QUIMICA FORENSE

DNA
En 1985, Jeffreys y cols, describan un mtodo de identificacin individual que
denominaron ADN fingerprinting o huella gentica que prometa ser la solucin
definitiva al anlisis de la diversidad humana desde la Medicina Legal, tanto en
Investigacin biolgica de la Paternidad como en Criminalstica.
A pesar de que se pens que el avance de estas tcnicas requera algn tiempo,
ya en Abril de ese ao se resolva un caso de inmigracin en U.K. por ese mtodo y muy
poco tiempo despus se admitira, tambin en un tribunal britnico, la Investigacin
Biolgica de la Paternidad basada en la prueba del ADN. La aplicacin por primera vez
de estos mtodos en procesos penales se produjo en Inglaterra en 1986, en un caso de
violacin en donde mediante esta tcnica se pudo liberar al principal sospechoso.
En U.S.A., la introduccin de esta tcnica no fue tan sencilla dando lugar a
numerosas controversias a favor y en contra. Sin embargo en 1992, el US Nacional
Research Council (NRC) confirmaba con rotundidad la validez de las tcnicas de
identificacin individual basadas en la prueba del ADN y estableca unas guas de
actuacin.

ANALISIS DE POLIMORFISMOS ADN EN MEDICINA LEGAL Y FORENSE .

Los fundamentos de las tcnicas de anlisis de polimorfismos ADN en Medicina
Forense se basan en dos hechos trascendentales y elementales que se deducen del
modelo de doble hlice, propuesto ya en 1953 por Watson y Crack. Estos son:
1. Principio de complementariedad entre bases.
2. Desnaturalizacin y renaturalizacin del ADN
El ADN es un polmero constituido por un limitado nmero de monmeros. Los
monmeros son nucletidos que consisten en una base nitrogenada, un azcar
(desoxiribosa) y un grupo fosfato.
Las bases nitrogenadas son las purinas: adenina (A) y guanina (G) y las
pirimidinas timina (T) y citosina (C). Los nucletidos estn ligados por medio de
enlaces fosfodiester formando una cadena de la que protuyen las bases que se emparejan
con las bases de otra cadena nucleotdica por medio de puentes de hidrgeno. El
proceso de emparejamiento entre bases no es al azar. La adenina y la timina siempre se
reconocer y se unen en forma especfica, lo mismo que ocurre entre la guanina y la
citosina. De tal manera que la secuencia de bases de una cadena de ADN determina
siempre la de su cadena complementaria.
Por otro lado, la exposicin a determinadas temperaturas o a un
ambiente alcalino provoca la abolicin de los puentes de hidrgeno entre las

bases y la separacin de las dos hebras del ADN. Esta situacin es reversible, y
cuando cesan esas condiciones, se vuelve a establecer de nuevo la asociacin entre
las cadenas que se unen otra vez segn el principio de complementariedad entre sus
bases.
Otro hallazgo fundamental que ha permitido el desarrollo de las tcnicas de
Biologa Molecular fue el descubrimiento y uso de enzimas de restriccin. Estas
enzimas o endonucleasas de restriccin son verdaderas tijeras moleculares que se aslan
de las bacterias que stas utilizan como mecanismo de defensa ante la entrada de un
virus u otro ADN extrao. Actan reconociendo una secuencia especfica de bases y
rompen el ADN en esa secuencia o cerca de la misma, dando lugar a fragmentos del
cido nucleico de distinto tamao. Por ej. el lugar de reconocimiento de la enzima Eco
RI, es entre una guanina y una adenina y sera en una porcin de ADN:
5 G/AATTC 3
3 C TTAA/G5

/lugar de corte.

En una hebra de ADN puede existir una enorme cantidad de secuencias

nucleotdicas diferentes. Por ej., si se consideran nicamente 10 posiciones en la cadena,
cada una de las cuales pudiera ser ocupada por cualquiera de los 4 nucletidos, el
nmero de combinaciones posibles seria 410, o sea 1.048.576.
La cantidad total de material gentico del ser humano consiste en 3 billones de
nucletidos, aproximadamente. En este ADN existe informacin para un total estimado
de unos 100.000 genes, que constituyen slo entre un 5 y un 10% del genoma.
El ADN expresivo o codificante, a pesar de ser el ms interesante desde el punto
de vista mdico, posee poca variabilidad entre las personas, con excepcin de ciertas
regiones, como la que informa para el sistema HLA. El resto del ADN, hasta el 80-95%,
se ha denominado Basura (junk), porque no es transcripto a ARN y no codifica para
ningn gen en particular, aunque parece poseer otras funciones biolgicas muy
importantes. Curiosamente, este ADN no expresivo, es injustamente denominado
basura, es tremendamente polimrfico y variable entre los individuos, por lo que
posee una utilidad extraordinaria en Medicina Legal. Adems tiene la ventaja de
representar, como se ha visto, la mayor parte del genoma humano, por lo que se ha
convertido en una gran fuente de marcadores genticos.
Se estima que aproximadamente la mitad del ADN no codificante es ADN
repetitivo y, aunque gran parte del mismo es extremadamente polimrfico por diversos
motivos, el ADN ms utilizado con fines forenses hasta la fecha es el ADN repetido en
tndem y, dentro de l el ADN minisatlite y microsatlite.
La variabilidad gentica observable en el ADN de los distintos individuos se
puede investigar experimentalmente por diversos procedimientos. En Gentica Forense
los ms habituales pueden clasificarse en dos grandes grupos desde una perspectiva
histrica. Estos son: procedimientos clsicos o de anlisis por sondas multilocus (MLP)
y unilocus (SLP). (DNA fingerprinting y DNA Profiling respectivamente) y
procedimientos basados en el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR.

Esa variabilidad o polimorfismos, que estas tcnicas detectan en el ADN

presente en las clulas de una persona puede residir:

En la secuencia de bases especfica de una determinada regin de ADN que

muestra diferencias o variaciones de una persona a otra. Este es el caso de la
regin control del ADN ( ADNmit) y la que codifica para el sistema HLA en
ADN nuclear.

Los polimorfismos de este tipo de denominan polimorfismos de secuencia.

En la longitud de los fragmentos de ADN que aparecen tras someter ste a la

accin de una enzima de restriccin que corta las cadenas de ese cido nucleico
en puntos concretos, sitios de restriccin, originando trozos o fragmentos de
ADN de distinto tamao. La longitud de esos fragmentos vara entre las
personas y el patrn de fragmentos es caracterstico para cada individuo, porque
tambin lo es la localizacin de los sitios de restriccin.

Los polimorfismos de este tipo se denominan polimorfismos de longitud de los

fragmentos de restriccin (RFLP, restriction fragment length polymorphisms).
Este tipo de polimorfismos es el que ms se utiliz inicialmente con fines
forenses, analizando ADN repetitivo y concretamente ADN minisatlite.
Posteriormente, el polimorfismo del ADN repetitivo minisatlite se analizara con ms
xito por medio de la tcnica de PCR.
Los loci mini y microsatlite pertenecen a la categora de los nmeros variables
de repeticiones en tndem (VNTR, variable number of tandem repeats), que
consisten en repeticiones en tndem de una secuencia especfica, siendo el nmero de
esas repeticiones diferente de unos individuos a otros. Precisamente de esas
diferencias interindividuales deriva su inters y utilidad en Medicina Legal. Las
unidades de repeticin de los microsatlites son muy pequeas (2-5 pb), por lo que se
denominan tambin secuencias cortas repetidas en tndem (STR, short tandem
repeats), mientras que en los casos de los minisatlites la unidad de repeticin es mayor
(10-80 pb).

PROCEDIMIENTOS CLASICOS: ANALISISI POR MLP Y SLP (DNA

fingerprint y DNA profiling)
Estos procedimientos responden a un conjunto de tcnicas, ya clsicas, de
estudio de RFLP con las que se obtiene el patrn de fragmentos de ADN caracterstico
de cada individuo gracias al uso de enzimas de restriccin y de sondas. Las sondas son
pequeos segmentos de ADN de cadena simple que se marcan radiactivamente por ej.
Con P32 o por procedimientos no isotpicos y que se utilizan para la identificacin de
fragmentos de ADN.
Se inician con el aislamiento o extraccin del ADN del fluido (sangre, semen,
etc.) o tejido que se haya enviado para anlisis. Una vez obtenido el cido nucleico, este
es clivado o sometido a la accin de una enzima de restriccin que lo fragmentar en

pequeos trozos. Los fragmentos de ADN producidos se someten a Electroforsis sobre

gel de azarosa para conseguir una separacin de los mismos de acuerdo con su tamao y
su PM. Lgicamente los que sean ms pequeos se movern ms deprisa que los ms
grandes dentro del campo elctrico, facilitando as la identificacin de los mismos.
Cuando la separacin eletrofortica concluye, los fragmentos del gel se
transfieren e inmovilizan en una membrana de nailon por un proceso conocido como
Southern Blotting. En este punto se suele realizar la separacin de la doble cadena de
ADN (de la que se componen los distintos fragmentos) en dos hebras simples por un
procedimiento de desnaturalizacin. Con ello se pretende conseguir cadenas simples de
cido nucleico que puedan unirse total o parcialmente a cualquier pieza de ADN
unicatenario que presente una secuencia complementaria. En definitiva, el objetivo que
se persigue es que se unan a una sonda especfica, proceso que se denomina
hibridacin.
Sea cual sea el tipo de sonda con la que se trabaje, sta siempre se acoplar con
determinados fragmentos de ADN, de los separados por Electroforsis, siguiendo el
principio de complementariedad de bases. En esto se basan los distintos mtodos que
existen para la deteccin de fragmentos, es decir, en la aplicacin de sondas marcadas
que permitan la visualizacin del patrn o perfil de fragmentos del ADN caracterstico
de un individuo.
Para conseguir ese resultado, la membrana de nailon, que contena los
fragmentos de ADN separados por Electroforsis, se sumerge en una solucin en la que
sta la sonda, de tal manera que los fragmentos de secuencia complementaria se unirn
a ella. La visualizacin de estos fragmentos se puede realizar por medio de una
autorradiografia y el patrn resultante puede ser evaluado de visu o por un analizador de
imgenes.
Este mtodo de diagnstico de la individualidad biolgica consiste bsicamente
en una tcnica comparativa, el igual que ocurre con cualquier otro en Gentica Forense.
El perfil de ADN que se ha obtenido de una muestra biolgica, recogida en el lugar del
crimen, se compara con el que muestra el sospechoso. Ese perfil es caracterstico de
cada individuo, y no vara aunque provenga de vestigios biolgicos de distinta
naturaleza, como sangre, semen, pelo, tejidos, et. Por lo tanto, si dos perfiles o patrones
son coincidentes es tremendamente probable que provenga del mismo individuo, y si no
es as se puede establecer, con toda seguridad, que no proceden del mismo sujeto.
Dependiendo de las condiciones de trabajo, y del tipo de sondas que se utilicen
durante el anlisis RFLP, se obtendrn patrones ms o menos complejos. Algunos de
ellos constan de un enorme nmero de bandas y resultan del empleo de sondad
multilocus que permiten detectar, en condiciones poco rigurosas de hibridacin,
variacin allica en distintos loci minisatlite de forma simultanea.
El anlisis por sondas multilocus fue el que Jeffreys y cols. describieron en 1985
y denominaron DNAfingerprinting o huella gentica por su capacidad de
individualizar. Sin embargo este anlisis que abri tantas expectativas inicialmente, ha
tenido una utilizacin escasa en la prctica porque era muy difcil su estandarizacin, as
como la creacin de bancos de datos, y tambin a serios problemas de interpretacin
bioestadstica de los resultados.

Posteriormente, se han desarrollado sistemas de RFLP que producen patrones

mucho ms sencillos y fciles de interpretar. Las sondas que utilizan reconocer
secuencias repetitivas o VNTR ubicadas en un locus nico dentro de cromosomas
homlogos, por lo que se les denomin sondas unilocus. El sondaje unilocus requiere
condiciones de hibridacin especiales (muy rigurosas).
Cuando un ADN genmico cortado con enzimas de restriccin se analiza con
una sonda unilocus, se detectarn hasta un mximo de dos alclos por individuo, uno
procedente del cromosoma materno y otro del cromosoma paterno. Si un individuo
hereda fragmentos de igual longitud de sus padres entonces solo ser visible una banda
(homocigoto).
El estudio con una nica sonda unilocus no permite la individualizacin de un
sujeto a partir de un espcimen de ADN. Se necesitan varias sondas para conseguir el
mismo poder de individualizacin que proporcionaba un nico anlisis multilocus. De
esta forma resulta un procedimiento que rene las ventajas de ambos sistemas:
simplicidad de patrones y gran poder discriminativo.
Al igual que ocurra en el anlisis de marcadores convencionales, el uso de
sondas unilocus exige conocer previamente las frecuencias con que aparecen las
distintas variantes allicas en la poblacin general. Por tanto, es necesario abordar
estudios de distribucin de frecuencias de esas variantes en distintos grupos
poblacionales y tnicos (creacin de bancos de datos).

ANLISIS POR REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Est claro que la tcnica del DNA Profiling supuso una autntica revolucin
metodolgica en la Identificacin Forense. Sin embargo, a pesar de que el anlisis SLP
es tremendamente til en investigacin de paternidad, existen tres aspectos relativos a
su aplicacin en Criminalstica en los que rpidamente se observaron graves
insuficiencias.
1. En su sensibilidad. Se requiere un mnimo de 20 a 100 ng de ADN genmico
para el anlisis con sondas unilocus.
2. en el estudio de muestras degradadas. En la prctica forense es muy difcil
encontrar en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se necesita
para un anlisis SLP.
3. En el tiempo empleado para el anlisis. Esta tcnica difcilmente puede
completarse en dos o tres das, incluso en uno, como sera deseable.
4. En el consumo de muestras. Este anlisis necesita para su prctica una gran
cantidad de muestra: esto supone que en muchas ocasiones se agota la misma
tras un primer estudio y ya no puede ser realizada posteriormente. En
definitiva se dificulta la contrapericia y la revisin del caso en cualquier
momento posterior.

Todas estas limitaciones pueden ser superadas por medio del uso de la tcnica de
la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que consiste en la amplificacin in vitro
de secuencias de ADN especficas.
As se puede llevar a cabo el estudio de polimorfismos ADN en manchas
diminutas o en vestigios biolgicos minsculos, puesto que la PCR permite realizar una
tipificacin completa a partir de un solo pelo, de una sola clula, de un nico
espermatozoide, de una gota de sangre seca, etc., y todo ello aunque el material
biolgico se encuentre parcialmente degradado.
La PCR permite tambin la automatizacin del procedimiento de anlisis
individual, generando con gran rapidez un elevado nmero de copias de la secuencia
especfica de ADN que es objeto de estudio.
Adems, ofrece la ventaja sobre los mtodos tradicionales de permitir la
determinacin y agrupacin allica en clases discretas, lo que facilita enormemente la
elaboracin de bases de datos, ya que la estandarizacin es inmediata y sobre todo
permite aplicar mtodos bioestadsticas y programas ya elaborados para marcadores
clsicos.
Una vez que el ADN es amplificado puede ser analizados por distintos mtodos
que releven los alelos presentes en los loci definidos, con la ventaja de que no es
necesario el uso de sondas marcadas radiactivamente, dado que se cuenta con millones
de copias de la zona ADN amplificada.
La PCR consiste en ciclos de temperatura repetidos en tres etapas por ciclo. La
primera etapa consiste en la desnaturalizacin del ADN a ms de 90C, con lo que se
consigue separar las dos cadenas de la doble hlice. Esto se sigue de una cada de la
temperatura, lo que permite el anillado de primers o fragmentos de ADN unicatenarios
(de aprox. 20 nucletidos de longitud) de secuencia complementaria a las regiones del
cido ribonucleico que flanquean la regin que se investiga. El paso final es una
reaccin de extensin a 72C, que es catalizada por una ADN polimerasa termoestable,
con lo que se generan copias iguales de las cadenas separadas de ADN diana. El
resultado neto por ciclo es que se dobla la cantidad de ADN diana, de tal manera que
tras repetidos ciclos el nmero de tales secuencias diana se ha podido incrementar hasta
un milln de veces.
Los sistemas de marcadores para anlisis mediante PCR i de utilidad en
Medicina Forense deben ser altamente polimrficos y han de tener un elevado grado de
heterocigosidad gentica. La secuencia estudiada debe ser fcilmente amplificable, del
mismo modo que la variacin allica debe ser reproducible. Antes de aplicar estos
marcadores en el diagnstico de la individualidad tambin es necesario e imprescindible
disponer de datos fiables acerca de la distribucin de sus frecuencias allicas en la
poblacin general. En definitiva antes de ser aceptados para la prctica forense el
conjunto de los polimorfismos analizables por PCR deben cumplir una serie de
requisitos y pasar sucesivos controles de validacin.
En los ltimos aos, el uso de polimorfismos STR o microsatlites se ha
impuesto por los motivos siguientes:

a)

Son de amplificacin ms sencilla debido a su menor tamao allico.

Los problemas de amplificacin que presentaron en un primer momento
ya estn superados. Actualmente los STR que se usan en gentica forense
pertenecen fundamentalmente al grupo de las secuencias
tetranucleotdicas polimrficas: tras experiencias iniciales con otros STR,
en particular los de tipo dinucletidico que plantean ms problemas de
amplificacin y tipificacin.
b) El pequeo tamao de los microsatlites hace que el fenmeno de
prdida allica y de amplificacin preferencial, a causa de la degradacin
y de diferencias de longitud importantes entre los alelos, no se produzca
habitualmente.
c) Al igual que ocurre con los minisatlites, los alelos pueden ser
fcilmente clasificados en funcin del nmero de repeticiones que
contienen y no de su peso molecular, como en el caso de los SLP,
facilitando enormemente la estimacin de frecuencias. Adems , tras las
amplificaciones los STR pueden ser separados utilizando electroforsis
convencional sobre genes de poliacrilamida y la deteccin de las
variantes allicas no precisa el uso de mtodos isotpicos, bastando una
sencilla tincin con plata.
d) Por ltimo, realizar una PCR multiplex, o amplificacin simultanea de
varios de estos loci microsatlite a partir de una unida muestra, es mucho
ms sencillo. En el momento actual existen ya en el mercado sistemas
para conseguir un perfil de STR en una nica amplificacin por PCR. El
resultado es un patrn de 12 y hasta 16 STR polimrficos detectables
simultneamente, con lo que se alcanza un poder discriminatorio enorme
a partir de una nica reaccin.
El desarrollo de mtodos basados en la fluorescencia para visualizar fragmentos
de ADN ha progresado rpidamente en los ltimos aos. La utilizacin de fluorocromos
y sistemas automatizados (secuenciadores automticos de ADN) que permiten la
tipificacin de varios mini o microsatlites simultneamente ha facilitado enormemente
el anlisis de productos amplificados y es actualmente el procedimiento de eleccin,
aunque no est al alcance de todos los laboratorios.
Aunque la variabilidad de los STR deriva fundamentalmente de la diversidad en
el nmero de repeticiones en tandem 8VNTR), tambin su polimorfismo puede ser
consecuencia de una microvariacin de la secuencia de las unidades de repeticin o de
una variabilidad estructural de las unidades de repeticin. Tambin en los ltimos aos
la comunidad cientfica internacional ha dedicado tiempo y esfuerzo a la incorporacin
de polimorfismos del cromosoma y a la rutina forense. Los microsatlites del
cromosoma han irrumpido con gran fuerza en el panorama de los marcadores genticos
de uso forense, debido a sus importantes aplicaciones en un tipo de pericias muy
definido. Entre ellas se destaca la determinacin de la paternidad en aquellos casos en
los que el progenitor est ausente y los hijos supuestos son varones, la identificacin del
agresor en delitos contra la libertad sexual, la identificacin cadavrica y la
determinacin de sexo en grandes catstrofes.
El polimorfismo de secuencia de la regin control del ADN mitocondrial
(ASNmit) tiene tambin importantes aplicaciones forenses. La amplificacin de restos
de ADN muy antiguos ha demostrado ser ms exitosa con ADNmit que con ADN

nuclear, presumiblemente porque el primero est presente en un nmero de copias

mayor (una nica clula de mamfero contiene de 1000 a 10000 molculas de ADNmit).
Adems el ADNmit se hereda directamente de la madre, lo que permite establecer la
lnea de herencia materna de los individuos.
Por sus caractersticas este ADN es ideal para la reconstruccin de linajes, para
el anlisis de restos seos y muestras degradadas. Sin embargo su utilidad forense es
reducida cuando se trata de distinguir quien entre dos individuos gemelos o
emparentados por va materna ha contribuido a la formacin de una mancha.

REGIONES MICROSATELITES DEL GENOMA HUMANO (Short tandem

repeats) Y SUS APLICACIONES EN GENETICA FORENSE.
El estudio de marcadores polimrficos del ADN se ha convertido en una
herramienta imprescindible en el anlisis gentico de vestigios biolgicos de inters
forense, as como en la investigacin biolgica de la paternidad. La introduccin de los
polimorfismos VNTR en la dcada del 80 y la posibilidad de realizar un anlisis
molecular de un nmero reducido de estas regiones hipervariables mediante el anlisis
de RFLP permita obtener por primera vez una informacin muy precisa acerca de la
identidad gentica del individuo del que provena el vestigio biolgico en estudio. Sin
embargo una gran limitacin para su aplicacin es que para su estudio es necesario
disponer de cantidad de ADN del orden de 100-200 ng de alto peso molecular y en
general en la mayora de los casos a los laboratorios de criminalstica llegan vestigios
biolgicos en muy pequea cantidad o con un avanzado estado de degradacin y por lo
tanto se imposibilita su estudio.
El descubrimiento a principio de los 90 de un gran nmero de regiones de
microsatlites o STR (Short tendem repeats) en el genoma humano permiti superar
estas limitaciones. Los STR son regiones altamente polimrficas compuestas por una
secuencia de 2 a 7 pb que se repiten en tandem, siendo precisamente la variacin en el
nmero de veces que se repite la unidad de secuencia la base de su polimorfismo
gentico. Debido a que el tamao de los alelos de los STR es generalmente menor a 350
pb, son susceptibles de ser analizados mediante tcnicas de amplificacin gnica (PCR),
lo que permite trabajar con muestras del orden de picogramo y en avanzado estado de
descomposicin. Por otro lado y como contraposicin con lo que ocurre con los
sistemas VNTR, la determinacin del tamao de los alelos de marcadores STR se
realizan con una gran precisin, resolucin de una base, y adems es posible realizar un
anlisis simultneo de distinto STR mediante un procedimiento conocido como
multiplex PCR-.
Los microsatlites o STR son regiones de ADN repetitivo que se encuentran
repartidas a lo largo de todo el genoma como media, un microsatlite por cada 5.00010.000 pb y estn compuestos por una secuencia de 27 pb que se repite en tandem. Un
gran nmero de estas regiones STR presenta un alto grado de polimorfismo gentico de
longitud cuya base molecular es la variacin en el numero de unidades de repeticin.

Los STR polimrficos se encuentran tanto en las regiones gnicas como extragnicas
del genoma humano. Los STR localizados en regiones gnicas se presenta tanto en
intrones y en regiones flanqueantes como en regiones codificantes.

EL CROMOSOMA Y, EN LAS IDENTIFICACIONES DE RASTROS DE

INTERES FORENSE Y EN EL RASTREO DE LINEA PATERNA.
El complemento cromosmico humano est compuesto por 46 elementos
organizados en 23 pares. De estos, 22 son semejantes en hombres y mujeres, y cada
elemento par presenta igual morfologa denominndose cromosomas autosmicos o
autosomas. El par restante, llamado (par sexual) tiene caractersticas diferenciales
dependiendo del sexo considerado.
Los individuos de sexo femenino normales presenta el par sexual constituidos
por dos elemento homlogos con morfologa semejante. En cambio en los hombres, el
par correspondiente posee elementos dismiles, formado por un cromosoma
metacntrico mediano y un pequeo cromosoma acrocntrico. El primero denominado
cromosoma X es el elemento presente en doble dosis en las mujeres, en tanto que el
segundo, solo presente en los varones, es el denominado cromosoma Y.
En el proceso de formacin de clulas germinales femeninas solo podrn
generarse gametos que contengan el cromosoma X como elemento sexual, por tanto la
mujer ceder a su descendencia obligatoriamente un cromosoma X, el varn, en cambio,
podr generar dos tipos de espermatozoides que diferiran en cuanto a la presencia de un
cromosoma X o un cromosoma Y, adems de los 22 elementos autosmicos. Ser, por
tanto, el hombre, quien determine el sexo en su descendencia, dependiendo si el
espermatozoide aporta un cromosoma X (descendencia femenina) o cromosoma Y
(descendencia masculina.)
Debido a que en la mujer el par sexual est formado por dos elementos de
morfologa semejante, todos los genes y secuencias presentes estarn en condicin
diploide y, por tanto, si los dos alelos de un locus determinado son idnticos, la
portadora ser homocigoto, si los alelos difieren su condicin ser heterocigota, al
menos en el locus referido. En el hombre, tanto el cromosoma X como el Y se
encuentran como elementos nicos, siendo su condicin hemicigtica.
El cromosoma Y es un elemento acrocntrico pequeo que solo representa el 2%
del complemento cromosmico. Contiene alrededor de 6x109 pb. El 60% de este ADN
est constituido por secuencias polimrficas, altamente repetidas, y est confinado
principalmente a la porcin heterocromtica del brazo largo, desde Yq13 a Yqter y a la
regin pericentromrica. Sin embargo recientes investigaciones demuestran la
existencia de genes y familias gnicas localizadas en las regiones supuestamente no
codificantes presentes en este cromosoma.
En el cromosoma Y existen secuencias polimrficas cuya variabilidad se refleja
en variantes de longitud, como es el caso de los microsatlites y los minisatlites, en los
que las unidades de repeticin pueden variar tanto en nmero como en secuencia.

Adems de stas, existen otras variantes como las de insercin/deleccin y tambin

simples sustituciones nucleotdicas.
Los polimorfismos presentes en este cromosoma proporcionan una herramienta
adicional en las metodologas de la identificacin humana. En particular, los
microsatlites hipervariables has contribuido en gran medida en este campo debido al
gran nmero de tales marcadores disponibles, los que han sido validados en el mbito
forense internacional.
La posibilidad de determinar vnculos de filiacin en ausencia del progenitor, la
investigacin de identidad y sexo en desastres en masa y la identificacin de
responsables de violacin, tanto hetero como homosexual constituyen algunos de los
campos de aplicacin forense de los marcadores de microsatlites del cromosoma Y.
Los marcadores posibles de trabajar con cromosomas Y tienen gran capacidad
discriminativa, pero presentan la limitacin de que todos los individuos de la misma
lnea paterna compartirn idntica informacin de stos haptotipos, por lo cual no sern
posible desvincular, individuos vinculados por va paterna de la posible existencia de
vnculo de parentesco o filiacin, ni tampoco descartar al hermano de un sospechoso si
solo se analizan marcadores presentes en este cromosoma. Puede por lo tanto concluirse
que estos marcadores son de enorme utilidad en la investigacin de identidad, pero
debern ser, en todos los casos, evaluados juntamente con marcadores autonmicos.

ADN MITOCONDRIAL EN GENETICA FORENSE

En las clulas de los organismos superiores, existen unas formaciones
denominadas mitocondrias que son autnticas generadoras de energa necesaria para el
buen funcionamiento de la clula, pero adems dichas formaciones estn provistas de un
patrimonio gentico propio, el ADN mitocondrial. A diferencia del ADN nuclear que
forma largas fibras, constituidas cada una de ellas por una doble hlice, y que codifican
aproximadamente 100.000 genes, el ADNmt que representa el 1 a 2% del ADN celular,
se presenta en pequeos anillos de doble filamento, codificando 37 genes. El ADNmt
codifica aproximadamente el 10% de las protenas constitutivas de las mitocondrias, por
consiguiente, para un buen funcionamiento de estas se necesitan una buena cooperacin
entre el ADN nuclear y el ADNmt.
El ADNmt no tiene nada especial que lo diferencia en cuanto a su composicin
qumica con el nuclear, sin embargo posee un cdigo gentico propio, su organizacin
es diferente pues solo el 10% de su totalidad es no codificante. Su genoma es haploide
debido a que su herencia es estrictamente materna, por lo que no est sometido a
procesos de recombinacin, caracterstica muy importante desde el punto de vista de los
estudios filogenticos. Al mismo tiempo, la herencia uniparental imposibilita su
utilizacin para realizar estudios de investigacin biolgica de paternidad.
Este ADN que se encuentra entre las molculas de ADN ms pequeas, con una
longitud de 16569 pb ha sido completamente secuenciado por Anderson y cols. en 1981.

Asimismo, se han asignado a todos los genes mitocondriales sus funciones y sus
productos gnicos, incluyendo 13 protenas.
Las dos hebras del ADNmt tienen una distribucin asimtrica de guaninas y
citosinas, lo que genera una hebra pesada (H) y una ligera (L). Cada hebra es transcripta
por un promotor localizados en la regin control, la regin ms interesante desde el
punto de vista Forense, es la de replicacin de la cadena H, dado que es una regin
hipervariable y lo suficientemente pequea para poder ser utilizada en PCR.
Debido a su alta variabilidad, la regin control es la que normalmente se analiza,
tanto para estudios antropolgicos como para gentica forense. Mide aproximadamente
1.100 pb y forma parte del 10% del ADNmt no expresivo. Es una regin no codificante
y se subdivide en dos regiones de aproximadamente el mismo tamao (400pb), la regin
HVI y la HVII. La enorme variabilidad.
El ADN nuclear puede proporcionar mucha ms informacin que el ADNmt
debido a la cantidad de sistemas polimrficos que se pueden estudiar, ej. los
microsatlites (STR). Sin embargo en muchas ocasiones, su estudio se hace totalmente
imposible debido a la cantidad insuficiente de material para analizar o al grado de
degradacin de ste.
La utilizacin del ADNmt se debe restringir a aquellos casos que no se pueda
realizar un estudio a travs del ADN nuclear o en aquellos casos en los que el ADNmt
pudiera proporcionar informacin adicional.
En algunos casos como en muestras de pelo sin bulbo, un vestigio bastante
comn en la pericia forense, tan solo se puede llevar a cabo el anlisis del ADNmt. El
abordaje estadstico de los resultados del ADNmt es complejo y las estimas de
frecuencias tan solo se podrn llevar a cabo en el futuro con la obtencin de amplias
bases de datos.
En Gentica Forense el ADNmt ofrce importantes ventajas. Por un lado, la
amplificacin es mucho ms fcil debido a que existe un gran nmero de molculas de
ADNmt por clula, por lo que podemos obtener mayor de cantidad de producto de PCR
de muestras muy pequeas. Adems, debido a que es menos propenso a la degradacin
que el ADN nuclear, se evitan errores de la polimerasa durante la amplificacin
provocados por la degradacin del ADN original.
As pues, las muestras ms idneas para el abordaje a travs del ADNmt son
aquellas muestras biolgicas que, debido a su pequeo tamao o posible degradacin,
no puedan ser analizadas por medio de polimorfismos de ADN nuclear. La
identificacin de restos antiguos o restos cadavricos procedentes de grandes
catstrofes, como los accidentes areos (normalmente piezas dentarias o huesos), y la
identificacin de vestigios de criminalstica, como pelos sin bulbo o manchas biolgicas
de escaso tamao parcialmente degradadas, son las aplicaciones ms importantes que
este tipo de ADN tiene en el campo de la Gentica Forense.

RESTOS BIOLOGICOS DE INTERES FORENSE.

El uso de procedimientos de individualizacin de muestras biolgicas (sangre,
semen, saliva, tejidos, restos seos, etc.), mediante el estudio de polimorfismos ADN se
ha generalizado en Biologa Forense, y la validez y reproducibilidad de los resultados
son indiscutibles, siempre y cuando los anlisis se realicen en las condiciones que
minimicen la posibilidad de contaminacin y que se utilicen los controles adecuados,
atendiendo a las recomendaciones de las distintas comisiones nacionales e
internacionales (EDNAP, European DNA Profiling Group; TWGDAM, Technical
Working Group on DNA anlisis and Methods; NRC, Nacional Research Council;
Consejo de Europa).
El anlisis de los polimorfismos de restriccin (RFLP) en el ADN, mediante
hibridacin con sondas de locus mltiple primero y de locus nico ms tarde, mejor
considerablemente la valoracin estadstica de los resultados de los estudios de
individualizacin de muestras forenses por su gran capacidad de discriminacin frente a
los marcadores proteicos utilizados hasta entonces y que pasaron a denominarse
convencionales. En la prctica, la probabilidad de coincidencia que se lograba en el
anlisis de restos biolgicos (manchas de sangre o semen) con marcadores proteicos
solan encontrarse entre 10-1 y 10-3, mientras que combinando 4 sondas de locus nico
se pueden alcanzar frecuencias de 1 entre 5 millones de personas.
Si bien la utilidad de los RFLP es indiscutible en los estudios de paternidad
normales (realizados sobre muestras recientes de individuos vivos), el uso de estos
marcadores se cuestion mientras no fuera posible la cantidad de muestra necesaria
(50ng para sondas de locus nico y mas de 100ng para las de locus mltiple). La
aplicabilidad de estas tcnicas se encuentra tambin limitada en el anlisis de restos, ya
que la mayora de las evidencias recogidas en el lugar de los hechos pueden estar
degradadas en mayor o menor medida, a causa de su posible antigedad, y las
condiciones ambientales adversas a las que hayan estado expuestas.
La verdadera revolucin en la individualizacin de muestras forenses la produjo
la introduccin, por parte de Kary Mullis en 1987, de la PCR.
A partir de ese momento fue posible, en teora, amplificar el ADN de una nica
clula, lo que se llev con xito a la prctica con muestras preparadas en el laboratorio,
un linfocito, una clula de la mucosa bucal, un espermatozoide, aunque no siempre con
muestras reales.
Son tipificables cantidades mnimas de ADN (2ng), y adems este puede estar
parcialmente degradado, siempre y cuando se mantenga ntegra la porcin de la hebra
de ADN que contiene la secuencia que se pretende amplificar.
Para un mayor aprovechamiento de muestras mnimas se han propuesto distintas
estrategias de amplificacin previa: uso de cebadores anidados o semianidados (nested o
seminested primers), cebadores aleatorios (randon priming), extensin previa a la
amplificacin, etc.
La aplicacin de estas tcnicas es problemtica por el riesgo aadido de
contaminaciones cruzadas entre muestras, como consecuencia del manejo de material ya

amplificado, y exige disponer de zonas aisladas donde efectuar estos anlisis. En la

actualidad se disponen de bateras de marcadores de gran potencia en las que la cantidad
de ADN necesarias para lograr una individualizacin que alcance frecuencias de 1 en
varios millones, se ha reducido drsticamente: as el anlisis de microsatlite,
secuencias repetitivas cortas (STR), permite adems un grado de antigedad y de
degradacin de la muestra considerable y la posibilidad de usar tcnicas de coamplificacin y de identificacin simultnea (multiplex), hasta 9, ms un marcador de
sexo, con los analizadores automticos.
Son muy numerosos los estudios de validacin con fines forenses de los
distintos marcadores genticos, de forma que cualquier laboratorio forense que utilice
tcnicas de PCR puede, cumpliendo la rigurosidad que exige la tcnica, asumir el reto
de individualizar cualquier tipo de muestra biolgica que contenga escasos restos de
ADN, an de nfima calidad.
El problema real de la individualizacin de evidencias con las tcnicas actuales
no es la cantidad ni la calidad del ADN extrado, sino la presencia incontrolable de
sustancias de interfieran, tanto en el propio proceso de extraccin como en la reaccin
de amplificacin. Los inhibidores de la PCR aunque no siempre se conoce su
mecanismo de accin, pueden actuar en uno o ms puntos esenciales del proceso, en la
lisis de las clulas, necesaria para la extraccin del ADN o inhibiendo la actividad de la
polimerasa.
Entre los inhibidores mas comunes se encuentran componentes de los propios
fluidos corporales o reactivos usuales del laboratorio clnico y forense (hemoglobina y
sus derivados, como la hematina o la hemina, urea y heparina), constituyentes de los
alimentos (compuestos fen6licos, gluc6geno, grasas, Ca''), compuestos procedentes del
rnedio ambiente (polen, constituyentes de la pared bacteriana, fenoles, cidos hmicos,
metales pesados), inherentes al tipo de muestra (bases de Schiff formadas por
exposici6n de nucleoproteinas al formol en muestras de tejidos fijados), en el
laboratorio, como el polvo de talco de los guantes, componentes de algunos plsticos
desechables o de la celulosa y nitrocelulosa de los papeles de filtro, etc.
El nmero de factores distintos que acompaan a cada muestra es insondable,
no es posible ni controlarlos ni reproducirlos en el laboratorio, si no es con
aproximaciones mAs o menos simplificadoras. Por todo ello la elecci6n de una resina
quelante o una extracci6n orgnica, forzar ms o menos la digesti6n con proteasas, o
incluir o no un paso de purificaci6n-concentracin, convierten la etapa de extracci6n
del ADN en un arte en el que solo la experiencia, rigurosidad y buen hacer del
cientfico forense pueden garantizar el xito y la fiabilidad del estudio. El estricto
cumplimiento de los C6digos- de Buena Prctica en el Laboratorio y una atenci6n
escrupulosa a las tcnicas de asepsia minimizan las contaminaciones durante el
trabajo.

EXTRACCION DE ADN EN MUESTRAS FORENSES

Es fundamental tener en cuenta que el criterio de elecci6n de un mtodo de

extracci6n u otro no es solamente su rendimiento en cuanto a cantidad de ADN sino
su 6xito en la amplificaci6n, dos funciones que no siempre se correlacionan.
El mtodo mas simple es aadir las clulas sustrato de la amplificacin
directamente a la mezcla de reaccin, la lisis celular se produce en el primer paso de
calentamiento para la desnaturalizaci6n, quedando as el ADN libre y accesible a la
polimerasa. Sin embargo cuando se sobrepasa un cierto nmero de clulas, el
rendimiento de producto amplificado empieza a declinar debido a la acumulaci6n de
restos celulares y de inhibidores. Esto hace necesario establecer ciertas condiciones
que permitan extraer el ADN a partir de un nmero elevado de clulas, preservando
con ello la actividad de la Taq-polimersa.
En general, los m6todos de digesti6n de muestras biol6gicas suelen hacer use
de detergentes para solubilizar componentes celulares, y de enzimas proteolticas, para
digerir proteinas, principalmente histonas, que de otra forma permaneceran
fuertemente ligadas al ADN, dificultando su extracci6n. Entre los detergentes el mas
utilizado es el dodecilsulfato s6dico (SDS), el cual debe ser retirado de manera total
antes de la amplificaci6n pues inhibidor do la Taq-polimerasa, otros detergentes tiles
son Tween-20, Triton X-100. Que no son inhibidores de la enzima.
La enzima proteoltica de use mas extendido es la proteinasa K, que se inactiva
por calor, con lo cual luego de su accin el calentamiento necesario en la primera etapa
de la PCR ser suficiente para inactivar la enzima y evitar su acci6n sobre la Taqpolimerasa.
El proceso de digestin de la muestra suele ir seguido de otros pasos de
purificacinn para retirar del extracto protenas residuales, componentes de membrana
y sobre todo posibles inhibidores de la PCR. El ms universal es la extraccinn con
disolventes orgnicos (fenolcloroformo-alcohol isoamlico, 24:24:1), conocida como
"extraccin orgnica", que se completa con una precipitacinn con etanol del ADN, o
bien lavado, dilisis y concentracin a travs de unidades de microfiltracin, en funcin
de la cantidad y calidad del ADN que so espera recuperar. Existen numerosos mtodos
disponibles comercialmente en forma de kits, en forma de columnas, suspensiones y
tambin mediante la utilizacin de resinas quelantes.

MUESTRAS DE SANGRE.
Aunque la hemoglobina es un conocido inhibidor de la Taq-polimerasa no son
requeridos protocolos especiales. Bastan 3-5 ul de sangre fresco o manchas de unos 3
mm2, de donde se pueden obtener cmodamente 200 ng de ADN. Las muestras de
sangre liquida procedentes de cadveres, degradada o contaminada, pueden ocasionar
problemas si el secado es lento pues los fenmenos de putrefaccin han avanzado. Es
por ello que se prefiere la utilizacin de pequeas manchas las cuales por su diminuto
tamao han secado rpidamente evitndose el fenmeno putrefactivo.

MUESTRAS DE SEMEN.
El estudio de restos de semen como evidencia en casos de agresin sexual es,
junto con el de vestigios sanguneos, el tipo de anlisis mas solicitado en el laboratorio
de biologa forense. Antes de la aplicacin de las tcnicas con ADN, los estudios con
este material tenan grandes limitaciones, incluso con Ia posibilidad de mezclado con
fluidos de la victima que podran enmascarar resultados en la identificacin. de
proteinas, enzimas e incluso del, agrupamiento ABO.
Actualmente muchas de esas limitaciones se han superado aunque por supuesto
que la tecnologa tiene sus propias limitaciones. Una do sus mayores ventajas es que
ofrece la posibilidad de resolver las mezclas de semen con otros fluidos biolgicos
procedentes de la victima (fluidos vaginales, sangre o saliva), gracias a un mtodo de
extraccin conocido como "lisis diferencial", se basa en Ia resistencia de los
espermatozoides a la lisis con detergente y proteinasa K en ausencia de un agente
reductor. En un primer paso se produce la ruptura de las clulas epiteliales, pero no de
los espermatozoides, que pueden recuperarse por centrifugacin. En el sobrenadante
de esa primera digestin queda el ADN procedente de la victima. El precipitado
conteniendo los espermatozoides ntegros convenientemente tratado aportara el ADN
del agresor.
Esta tcnica no resuelve el problema cuando el agresor es un sujeto
azoospermico pues en este caso la cantidad de ADN que puede recuperarse es mucho
menor y proveniente solo de las clulas o leucocitos presentes en el semen del agresor,
aproximadamente la cantidad recuperable ser del orden del 6 % de la posible en un
sujeto esprmico.
Recientemente el estudio de evidencias en casos de agresin sexual, en
particular aquellas que se presentan en cantidades trazas, se ha beneficiado mucho de
la incorporacin en las bateras de tipificacin de microsatlites especficos del
cromosoma Y. Estos Y-STR incrementan notablemente el ndice de xito en la
identificacin del componente masculino en mezclas de fluidos biolgicos
hombre/mujer en los que la lisis diferencial es intil o en aquellas en las que sea de
alto riesgo su aplicacin.

MUESTRAS DE SALIVA
En los ltimos aos, debido al notable incremento de las tcnicas utilizadas, con
el consiguiente requerimiento de contar con menor cantidad de ADN, aumentando el
xito en muestras con cantidades trazas de material biolgico, tales como sellos, sobres,
colillas, mordazas, huellas de mordedura, manchas en ropa, etc. Cada vez se extiende
mas su utilizaci6n en casos de criminalstica o de estudios de paternidad.
Si se compara con la venopuntura, la toma de saliva con ayuda de un hisopo
resulta un mtodo no invasivo, ni doloroso, ni traumtico, de fcil recogida en recin

nacidos y no implica el riesgo de vertido o rotura de los tubos conteniendo la sangre. Si

bien en ensayos realizados con hisopos bucales con muestras de saliva, se obtuvo un
promedio de alrededor de 9 ug. de ADN, utilizando extraccin orgnica y precipitaci6n
con etanol, esta recuperaci6n queda bastante lejos de la obtenida en casos reales con
muestras coma las mencionadas arriba.
En general cuando se trabaja con muestras tan exiguas, en las que a menudo
solo pueden obtenerse unos pocos nanogramos de ADN, es aconsejable el use de
sistemas "multiplex", en los que se obtendr informacin simultanea de varios
marcadores con una sola amplificacin

MUESTRA DE PELOS
En ocasiones, unos pelos son la nica evidencia que permite establecer una
conexin entre un agresor y la vctima o al menos con el lugar de los hechos. Cabellos
o vellos de cualquier origen corporal son recogidos en la escena del delito, sobre la
victima, en las prendas, etc. Pero como tambin es una muestra ubicua y, en el caso de
cabellos, el ritmo normal de cada en un sujeto normal es de 80 a 100 diarios y, aunque
la decisin de la importancia de una evidencia, habitualmente no es incumbencia del
laboratorio, seria muy importante no considerar en los estudios nada ms que aquellos
pelos que estn incuestionablemente relacionados con el delito.
El pelo es una muestra delicada, posiblemente la que presenta mayor ndice de
fracasos; una de las razones puede encontrarse en el elevado contenido en melaninas
solubles, potentes inhibidores de las ADN polimerasas y que se forman
espontneamente, por contacto con el aire, en los pelos oscuros y se ve favorecida
adems, por los tratamientos de decoraci6n con agua. Su anlisis es laborioso ya que se
requiere un exhaustivo anlisis morfol6gico, sobre todo si se trata de una muestra
abundante, para hacer un cribado previo que los clasifique y ordene por su semejanza o
sus diferencias.
Solo los pelos provisto de raz y vaina son tiles para el anlisis de ADN
nuclear, si no la presentan, deber estudiarse ADN mitocondrial. No hay que olvidar
que analizados uno a uno, o agrupados si es posible, los pelos son siempre muestra
nica que se destruye en el proceso de extracci6n. Solo se dispone de los nanogramos
de ADN que se hayan obtenido en el primer y definitivo anlisis. Los primeros en
realizar la individualizaci6n de un nico pelo humano, fueron Higuchi y cots. , las
races de los pelos arrancados, sobretodo si son recientes no ofrecen demasiados
problemas y pueden ser extrados con una tcnica especial con fenolcloroformo o con
un buffer especifico para pelos, adicionado de un detergente no inico como el
Laureth-10.

Aunque un pelo con raz puede contener te6ricamente 5 ug de ADN, no suelen

extraerse mas de 200 ng. No ocurre lo mismo con los pelos cados, normalmente en
fase telognica, carentes de raz o con muy escasos restos, de los que pueden extraerse
como mximo alrededor de 10 ng de ADN y de los que es frecuente no obtener
resultados.
No ocurre lo mismo con los pelos cados, normalmente en fase telognica,
carentes de vaina o con muy escasos restos, do los que pueden extraerse como mximo
10 ng de ADN y de los que es frecuente no obtener resultados. Es difcil establecer una
correlacin entre la tcnica de extraccin n, su eficiencia y el xito de la tipificacin.

OTROS TIPOS DE MUESTRA

Otro tipo de muestras, menos habituales, pero que tambin se contemplan desde
la ptica del diagnstico de individualizacin son: orina, heces, secreciones nasales,
uas y, en general, cualquier vestigio que pueda contener clulas de las que poder
extraer el ADN.
La identificacin de muestras de orina suele estar relacionada con el control de
consumo de drogas en determinados trabajos o como dopaje en el deporte, que puede
conllevar un intento fraudulento de sustitucin de muestras. El rendimiento del ADN en
orina depende de su procedencia y de la demora entre su recogida y el anlisis. La orina
de mujer habitualmente es ms rica en material celular por que se contamina con clulas
del epitelio vaginal, obtenindose habitualmente un rendimiento 5 veces superior al de
la orina del hombre. En cuanto al tiempo transcurrido se ha determinado cadas de hasta
tres veces entre orinas recientemente obtenidas y conservadas en freezer durante una
semana. En una orina fresca de 20 ml suelen obtenerse 800 ng de ADN, sin embargo en
una mantenida 24 hs. a 4 grados y partiendo do 50 ml el valor obtenido fu de 230 ng
En la individualizacin de muestras de heces, su escassimo rendimiento en la
extraccin do ADN hace infructuoso el anlisis de STR, pero puede abordarse el
problema por estudio del ADN mitocondrial. Se ha conseguido amplificar con xito la
regin HV 1 partiendo de 10 mg de heces frescas, usando bolas magnetizadas para
aislar y purificar el ADN.
En uas, es posible obtener informacin directamente de un fragmento de stas,
para lo que es necesario digerir un mnimo de 9 mg de ua para poder llevar a cabo la
amplificacin. Habitualmente el inters de estas muestras se centra en los restos que
pudieran permanecer adheridos a las uas si se produjeron araazos o heridas en el
transcurso del ataque violento. En este caso la recuperacin de las partculas de pie! o
clulas sanguneas ser funcin directa de la profundidad de la herida producida, por
lo que no puede generalizarse nada sobre el rendimiento en la extraccin de ADN.
Bibliografa:
El presente trabajo es un Resumen obtenido del Libro "La Prueba. del ADN en Medicina
Forense", "La Gentica al servicio de la Ley en el anlisis de indicios criminales y en la investigacin

biolgica de la paternidad". Con la Direccin de Ma.Begoa Martinez Jarreta. Prof Tit. de Medicina
Legal y Forense, Directora del Laboratorio de Gentica Forense, Facultad de Medicina, Universidad de
Zaragoza y numerosos colaboradores.
La compilacin de los temas enunciados estimo que pueden resultar de utilidad para los
profesionales y peritos que trabajen en Criminalstica, sin que esto pueda tener pretensiones de manual
o de indicador de tcnicas.
By Dr. Carlos Alberto Palacios