UBA Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Qumica Biolgica

Alumnos: Licciardo, Lucas

Soto, Sergio
JTP: Matkovic, Laura

INFORME TRABAJO PRCTICO Nro. 3

OBJETIVOS

CINTICA ENZIMTICA

1 - Conocer cmo se puede estudiar la cintica bsica de una enzima y se

calculan sus parmetros Michaelianos.
2 - Estudiar el efecto que ejerce un inhibidor sobre la cintica de una enzima.
METODOLOGA
DETERMINACIN
DE
LA
ACTIVIDAD
-AMINOLEVULNICO DEHIDRASA (ALA-D)

DE

LA

ENZIMA

Materiales
Fuente enzimtica: Fracin S proveniente de la centrifugacin a alta
velocidad (15.000 g) de un
homogenato de hgado de cerdo.
Buffer de la incubacin: buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8.
Sustrato: ALA en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8.
Solucin desproteinizadora: CuS04 ss (solucin saturada).

Reactivo
de
Ehrlich
(pipetear
bajo
campana): 2 g
de
pdimetilaminobenzaldehdo disueltos en 25ml de HCl (concentrado, 12 M) y 75
ml de cido actico glacial.
-Mercaptoetanol (proviene de un stock concentrado: 14,34 M) (pipetear bajo
campana): 200 mM.
Procedimiento
Se procedi segn el protocolo descripto en la gua de trabajos prcticos de
cintica enzimtica y segn las indicaciones de los docentes para cada grupo.
Para el anlisis se realiz una espectrofotometra de absorcin de la cantidad
de producto (PBG) formado para distintas concentraciones de sustrato. Los
tubos se prepararon segn el protocolo indicado en la Tabla 1 mantenindolos
en fro, en dicha tabla tambin se detallan los resultados de absorbancia.
Luego se los llev a incubar a 37C durante 20 minutos. La reaccin se cort
con 0,1 mL de CuSO4 (s.s.), se agit vigorosamente y se centrifug durante 15
minutos a 3000 r.p.m. El producto de la reaccin (PBG) se determin en el
sobrenadante. Para ello, se trasvas a otro tubo, se le agreg 1 ml de reactivo
de Ehrlich y se agit inmediatamente. Se midi la absorbancia a 555 nm entre
los 8 y 15 minutos. Con estos datos, la cantidad de PBG en cada reaccin pudo
determinarse a partir de la Ley de Beer. ( = 113.6 ml/mg).
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RESULTADOS Y DISCUSIN

Tub
os

ALA
(mM)

ALA
10 mM
(mL)

c.
Levuln
ico
(mM)

c.
Levulni
co
5 mM
(mL)
0

0.05

0.005

0.10

0.010

0.25

Me
200
mM
(mL)

Enzima
(mL)

Buf
er
(mL)

Abs
(555n
m)

0.1

0.15

0.75

0.1

0.15

0.1

0.15

0.025

0.1

0.15

0.50

0.050

0.1

0.15

0.75

0.075

0.1

0.15

1.00

0.1

0.1

0.15

3.00

0.3

0.1

0.15

Bi

0.5

0.05

0.1

0.15

1i

0.05

0.005

0.25

0.05

0.1

0.15

2i

0.10

0.010

0.25

0.05

0.1

0.15

3i

0.25

0.025

0.25

0.05

0.1

0.15

4i

0.50

0.050

0.25

0.05

0.1

0.15

5i

0.75

0.075

0.25

0.05

0.1

0.15

6i

1.00

0.1

0.25

0.05

0.1

0.15

7i

3.00

0.3

0.25

0.05

0.1

0.15

0.74
5
0.74
0
0.72
5
0.70
0
0.67
5
0.65
0
0.45
0
0.70
0
0.69
5
0.69
0
0.67
5
0.65
0
0.62
5
0.60
0
0.40
0

0.022
*
0.134
0.235
0.309
0.384
0.422
0.415
0.05**
0.021
*
0.096
0.128
0.212
0.268
0.309
0.313
0.374

Tabla 1 Protocolo utilizado para analizar el efecto del cido levulnico sobre la
actividad de la ALA-D.
* La diferencia de absorbancia en el blanco se muestra comparada frente a la del H 2O

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** El valor de absorbancia es anmalo debido a un error en el procedimiento, por lo
que no se utiliza para realizar los anlisis correspondientes.

Determinacin de las velocidades iniciales

Sabemos segn la Ley de Beer que la absorbancia se relaciona con la
concentracin de una muestra segn:

A= . b .C

Donde b es el paso de la cubeta (en este caso, 1 cm) y es una constante de

absortividad. Para conocer la masa de protena en dicha cubeta debemos
multiplicar el valor de concentracin por el volumen utilizado, por lo tanto
tenemos:

C=

A
m
A v
= m=
b v
b

Para conocer el valor de velocidad necesitamos normalizar el valor a una

cantidad de unidades enzimticas por hora. Por lo tanto, necesitamos dividir
por el peso molecular del PBG para normalizar por UE y multiplicar por 3
debido a que este valor de velocidad es por 20 minutos y queremos que sea
cada 60 minutos.
Vo= A v 3 PM(PBG) b
Donde

PM (PBG)=Peso Molecular PBG= 226 gr/mol = 0,226 mg/nmol

V = 1 mL
De esta manera, tenemos la velocidad normalizada por unidad enzimtica, por
tiempo y por volumen. Si reemplazamos los valores para cada valor de
velocidad obtenemos la siguiente tabla.
Tubos
B
1
2
3
4
5
6
7
Bi
1i
2i
3i
4i
5i

Vi
0,000
0,013
0,025
0,034
0,042
0,047
0,046
0,003
0,000
0,009
0,013
0,022
0,029
0,034

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6i
7i

0,034
0,041

Tabla 2. Velocidades inciales para cada ensayo tanto con inhibidor como sin inhibidor.

En base a los valores de la tabla 2, y las concentraciones de sustrato en cada

tubo se realiz el siguiente grfico 1.

Grfico 1. Velocidades iniciales vs. Concentracin de ALA-D para los ensayos con y sin
cido levulnico

En el grfico 1 en el cual se puede observar cmo evoluciona la relacin entre

la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin (obtenidas
anteriormente de manera analtica) puede verse que las curvas tienen un
comportamiento logartmico consistente con una curva michaeliana. En las
concentraciones ms altas, cuando aumentamos [ALA-D], la enzima se satura
de sustrato y alcanza su velocidad mxima, que no sobrepasar en ningn
caso, independientemente de la [ALA-D]. Comparando ambas curvas, con y sin
cido levulnico podemos ver que en los ensayos en los cuales se aadi dicho
compuesto, las velocidades disminuyeron respecto a los tubos sin cido
levulnico. Por lo tanto, podemos confirmar que el cido levulnico es un
inhibidor competitivo.

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Grfico 2. Linealizacin de Lineaweaver-Burk, representando 1/Vi vs. 1/[ALA-D]

En el grfico 2 se realiz una linealizacin de Lineweaver-Burk, en el cual se

representan la inversa de la velocidad inicial versus la inversa de la
concentracin de ALA-D. Utilizando esta linealizacin y realizando un ajuste
lineal a partir del mtodo de cuadrados mnimos como puede verse en el
grfico 3, se puede obtener la constante de Michaelis (Km) y la velocidad
mxima Vm para cada grupo de datos a partir de los parmetros de la
pendiente y la ordenada al origen de dicha recta.

Con inhibidor

Sin inhibidor

Grfico 3. Linealizacin de Lineaweaver-Burk, representando 1/Vi vs. 1/[ALA-D]

incluyendo ajuste lineal.

Teniendo en cuenta que

Vo=

Vm [S ]
Km+[S]

Entonces
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1 Km+[S ] Km 1
1 [S ]
=
=

Vo Vm[ S] Vm [S ] Vm [S ]
Por lo tanto, podemos considerar una relacin lineal entre 1/Vo y el resto de los
parmetros, considerando:

f ( x )=mx+ b
Donde

f ( x )=

1
Km
1
1
; m=
; x=
; b=
Vo
Vm
[S ]
Vm

Por lo tanto, segn los datos del ajuste lineal obtenemos los siguientes
resultados

Con
inhibidor
Sin
inhibidor

1/Vm

Km/Vm

Vm

Km

Keq (interseccin
con el eje x)

26,68

4,55

0,037

0,168

0,170

16,92

2,86

0,059

0,169

0,169

Tabla 3. Parmetros cinticos obtenidos a partir de las regresiones lineales de ambas

rectas.

Como podemos observar en la tabla 3, el valor de Km experimental es muy

similar en los ensayos sin inhibidor al valor de dicha constante en los ensayos
con inhibidor, tanto en el clculo realizado a partir de la pendiente (Km/Vm)
como el clculo realizado a partir de la interseccin de la recta con el eje de las
absisas (llamado K equivalente en la tabla 3). Por lo tanto, podemos afirmar en
base a estos resultados que la constante de Michaelis es igual en ambos
grupos de datos.
Km = Km
Donde Km es la constante de michaelis de los ensayos con inhibidor. En
cuanto a Vm, podemos ver que en los ensayos sin inhibidor el valor es de
aproximadamente el doble del Vm de los ensayos con inhibidor. Por lo tanto
Vm < Vm
Donde Vm es la velocidad mxima de los ensayos con inhibidor.
Teniendo en cuenta estos datos podemos decir que el cido levulnico parece
ser un inhibidor no competitivo puro. De todas maneras, estos resultados
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pueden ser poco confiables debido a que no se realizaron rplicas de los
ensayos por falta de tiempo, por lo tanto pueden no ser exactos.
Determinacin de Ki
Para un inhibidor no competitivo puro sabemos que:

V m' =

Vm
[ I]
1+
Ki

Por lo tanto,

Ki=

V m' [I ]
VmVm '

Reemplazando los valores a partir de los datos de las tablas 1 y 3 se tiene que

Ki=

0,059 0,250
=0,67
0,0370,059

CONCLUSIONES
Se determinaron las velocidades iniciales utilizando la Ley de Beer y los
parmetros necesarios para determinar las unidades enzimticas presentes en
los ensayos.
Se pudieron graficar correctamente las curvas de velocidades iniciales versus
concentracin de sustrato obtenindose curvas michaelianas, adems de
constatarse el efecto del inhibidor, el cual redujo proporcionalmente las
velocidades iniciales alcanzadas en cada una de las concentraciones de
sustrato.
Se linealizaron los datos aplicando el mtodo de linealizacin de LineweaverBurk y a partir de los parmetros obtenidos de la regresin lineal se calcularon
las constantes michaelianas de los ensayos con y sin inhibidor y las
velocidades mximas alcanzadas para cada grupo de datos. Estas constantes
nos indicaron que el inhibidor era compatible con un tipo de inhibicin no
competitivo puro.
Se determin la constante de disociacin del inhibidor considerando un modelo
de inhibicin no competitivo puro.