensin final en 72oC para 7 minuto. Un
control negativo (el agua en vez de cDNA) fue incluido en todas las reacciones.

Todas las muestras fueron amplificadas sobre al menos dos ocasiones

diferentes para confirmar los resultados. En casos donde ninguna amplificacin
fue obtenida durante la primera ronda de PCR, el cDNA fue probado en un PCR
con cartillas de b-actin (Schulze et al., 1995) (control) para evaluar la
integridad de la molcula de ARN.
Las partes alcuotas (8 ml) de los productos PCR fueron controladas sobre el 2
% nucleic el cido (NA) agarose (Pharmacia Biotech) geles que contienen
ethidium el bromuro y marcadores de peso moleculares (la escala de par de
100 bases; Pharmacia Biotech). Las cartillas usadas en las dos rondas de PCR
especificaron un fragmento 327-bp del b3a2 mRNA, y un fragmento 246-bp en
ausencia de exon b3.
Anlisis estadstico
Los pacientes fueron separados en dos grupos (la presencia o la ausencia de
exon b3), y la asociacin con parmetros clnicos y hematological fue analizada
usando la prueba de c2 o el Pescador la prueba exacta para parmetros
categricos y la prueba de t del Estudiante o la prueba de Mann-Whitney para
parmetros continuos. Parmetros edad incluida, sexo, medida de
hemoglobina, glbulo blanco y cuentas de plaqueta, y porcentaje de rfagas y
basophils. El tamao de bazo (expresado como el aumento comparando con de
talla normal) y el ndice de Sokal (mirar la Introduccin) tambin fueron
incluidos. Los datos no estaban disponibles para algunos pacientes.
La duracin de la fase crnica fue calculada de la fecha del diagnstico a la
fecha de la fase acelerada o aguda. La definicin de fases crnicas y agudas
sigui los criterios descritos de Kantarjian et al. (1990). En nueve de los 33
casos, un anlisis citolgico tambin fue hecho durante la fase aguda de la
enfermedad. B3a2 mRNA fue observado en tres de estos nueve casos, mientras
que en cinco b2a2 mRNA fue visto y en un ambos tipos de mRNA fueron
descubiertos. Un estudio combinado fue conducido en el cual los resultados
relatados por otros fueron incluidos. Slo los estudios en los cuales el tipo de
mRNA fue determinado por pruebas con una sensibilidad similar a esto
empleado en el estudio presente, p. ej., dos rondas consecutivas de PCR o una
ronda con el empleo de sondas radiactivas para descubrir los fragmentos
amplificados, fueron considerados. Los datos de los informes siguientes fueron
usados en nuestra bsqueda para asociaciones entre el tipo de mRNA y
parmetros clnicos: Yin et al. (1995) y Pastor et al. (1995) para el Sokal
RESULTADOS
Las condiciones para RT-PCR establecido con este trabajo proporcionaron la
amplificacin excelente de cDNA de BCR/ABL mRNA. El material analiz
muestras incluidas de 33 pacientes, 25 tranquilo en la fase crnica y 13 en la
fase acelerada de la enfermedad. En casos donde ms que una muestra fue
probada sobre ocasiones diferentes durante la fase crnica (dos pacientes), o
en la fase crnica y subsecuente acelerada (tres pacientes), no haba ninguna
alteracin en el tipo de transcripcin obtenida. B3a2 mRNA fue descubierto en
muestras de 14 de los pacientes CML, mientras que b2a2 mRNA fue observado
en 13 casos y seis pacientes tena ambos tipos de transcripciones. BCR/ABL

mRNA fue descubierto despus de la primera ronda de PCR en todos los casos
excepto el que en el cual las clulas mononucleares mostraron una viabilidad
baja. En cuatro de los seis casos con ambos tipos de transcripciones, el
segundo tipo fue observado slo despus de la segunda ronda de PCR.
No haba ningunas asociaciones significativas entre el tipo de mRNA y
hematological o parmetros clnicos en el diagnstico, o la duracin de la fase
crnica (la Mesa I). Un anlisis combinado incluyendo nuestros resultados y
aquellos hechos un informe en la literatura mostraron que la nica asociacin
significativa estaba entre el tipo de mRNA y el sexo (la Mesa II), con un
predominio de hombres en los grupos que expresan b2a2 (2.68:1) y b3a2
(1.33:1).
DISCUSIN
RT-PCR extensamente es usado para estudiar el gene hbrido BCR/ABL en CML.
Pueden confirmar la especificidad de la reaccin de amplificacin la hibridacin
con sondas etiquetadas. Esto no era necesario en el estudio presente como la
mayor parte de las muestras eran tambin ordenadas en un estudio paralelo
(Meissner et al., 1998). Desde cartillas para exons b2 y a2 fue usado, la tcnica
no es apropiada por la identificacin de mRNA con una unin e1a2 o para los
casos raros donde el lmite de facturacin es M-bcr exterior. Biernaux et al.
(1995) desarroll PCR sumamente sensible anidado para descubrir CML
residual. En las condiciones de alta severidad y el control estricto de aspectos
positivos falsos, este ensaye fue capaz de descubrir BCR/ABL mRNA en
individuos normales. Algunas diferencias importantes entre personas sanas y
pacientes con CML aseguran que en condiciones normales RT-PCR es adecuado
para el diagnstico de CML. En el estudio por Biernaux et al. (1995), mRNA fue
extrado de clulas en 100 ml de sangre comparada 1-5 ml generalmente
usados para pacientes. En personas normales, el gene BCR/ABL fue descubierto
slo despus de la segunda ronda de PCR, mientras que para pacientes CML
una ronda era suficiente en la mayora de los casos. Finalmente, la
concentracin de BCR/ABL mRNA en pacientes CML es de 5-6 transcripciones
por clula (la furgoneta Rhee et al., 1996), mientras que Biernaux et al. (1995)
encontr una concentracin de 5-20 transcripciones por 5-10 x 107 clulas
normales. El anlisis molecular del cromosoma de Filadelfia en CML ha
mostrado que, independiente de la posicin del lmite de facturacin de M-bcr,
el hbrido BCR/ABL el gene puede dar lugar a dos tipos principales de 8.5
kilobytes mRNA que se diferencia por el presencia de exon b3 (Nakamura et al.,
1991; Molinos et al., 1991b). No lo saben si esta diferencia es reflejada en las
propiedades de la protena hbrida o en el fenotipo de enfermedad. Varios
estudios, incluyendo ste, han mostrado que la clasificacin CML segn el tipo
de mRNA no produce datos homogneos clnicos o hematological. Aunque la
discrepancia de cada parmetro fuera grande entre pacientes para cada tipo
de mRNA, no haba ningunas diferencias significativas entre los grupos,
excepto la duracin de la fase crnica para la cual la discrepancia en el grupo

b3a2 era mayor que en el grupo b2a2 (P <0.05). Los pacientes en la fase
acelerada o aguda en el diagnstico no fueron considerados en el anlisis.
La variacin considerable en los parmetros dentro de cada grupo ha sido
relatada en otros estudios que han investigado una correlacin entre el tipo de
mRNA o la regin de lmite de facturacin de ADN y los parmetros clnicos o
hematological en el diagnstico. Morris et al. (1990) combin sus resultados
con aquellos de Shtalrid et al. (1988) y observado que los pacientes con lmites
de facturacin en 5 ' M-bcr tenan una tendencia considerablemente ms alta
de desarrollar la crisis de rfaga de myeloid, mientras que los 3 ' el lmite de
facturacin de M-bcr fueron asociados con la crisis de rfaga de lymphoid.
Martinelli no confirm esta asociacin et al. (1991) cuando sus resultados
fueron analizados juntos con aquellos de otros estudios.
La mayor parte de investigaciones han buscado para una asociacin entre la
lnea de clula se ampli durante la crisis de rfaga y lmites de facturacin en
los 3 ' o 5 ' las regiones de M-bcr. A nuestro conocimiento, ningn estudio haba
analizado la asociacin entre la crisis de rfaga y el tipo de mRNA complicado.
El anlisis combinado de nuestros resultados con aquellos de otros (el total de
43 casos) mostr que ningn predominio de dos mRNA teclea myeloid o la
crisis de rfaga de lymphoid. Sin embargo, haba una asociacin entre el tipo
de mRNA y sexo (P = 0.029), pero no tenemos ninguna explicacin de esto en
este momento.
La heterogeneidad clnica de pacientes CML en el diagnstico parece ser
dependiente durante el tiempo en el cual la asistencia mdica es buscada.
Como con muchas otras enfermedades, el estado socioeconmico, la
localizacin geogrfica del paciente y otros factores culturales influye cuando
la asistencia mdica es buscada y la situacin clnica en el diagnstico. As, los
pacientes con las formas menos agresivas de la enfermedad pueden buscar
para la ayuda ms tarde cuando la enfermedad es ms avanzada. Si las
diferencias decididas por exon b3 del hbrido BCR/ABL el gene desempean un
papel en el progreso, ellos no son al parecer bastante fuertes para ser visto en
este nivel.
las diferencias decididas por exon b3 del hbrido BCR/ABL el gene desempean
un papel en el progreso, ellos no son al parecer bastante fuertes para ser visto
en este nivel.
ser asociado con la regulacin de expresin de oncogn y heterogeneidad de la
enfermedad. Los estudios en los cuales los pacientes fueron clasificados segn
la posicin del lmite de facturacin de M-bcr en relacin con un sitio de HindIII
al azar seleccionado central (ven Molinos et al., 1991a) generalmente no
consideraba cuntos de estos elementos reguladores fueron incluidos en el
hbrido BCR/ABL el gene. Creemos que una mejor comprensin de la regulacin

y el funcionamiento del BCR y genes ABL durante la diferenciacin de clula en

hematopoiesis normal ayudar a aclarar su papel en leukemogenesis.