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INDICE
Introduo
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Reaes
Reao de Aglutinao
Reao de Turvao e Precipitao
Reao Colorimtrica
Reao Ultra Violeta
Reao Ponto Final
Utilizao do Branco de Reagente
Utilizao do Branco de Amostra
Reao Cintica
Reao Cintica Contnua
Reao Cintica Tempo Fixo com medio em Ponto Final
Reao Cintica de dois pontos
Observaes
Reao Crescente e Reao Decrescente
Modo de Leitura
Concluses
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Referncias
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INTRODUO
A determinao de um analito em amostra biolgica se baseia primariamente na reao do analito
que se deseja avaliar, qualitativa ou quantitativamente, com um ou mais reagentes, visando
formao de um produto, que pode ser identificado visualmente ou medido atravs de um
analisador.
Os produtos formados podem ter as mais variadas apresentaes, podendo ser uma aglutinao
de partculas, turvao, formao de cor ou formao de um produto sem cor, que pode ser
identificado ou medido atravs de fotmetros ou contadores de radiao. Portanto, o trabalho no
Laboratrio Clnico se baseia quase na sua totalidade, no uso de reagentes que produzem as
reaes desejadas, formando os produtos indicadores da reao.
Filtrao com carvo ativado: Este processo remove o cloro por quimioabsoro e as
substncias orgnicas dissolvidas por adsoro. Geralmente o filtro de carvo ativado colocado
nos sistemas de purificao da gua antes da osmose reversa e antes da deionizao.
Ultrafiltrao: Utiliza uma membrana com poros ligeiramente maiores que os da membrana de
osmose reversa. utilizado para remover pirognios da gua purificada.
A tabela 1 relaciona os vrios procedimentos de purificao da gua e sua eficincia na remoo
dos principais interferentes.
Slidos
Ionizados
Gases
Ionizados
Matria
Orgnica
Partculas
Bactrias
E/B
Deionizao
Osmose Reversa
Carvo Ativado
E/B
Ultra filtrao
Destilao
CLSI
ARLC
< 10
Tipo I
Tipo II
< 10
< 1000
Resistividade (M/cm a 25 C)
Condutividade (mS/cm a 25 C)
> 10
< 0,1
>1
<1
Silicatos (mg/L)
< 0,05
< 0,1
<1
< 500
< 0,22
< 0,22
NI
NI
> 0,1
< 10
10
0,1
Reaes
As reaes correspondem ao resultado da atuao de um ou mais reagentes sobre o analito para
formar o produto. Existem vrios modelos de reao e aquele a ser escolhido para determinado
sistema analtico ir depender dos reagentes a serem utilizados ou disponveis e das facilidades
instrumentais.
Reao de Aglutinao: So utilizadas partculas ligadas a antgenos ou anticorpos que reagem
com um analito produzindo uma reao visvel a olho nu ou ao microscpio. Na maioria dos
formatos analticos as reaes positivas se manifestam por presena de aglutinao. Em algumas
reaes de aglutinao utiliza-se o modelo da inibio de aglutinao e as reaes positivas se
manifestam pela ausncia de aglutinao.
Reao de turvao e precipitao: As reaes de turvao ocorrem por precipitao de um
analito, na maioria das vezes uma protena, por ao de um reagente que pode ser um anticorpo e
o precipitado permanece na forma de suspenso que ser quantificado por espectrofotometria. O
comportamento cintico dessas reaes normalmente de ponto final, ou seja, o produto formado
atinge o seu ponto mximo de deteco e permanece inalterado por um determinado tempo em
funo de sua estabilidade.
Reao Colorimtrica: Reao Colorimtrica aquela em que o produto formado tem uma cor e
a intensidade da cor medida na faixa visvel do espectro (380 - 680 nm).
Reao Ultravioleta (UV): So reaes cujos produtos formados absorvem energia radiante ("luz")
na poro do ultravioleta prximo, mais especificamente em 340 ou 365 nm.
A reao colorimtrica ou a reao ultravioleta pode ser utilizada em vrios modelos, como
reao de ponto final e reao cintica.
Reao de Ponto Final
As reaes de aglutinao, turvao ou precipitao so, em muitas situaes, reaes de ponto
final, mas o termo especialmente dedicado quelas reaes que formam um produto cuja
concentrao chega a um ponto mximo, permanecendo inalterada por um determinado tempo em
funo da estabilidade do produto formado. Estas reaes podem ser colorimtrica ou ultravioleta.
Um nmero bastante elevado de ensaios utiliza as reaes de ponto final onde a concentrao do
produto formado medida fotometricamente. Podemos mencionar alguns exemplos, como as
determinaes qumicas ou enzimticas de albumina, colesterol, glicose e triglicrides.
A Figura 1 mostra graficamente uma reao de ponto final. A diviso em trs etapas mostra o incio
e incremento na formao do produto, a etapa de estabilidade, e o decaimento do produto por
perda da estabilidade.
Reao Cintica
So reaes onde a velocidade da formao do produto medida durante um intervalo de tempo,
que pode ser horas, minutos ou segundos e a denominao cintica decorrente do
relacionamento da reao com o tempo. Muitos consideram que as reaes cinticas so aquelas
em que se mede a formao de produto usando pequenos intervalos de tempo, minuto a minuto,
na faixa ultravioleta do espectro (340 ou 365 nm). Estas reaes, sem dvida, so cinticas, mas
tambm o so aquelas reaes em que se mede a formao de um produto em 5, 10 ou 30
minutos de incubao. As medies da atividade da fosfatase alcalina e amilase, entre outras, so
realizadas utilizando reaes cinticas.
Reao Cintica Contnua
As reaes que utilizam medidas contnuas da formao de produtos so denominadas "reaes
de cintica contnua".
Figura 4: a-b - fase inicial da reao onde a velocidade no constante; b-c - reao com
velocidade constante onde so obtidas as diferenas de absorbncia/minuto (abs/min), usadas
para calcular o resultado; c - reduo da velocidade de reao por esgotamento do substrato.
Na reao de cintica contnua quando no se dispe de um fotmetro com temperatura
controlada, deve-se utilizar reao cintica de tempo fixo.
Reao Cintica de Tempo Fixo com medio em Ponto Final
As reaes cinticas de tempo fixo com medio em ponto final requerem um rigoroso controle do
tempo e da temperatura de incubao, para que os resultados tenham a qualidade esperada. Um
dos erros mais comuns neste tipo de reao ocorre no controle do tempo de incubao. Deve-se
marcar o tempo no momento em que a amostra entra em contato com o substrato, que j deve
estar na temperatura de incubao, isto , dentro do banho-maria. Quando houver vrias amostras
a serem dosadas, pipet-las com intervalos de tempo, 10 a 15 segundos. Quando o tempo se
completar, interromper a reao com os mesmos intervalos.
Um mesmo analito pode ser determinado tanto por uma reao cintica contnua como por uma
reao de cintica de tempo fixo e podemos citar como exemplo a determinao da Gama Glutamil
Transferase.
Reao Cintica de Dois Pontos
As reaes cinticas so geralmente aplicadas nas determinaes de atividade de enzimas, mas
podem ser utilizadas para determinao de analitos, habitualmente ensaiados por reaes de
ponto final. A creatinina comumente dosada com uma reao de ponto final, mas pode-se
tambm utilizar uma reao cintica de dois pontos. Neste caso, a reao de ponto final aplicada
em metodologias manuais e a reao cintica utilizada, principalmente, em metodologias
automatizadas.
Quando se dispe de facilidades instrumentais para medidas fotomtricas contnuas em tempos
reduzidos, pode-se medir em modo cintico de dois pontos vrios analitos habitualmente
ensaiados por reaes de ponto final. Se uma determinao de glicose, usando a enzima glicose
oxidase, medida em 10 minutos na reao de ponto final, pode-se realizar a mesma
determinao usando um instrumento capaz de medir a reao em um tempo de 5 minutos ou
menos, quando se tem a certeza de que as medies das amostras desconhecidas, calibradores e
controles sero realizadas no mesmo tempo de reao e que a velocidade de reao a mesma
para amostras, controles e calibradores.
As reaes cinticas de dois pontos podem ser utilizadas para diminuir o tempo de reao,
minimizar a ao de interferentes ou estender a linearidade do sistema analtico. Comumente, as
reaes cinticas de dois pontos utilizam a fase inicial da reao com uma medio aos 30
segundos, que servir como branco, e outra medio aos 90 segundos. Utiliza-se ento o delta da
reao para calcular a concentrao do analito.
Observaes
Na reao Cintica Contnua e Cintica de 2 Pontos, importante que o equipamento tenha
cubeta termostatizada.
Na reao Cintica de Tempo Fixo imprescindvel um rigoroso controle da temperatura e do
tempo de incubao.
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Modo de Leitura
Monocromtica - A absorbncia utilizada para clculo o resultado da leitura realizada em um
nico comprimento de onda.
Bicromtica A absorbncia utilizada para clculo o resultado da diferena entre as leituras
realizadas no comprimento de onda primrio e no comprimento de onda secundrio. As leituras
bicromticas so utilizadas para minimizar a ao de interferentes, principalmente a lipemia.
Concluso
As reaes representam a base do trabalho no Laboratrio Clnico e o conhecimento dos vrios
modelos relevante para uma atuao adequada e interveno em muitas dificuldades tcnicas
encontradas no dia a dia do trabalho.
Para finalizar, procuramos sintetizar nas duas figuras abaixo, as principais reaes utilizadas no
Laboratrio, classificando-as de acordo com o produto formado ou o modelo da reao.
REAO
AGLUTINAO
PRECIPITAO
COLORIMTRICA
ULTRA VIOLETA
REAO COLORIMTRICA
PONTO FINAL
COM BRANCO
DE AMOSTRA
SEM BRANCO
DE AMOSTRA
CINTICA
CONTNUA
TEMPO FIXO
DOIS PONTOS
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Modelo experimental
A forma inicial para abordar um problema tcnico consiste em caracterizar o erro que est
ocorrendo.
Se a calibrao ou os resultados de controles ou amostras de paciente apresentam uma
variabilidade muito grande, seja nas determinaes em duplicata ou no dia a dia, est ocorrendo
um Erro Aleatrio.
Este erro pode ser devido s seguintes causas: amostra inadequada, erros na medio da
amostra, oscilao da temperatura ou tempos incorretos de incubao, tcnica mal conduzida,
vidraria contaminada, defeitos no fotmetro e gua de m qualidade.
Se os resultados mostram valores consistentemente elevados ou diminudos, est ocorrendo um
Erro Sistemtico, que tem como causas principais os seguintes fatores: amostras inadequadas
seja por erros de medida, de conservao ou de preparo, temperatura ou tempo incorreto de
incubao, erros de calibrao, reagentes contaminados, inadequadamente conservados ou
preparados de modo incorreto, defeito no fotmetro, bias do analista e gua de m qualidade.
Ocorrendo um problema tcnico, deve ser feita uma investigao para encontrar a causa e
introduzir as medidas de correo.
Deve-se, em primeiro lugar, fazer uma reviso de todo o processo operacional, procurando as
causas mais bvias como: pipetas utilizadas, principalmente a usada na medida da amostra;
volume correto de amostra e reagente; relao correta do volume amostra/reagente; omisso ou
troca de reagentes; desempenho do fotmetro; protocolo adequado de acordo com orientao do
fabricante e correo dos clculos dos resultados.
evidente que um conhecimento adequado da metodologia, das causas de erro e a experincia
com a metodologia iro contribuir decisivamente para identificar as causas do problema e
encontrar uma soluo.
Deve ser criado um esquema de avaliao dos problemas, que, para convenincia, pode ser
dividido em 3 subunidades: pr analtica, analtica e ps-analtica.
A idia estabelecer pontos de verificao em cada passo da metodologia, visando identificar o
erro e ajudar na soluo do problema.
Cada mtodo deve ter seu esquema prprio, pois eles diferem em etapas e procedimentos.
Relacionaremos a seguir um roteiro bsico contemplando as trs fases analticas.
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Fase pr-analtica
No existem meios fsicos de controlar a ao dos efeitos pr-analticos como existem os materiais
de controle para a fase analtica.
Para realizar esse controle deve-se basear em treinamento de pessoal, padronizao dos
procedimentos e registro das atividades.
Preparo do paciente
Definir procedimentos da adequao ao preparo do paciente.
1. Prtica de exerccio fsico.
2. Jejum de acordo com a necessidade do analito a ser determinado.
3. Dieta.
4. Drogas Teraputicas (Efeito Fisiolgico in vivo e in vitro).
5. Postura.
6. Variao circadiana
7. Consumo de lcool.
8. Fumo
Coleta e Obteno da amostra
1. Conferncia da identificao do paciente.
2. Definio do momento correto para obteno da amostra.
3. Uso do anticoagulante correto de acordo com o mtodo a ser utilizado.
4. Preservao correta da amostra.
Processamento da amostra
1. Separao das clulas no tempo correto.
2. Ateno para necessidade de extrao ou outro processo preparativo.
3. Armazenamento correto (temperatura de armazenamento, proteo da luz).
4. Condio da amostra e adequao para o teste: Amostra ictrica, turva ou hemolisada.
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Fase analtica
ANALISADOR MANUAL E SEMIAUTOMTICO
Amostra (amostra de paciente, material calibrador e controle)
1. Certificar-se da correta limpeza da vidraria.
2. Conferir a pipeta utilizada de acordo com o volume requerido.
3. Usar ponteiras adequadas para a pipeta automtica em uso.
4. Verificar o procedimento de pipetagem.
5. Criar mecanismos que impeam a troca de amostras.
6. Verificar a condio das amostras (presena de interferentes).
7. Verificar condies de reconstituio, armazenamento e estabilidade de material calibrador
e controles.
Reagente
1. Conferir o preparo de reagentes (quando for o caso).
2. Verificar se o reagente est dentro de sua validade e se foi armazenado corretamente.
3. Verificar modificaes visuais no reagente (turvao, precipitao, mudana da cor).
Incubao
1. Monitorar o tempo e a temperatura de incubao.
2. Certificar-se de que a adio de amostra ao substrato seja efetuada na temperatura de
incubao.
3. Na determinao de enzimas, aps a mistura de amostra e substrato, observar o tempo
crtico de incubao.
4. O nvel de gua no banho-maria deve ser superior ao nvel de reagentes nos tubos de
ensaio.
Procedimento
1. Certificar-se de que a manuteno preventiva do equipamento est adequada.
2. Verificar os Zeros mecnico e eltrico do equipamento.
3. A cubeta de medio deve estar ntegra, limpa e corretamente posicionada.
4. Verificar o volume mnimo de reagente necessrio para a medio.
5. Utilizar a proporo amostra/reagente de acordo com o mtodo em uso.
6. Conferir se o protocolo est correto, de acordo com as orientaes do fabricante do
reagente (modo de reao, filtro, volumes, tempo de incubao....).
7. Verificar se os valores dos controles esto dentro dos limites estabelecidos.
8. Analisar os mapas de controle verificando se existem tendncias ou desvios.
9. Verificar se o Fator de Calibrao est se mantendo (histrico de fatores).
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ANALISADOR AUTOMTICO
Amostra (amostra de paciente, material calibrador e controle)
1. Verificar a condio das amostras (presena de interferentes).
2. Verificar condies de reconstituio, armazenamento e estabilidade de material calibrador
e controles.
Reagente
1. Conferir o preparo correto de reagentes (quando for o caso).
2. Verificar se o reagente est dentro de sua validade e se foi armazenado corretamente.
3. Verificar modificaes visuais no reagente (turvao, precipitao, modificao da cor).
4. Verificar a estabilidade do reagente onboard.
Procedimento
1. Certificar-se de que a manuteno preventiva do equipamento est adequada.
2. Verificar se a manuteno diria foi realizada.
3.
Fase ps-analtica
Clculos
1. Verificar conformidade dos clculos.
2. Verificar se o resultado encontrado est dentro da linearidade do mtodo.
3. Verificar se foi feita diluio da amostra e se a diluio foi considerada no momento
dos clculos.
Resultados ou relatrios
1. Liberar laudo legvel, impedindo erros na interpretao.
2. Verificar se houve erros de transcrio.
Os problemas tcnicos ocorrem em situaes inesperadas, muitas vezes em metodologias
que esto operando em condies estveis no laboratrio. Portanto, na ocorrncia de uma
dificuldade com determinado mtodo, deve-se procurar uma das causas de erro
mencionadas acima, para encontrar a soluo para o problema.
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Referencias
1- CLSI document C3-A4 Preparation and Testing of Reagent Water in the Clinical Laboratory;
Approved Guideline Fourth Edition.
2- Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Burtis CA, Ashood ER, 4a edio, The W.B. Saunders Co,
Philadelphia, 2006
3- Critrios para Uso de Amostras Informativo Labtest
4- Guia Tcnico Informativo Labtest
Labtest Diagnstica SA
Reagentes e Reaes Interveno em Problemas Tcnicos
Atualizao: Outubro 2010
Frida Wilke Alves Basques
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