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SISTEMAS AQUOSOS BIFSICOS: UMA ALTERNATIVA PARA

PURIFICAO DE BIOMOLCULAS E SIMULAO DE SISTEMAS


LQUIDOS COMPLEXOS
Elias de Souza MONTEIRO FILHO *
Resumo
Sistemas aquosos bifsicos (SAB) so conhecidos h mais de 100 anos. Desde a dcada
de 1950, tm sido sugeridos como alternativa para purificao de compostos
biotecnolgicos e, mais recentemente, para a simulao de solues aquosas complexas,
como alimentos, por exemplo.
Apesar de razoavelmente bem estudados e
compreendidos, ainda so raramente empregados em processos industriais,
permanecendo como metodologia analtica laboratorial.
Palavras-chave: Sistemas Aquosos Bifsicos. Simulao. Biotecnologia
Introduo
No final do sculo XIX, observou-se casualmente que uma mistura de gelatina (uma
protena) e gar (um carboidrato) em gua apresentava a formao de duas fases
lquidas (ALBERTSSON, 1971). O fenmeno foi tratado, na poca, como uma
curiosidade e permaneceu assim at a primeira metade dos anos 1950, quando
ALBERTSSON iniciou novos estudos, descobrindo uma mirade de compostos que
apresentavam as mesmas caractersticas quando em soluo aquosa. Adicionalmente,
com a observao que havia uma grande quantidade de gua em ambas as fases (mais
que 90 % em massa, geralmente), pesquisou a purificao de substncias notoriamente
sensveis aos processos tradicionais, como cromatografia e extrao lquido-lquido por
meio de solventes orgnicos, e notou que tais molculas preservaram sua atividade aps
o processo.
Estas observaes deram incio a uma frtil linha de pesquisa, com diferentes propsitos
especficos, mas focados em duas ideias principais: a obteno de compostos de origem
biotecnolgica mais puros e, com o desenvolvimento das cincias computacionais, a
modelagem e simulao matemtica de misturas aquosas complexas (p. ex., solues
contendo protenas, carboidratos e sais). Atualmente, centenas de SAB so conhecidos
e utilizados com diferentes propsitos, mas sempre em escala laboratorial, sendo raros
os relatos de uso industrial.
O presente artigo visa descrever sucintamente os principais tipos de SAB utilizados e
em quais aplicaes, apontando possveis linhas futuras de desenvolvimento e seus
obstculos mais comuns.
Reviso Bibliogrfica
Termodinamicamente, fase uma regio de um sistema com propriedades intensivas
nicas; densidade, temperatura e concentrao de componentes, por exemplo, so
constantes em uma fase em equilbrio termodinmico com sua vizinhana. Se um
sistema termodinmico possui mais de uma fase, os compostos presentes tendero a
distribuir-se de maneira diferenciada entre elas (SANDLER, 1989). Um exemplo a
*

Doutor em Engenharia de Alimentos. FATEC-Sertozinho e FATEC-Jaboticabal. eliasjr70@gmail.com

Cincia & Tecnologia: FATEC-JB (ISSN 2178-9436), Jaboticabal (SP), v. 1, n. 1, p. 33-41, 2010.

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destilao, em que uma mistura lquida parcialmente vaporizada, separando seus


componentes devido s suas diferentes volatilidades. Alguns compostos permanecem
lquidos com a aplicao de calor, sendo recolhidos como produtos de base da coluna, e
outros tendem a vaporizar-se e so removidos na parte superior.
Outra possibilidade o uso de misturas lquidas que apresentam a chamada
miscibilidade parcial, sendo a mistura gua + leo o exemplo mais conhecido. Neste
caso, solutos dissolvidos em uma das fases tende a distribuir-se entre as duas e de
maneira desigual, promovendo-se ento uma separao entre eles. o processo
conhecido como extrao lquido-lquido (McCABE et al., 1993).
A extrao em fase lquida ou extrao lquido-lquido uma tcnica empregada
comumente em diversos processos industriais, sendo uma operao unitria corriqueira
na indstria petroqumica. Na indstria farmacutica, a extrao com solvente orgnico
usada na produo de antibiticos. Entretanto, protenas, organelas e fragmentos
celulares, cidos nucleicos ou mesmo clulas inteiras podem sofrer danos irreparveis
quando submetidas a tal processo, exigindo tcnicas alternativas quando se deseja sua
purificao (PESSOA Jr.; KILIKIAN, 2005; XU et al., 2001).
SAB so definidos genericamente como sistemas de duas fases lquidas imiscveis em
que o solvente principal a gua (ZASLAVSKY, 1992). Esta definio, aparentemente
um tanto vaga, exclui os sistemas tradicionais formados por gua e um solvente
orgnico (hidrocarbonetos cclicos ou aromticos, alcois de cadeia longa, etc...) e os
torna nicos. Em geral, apresentam grande quantidade de gua em ambas as fases,
fazendo com que sejam meios muito pouco agressivos a molculas como enzimas, por
exemplo.
Existem basicamente dois tipos de SAB: os formados por uma mistura de um polmero
sinttico e um sal (p. ex. poli(etileno glicol) e sulfato de potssio) e os obtidos por
mistura de dois polmeros (p. ex.: poli(propileno glicol) e maltodextrina), geralmente
um sinttico e um carboidrato de origem natural, sempre dissolvidos em matriz aquosa.
A distino entre os dois tipos feita quanto aplicabilidade em termos das substncias
a serem purificadas e s necessidades operacionais: os primeiros tendem a ser menos
viscosos, facilitando a separao das fases, enquanto os demais podem ser aplicveis a
determinadas substncias que no toleram a presena de sais em concentraes maiores,
que por sua vez apresentam tambm maiores dificuldades quanto reciclagem ou
descarte.
Um exemplo a purificao de uma protena recombinante obtida por fermentao. A
apolipoprotena A1 obtida de Escherichia coli pode ser extrada do meio adicionando-se
um polmero sinttico que, acima de uma determinada temperatura, apresenta
miscibilidade parcial com a gua. Sob determinadas condies, a protena tende a
concentrar-se na fase rica em copolmero, enquanto os demais componentes do sistema
permanecem dissolvidos na fase rica em gua. Em seguida, separam-se as fases do
sistema e, elevando-se a temperatura, nova separao de fases obtida, com a protena
particionando-se desta vez para a fase rica em gua e o polmero sendo coletado
praticamente puro e reciclado para novo processo (PERSSON et al., 1999). Neste tipo
de sistema, no houve o emprego de um terceiro componente.

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Rabelo et al. (2004) utilizaram a mesma tcnica para a purificao de bromelina, uma
enzima presente nos frutos do abacaxi. Aps triturados os frutos, o suco obtido foi
filtrado e alquotas foram adicionadas a sistemas bifsicos. Medidas laboratoriais
indicaram que houve, sob condies adequadas, uma purificao adequada da enzima
diretamente a partir do seu meio de obteno, mantendo-se boa atividade e a
possibilidade de aplicao tecnolgica.
Alves et al. (2000) estudaram a purificao de insulina obtida de sunos, bastante
semelhante humana, simulando sua obteno em um meio fermentado. A protena foi
satisfatoriamente purificada, mantendo sua atividade aps o processo, o que indica o
potencial de utilizao desta metodologia na indstria farmacutica.
Machado (1999) estudou a purificao de clulas inteiras (Lactobacillus acidophilus
H2B20) por meio de sistemas aquosos bifsicos formados por poli(etileno glicol) e
maltodextrina. Empregou-se como meio de fermentao o soro de queijo ultrafiltrado e
o objetivo foi obter um concentrado de clulas possvel de ser adicionado a um alimento
no fermentado, tendo-se em vista eliminar o problema da baixa aceitao de produtos
fermentados com o microrganismo, que por sua vez possui caractersticas benficas.
Obteve-se como resultado final um mtodo de purificao de L. acidophilus H2B20 que
no apenas foi capaz de preservar a atividade microbiana, mas tambm de suportar seu
crescimento.
Uma possibilidade interessante de uso deste tipo de sistema a chamada bioconverso
extrativa. Nesta tcnica, um processo de fermentao contnua utilizado. Porm, em
lugar do fornecimento de nutrientes e remoo de meio fermentado contnuos, ocorre a
adio de uma fase parcialmente miscvel com o meio. Idealmente, esta fase fornece os
nutrientes e remove os produtos de fermentao por extrao lquido-lquido, mantendo
as condies ideais de operao e obtendo-se o produto desejado. Com esta tcnica,
possvel manter-se a concentrao de substncias inibidoras abaixo das usualmente
possveis com a fermentao contnua tradicional, otimizando-a (ZIJLSTRA, 1998).
Existem sistemas que apresentam mais de duas fases lquidas. Monteiro Filho (2009)
demonstrou que sistemas contendo um determinado polmero sinttico exibiu trs fases
em misturas aquosas contendo tambm maltodextrina (vide Figura 1). Embora no
tenham sido feitos testes de purificao de substncias, o autor aponta como vantagem
deste tipo de sistema a maior flexibilidade para tal intento, visto que o aumento no
nmero de fases lquidas aumenta o nmero de graus de liberdade para a separao de
substncias; a contrapartida o controle mais complexo deste tipo de sistema num
processo extrativo. Tan et al (2006) estudaram a partio de penicilinas G e V em um
sistema trifsico formado por quatro componentes: um solvente orgnico (acetato de
butila), um polmero sinttico (poli(etileno glicol)), um sal (sulfato de amnio) e gua.
Estes autores argumentam como vantagens deste tipo de sistema na purificao do
composto desejado a reduo na formao de emulses que dificultam o processo de
extrao e tambm a reduo no nmero de etapas de purificao exigidas, visto que o
produto foi coletado em uma fase e os contaminantes nas demais. Na extrao lquida
tradicional (fase aquosa + fase orgnica) h uma significativa presena de
contaminantes na fase em que a penicilina obtida, exigindo vrias etapas adicionais de
purificao.

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Figura 1: Sistema trifsico ilustrando a partio de dois corantes (MONTEIRO


FILHO, 2009).
Aspectos Termodinmicos
Quando se observa a separao de fases lquidas em uma mistura cujo solvente a
gua, pode-se perguntar o porqu disto. Como gua no se mistura com gua? As
razes para esta ocorrncia envolvem dois tipos de fenmeno: um energtico e outro
organizacional.
Quando molculas de um soluto so adicionadas a um solvente, ocorre uma
reorganizao das espcies qumicas presentes na mistura. Considerando-se a no
ocorrncia de reaes qumicas (os componentes do sistema permanecem inalterados ao
longo do tempo), ainda assim ligaes fracas, do tipo ponte de van der Waals ou pontes
de hidrognio, so rompidas e refeitas um certo nmero de vezes por cada molcula de
soluto adicionada. Toda ligao qumica, inclusive estas citadas, armazena uma certa
quantidade de energia, que liberada e logo em seguida reutilizada na formao de
novas ligaes. O balano geral pode ser positivo (o sistema precisa absorver alguma
energia das vizinhanas para refazer todas as ligaes) ou negativo (o sistema libera
energia para a vizinhana). Esta energia total absorvida ou liberada durante o processo
o que se chama Entalpia de mistura (H) (SANDLER, 1989).
Alm disso, as molculas possuem um determinado volume e formato, e sempre tentam
organizar-se de modo a encaixar umas s outras de modo a maximizar as ligaes
fracas e atingirem uma situao de mxima estabilidade.
Ora, quanto mais
possibilidades diferentes de organizar-se, maiores as chances que haja uma situao
bastante confortvel. As molculas tentam, ento, maximizar os modos possveis de
auto-organizar-se. O nmero de diferentes modos que uma coleo de indivduos
podem organizar-se conhecido como Entropia (S), e todos os fenmenos espontneos
ocorrem sempre no sentido de maximiz-la. A dissoluo de solutos em solventes, a
mudana de estado de um lquido para vapor, papis organizados em um fichrio que se
perdem com o vento, so todos fenmenos em que h uma variao positiva (S) de

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entropia, visto que o sistema ganhou graus de liberdade para organizar-se de muito mais
maneiras (SANDLER, 1989).
Isto gera a seguinte questo: uma determinada molcula prefere manter contato com
outras molculas (o soluto) ou com semelhantes? Caso haja preferncia por
semelhantes, ocorre a chamada separao de fases: gua e leo (como citado
anteriormente), protenas precipitadas, gua e etanol sob determinadas condies de
temperatura, etc... A lista bem grande.
No caso de misturas contendo trs componentes, pode acontecer o que efetivamente
ocorre com os SAB: as misturas de gua com polmero sinttico ou gua com o
carboidrato permanecem em fase nica. A separao de fases ocorre com a mistura
ternria, ou seja, gua + polmero + carboidrato. Neste caso, o fenmeno um pouco
mais complexo: como se o polmero e a gua se entendessem bem quando misturados,
assim como o carboidrato e a gua. Mas carboidrato e polmero no podem coabitar a
mesma regio do espao, ento a situao mais confortvel cada um buscar seu
prprio espao, levando consigo uma quantidade razovel de gua (JOHANSSON et al.,
1998).
Quando uma protena, por exemplo, adicionada a tal sistema, haver o mesmo tipo de
reorganizao das molculas. Com isso, a protena pode preferir a fase rica em
polmero ou a fase rica em carboidrato. Se houver contaminantes na soluo que
contm a protena e aqueles preferirem uma fase diferente desta, pode-se dizer que
ocorreu uma purificao. Para muitos propsitos a purificao gerada pelo SAB pode
resultar em uma soluo contendo a protena que muito prxima daquela necessria
aplicao final; em outros casos apenas uma etapa adicional necessria, no caso de
protenas ultrapurificadas (insulina injetvel, por exemplo) (PESSOA Jr.; KILIKIAN,
2005).
Aspectos Ambientais
Os SAB tambm so bastante pesquisados devido sua potencialidade como tecnologia
ambientalmente benigna. Raghavarao et al. (2003) publicaram um artigo revisional
sobre o tema, indicando que este aspecto pode ser a chave para justificar o emprego de
SAB em lugar de tcnicas mais baratas, pois as consideraes ambientais podem
inverter esta perspectiva. Em geral, as substncias utilizadas so biologicamente inertes
(polmeros sintticos) ou biodegradveis, no caso dos carboidratos. Em SAB polmero
+ sal + gua, o sal deve ser convenientemente reciclado em processos que podem ser to
dispendiosos quanto a destilao de solventes orgnicos, porm sob risco menor por no
serem volteis.
Um tipo de sistema interessante sob este aspecto aquele formado por polmeros ditos
termossensveis (TSP, do ingls thermoseparating polymer). Os TSP exibem uma
caracterstica interessante: existe uma temperatura, chamada temperatura de ponto de
nvoa (cloud point temperature) abaixo da qual o sistema gua + polmero apresenta
miscibilidade total, ou seja, so completamente miscveis em qualquer proporo e o
sistema ser, consequentemente, monofsico. Entretanto, acima desta temperatura,
ocorre a formao de uma fase rica em polmero e outra rica em gua. medida que se
eleva a temperatura, a separao intensifica-se, chegando a um ponto em que coexistiro
uma fase de polmero e outra de gua praticamente puros. Este tipo de sistema tambm

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empregado em extrao lquido-lquido de substncias sensveis ao meio e apresentam


excelentes possibilidades de reciclagem do polmero. Johansson et al. (1998) indicam
este tipo de sistema para situaes em que a substncia a ser purificada deve ser extrada
de uma fase aquosa a uma dada temperatura e em seguida deve retornar a uma fase
aquosa a uma outra temperatura para reciclagem do polmero.
Simulao Computacional
Outra possibilidade aberta pelos SAB a simulao em computador de misturas dos
polmeros. Esta simulao importante quando se deseja conhecer em maiores detalhes
como as substncias interagem entre si, visto que a ideia bsica da separao de fases
envolve tais interaes.
Bruin (1999) indica que em diversos produtos alimentcios ocorrem misturas de
substncias que promovem a separao de fases. Por exemplo, em sorvetes coexistem
na matriz aquosa uma fase oleosa (gordura do leite), alm de protenas e carboidratos
que tambm podem separar-se em duas fases ricas em gua. Estas caractersticas so
importantes do ponto de vista sensorial, influenciando significativamente como o
consumidor percebe caractersticas como a textura do alimento. Alm disso, aromas e
corantes podem ser convenientemente preservados ou liberados durante a vida til do
produto.
Para que uma mistura seja corretamente representada em computador, medidas
experimentais devem ser realizadas. Usualmente mistura-se quantidades conhecidas
dos componentes do sistema desejado, mantm-se um dado tempo sob condies
controladas e, aps a separao completa das fases, mede-se a composio de cada uma
delas, ou seja, as concentraes dos componentes. Com este procedimento, pode-se
obter um diagrama representativo das diferentes misturas possveis de ser obtidas, o
chamado diagrama de fases. Um diagrama de fases tpico est ilustrado na Figura 2
(MONTEIRO FILHO, 2009).

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Figura 2: Diagrama de fases representativo do equilbrio lquido-lquido de um SAB


contendo um polmero sinttico e um carboidrato (MONTEIRO FILHO, 2009).
Neste diagrama, o ponto 1 representa a mistura preparada. A composio lida do
seguinte modo: traa-se uma linha vertical (tracejado vermelho vertical) at que esta
intercepte o eixo horizontal e l-se a composio em carboidrato, neste caso 30% em
massa; uma linha horizontal originando-se do mesmo ponto at a interseo com o eixo
vertical fornecer a composio em polmero, cerca de 13% em massa neste caso. A
soma d 43% aproximadamente, e os restantes 57% so gua.
Esta mistura ir separar-se em duas fases lquidas distintas, em equilbrio
termodinmico entre si, e suas composies so obtidas do mesmo modo. A fase rica
em polmero apresentar a composio representada pelo ponto 2, cujas concentraes
so, aproximadamente, 25% de polmero, 10% de carboidrato e o restante em gua, e a
fase rica em carboidrato ter as composies descritas pelo ponto 3, praticamente isenta
de polmero, 50% de carboidrato e 50% de gua. A composio 1 preestabelecida,
enquanto as 2 e 3 so obtidas por meio de anlises em laboratrio aps o equilbrio.
Estas medidas experimentais podem ser analisadas por meio de modelos matemticos.
Tais modelos levam em considerao os fenmenos descritos anteriormente: as

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interaes entre as molculas e o modo como organizam-se na soluo. Com isso, um


modelo bem estabelecido capaz de estimar composies diferentes das estudadas, ou
at mesmo simular sistemas ainda inditos.
Futuras Possibilidades
Ainda h uma mirade de sistemas inexplorados e de substncias potencialmente aptas
purificao por meio de SAB. A Engenharia Gentica e a Biotecnologia produzem
muitas novas molculas continuamente. Novas substncias capazes de apresentar
comportamento multifsico em mistura aquosa so descobertas com frequncia e o
leque amplia-se.
Recentemente, em congresso realizado no Reino Unido, a discusso principal foi o
futuro da tcnica (PESSOA Jr., 2009). Sabe-se que h emprego em operaes
industriais; porm, dado seu carter sigiloso, tais aplicaes no so descritas em
publicaes especializadas. H portanto um caminho a ser explorado, pois a viabilidade
econmica j bem estabelecida e os SAB so considerados no meio cientfico como
tecnologia suficientemente madura para uso na indstria (RITO-PALOMARES, 2004).
Concluso
Sistemas aquosos bifsicos podem ser utilizados na purificao de diversas substncias
de origem biotecnolgica. Sua aplicao industrial depende de maiores estudos,
indicativos da possibilidade de reciclagem dos componentes, de sua produo em
escala, de conscientizao da indstria no tocante a tecnologias benignas ao meio
ambiente e do custo inerente substncia purificada. Vrias situaes j demonstraram
seu potencial de uso, restando provarem-se adequados o suficiente para um
reinvestimento em tecnologias inovadoras.
Abstract
Aqueous two-phase systems (ATPS) are systems formed by either a synthetic polymer
and a carbohydrate dissolved in water, or by a synthetic polymer and a salt. They are
gaining increasing attention in biotechnology due to their mild medium conditions for
liquid-liquid extraction and environmentally benign features.
Also, computer
simulation of complex mixtures may arise from knowledge proportioned by ATPS.
Keywords: Aqueous two-phase system. Biotechnology. Computer simulation.
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