. ..

.
.

c
I

COURS

DE

MICROBIOLOGIE

Pasteur

DES

SOLS

PARIS

1968

Compte-Rendu des R s u l t a t s o b t e n u s l o r s
..

. .

..

. .

.-

Septembre

-.

..

Institut

.. .

des T r a v a u x P r a t i q u e s

i
I

..

* -

,-

,.. .

O. R.S.T. O. M.fonds Docume~iaire

-:

. .-

-.

'--

-i

1.

INTRODUCTION

Le sol, l o i n d ' t r e un s u b s t r a t i n e r t e , e s t un lnilieu dyna-

mique e t complexe gr$ce, en p a r t i c u l i e r , aux microorganismes q u i l ' h a b i t e n t . Ces d e r n i e r s c o n s t i t u e n t un es maillons du c y c l e biologique e t

1'Btude de l e u r nature, de l e u r nombre, de leurs effets, est un B16ment
n g c e s s a i r e B l a connaissance es sols en ce q u i concerne la formation,

l a conservation, 1 '6volution e t l a f e r t i l i &

L'ktude microbiologique d'un sol, f a i s a n t s u t e B la c a r a c t &
r i s a t i o n physico-chimique de c e l u i - c i ,

devra donc s ' i n t k r e s s e r aux p o i n t s

suivants :

N u d r a t i o n totale des nicroorgmismes ; r e p a r t i t i o n au sein des

grands groupes taxonomiques (Bactektes o ActinomycZttes

et, &entuellement,

, Champignonsa

Algues)

dtitermfnation des espiices au moyen de tests morpholo-

giques, srologiques et n u t r i t i o n n e l s .
Evaluation es groupements f o n c t i o n n e l s au niveau des diff6rents
c y c l e s (Azote, Carbone, Soufre, etc

N.B.

...

)*

: Les d i f f 4 r e n t e s techniques utilis6es t a n t pour 1'8tude physico-

chimique que pour l'4tude microbiologique du sol sont d g c r i t e s dans l e manuel

de Messieurs 9, PDCEON & P. TARDIEUX
du Sol".

- "Techniques

Collection "Techniquade W e "

- Editions

d'analysesen Microbiologie

de la Tourelle.

.(

2.

II

PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
Le s o l d t u d i 6 e s t un sol de j a r d i n que l ' o n peut c a r a c t 6 r i s e r

par les criteres s u i v a n t s :

-----_--

1. Humidit& :
Mesurde par d e s s i c c a t i o n aux i n f r a r o u g e s : 6.9 %
Le f a c t e u r de c o r r e c t i o n pour rammer les r g s u l t a t s B 100 g de

sol sec sera donc e g a l B :

100
=
100 6.9

1.074

Mesur6 dans l ' e a u en formattdl une p 8 t e f l u i d e avec l e sol : 6.7

3..

-----

Azote

Mesure par l a d t h o d e de Kjeldahl

2.17 c d de S04H2

N sont n g c e s s a i r e s

pour n e u t r a l i s e r l'armo-

50

niaque f o r d .

C e q u i correspond il :

2.17 x 2 x 14 x 100 x 1.074 =

50 x

4.

0.13

100

-------------

Carbone t o t a l :

Mesurd par l a &thode Anne modGfi6e

s u r 0.5 gramme de terre
L a r e a c t i o n n e c e s s i t e 2.88 m l de bichromate, ce qui correspond

a:
0.003 x 2.88 x 2 x 100 x 1.074
5.

---

C/N

1.86 %

E s t &gal 2l

14 ce q u i correspond h un sol ayant une m i n i k a l i s a t i o n

a c t i v e de l a m a t i e r e organique.
6.

-----

Humus

~ ~ ~ S
perUla
I S
&thode au permanganate

. I

3.

un m l de permanganate correspond B 1.02 mg d'acides humiques.

11 f a u t trois ml pour un gramme de s o l ; ce qui correspond B :

1.02 x 3 x 100 x 1.074
soit

328.4 mg / 100 g

3/3 % d'humus.

Tableau r 6 c a p i t u l a t i f

PH

N 7.

6.7

O. 13

C %

1.86

C/N

A.H. Z

H%

14

3.29

6.9

4.

111

EVALUATION ET ETUDE DE LA MICROPOPULATION

Remarque : L e s numgrations s o n t e x p r i d e s en nombre de microorganismes

p a r gramme d e terre seche.

A) MICROFLORE TOTALE

-----------------

a ) en milieu l i q u i d

(Tableau 1)

RGsultat : nombre c a r a c t d r i s t i q u e B 14 j o u r s
s o i t : 17.5 x 1.074 x

lo6

533

a IO6

18.795.000 germes / g

(ensemencement par O. 1 ml)

'

La l e c t u r e e s t f a i t e i
3

Germes

Moyenne

s u r deux b o t t e s :

Nombre d e germes / a terre seche

Champignons

O. 5

Actinomycetes

1.5

611 O00

Bac t d r i e s

1.5

611 O00

TOTAL

3.5

759

537

La m6thode e n m i l i e u l i q u i d e f a i s a n t a p p e l

O00

000

un grand nombre de

r 6 p e t i t i o n s , donne d e s r d s u l t a t s q u i semblent p l u s d i g n e s de f o i . En revanche, l a d t h o d e en m i l i e u s o l i d e e s t soumise B des aleas (envahissement

;

p a r B a c i l l u s mycoSdes, par ex.),

q u i eutpschent souvent les mesures e t , sem-

ble, en l'absence de r e p e t i t i o n s , p l u s q u a l i t a t i v e .

.- .

-.l

5.

B) BACTERIES (Tableau 3 )
Remarque : L'Gtude s p d c i f i q u e des groupements fonctionnels sera envisagiSe
dans un t r o i s i h e chapitre. Le p r 4 s e n t paragraphe s ' i n t 6 r e s s e r a B l a c a r a c t e r i s a t i o n de l a m i c r o f l o r e b a c t 6 r i e n n e au moyen de l a morphologie, des
tests c o l o r & , n u t r i t i o n n e l s e t srologiques.
a ) T e s t s morphologiques, color& e t n u t r i t i o n n e l s
--------I-------------------------------------

Onze c o l o n i e s b a c t r i e n n e s sont: isol6es B partir des milieux so-

lides u t i l i s g s , pour 12 n u d r a t i o n de l a m i c r o f l o r e t o t a l e , e t sont r e p i quees sur tube de g l o s e , i n c l i n g , ( m i l i e u

l a pomme de t e r r e ) . Ce re-

piquage s 'accompagne d'un examen microscopique de chaque c o l o n i e ( c o l o r a -

t i o n G r a m et dtermination de I f a p t i t u d e l a s p o r u l a t i o n ) .
Aprs trois jours d ' i n c u b a t i o n , les d i f f r e n t e s souches -sont repiquees s u r t r o i s milieux s p c i f i q u e s (LOCKHEAD
a c i d e s amins n i vitamines ; B

vitamines ; C = A

-!- 0.1

=i

: A = milieu de base sans

A 4- 0.4 % d ' h y d r o l y s a t de casdine, sans

Yo d ' e x t r a i t de l e v u r e

e x t r a i t de t e r r e ) .

Aprs q u a t r e j o u r s d ' i n c u b a t i o n , u n e F e m i h r e lecture e s t e f f e c t u e e

s u i v i e par un second repiquage s u r les mmes m i l i e u x ; ceci pour s ' a s s u r e r
de l a pure;

des m i l i e u x q u i ont pu r e c e v o i r des t r a c e s d ' a c i d e s amines ou

de vitamines l o r s du premier ensemencement. L e s r s u l t a t s obtenus (Tableau 3)

permettent de c l a s s e r les souches b a c t 4 r i e n n e s s u i v a n t 6 c r i t b r e s :

...
..
.

Korphologie
Pr6sence ou non de s p o r e s
Coloration Gram
Drheloppement s u r m i l i e u min4ral
Besoin en a c i d e s amins
Besoin en vitamines

S u r onze souches observ4es, neuf s o n t Gram f, s e p t e o n t sporuMes,

neuf peuvent se d6velopper s u r m i l i e u uniquement minbral, s i x o n t besoin d '

a c i d e s amin&s e t t r o i s ont: besoin d e vitamines.

6.

Le t e s t e s t effectu6 sur l a souche 522 de Ftizobfum. Cette souche

i n o c u l d e B un l a p i n permet d ' o b t e n i r un &rum anti-522.

Un tal de suspension de Rkizobium est placd dans 8 tubes d e Kahn.

Dans chaque tube, an a j o u t e un ml de s o l u t i o n de s i r u m correspondant

des

d i l u t i o n s v a r i a n t du 1.50 au 1.6400 ; le d e r n i e r t u b e o le sdrum e s t remp l a c e p a r un m l d'eau physiologique, sert de tdmoin.

L'ensemble est p l a c e au bain-marie ; l a l e c t u r e est f a i t e au b o u t

de deux heures.
Resultats

: On observe une a g g l u t i n a t i o n tres n e t t e dans les six premiers

tubes, moins n e t t e dans les 7me e t 8Bme et: nulle dans le t 6 m i n .

: permet une c a r a c t e r i s a t i o n p r d c i s e e t r a p i d e

f n t 6 r t t de c e t t e &thode
d e s souches bact&iennes,

C)

ACTINOMYCETES

ne, une lecture est f a i t e

au bout: d e q u a t r e jours. Les c o l o n i e s s o n t souvent d ' a s p e c t corn6 avec un

c e n t r e progmingnt, e t i n c r u s t & dans le milieu.
R 6 s u l t a t : S u r deux boPtes ensemenckes, p a r 0.2 ml (4 g o u t t e s ) B l a d i l u t i o n
-5
10 , on trouve une moyenne d e 28.5 c o l o n i e s p a r b o f t e , s o i t :
1/2

28.5

10 x

5
10 x

1.074

15 304 500 / g

A partir des boltes de Ptri, a y a n t servi

l a n u d r a t i o n , on

repique dix souches en tube i n c l i n e sur m i l i e u B l a c h i t i n e .

---

~~

I.

7.

A p r b une i n c u b a t i o n de dix j o u r s , s i x de ces souches s o n t re-

piquees s u r q u a t r e b o f t e s de PiStri, pr6alablement inoculBes, r e s p e c t i v e nent avec B a c i l l u s s u b t i l i s , Azotobacter, Ustillagozeae et C o l l e t o t r i c h u m

1indemu tianum.

La l e c t u r e des tests d ' a n t a g o n i s k est e f f e c t u e e au bout de t r o h

jours en n o t a n t l a prgsence, la t a i l l e e t l ' i n t e n s i t 6 de l a zone d ' i h h i b -

t i o n d'apre8 l e mcde de n o t a t i o n indiqu sur l a planche c i - a p r b (Tableau

4).

D) ALGUES

Deux ensemencements sont f a i t s sur m i l i e u l i q u i d e e n tubes e t

m i l i e u gdlosd en b o f t e s de P B t r i ( g r a i n s d e t e r r e ) , Une o b s e r v a t i o n des
c u l t u r e s e s t e f f e c t u d e a bout: de onze jours.
En m i l i e u liquide, on n o t e l a prBsence de DfatOm&6 ; le
dt5veloppement est presque nul.

Sur milieu s o l i d e , un dgveloppement p l u s marque permet de

c a r a c t g r i s e r des D i a t o d e s ( p e t i t e s c o l o n i e s brunes) ; des Chlorococeales

( c o l o n i e s vertes& e t des Cyanophyc6es ( c o l o n i e s b l e u e s f i l a m e n t e u s e s tres

fines)

D'autre p a r t , des o b s e r v a t i o n s microscopiques s o n t e f f e c t u e s B

p a r t i r de souches de c o l l e c t i o n :

..
.
.

Euglena sp.
Phormidium uncinatum
Tribonema equala
Chlamidomonas u a r i a b i l i s
P a l o t h r i x thermalis
Cylindrocarpon s t a g n a l a

I-

. . --

~~

.-

..

.i

a.

E) CHAMPIGNONS
L'Otude be l a mlfcoflore a b t 6 r g a l i s e s u r un sol d i f f 6 r e n t de
c e l u i u t i l i s pour les a u t r e s manipulations.

I1 s ' a g i t d'un sol caract6risb

par les p o i n t s s u i v a n t s :
t e r r e de grande c u l t u r e , a r g l o - c a l c a i r e , grumeleuse, s u r c a l c a i r e
Lutt5tien ; prgcddent de ctireales ; huni.dit6 20 %.

Les d i f f i r e n t e s ensemencements o n t 4 t S e f f e c t u C s B p a r t i r de di-

lutions au 1/2000 e t au 1/5000. L'bliminatLon des BactQries l o r s de la m i s e

en c u l t u r e , s u r m i l i e u gdlosd en b o r t e s de P g t r i , e s t assur6e par l'addt i o n d ' a c i d e c i t r i q u e (3 ml de s o l u t i o n 8 1 % pour 150 ml de nilieu).
Une premiare experience c o n s i s t e en une n u d r a t i o n de l a mycoflore
s u i v i e d'un comptage des d i f f e r e n t e s souches dE?ternin!es

p a r t i r de leur

?
i

a s p e c t morphologique.

Les souches s o n t e n s u i t e repiques s u r & l i e u s o l i d e , en tubes

( P 6 n i c i l l i u m ) ou s u r b o l t e s de Petri ( a u t r e s espikes). Aprs une semaine d '
incubation, ces souches sont d8trerminGes par examen microscopique.

RIsultats

:
a) Nudration

----I-----

165 c o l o n i e s dans 5 b o f t e s a u l/SOOO s o i t : 165 O00 germes / g

t e r r e sBche.

b) Etude e t r 6 p a r t i t i o n des esphces

B. Voir planche c i - a p r e s
~

(Tableau 5 ) .

4 e "e
5-

f
I _ U M

..

IV

ETUDE DES GROUPEMENTS FONCTIONNELS

A)

FIXATION AEROBIE DE L'AZOTE PlOLECULAIRE

Principe

Cycle de l'Azote

(Azotobacter)

: ensemencement par suspension-dilution d'un m i l i e u ne

contenant pas d'azote combin&

RBsultats
soit

: 5

: Lecture B 14 j o u r s , nombre c a r a c t g r i s t i q u e 500 B

x

102

1.074

= 537

g terre seche.

------_---------

b) en m i l i e u solide

1. S i l i c o g e l s
On

r Q t l i s e un ensemencement par 25 g r a i n s de t e r r e . Au bout de 4

jours, tous les g r a i n s donnent des c o l o n i e s blanches muqueuses, q u i v i r e n t

au brun e n v i e i l l i s s a n t .
Un repiquage en stries s u r m i l i e u g6los6 e s t e f f e c t u e afin d'obt e n i r des souches pour observations microscopiques avec c o l o r a t i o n par 1'
Erythrosine.

2. Terres moulees

Sur deux boftes t&moin, on observe un d6veloppement r a p i d e de

nombreuses c o l o n i e s brunes b r i l l a n t e s (en cinq j o u r s ) .

. Su r terre moulde e n r i c h i e en ca1ciuIp,

le dgveloppement e s t

i d e n t i q u e b c e l u i du t h o i n .

Sur terre moult5e e n r i c h i e en phosphore ou en phosphore

-!-

cal-

cium, on observe un ddveloppement envahissant de Champignons au d6trirzbent

des Azotobacters.
Conclusion

: il n'y a pas de carences narquQes en P et C a dans ce s o l .

'.
I

3
I

---I

10.

B) FIXATION ANAEROBIE

(Clostridium)

: (Tableau 6

a> e n milieu l f q u i d e

--------I--------

- Sch6ma 1)

L e c t u r e B lrt j o u r s ; nombre c a r a c t r i s t i q u e 333 3 10-2 s o i t :

1400 x

1.074

/ g terre seche

1504

: ( S i l i c a g e l s e t g r a i n s d e terre)

b) e n d l . i e u s o l i d e
--_--------a---

On

n'observe pas de d6veloppement. Ceci peut sans doute s'ex-

p l i q u e r par un vide i n s u f f i s a n t l o r s de l ' i n c u b a t i o n .

C)

- Schema 1)

PROTEOLYSE (Tableau 6
Lecture B 13 j o u r s

n d r e c a r a c t 6 r i s t i q u e 322 B 10-6 s o i t :
6

20 x '10
1

1.074

= 21.48U.ooO

g terre seche

i.

D) AMHONIFICATION

Lecture B IO jours ; nombre e a r a c t d r i s t i q u e 333 B 1 0 ' ~ O s o i t :

140 x

tubes

10"

1.074

15. 1011 : g terre &che

Ce r e s u l t a t e s t a b e r r a n t e t d o i t &re dd B une contamination d e s

b)

-------en terre

Les nesures p o r t e n t sur SO g de terre humiQe e t montrent une tres

grande a c t i v i t 6 du sol.
L e dgagement d'ariiinoniac e s t 16gerement s u p & r i e u r dans l e cas du

sol e n r i c h i en sang sBch4.

11.

Pendant les trois premiers jours, on observe un d6gagemnt moyen

3
de 22.4 cm d'amoniac par jour e t pour 5 0 g de sol humide.

E) NITRXFICATION (Tableau 6

- Sch&ma 1)

On effectue une lecture shparbe des ferments nitriques el: nitreux

aprks 22 jours d qincubation.

Nombre caracteristique 405

environ
b)

10 x

10

Ferments nStrewr

-2
10
soit :

x 1.074 = 1074 g e m s / g terre skche

:

---------------I

Nombre caractgristique 400 10"

soit :
2
environ 2.5 x 10 x 1.074 = 268
germes / g terre &che

F > DENITRIFICATION

(Tableau 6

- Sch&m 1)

Lecture aprs 13 jours d'incubation.

Nombre caractristique 300
2.5

lo6 x

1.074

soit :
=

2.68

6
10

germes / g terre
s kche

12

ETUDE DES GROUPEMENTS FONCTIONNELS

(Tableau 7

A) AMYLOLYSE
Prncipe
--------

Cycle du Carbone

- Schma 2 )

: Ensemencement avec des s u s p e n s i o n s - d i l u t i o n s d'un

m i l i e u o l'amidon est l a s e u l e source de Carbone.

---------

: Lecture B 13 jours ; nombre c a r a c t 6 r i s t i q u e 322

R6sultats

l4 s o i t

lo4 x

20 x

B)

1.074

------_-

germes/g terre sche

214 800

- Schma 2 )

PECTINOLYSE (Tableau 7
Principe

: Ensemencement avec d e s suspensions-dilutions d'un

m i l i e u o& l a p e c t i n e e s t l a seule source d e Carbone.

---------

: Lecture B 13 j o u r s ; nombre c a r a c t 6 r i s t i q u c 300

R6suLtats
B

lo6 soit
2.5

lo6

1.374

2.68

lo6

germes/g t e r r e sbche

C > CELLULOLYSE
a)

-------------------

Cellulolyse arobfe

L'ensemencemnt par 10 g r a i n s de terre d e 2 s i l i c a g e l s r e c o u v e r t s

d'une feuille d e p a p i e r c o n d u i t

a l ' o b s e r v a t i o n s u i v a n t e , au bout de 7 jours

D6veloppement de :

I. Colonie de Cytophaga

- j e u n e fonc

, 1 Colonie de Cellvibrfo -&tendue

b)

e t jaune trs c l a i r

Nombreuses c o l o n i e s d e Champignons.

.....................

Cellulolyse anatirobie

(Tableau 7

- Schma 2 )

1) Milfeu l i q u i d e B f a poudre d e c e l l u l o s e

4
5

11
3

_ .

-..

-----

... .

..

-_

.-

..

>

_.

--

.-

...

__.

.....

___

. .-

.. -.-

4
q

13.

-----Princip5

: Mesure du d&gagement gazeux en cloches dans

un milieu oh la seule source de carbone est la poudre de cellulose.

----__--- :

R6sultats

Lecture B 18 jours ; nombre caractristique

323 Zi ~ C I ' ~ soir

4,034

30 x

lo2

= 3222

germes / g terre seche

2) Cellulolytiques &sophiles et thermophiles

- Milieu avec

feuille de papier
Principe
--------

: Incubation en tubes scelles sous vide en presence

d'une feuille de papier filtre.

---------

RBsultats

.
.

: Lecture B 20 Jours

Thermophiles

: 3

M4sophiles

: Tous les tubes n6gatifs.

Tubes p o s i t i f s sur 3 ensemencements

14.

VI

ETUDE DES GROUPEMENTS FONCTIONNELS

Cycle du Soufre

A) REDUCTION DU SOUFRE: OXYDE (SvLFATO-REDUCTEI.JFLS)

Principe
--------

: Ensemencement d'un milieu l i q u i d e contenant un

s u l f a t e , un donnateur d'hydrogsne convenable e t de l ' a z o t e min6ral ; obs e r v a t i o n de l a f formation de s u l f u r e de f e r sur un c l o u p l a c e dans l e

milieu.

-RBsultats
--------

20 j o u r s , sur 4 tubes ensemenc&s, 4 s o n t PO-

s i t i f s.

B) OXYDATION DES SULFURES

Principe :
_-----_-

/ I

Ensemencement d'un milieu l i q u i d e contenant du

s o u f r e d t a f l o r d i q u e e t o b s e r v a t i o n de l a formation de s u l f a t e s .
L
,,

---------

Resultats
&I

: 21 20 j o u r s , 'sur 5 tubes, ensemencGs, 5 s o n t PO-

sitifs.
C)

MINERALISATION A U E R O B I E DU SOUFRE ORGANIQUE

-------_
Principe

: Ensemencement d'un n i l i e u l i q u i d e contenant un

acide amin8 soufre e t du c i t r a t e de f e r ammoniacal ; recherche de l a

formation de s u l f u r e de f e r (d6pt n o i r ) .

---------

R6sultats

s i t i f s e t un e s t E

: B 20 j o u r s , s u r 6 tubes ense"%,

5 sont

PO-

..

I.*

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VI1

CONCLUSION

L e s rdsultats obtenus ont 6t.6 regroupes dans le tableau 8.

En ce qui concerne les propridtks physico-chimiques, le sol

Btudil! est un sol 3 pH voisin de la neutralite, sana carences en Ca et

P, B teneur normale en matiere organique et B C/N traduisant un 6quilibre stable du b i l a n humique.

En ce qui concerne La microflore, si l'on excepte le rbsultat de l'ammonificatiun qui semble largement surestid, ce sol prdsenta une microflore qui n ' e s t pas particulihrement a b w b a n t e , toutefois, certaines fonctions semblent trs actives (Ammonification, ProtBolyse 1.