Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
l aire exhalado de los humanos contiene ms de 2.000 sustancias [1-3] que desde el punto
de vista del laboratorio clnico representan nuevas posibilidades de diagnstico. Alrededor
de algunas de estas sustancias, en particular el hidrgeno y el dixido de carbono (C02), se
han desarrollado pruebas de utilidad clnica, cada vez ms solicitadas en la prctica mdica del
da a da. Es as como se dispone de pruebas de aliento para enfermedades infecciosas como la
infeccin por Helicobacter pylori [4-5] y el sobrecrecimiento bacteriano [6]; para enfermedades
digestivas como el estudio del vaciamiento gstrico [7], el tiempo de trnsito intestinal [8] y la
enfermedad celaca [9]; para enfermedades metablicas como la malabsorcin (e intolerancia)
a lactosa [10] y otros carbohidratos como la sucrosa o sacarosa [11], la fructosa [12] y la maltosa
[13]; para enfermedades endocrinas como la diabetes mellitus [14] y la resistencia a la insulina
[15], en alteraciones de la funcin pancretica [16] y para el manejo de las hepatopatas crnicas
[17], incluido el trasplante heptico [18]; y, para enfermedades alrgicas como el asma [19] y el
diagnstico diferencial con la enfermedad pulmonar crnica [20] y se est avanzando en la utilizacin de estas pruebas para el diagnstico de cncer, como el cncer de pulmn [21-24], solo
para poner algunos ejemplos de la utilidad de esta nueva tecnologa mdica.
1
Mdico especialista en Hematologa y Patologa Clnica. Docente, Ad Honorem, Facultad de Medicina, Universidad
de Antioquia. Mdico Director, Laboratorio Clnico Hematolgico, Carrera 43C No. 5-33, Medelln, Colombia. E-mail:
gcampuzano@hematologico.com
431
El 99% de los gases intestinales est representado por nitrgeno, oxgeno, dixido de carbono, hidrgeno y metano y es el nitrgeno, el que predomina en condiciones normales,
mostrando, adems, variaciones de acuerdo con el segmento del tracto gastrointestinal en
donde se analicen; por ejemplo, en el estmago predominan el nitrgeno y el oxigeno,
con concentraciones similares a las de la atmsfera, y en el colon predominan el hidrgeno y el metano [27].
La
produccin intraluminal de gases se limita a tres de los cinco gases que se encuentran en
el intestino: al hidrgeno, al metano y al dixido de carbono, as:
432
Campuzano-Maya G.
El dixido de carbono se deriva de la digestin de las grasas y las protenas en el tracto digestivo superior, por fermentacin bacteriana de sustratos intraluminales o como resultado
de la interaccin de cido y bicarbonato [34]. Gran parte del dixido de carbono que se
produce en el intestino delgado probablemente es absorbido antes de llegar al colon, en
tanto que el dixido de carbono que se produce por accin bacteriana (fermentacin) en
el colon, es eliminado mediante flatos, caractersticamente explosivos [35];
La
difusin de los gases intestinales a la sangre y su eliminacin a travs del alvolo pulmonar
La flora bacteriana del colon constituye un ecosistema donde muchas especies distintas participan de ciclos vitales interrelacionados o incluso interdependientes, en
un mbito de gran biodiversidad, comparable a los grandes hbitats naturales de la
superficie terrestre como los bosques y los lagos [36], y una de las muchas funciones
es la fermentacin de residuos de la dieta y mucinas endgenas;
Las bacterias del colon actan como un rgano de intensa actividad metablica por la
accin de enzimas bacterianas sobre sustratos presentes en la luz intestinal; tanto que
algunos autores consideran que la actividad metablica de la flora es comparable en
su magnitud a la del hgado, pero es mucho ms diversa en funciones [36-37];
La cantidad de hidrgeno y de metano en el aire espirado (aire alveolar) es proporcional a la cantidad de material fermentado por bacterias de origen colnico [28],
fundamento bsico de la prueba de aliento basada en hidrgeno [3];
433
Malabsorcin de lactosa
La lactosa es un disacrido presente en la leche que dependiendo de la especie de donde se
derive, se encuentra en concentracin variable: la leche humana contiene 7,2 g/100 mL, en tanto
que la leche de vaca contiene 4,7 g/100 mL [38]. Como un disacrido que es la lactosa, para
sta ser absorbida en el intestino delgado debe ser convertida en monosacrido, y para lograr
este objetivo, la lactasa-florizina hidrolasa, ms conocida como lactasa, una beta-galactosidasa, la
hidroliza y genera glucosa y galactosa, que son absorbidas por los enterocitos intestinales distribuidos uniformemente desde el yeyuno hasta el leon [39-40].
La actividad de la lactasa aumenta en el humano en las fases finales de la gestacin y se mantiene en niveles altos hasta el momento del destete, momento en el que comienza a declinar su
actividad, encontrndose en la mayora de los adultos una hipolactasia o deficiencia de la lactosa,
como se analizar a continuacin [40]. La hipolactasia o deficiencia de lactasa, se presenta en tres
formas: congnita, primaria y secundaria, con las siguientes caractersticas:
La
forma congnita es un desorden autosmico recesivo, extremadamente raro, que se manifiesta con diarrea severa a partir del momento en que el recin nacido se pone en contacto
con la leche, situacin que pone en riesgo la vida del nio si no se la diagnstica a tiempo y no
se la trata adecuadamente [41-42].
La
forma primaria de la deficiencia de lactasa, tambin conocida como hipolactasia del adulto, se da como resultado de la disminucin de la expresin de la enzima a travs del tiempo,
desde la niez hasta la adolescencia, disminucin que vara ampliamente de una poblacin a
otra [40], como se analizar ms adelante.
La
434
Campuzano-Maya G.
dad normal de la lactasa, como sucede con las gastroenteritis virales como la producida
por rotavirus [43], parasitosis del intestino delgado, como la giardiasis [44] y la criptosporidiaris [45], y en pacientes con enfermedad celaca [46], que contrario a la hipolactasia
primaria puede ser reversible [47], en la enfermedad de Crohn [48-49] y en los pacientes con sobrecimiento bacteriano, sobre todo cuando son de edad avanzada [50], entre
otras.
Para mayor informacin sobre el aspecto molecular, el diagnstico y las consecuencias de
la malabsorcin de lactosa, se recomienda consultar un mdulo sobre este tema publicado en
Medicina & Laboratorio [39].
Prevalencia
La malabsorcin de lactosa que contiene los alimentos, principalmente los lcteos, es un
problema mdico relativamente frecuente [51]. Se estima que alrededor del 70% de la poblacin
mundial tiene deficiencia primaria de lactasa [40], que en su mayora no se manifiesta por mecanismos de adaptacin [52] o por los bajos consumos de lcteos o porque, simplemente, los que
la presentan se cuidan para no excederse en el consumo de estos productos. La prevalencia de
la hipolactasia tiene una marcada diferencia racial y regional: es tan baja, como 3% a 8%, en Escandinavia y en el noroeste de Europa [53], pases con alta tradicin lechera, hasta tan alta, como
el 100%, en el sudoeste de Asa [54-55]. En Estados Unidos, la prevalencia vara de acuerdo con
los grupos tnicos: se encuentra una prevalencia global de 25%, que discriminada por grupos
tnicos es de 12% para los blancos americanos, de 53% para los blancos americanos de origen
mexicano, de 80% para los afroamericanos y de 90% para los americanos de origen asitico [56].
En Colombia, ngel y colaboradores estudiaron, en Bogot, una poblacin universitaria de 98
individuos, con una edad promedio de 20 aos, y encontraron hipolactasia, tras una prueba de
aliento, una prevalencia de 56% [57], cifra que es muy similar a las frecuencias descritas en el
resto de continente latinoamericano [58].
Manifestaciones clnicas
Como se expres al principio de este mdulo, la intolerancia a lactosa es un sndrome clnico caracterizado, por algunos de los siguientes sntomas: dolor abdominal, diarrea, flatulencia,
meteorismo y nauseas relacionados con la ingesta de lcteos, en tanto que la malabsorcin de
lactosa es un fenmeno fisiopatolgico caracterizado por absorcin deficiente de lactosa que
clnicamente se manifiesta por intolerancia a lactosa y se da como consecuencia de la ingesta de
lactosa en cantidad superior a la capacidad de hidrolizar por accin de la lactasa presente en el
intestino delgado del individuo afectado; lo que en otras palabras significa que no todas las personas con hipolactasia necesariamente desarrollan intolerancia a lactosa (sntomas) despus de
la ingestin de lcteos, y, viceversa, no todas las personas que son intolerantes a la lactosa tienen
hipolactasia, debido a que sta se puede presentar asociada con factores fisiolgicos y sicolgicos
[56,59], ms que a la deficiencia enzimtica.
Los sntomas que acompaan a la deficiencia de lactasa no son especficos y varan de
intensidad y forma y de persona a persona, y usualmente son dependientes de la cantidad
de lactosa ingerida [56]. Se puede presentar dolor abdominal, clicos, flatulencia, borborigmos, distensin abdominal y diarrea [60], manifestaciones que se pueden presentar tan
temprano como a partir de los 30 minutos o tan tarde como despus varias horas de ingerir
los alimentos que contienen lactosa [53]. Adems de la sintomatologa digestiva propia de la
malabsorcin de lactosa, los pacientes con esta afeccin tienen mayor tendencia a desarrollar osteoporosis y fracturas patolgicas como resultado de la eliminacin de los productos
lcteos de la dieta [61-62].
Medicina & Laboratorio, Volumen 15, Nmeros 9-10, 2009
435
Diagnstico
El estndar de oro para el diagnstico de la malabsorcin de lactosa es la determinacin de
la actividad de la lactasa, demostrada en biopsia de yeyuno procesada con tcnicas inmunomorfolgicas, enzimo-histoqumicas y ensayos de actividad enzimtica [26], que adems de ser un
mtodo invasivo y con ndices de desempeo por debajo de las otras pruebas, como las que se
analizan en este mdulo, es un mtodo costoso e invasivo para ser empleado de rutina, al menos
en nuestro medio [63]. Como alternativa a la prueba invasiva, hasta la introduccin al laboratorio
clnico de las pruebas de aliento, en la prctica mdica, el diagnstico de malabsorcin de lactosa
se poda hacer mediante la prueba de malabsorcin de lactosa, en donde al paciente con sospecha de ser intolerante, previo ayuno de 12 horas, ingiere 50 g de lactosa y se toman muestras de
sangre basal y cada 30 minutos por 2 a 3 horas [64]. Esta prueba, adems de que se administra
por va oral la misma cantidad de lactosa que la que se utiliza en la prueba de aliento, requiere
una flebotoma cada 30 minutos, por dos a tres horas y determinacin de glucosa en sangre en el
laboratorio clnico, procedimiento que aparte de ser un mtodo invasivo [64] y no estar disponible en la mayora de los laboratorios clnicos, tiene un desempeo analtico por debajo del que
se logra con la prueba de aliento [10], si se tiene en cuenta que da resultados falsos positivos y
falsos negativos hasta en el 20% de los casos [65].
Lactosa
Lactasa
Glucosa
Galactosa
Yeyuno
leo
Colon
Figura 1. Metabolismo y absorcin de la lactosa. La lactosa, una vez en el intestino delgado se hidroliza, mediante la intervencin de la lactasa, para generar glucosa y galactosa que son absorbidas por los enterocitos intestinales, distribuidos
uniformemente desde el yeyuno hasta el leon.
436
Campuzano-Maya G.
H2O
H2O
Lactosa
Yeyuno
leo
CO2
Colon
H2
CH4
Figura 2. Malabsorcin de lactosa. Cuando no hay lactasa o la mucosa intestinal est deteriorada, independiente de la
causa, la lactosa ingerida, en la prueba o en la alimentacin, sta no es metabolizada y en consecuencia llega al colon, en
donde es descompuesta por fermentacin bacteriana, dando origen a la produccin de gases, que como el hidrgeno (H2)
y el metano (CH4) llegan al torrente sanguneo y de all a los pulmones, en donde son eliminados con el aire espirado.
Procedimiento
Los siguientes son los pasos a seguir para hacer la prueba utilizando lactosa como sustrato [67]:
La preparacin del paciente es crtica y debe tenerse en cuenta:
Que
Adems,
Tras
un ayuno de 12 horas, tomar la muestra basal. Es ideal que el laboratorio clnico haga la
determinacin de hidrgeno basal antes de administrar la carga de lactosa. Si la preparacin
del paciente ha sido correcta, el hidrgeno basal debe estar por debajo de 10 ppm [67]. Si
la muestra basal tiene ms de 10 ppm de hidrgeno, aparte de que puede indicar falta de
preparacin del paciente, tambin puede ser indicio de un sobrecrecimiento bacteriano, y
en este caso se le debe sugerir revisar la dieta, ajustarla y volver otro da o si se sospecha sobrecrecimiento bacteriano o la muestra basal persiste con hidrgeno elevado, se debe indicar
una prueba para sobrecrecimiento bacteriano, en vez de la prueba con lactosa [67].
437
Tomar
muestras de aire espirado (aire alveolar) cada 30 minutos a partir del momento en
que se toma la lactosa hasta por tres horas, tiempo que puede ampliarse de acuerdo a los
resultados que se vayan observando en el curso de la prueba [67]. Algunos laboratorios clnicos toman las muestras cada hora con resultados similares a la prueba convencional y para
aumentar el desempeo analtico, en especial para mejorar la sensibilidad, las mediciones se
pueden extender hasta por 6 horas [40]. Adems, para diferenciar la malabsorcin de la
intolerancia, como se ha expresado, al momento de hacer la prueba se debe interrogar al
paciente sobre manifestaciones clnicas y si estn presentes, anotarlas en el resultado final,
idealmente definindolas y ubicndolas en la curva [68].
Interpretacin de la prueba
Se considera que la prueba es negativa, o normal, para malabsorcin de lactosa cuando la
concentracin de hidrgeno permanece por debajo de 10 ppm durante todo el tiempo que dura
la prueba y se considera que la prueba es positiva, o anormal, para malabsorcin de lactosa cuando la concentracin de hidrgeno se eleva por lo menos 10 ppm [68]. Para mayor comprensin
de la prueba, en la figura 3 se muestran algunos ejemplos representativos de las diferentes posibilidades de una prueba de aliento para malabsorcin de lactosa, utilizando la medicin nica
de hidrgeno, y en la figura 4 se muestra la prueba en un paciente con malabsorcin de lactosa
pero con flora metanognica.
Indicaciones de la prueba
La prueba de aliento para malabsorcin de lactosa est indicada en todos los individuos que
presenten dolor abdominal, clicos, flatulencia, borborigmos, distensin abdominal y diarrea, y
Intestino delgado
140
120
100
80
Anormal
60
(2)
40
(3)
20
(1)
0
Basal 15
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
195
Normal
210
Tiempo (minutos)
Figura 3. Prueba de aliento para malabsorcin de lactosa basada en la medicin de hidrgeno espirado. Se presentan los
resultados de tres pacientes con las diferentes posibilidades de resultados, (1) normal: la lactosa se absorbe en el intestino
delgado y en consecuencia no hay cambios en los niveles de hidrgeno en aire espirado en los 180 minutos, tiempo que
dura la prueba; (2) malabsorcin de lactosa: debido a que no hay absorcin de la lactosa en el intestino delgado, sta
llega al colon en donde en donde la fermentacin bacteriana libera, entre otros gases, hidrgeno que aparece aumentado
a partir de 90 minutos despus de haber ingerido una carga de 25 g de lactosa; (3) normal en la curva de hidrgeno, pero
presencia de sntomas compatibles con intolerancia (borborigmos, dolor abdominal) durante la prueba: ver interpretacin
de la prueba con medicin de metano, en la figura 4. Fuente: Laboratorio Clnico Hematolgico, Medelln, Colombia.
438
Campuzano-Maya G.
Intestino delgado
140
120
100
(2)
80
Anormal
60
40
(1)
20
Normal
0
Basal 15
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
195
210
Tiempo (minutos)
Figura 4. Prueba de aliento para malabsorcin de lactosa basada en la medicin de metano espirado. Se presentan el
resultado del paciente nmero 3 sealado en la figura 3, en donde, (1) corresponde a la prueba basada en la medicin
de hidrgeno negativa pero con signos de intolerancia (borborigmos y dolor abdominal); (2) corresponde a la prueba del
paciente antes citado pero con la medicin de metano que se encuentra elevado a partir de 105 minutos despus de haber
ingerido una carga de 25 g de lactosa. Esta diferencia se explica por la presencia de bacterias metanognicas en el colon.
Fuente: Laboratorio Clnico Hematolgico, Medelln, Colombia.
con mayor nfasis, cuando el mismo paciente asocia estas manifestaciones con el consumo de
leche o de productos lcteos [27]. Es pertinente recordar que en la dieta normal, aparentemente
libre de lcteos, como perros calientes, carnes fras, cremas para caf, adobo de aves, pat de
hgado y confitera, para enunciar algunos de ellos, sin saberlo se puede consumir lactosa que
se le ha agregado a estos productos durante su produccin. Igual situacin sucede con muchos
medicamentos, en donde hasta el 30% de ellos tienen lactosa como excipiente [73-74].
Limitaciones de la prueba
Como toda prueba de laboratorio, la prueba de aliento para malabsorcin de lactosa no est
exenta de resultados falsos positivos o falsos negativos, situacin que se analizar a continuacin.
439
Observaciones adicionales
Ante todo, como sucede en la mayora de las pruebas de laboratorio clnico, la prueba de
aliento para malabsorcin de lactosa debe ser indicada e interpretada en el contexto clnico
[68]. La prueba de aliento para malabsorcin de lactosa, con respecto a otras alternativas de
diagnstico, incluida la biopsia de intestino delgado, tiene dos grandes ventajas: es muy conveniente tanto para el examinador como para el paciente, debido a que es una prueba no-invasiva
y sus resultados son muy confiables, cuando se hace siguiendo los protocolos al pie de la letra
[82]. Una variable tcnica de la prueba de aliento para malabsorcin de lactosa es la prueba utilizando lactosa marcada con carbono 13 (13C-lactosa) [83-84], pero a pesar de las expectativas
con esta variable, no ha superado el desempeo analtico y la facilidad de la prueba de aliento
basada en hidrgeno como la que se ha descrito en este mdulo utilizando la cromatografa de
gases [67].
Malabsorcin de fructosa
La fructosa, tambin conocida como levulosa o azcar de fruta, es un azcar de seis carbones, presente en forma natural en frutas como manzanas, peras, melones, cerezas y naranjas, y en
la miel de abejas, en donde llega a tener hasta 35 gramos por 100 gramos de porcin [85-86], o
derivada enzimticamente de cereales ricos en fructosa como el jarabe o sirope de maz, que se
utiliza como endulzante de muchos alimentos [87-88]. La fructosa puede ser ingerida como monosacridos en los alimentos ricos en fructosa como el jarabe de maz o como disacridos como
la sucrosa o azcar de mesa que hidrolizada por la sucrasa produce fructuosa y glucosa que
son absorbidas por los enterocitos intestinales distribuidos uniformemente desde el yeyuno hasta
el leon. La prueba de aliento para malabsorcin de fructosa provee informacin clnica acerca de
la digestin de la fructosa. Es importante diferenciar la malabsorcin de fructuosa que se refiere
a una alteracin en el intestino delgado que no permite que sta sea absorbida [86-87,89], de la
intolerancia a fructuosa, una grave enfermedad gentica, caracterizada por un defecto del metabolismo de la fructuosa a nivel heptico por deficiencia de aldolasa B, fructosa 1-fosfato aldolasa,
necesaria para descomponer la fructuosa e incorporarla a los procesos metablicos a nivel del hgado [90-91], potencialmente mortal si no se la reconoce y se maneja adecuadamente [92-94].
No hay estudios que permitan determinar a ciencia cierta la prevalencia de malabsorcin de
fructuosa y en gran parte se debe a que la mayora de los pacientes que la presentan autolimitan
el consumo de alimentos que potencialmente la contienen. Un reciente informe, dependiendo
de la concentracin de fructuosa administrada, mediante la prueba de aliento midiendo hidrgeno, encuentra que la prevalencia de la malabsorcin de fructuosa puede oscilar entre el 30% y
80% de la poblacin estudiada [90], pero el Departamento de Agricultura de Estados Unidos ha
encontrado que la prevalencia de la malabsorcin de fructosa ha aumentado significativamente
entre 1966 y 2003, debido a que cada vez es ms frecuente el uso de jarabe de maz como endulzante de muchos productos de consumo masivo como gaseosas y confites [88]. En la figura
5 se esquematiza la absorcin intestinal de la fructuosa y en la figura 6 la malabsorcin de la
fructuosa.
Medicina & Laboratorio, Volumen 15, Nmeros 9-10, 2009
440
Campuzano-Maya G.
Fructosa
Sucrosa
Fructosa
Sucrasa
Fructosa +
Glucosa
Yeyuno
leo
Colon
Figura 5. Metabolismo y absorcin de la fructuosa. La fructuosa, ingerida como tal en las frutas o como endulzante o
derivada de la sucrosa (sacarosa), una vez en el intestino delgado se hidroliza, mediante la intervencin de la sucrasa,
para generar fructosa y glucosa que son absorbidas por los enterocitos intestinales, distribuidos uniformemente desde el
yeyuno hasta el leon.
H2O
Fructosa
Fructosa
Sucrosa
Sucrosa
Yeyuno
leo
H2O
CO2
H2
CH4
Colon
Figura 6. Malabsorcin de la fructuosa. Cuando no hay absorcin de la fructuosa, independiente de la causa, la fructuosa
ingerida, en la prueba o en la alimentacin, sta llega al colon, en donde es descompuesta por fermentacin bacteriana,
dando origen a la produccin de gases, que como el hidrgeno (H2) y el metano (CH4) llegan al torrente sanguneo y de all
a los pulmones, en donde son eliminados con el aire espirado.
Observaciones adicionales
El consumo de fructuosa continua en aumento debido a que cada vez se incorpora ms a la
industria alimenticia, llegando a un consumo promedio en la poblacin americana de 54,7 g/da,
sobre todo en adolescentes [97], cifra que ya est por encima del valor lmite de 50 g/da, para
el manejo de este azcar en el intestino delgado sin manifestaciones, debido a que es dosis dependiente [98]. La prueba de aliento para malabsorcin de fructuosa, que es el estndar de oro
en el diagnstico de la malabsorcin e intolerancia intestinal, est contraindicada en pacientes
con sospecha de intolerancia hereditaria a la fructuosa o antecedentes de hipoglicemia, debido
a que puede tener complicaciones severas [90-91,93], aun con la muerte del paciente, cuando
sin saberlo se le administra fructosa parenteral [93]. En este caso es recomendable empezar por
descartar el diagnstico de intolerancia hereditaria a la fructuosa, preferiblemente con una prueba de gentica molecular [91,99].
Medicina & Laboratorio, Volumen 15, Nmeros 9-10, 2009
441
Sobrecimiento bacteriano
La microflora gastrointestinal del humano es un complejo ecosistema compuesto por alrededor de 500 especies de bacterias que colonizan el tracto digestivo poco despus del nacimiento,
ecosistema que mantiene una composicin relativamente constante a travs de la vida [103].
Mientras que en el intestino delgado el nmero de bacterias es escaso, con 103 a 105 unidades
formadoras de colonia por mililitro (ufc/mL), en su mayora representadas por especies aerobias
de tipo Gram positivas, en el intestino grueso la cantidad es superior 1011 ufc/mL y en su mayora estn representadas por especies anaerobias de tipo Gram negativas [103]. El sobrecimiento
bacteriano, tambin conocido como SIBO por la sigla de Small Intestinal Bacterial Overgrowth
y sndrome de intestino contaminado, se define como una situacin anormal en la cual el
intestino delgado contiene un exceso de bacterias como resultado de ser colonizado por flora
bacteriana procedente del colon, en donde predominan estreptococos, Escherichia coli, estafilococos, micrococos y Klebsiella [104]. Desde el punto de vista de su definicin, el diagnstico
de sobrecimiento bacteriano se establece bajo uno de los siguientes criterios: (1) cuando en el
intestino delgado proximal hay un recuento bacteriano por encima de 105 ufc/mL [105] y (2)
cuando, a pesar de que el recuento bacteriano sea inferior a 103 ufc/mL, las bacterias aisladas en
el aspirado yeyunal son bacterias que normalmente colonizan el colon o si la misma especie se
encuentra ausente en la saliva o en el jugo gstrico [106].
442
Campuzano-Maya G.
por Helicobacter pylori [109-112], el consumo por largos periodos de inhibidores de la bomba de
protones [113], los procedimientos sobre el estmago como la gastrectoma [114], la vagotoma
troncular [115], la ciruga mayor a nivel del estmago, en donde el sobrecrecimiento bacteriano
puede llegar hasta el 50% [114,116], el envejecimiento, debido a que a medida que avanza la
edad aumenta la prevalencia de la hipoclorhidria [117-120], y la desnutricin [121]; tambin se
incluyen en este grupo, enfermedades inmunolgicas como la anemia perniciosa [122-123] y la
artritis reumatoide [124].
Causas variadas
Adems de las causas descritas en algunos grupos especiales, en la literatura mdica se relacionan con el sobrecimiento bacteriano entidades clnicas como la displasia neuronal del intestino [134], la disfuncin autonmica por neuropatas extrnsecas [135], las mielopatias entricas
como la distrofia miotnica y la distrofia de Duchenne [136] y enfermedades del tejido conectivo
como el sndrome de Ehler-Dalos y la amiloidosis [137], la roscea [138] y la escleroderma [139];
enfermedades infecciosas como la enfermedad de Chagas [140], la enfermedad de Lyme [141]
y enfermedades virales por citomegalovirus e inmunodeficiencia adquirida [142]. Tambin se
observa aumento de sobrecimiento bacteriano en pacientes con enfermedad celaca [9,143144] y en los ltimos aos se le ha dado mucha importancia al sobrecrecimiento bacteriano en
el sndrome de intestino irritable [145-154], la fibromialgia [145-146,155], el sndrome de fatiga
crnica [156] y el sndrome de la piernas inquietas [157].
Prevalencia
La prevalencia del sobrecimiento bacteriano es muy variable y depende del tipo de poblaciones estudiadas y de los mtodos con los cuales se estudian. Todos los autores coinciden en el hecho de que la poblacin senescente es particularmente ms susceptible a presentar este cuadro
[158] y en este sentido el sobrecimiento bacteriano aumenta paralelo con la longevidad de las
poblaciones. En Colombia, de acuerdo con el trabajo de Mendoza y colaboradores, la prevalencia de sobrecimiento bacteriano en nios con sintomatologa como dolor abdominal, flatulencia,
sensacin de plenitud, vmitos y diarrea, fue de 29,78% [159], en tanto que en Venezuela se
ha informado que puede llegar hasta el 82,9% [160]. Finalmente, se considera que, al menos en
nuestro medio, el sobrecimiento bacteriano est subdiagnosticado [159].
Medicina & Laboratorio, Volumen 15, Nmeros 9-10, 2009
443
Manifestaciones clnicas
Las manifestaciones clnicas dependen de la severidad de la enfermedad y de las causas
subyacentes que conducen a su desarrollo. Los individuos con sobrecimiento bacteriano pueden
ser asintomticos o presentar uno o ms sntomas como malestar y distensin y dolor abdominal,
diarrea lquida, flatulencia, dispepsia y prdida de peso o falta de ganancia en nios y esteatorrea [72,161-163]. En los casos graves, principalmente en aquellos relacionados con ciruga de
bypass yeyuno-ileal o sndrome de intestino corto, se puede presentar tetania como resultado
de la hipocalcemia inducida por la deficiencia de la vitamina D [164-165], ceguera nocturna
por deficiencia de vitamina A [166-168] y la osteoporosis, debido a que hay disminucin de la
densidad mineral con alto riesgo de fracturas patolgicas [169]. Puede haber anemia microctica
por lceras en asas intestinales o macroctica por falta de absorcin de vitamina B12 [170], aun
con ataxia y delirio despus de la ingestin de hidratos de carbono, ms frecuente en pacientes
con sndrome de intestino corto [171-172]. Los pacientes con enfermedades hepticas severas y
la esteatohepatitis no alcohlica (hgado graso) presentan sobrecimiento bacteriano hasta en un
60% [173]. La pancreatitis crnica es una enfermedad que frecuentemente se asocia con sobrecimiento bacteriano, con una frecuencia de alrededor del 40% de los casos [174], relacionada con
la disminucin de la motilidad intestinal y cambios inflamatorios, entre otros. Puede estar asociado con otras enfermedades, en donde las manifestaciones clnicas antes descritas relacionadas
anteriormente se suman a la de la fibrosis qustica [175] y la enfermedad celaca [9,144,176].
Principio de la prueba
Cuando se administra lactulosa, un carbohidrato que no se metaboliza en el intestino delgado, como sustrato, en ausencia de sobrecimiento bacteriano, sta llega al colon despus de 2 a
3 horas de haberse tomado, dando un pico usualmente por encima de 20 ppm de hidrgeno.
En caso de que en el intestino delgado haya bacterias colnicas, stas la fermentan y liberan hiMedicina & Laboratorio, Volumen 15, Nmeros 9-10, 2009
444
Campuzano-Maya G.
drgeno que aparece como un pico en la primera hora poslactulosa [72, 179]. Como en el caso
de la prueba de aliento para malabsorcin de lactosa, la prueba de aliento con lactulosa se basa
en el hecho de que al administrar un carbohidrato, que como la lactulosa no se absorbe en el
intestino delgado, ste, al llegar al colon se fermenta y produce hidrgeno que puede ser medido
en muestras de aire espirado [10] como se observa en la figura 7. Si se detecta la presencia de
hidrgeno antes del tiempo estimado para llegar al coln, hay una evidencia indirecta de la presencia de bacterias fermentadoras en el intestino delgado, cuando normalmente slo estaran en
el colon [72,179], como se esquematiza en la figura 8.
H2O
H2O
Lactulosa
Yeyuno
CO2
leo
Colon
H2
CH4
Figura 7. Prueba de aliento con lactulosa para sobrecimiento bacteriano. Resultado negativo (ausencia de sobrecimiento
bacteriano). Los procesos de metabolismo y absorcin de la lactulosa no se producen en el intestino delgado, y en consecuencia la lactulosa administrada llega al colon, donde por la fermentacin bacteriana se descompone dando origen a la
produccin, entre otras, de gases que como el hidrgeno (H2) y el metano (CH4) llegan al torrente sanguneo y de all a los
pulmones, de donde son eliminados con el aire espirado.
H2O
H2O
Lactulosa
Yeyuno
CO2
H2
CH4
leo
Colon
Figura 8. Prueba de aliento con lactulosa para sobrecimiento bacteriano. Resultado positivo (presencia de sobrecimiento
bacteriano). Los procesos de metabolismo y absorcin de la lactulosa se producen en el intestino delgado debido al sobrecrecimiento bacteriano, y en consecuencia la lactulosa administrada llega al colon, donde por la fermentacin bacteriana,
se descompone dando origen a la produccin, entre otras, de gases que como el hidrgeno (H2) y el metano (CH4) llegan
al torrente sanguneo y de all a los pulmones, de donde son eliminados con el aire espirado.
Procedimiento
Los siguientes son los pasos a seguir para hacer la prueba de aliento para sobrecimiento bacteriano utilizando lactulosa como sustrato [179]:
Preanalticos
La preparacin del paciente es crtica y debe tenerse en cuenta:
Medicina & Laboratorio, Volumen 15, Nmeros 9-10, 2009
445
Adems,
Analticos
Tomar
la muestra basal. Es ideal que el laboratorio clnico haga la determinacin de hidrgeno basal antes de dar la carga de lactulosa. Si la preparacin del paciente ha sido correcta el
valor basal de hidrgeno debe estar por debajo de 10 ppm. Si la muestra basal est entre 10
y 20 ppm puede indicar falta de preparacin del paciente y en este caso se le debe sugerir al
paciente revisar la dieta, ajustarla y volver otro da; si la muestra basal tiene ms de 20 ppm
de hidrgeno, y se tiene certeza en las condiciones preanalticas, es altamente sugestivo de
sobrecimiento bacteriano [179].
Administrar
lactulosa, a dosis de 0,5 g/k con una dosis mxima de 10 g, disueltos en 250 mL
de agua que el paciente debe ingerir en 3 a 5 minutos [179].
Tomar
muestras de aire espirado (aire alveolar) cada 30 minutos a partir del momento en que
se toma la lactulosa hasta por tres horas, tiempo que puede ampliarse de acuerdo a los resultados que se vayan observando en el curso de la prueba. Algunos laboratorios clnicos toman
las muestras cada hora con resultados similares a la prueba convencional y, para aumentar
el desempeo analtico, en especial aumentar la sensibilidad, la prueba se puede extender
hasta por 6 horas [179].
Interpretacin de la prueba
En presencia de sobrecimiento bacteriano, la lactulosa tpicamente produce dos picos, con un
aumento precoz de al menos 12 ppm a medida que la lactulosa entra en contacto con bacterias
del intestino delgado. Esto se contina con un segundo pico, mucho ms grande, despus de una
hora, producido por la flora colnica normal que fermenta el resto de la lactulosa [179], como
se observa en figura 9. Los picos pueden unirse como una meseta precoz. Se considera que la
lectura es positiva para sobrecimiento bacteriano cuando el nivel de hidrgeno sobrepasa las 12
ppm dentro de los primeros 30 minutos posteriores a la ingestin de la dosis de lactulosa o si
los niveles de hidrgeno basal exceden 20 ppm [179]. Cuando no hay respuesta a la lactulosa
se est frente a una curva plana y en estos casos hay que considerar, entre otros: (1) que la flora
intestinal puede estar alterada por antibiticos previos a la prueba, (2) cambios en el pH de la
materia fecal a nivel del colon, (3) trnsito intestinal extremadamente lento, y, (4) predominio de
bacterias productoras de metano [31, 33, 179].
Medicina & Laboratorio, Volumen 15, Nmeros 9-10, 2009
446
Campuzano-Maya G.
Intestino delgado
140
120
100
(2)
80
60
Anormal
(1)
40
20
Normal
0
Basal 15
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
195
210
Tiempo (minutos)
Figura 9. Prueba de aliento con lactulosa para sobrecimiento bacteriano basada en la medicin de hidrgeno espirado.
Se presentan los resultados de 2 pacientes con diferentes resultados. (1) prueba de lactulosa negativa para sobrecimiento
bacteriano (normal): la lactulosa no se absorbe en el intestino delgado, en consecuencia no hay cambios en los niveles
de hidrgeno hasta que sta no llegue al colon, en donde es fermentada y produce hidrgeno a partir de los 120 minutos
dando una curva bifsica caracterstica; (2) prueba de lactulosa positiva para sobrecimiento bacteriano (anormal): la lactulosa es fermentada en el intestino delgado por accin de bacterias colnicas que lo han colonizado dando elevacin del
hidrgeno espirado a partir de los 30 minutos despus de haber ingerido la lactulosa de carga. Fuente: Laboratorio Clnico
Hematolgico, Medelln, Colombia.
Indicaciones de la prueba
Todos los pacientes que presentan sntomas o enfermedades asociadas, como las descritas,
compatibles con sobrecimiento bacteriano, deben ser avaluados para confirmar o descartar esta
posibilidad y la prueba de aliento para sobrecimiento bacteriano es la mejor alternativa en estos
casos [6, 72, 153-154, 163, 180-183].
Limitaciones de la prueba
Como toda prueba de laboratorio, la prueba de aliento para sobrecimiento bacteriano no
est exenta de resultados falsos positivos o falsos negativos, eventualidades que se analizarn a
continuacin.
447
Observaciones adicionales
Con el desarrollo tecnolgico alrededor de los istopos estables gracias al carbono 13, la
prueba de aliento para sobrecimiento bacteriano puede hacerse con sustratos como xilosa o coliglicina (un cido biliar) marcados con carbono 13, que las bacterias descomponen para liberar
13
CO2 dentro de sus subproductos derivados de la fermentacin bacteriana del sustrato [72,186188], alternativas de diagnstico que sern analizadas ms adelante en el grupo de pruebas
basadas en istopos estables.
Abstract: Breath tests have become an invaluable strategy to evaluate in vivo an array of enzymatic activities, organ functions and transport processes. Breath tests, either based on the
measurement of hydrogen or methane, as well as the ones that use stable isotopes, are safe
and have no secondary effects, can be used in children and adults, men and women, and
even in pregnant women. This module reviews the most important aspects from the clinical
and laboratory point of view, and their applications within the medical practice as the first
line tests for the study of digestive diseases associated with malapsorption and intolerance
to carbohydrates, including lactose and fructose, and for the study of bacterial overgrowth,
a syndrome closely linked to a wide variety of clinical disorders. Knowledge of the tests limitations and factors that influence the assays are important in order to properly interpret the
results of the hydrogen based breath tests before a clinical decision can be made.
Key words: Breath tests, hydrogen, methane, lactose malapsorption, fructose malapsorption, lactose intolerance, fructose intolerance, bacterial overgrowth, lactulose.
Campuzano-Maya, G. Hydrogen-based breath tests. Medicina & Laboratorio 2009; 15: 431456.
Module 14 (Technology), number 12. Editora Mdica Colombiana S.A., 2009
Received on September 7, 2009; accepted on September 17, 2009.
Bibliografa
1.
Phillips M, Herrera J, Krishnan S, Zain M, Greenberg J, Cataneo RN. Variation in volatile organic
compounds in the breath of normal humans. J
Chromatogr B Biomed Sci Appl 1999; 729: 75-88.
6.
Gasbarrini A, Lauritano EC, Gabrielli M, Scarpellini E, Lupascu A, Ojetti V, et al. Small intestinal
bacterial overgrowth: diagnosis and treatment.
Dig Dis 2007; 25: 237-240.
2.
7.
3.
4.
5.
448
Campuzano-Maya G.
10. Lomer MC, Parkes GC, Sanderson JD. Review article: lactose intolerance in clinical practice--myths
and realities. Aliment Pharmacol Ther 2008; 27:
93-103.
11. Perman JA, Barr RG, Watkins JB. Sucrose malabsorption in children: noninvasive diagnosis by
interval breath hydrogen determination. J Pediatr
1978; 93: 17-22.
12. Ravich WJ, Bayless TM, Thomas M. Fructose:
incomplete intestinal absorption in humans. Gastroenterology 1983; 84: 26-29.
13. Gudmand-Hoyer E, Krasilnikoff PA, Skovbjerg
H. Sucrose-isomaltose malabsorption. Adv Nutr
Res 1984; 6: 233-269.
14. Dillon EL, Janghorbani M, Angel JA, Casperson
SL, Grady JJ, Urban RJ, et al. Novel noninvasive
breath test method for screening individuals at risk
for diabetes. Diabetes Care 2009; 32: 430-435.
15. Lewanczuk RZ, Paty BW, Toth EL. Comparison of
the 13C-glucose breath test to the hyperinsulinemic-euglycemic clamp when determining insulin
resistance. Diabetes Care 2004; 27: 441-447.
16. Nakamura H, Morifuji M, Murakami Y, Uemura K, Ohge H, Hayashidani Y, et al. Usefulness
of a 13C-labeled mixed triglyceride breath test for
assessing pancreatic exocrine function after pancreatic surgery. Surgery 2009; 145: 168-175.
17. Ilan Y. Review article: the assessment of liver
function using breath tests. Aliment Pharmacol
Ther 2007; 26: 1293-1302.
18. Petrolati A, Festi D, De Berardinis G, Colaiocco-Ferrante L, Di Paolo D, Tisone G, et al. 13Cmethacetin breath test for monitoring hepatic
function in cirrhotic patients before and after liver
transplantation. Aliment Pharmacol Ther 2003;
18: 785-790.
19. Chladkova J, Havlinova Z, Chyba T, Krcmova
I, Chladek J. Analysis of single-breath profiles of
exhaled nitric oxide in children with allergy and
asthma: guideline-derived plateau concentrations
compared to results of automatic evaluation by
two analyzers. J Asthma 2008; 45: 820-826.
22. Mazzone PJ. Analysis of volatile organic compounds in the exhaled breath for the diagnosis of
lung cancer. J Thorac Oncol 2008; 3: 774-780.
23. Poli D, Goldoni M, Caglieri A, Ceresa G, Acampa O, Carbognani P, et al. Breath analysis in non
small cell lung cancer patients after surgical tumour resection. Acta Biomed 2008; 79 Suppl 1:
64-72.
24. Song G, Qin T, Liu H, Xu GB, Pan YY, Xiong FX,
et al. Quantitative breath analysis of volatile organic compounds of lung cancer patients. Lung
Cancer 2009.
25. Levitt MD, Donaldson RM. Use of respiratory
hydrogen (H2) excretion to detect carbohydrate
malabsorption. J Lab Clin Med 1970; 75: 937945.
26. Newcomer AD, McGill DB, Thomas PJ, Hofmann AF. Prospective comparison of indirect
methods for detecting lactase deficiency. N Engl J
Med 1975; 293: 1232-1236.
27. Lasser RB, Bond JH, Levitt MD. The role of intestinal gas in functional abdominal pain. N Engl J
Med 1975; 293: 524-526.
28. Levitt MD. Production and excretion of hydrogen
gas in man. N Engl J Med 1969; 281: 122-127.
29. Olesen M, Rumessen JJ, Gudmand-Hoyer E.
Intestinal transport and fermentation of resistant
starch evaluated by the hydrogen breath test. Eur J
Clin Nutr 1994; 48: 692-701.
30. Wolin MJ. Fermentation in the rumen and human
large intestine. Science 1981; 213: 1463-1468.
31. Christl SU, Murgatroyd PR, Gibson GR, Cummings JH. Production, metabolism, and excretion
of hydrogen in the large intestine. Gastroenterology 1992; 102: 1269-1277.
32. Florin TH, Woods HJ. Inhibition of methanogenesis by human bile. Gut 1995; 37: 418-421.
33. Vernia P, Camillo MD, Marinaro V, Caprilli R.
Effect of predominant methanogenic flora on the
outcome of lactose breath test in irritable bowel
syndrome patients. Eur J Clin Nutr 2003; 57:
1116-1119.
36. Salminen S, Bouley C, Boutron-Ruault MC, Cummings JH, Franck A, Gibson GR, et al. Functional
food science and gastrointestinal physiology and
function. Br J Nutr 1998; 80 Suppl 1: S147-171.
449
the elderly: role of small intestinal bacterial overgrowth. Scand J Gastroenterol 2008; 43: 146154.
51. Caspary WF. Diarrhoea associated with carbohydrate malabsorption. Clin Gastroenterol 1986;
15: 631-655.
52. Hertzler SR, Savaiano DA. Colonic adaptation to
daily lactose feeding in lactose maldigesters reduces lactose intolerance. Am J Clin Nutr 1996; 64:
232-236.
53. Gudmand-Hoyer E. The clinical significance of
disaccharide maldigestion. Am J Clin Nutr 1994;
59: 735S-741S.
54. Flatz G. Genetics of lactose digestion in humans.
Adv Hum Genet 1987; 16: 1-77.
55. Sahi T. Genetics and epidemiology of adult-type
hypolactasia. Scand J Gastroenterol Suppl 1994;
202: 7-20.
56. Aurisicchio LN, Pitchumoni CS. Lactose intolerance. Recognizing the link between diet and discomfort. Postgrad Med 1994; 95: 113-116, 119120.
57. ngel Arango LA, Calvo E, Muoz Y. Prevalencia de hipolactasia tipo adulto e intolerancia a la
lactosa en edultos jvenes. Rev Col Gastroenterol
2005; 20: 35-47.
58. Bayless TM, Rosensweig NS. A racial difference
in incidence of lactase deficiency. A survey of milk
intolerance and lactase deficiency in healthy adult
males. JAMA 1966; 197: 968-972.
59. McBean LD, Miller GD. Allaying fears and fallacies about lactose intolerance. J Am Diet Assoc
1998; 98: 671-676.
60. Forget P, Lombet J, Grandfils C, Dandrifosse G,
Geubelle F. Lactase insufficiency revisited. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1985; 4: 868-872.
61. Laroche M, Bon E, Moulinier L, Cantagrel A, Mazieres B. Lactose intolerance and osteoporosis in
men. Rev Rhum Engl Ed 1995; 62: 766-769.
62. Obermayer-Pietsch BM, Bonelli CM, Walter
DE, Kuhn RJ, Fahrleitner-Pammer A, Berghold
A, et al. Genetic predisposition for adult lactose intolerance and relation to diet, bone density,
and bone fractures. J Bone Miner Res 2004; 19:
42-47.
63. ngel LA, Arajo GE, Prez M, Gutirrez O, Castillo B. Prevalencia de hipolactasia tipo adulto, en
biopsias de tercera porcin de duodeno obtenidas
por endoscopia en pacientes con indicacin clnica de endoscopia digestiva alta. Acta Med Colomb
1999; 24: 41-48.
450
Campuzano-Maya G.
64. Isokoski M, Jussila J, Sarna S. A simple screening
method for lactose malabsorption. Gastroenterology 1972; 62: 28-32.
79. Le Marchand L, Wilkens LR, Harwood P, Cooney RV. Use of breath hydrogen and methane as
markers of colonic fermentation in epidemiologic
studies: circadian patterns of excretion. Environ
Health Perspect 1992; 98: 199-202.
68. Hamilton LH. Interpreting lactose malabsorption breath-tests. In: Hamilton LH, ed. Breath
tests and gastroenterology (ed Second edition).
Milwaukee: QuinTron Instruments Company;
1998: 37-47.
69. Gilat T, Ben Hur H, Gelman-Malachi E, Terdiman R, Peled Y. Alterations of the colonic flora
and their effect on the hydrogen breath test. Gut
1978; 19: 602-605.
451
452
Campuzano-Maya G.
118. Bird T, Hall MR, Schade RO. Gastric histology
and its relation to anaemia in the elderly. Gerontology 1977; 23: 309-321.
119. McEvoy A, Dutton J, James OF. Bacterial contamination of the small intestine is an important cause of occult malabsorption in the elderly. Br Med J
(Clin Res Ed) 1983; 287: 789-793.
120. Lewis SJ, Potts LF, Malhotra R, Mountford R.
Small bowel bacterial overgrowth in subjects living
in residential care homes. Age Ageing 1999; 28:
181-185.
121. Gilman RH, Partanen R, Brown KH, Spira WM,
Khanam S, Greenberg B, et al. Decreased gastric acid secretion and bacterial colonization of
the stomach in severely malnourished Bangladeshi children. Gastroenterology 1988; 94: 13081314.
122. Stockbruegger RW, Cotton PB, Menon GG, Beilby JO, Bartholomew BA, Hill MJ, et al. Pernicious anaemia, intragastric bacterial overgrowth,
and possible consequences. Scand J Gastroenterol
1984; 19: 355-364.
123. Chesner IM, Montgomery RD. Small bowel contamination and vitamin B12 deficiency in the elderly. J Clin Gastroenterol 1986; 8: 447-450.
124. Henriksson AE, Blomquist L, Nord CE, Midtvedt
T, Uribe A. Small intestinal bacterial overgrowth in
patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis
1993; 52: 503-510.
125. Lauritano EC, Bilotta AL, Gabrielli M, Scarpellini E, Lupascu A, Laginestra A, et al. Association
between hypothyroidism and small intestinal bacterial overgrowth. J Clin Endocrinol Metab 2007;
92: 4180-4184.
126. Annese V, Bassotti G, Caruso N, De Cosmo S,
Gabbrielli A, Modoni S, et al. Gastrointestinal
motor dysfunction, symptoms, and neuropathy in
noninsulin-dependent (type 2) diabetes mellitus. J
Clin Gastroenterol 1999; 29: 171-177.
127. Malagelada JR, Rees WD, Mazzotta LJ, Go VL.
Gastric motor abnormalities in diabetic and postvagotomy gastroparesis: effect of metoclopramide and bethanechol. Gastroenterology 1980; 78:
286-293.
128. Resmini E, Parodi A, Savarino V, Greco A, Rebora A, Minuto F, et al. Evidence of prolonged
orocecal transit time and small intestinal bacterial
overgrowth in acromegalic patients. J Clin Endocrinol Metab 2007; 92: 2119-2124.
129. Passaro E, Jr., Drenick E, Wilson SE. Bypass enteritis. A new complication of jejunoileal bypass for
obesity. Am J Surg 1976; 131: 169-174.
453
454
Campuzano-Maya G.
168. Aasheim ET, Sovik TT, Bakke EF. Night blindness
after duodenal switch. Surg Obes Relat Dis 2008;
4: 685-686.
the small intestine. Comparison of the 14C-D-xylose breath test and jejunal cultures in 60 patients.
Scand J Gastroenterol 1985; 20: 1267-1275.
169. Stotzer PO, Johansson C, Mellstrom D, Lindstedt G, Kilander AF. Bone mineral density in patients with small intestinal bacterial overgrowth.
Hepatogastroenterology 2003; 50: 1415-1418.
170. Murphy MF, Sourial NA, Burman JF, Doyle DV, Tabaqchali S, Mollin DL. Megaloblastic anaemia due
to vitamin B12 deficiency caused by small intestinal
bacterial overgrowth: possible role of vitamin B12
analogues. Br J Haematol 1986; 62: 7-12.
176. Murray JA. The widening spectrum of celiac disease. Am J Clin Nutr 1999; 69: 354-365.
455