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INDICE
Introduo

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Reagentes para Pesquisa Visual ou Qualitativa


Reagentes para Anlise Quantitativa

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03

A gua como Reagente


Destilao
Deionizao
Osmose Reversa
Filtrao atravs de Carvo Ativado
Ultra filtrao
Principais contaminantes e eficincia da purificao
Controle da Qualidade da gua
Armazenamento

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Limpeza do Material de Laboratrio

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Reaes
Reao de Aglutinao
Reao de Turvao e Precipitao
Reao Colorimtrica
Reao Ultra Violeta
Reao Ponto Final
Utilizao do Branco de Reagente
Utilizao do Branco de Amostra
Reao Cintica
Reao Cintica Contnua
Reao Cintica Tempo Fixo com medio em Ponto Final
Reao Cintica de dois pontos
Observaes
Reao Crescente e Reao Decrescente
Modo de Leitura
Concluses

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Interveno em Problemas Tcnicos


Modelo Experimental
Fase pr Analtica
Fase Analtica
Analisador Manual e Semiautomtico
Analisador Automtico
Fase ps Analtica

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Referncias

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INTRODUO
A determinao de um analito em amostra biolgica se baseia primariamente na reao do analito
que se deseja avaliar, qualitativa ou quantitativamente, com um ou mais reagentes, visando
formao de um produto, que pode ser identificado visualmente ou medido atravs de um
analisador.
Os produtos formados podem ter as mais variadas apresentaes, podendo ser uma aglutinao
de partculas, turvao, formao de cor ou formao de um produto sem cor, que pode ser
identificado ou medido atravs de fotmetros ou contadores de radiao. Portanto, o trabalho no
Laboratrio Clnico se baseia quase na sua totalidade, no uso de reagentes que produzem as
reaes desejadas, formando os produtos indicadores da reao.

Reagentes para Pesquisa Visual ou Qualitativa


Os reagentes utilizados para pesquisa visual podem ser partculas de ltex, clulas (principalmente
hemcias), onde so aderidos antgenos ou anticorpos, destinados a reagir com a substncia cuja
presena se deseja identificar. As partculas tm a funo de mostrar visualmente a reao
ocorrida, que se manifesta pela presena ou ausncia de aglutinao.
Os reagentes podem ainda ser anticorpos especficos para antgenos que desejamos pesquisar ou
quantificar e que desenvolvem reaes cujo produto pode ser uma turvao ou uma precipitao
em um meio slido.
Outra forma de identificao visual consiste na colorao de clulas onde os corantes reagem com
substncias presentes dentro das clulas, mostrando cores diferentes em funo das reaes
ocorridas.
A pesquisa visual utiliza tambm reagentes (antgenos ou anticorpos) imobilizados em membranas
ou microplacas, que reagem com a substncia a ser pesquisada. A ocorrncia da reao antgenoanticorpo mostrada pela ao de reagentes auxiliares que desenvolvem cor, podendo at mesmo
mostrar smbolos de fcil interpretao.
A cromatografia de coluna ou camada delgada tambm um modelo de pesquisa visual, que
permite a separao de vrios componentes em uma amostra biolgica. A identificao dos
analitos realizada atravs dos mais variados processos de colorao ou pode ser feita atravs da
prpria cor dos analitos separados, como na separao cromatogrfica das hemoglobinas. Em
muitos casos pode-se utilizar um instrumento para quantificar os analitos separados.
A pesquisa visual, quando qualitativa, denominada genericamente como um "teste" que gera
uma deciso de confirmar a ausncia ou presena do analito. um resultado em que a resposta
sim ou no, positivo ou negativo.

Reagentes para anlise quantitativa


Na grande maioria das vezes, os reagentes utilizados na anlise quantitativa devem gerar
produtos, cuja quantidade pode ser medida com a utilizao de um analisador. Os dados obtidos
so comparados com padres calibradores para se obter a concentrao do analito presente na
amostra. Durante muito tempo estes reagentes utilizaram somente substncias qumicas,
orgnicas ou inorgnicas, capazes de gerar um produto mensurvel.
O desenvolvimento de mtodos eficientes de fermentao e separao permitiu a obteno de
enzimas purificadas de custo acessvel, fazendo com que estas possam ser utilizadas como
reagentes, substituindo os reagentes qumicos em vrios sistemas analticos. As enzimas
passaram a fazer parte da formulao de um nmero cada vez maior de sistemas analticos com
as seguintes vantagens operacionais:
a) Emprego de reagentes pouco agressivos e de fcil utilizao;
b) Facilidade para utilizao monorreagente ou birreagente em analisadores semiautomticos
e automticos;
c) Custos operacionais totais similares aos dos reagentes qumicos, porque reduzem as
operaes manuais e so facilmente automatizados.
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As enzimas so tambm produtos qumicos, mas devido a caractersticas prprias destes


reagentes, os sistemas analticos utilizando enzimas so denominados enzimticos. Os usurios
dos reagentes enzimticos sentiram a necessidade de distinguir estes reagentes dos reagentes
qumicos e criou-se ento a denominao de reagentes colorimtricos para os reagentes qumicos
e de reagentes enzimticos para aqueles utilizando enzimas. Entretanto, muitos reagentes
enzimticos formam produtos coloridos, sendo colorimtricos tambm.

gua como Reagente


A gua o suprimento do Laboratrio Clnico de menor custo. Talvez, por este motivo, sua
qualidade seja to negligenciada, apesar de ser um reagente importante e o mais utilizado.
A classificao de gua PURA pode ter diferentes significados, dependendo da situao.
gua PURA para uso domstico significa que ela livre de microrganismos patognicos e agentes
txicos, sendo prpria para o consumo humano.
gua PURA para uso farmacutico significa principalmente que ela livre de pirogenios e
microrganismos.
No Laboratrio Clnico, a gua utilizada como reagente qumico e por isto a denominao gua
PURA significa que ela deve conter uma quantidade mnima de contaminantes (ons, matria
orgnica e microrganismos), capaz de atender a diferentes aplicaes.
Traos de ons ou metais aceleram ou inibem vrias reaes, principalmente as mediadas por
enzimas e prejudicam o desempenho de vrios reagentes, controles e calibradores.
O efeito das impurezas da gua nos diversos testes de laboratrio tem sido estudado
sistematicamente e existem evidncias de numerosas causas de erro. O cloro utilizado na gua
servida populao, na concentrao em torno de 1,0 mg/L, pode introduzir erros de at 25% na
determinao de cloretos e interfere com vrios procedimentos em bacteriologia e enzimologia.
Traos de metais aceleram ou inibem vrias reaes e podem introduzir erros significativos nas
medies de atividades enzimticas ou em procedimentos que utilizam enzimas como reagentes.
A dimenso do erro gerado pela impureza da gua depende em muito da concentrao do analito.
Um miligrama de sdio por litro de gua pode introduzir um aumento de 4,3 mEq/L na
determinao de sdio se a diluio utilizada for de 1:100, representando um erro de 3,1%, em
uma concentrao de sdio de 140 mEq/L. Por outro lado, 1,0 mg de potssio por litro de gua
introduz um aumento de 2,5 mEq/L. Em uma amostra com potssio de 4,0 mEq/L, o erro de 62%.
Assim, a gua a ser utilizada no laboratrio deve ser purificada para que no produza
interferncias nos testes ou ensaios. Vrios so os processos de purificao que esto disponveis
para utilizao no laboratrio. Esta purificao consiste na eliminao de todas as substncias
dissolvidas e suspensas na gua.
Destilao: Processo de vaporizao e condensao de um lquido para purificar ou concentrar
uma substncia ou para separar uma substncia voltil de outras substncias menos volteis. o
mtodo mais antigo de purificao da gua.
Deionizao: Neste processo a gua passa por um sistema contendo resinas insolveis, aninicas
e catinicas, onde os ons presentes na gua so trocados pelos ons presentes nessas resinas.
No caso das resinas de troca catinica, esta trocar seus ons hidrognio (H+) por contaminantes
catinicos, como clcio, magnsio, ferro, alumnio, mangans, cobre, zinco, cromo, nquel e outros
ctions metlicos e ctions diversos.
As resinas aninicas por sua vez trocam seus ons hidroxila (OH-) pelos contaminantes aninicos,
como clorato, clorito, cloreto, sulfato, sulfito, sulfeto, nitrato, nitrito, fosfato, fluoreto e outros nions,
alm da slica.
Osmose Reversa: Processo pelo qual a gua forada a passar por uma membrana
semipermevel que age como um filtro molecular. A membrana remove de 90 a 99% das
impurezas da gua.
Devido a sua capacidade de remoo de bactrias e pirognios, a osmose reversa
frequentemente combinada com a deionizao de modo a reduzir a frequencia de regenerao das
resinas de troca inica.

Filtrao com carvo ativado: Este processo remove o cloro por quimioabsoro e as
substncias orgnicas dissolvidas por adsoro. Geralmente o filtro de carvo ativado colocado
nos sistemas de purificao da gua antes da osmose reversa e antes da deionizao.
Ultrafiltrao: Utiliza uma membrana com poros ligeiramente maiores que os da membrana de
osmose reversa. utilizado para remover pirognios da gua purificada.
A tabela 1 relaciona os vrios procedimentos de purificao da gua e sua eficincia na remoo
dos principais interferentes.
Slidos
Ionizados

Gases
Ionizados

Matria
Orgnica

Partculas

Bactrias

E/B

Deionizao

Osmose Reversa

Carvo Ativado

E/B

Ultra filtrao

Destilao

Tabela 1: E = excelente; B = boa; P = pobre (remoo pequena ou nula)


Uma combinao dos processos de purificao da gua para uso no Laboratrio Clnico consiste
de: Filtro inicial para reter partculas e bactrias; Filtro de carvo ativado para eliminar matrias
orgnicas e Sistema deionizador de leito misto ou separado para reter ons, acoplado ou no a um
sistema de osmose reversa.
O processo de deionizao e de osmose reversa, tem aplicao muito comum nos Laboratrios
Clnicos, mas o sistema deve ser monitorado para que possveis problemas sejam sanados. A
pequena sensibilidade no sistema de informao da qualidade da gua processada acarreta na
utilizao de gua imprpria. Contaminao com bactrias podendo deteriorar o sistema (resinas e
membranas). Liberao de silicatos, substncias alcalinas e potentes oxidantes, que interferem
nas reaes, principalmente as enzimticas.
A gua purificada para uso no Laboratrio Clnico, deve ser submetida ao controle da qualidade
devendo ser testada todas as vezes em que se obtiver um novo lote.
A gua de uso no laboratrio pode ser classificada em funo da concentrao de contaminantes
mais importantes.
Especificaes estabelecidas no momento da produo da gua:
NCCLS
Tipo III

CLSI
ARLC

< 10

Tipo I

Tipo II

Bactrias Heterotrficas (ufc/mL)

< 10

< 1000

Resistividade (M/cm a 25 C)
Condutividade (mS/cm a 25 C)

> 10
< 0,1

>1
<1

Silicatos (mg/L)

< 0,05

< 0,1

<1

< 500

< 0,22

< 0,22

NI

NI

Carbono orgnico total (TOC) ng/g (ppb)


Partculas (micra)
Armazenamento / Recipiente

> 0,1
< 10

10
0,1

Tabela 2: ufc - unidade formadora de colnias; m - megaohms; S - microsiemens; NI No


Indicado; ARLC = gua Reagente para Laboratrio Clnico
Existe ainda uma especificao para a gua que usada em HPLC, cultura de clulas e tecidos,
anlise de cromossomas e testes de HLA, que denominada gua tipo Especial.
Cuidados devem ser tomados aps obteno de gua destilada ou deionizada, pois no tem
sentido obter uma gua de boa qualidade e contamin-la durante o processo armazenamento.
A gua de tipo I s existe nesta forma no momento de sua produo. Portanto, quando um
reagente requerer este tipo de gua, ele deve ser preparado imediatamente aps a produo da
gua purificada.
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De modo geral, a gua deionizada se encontra em um estado antinatural e tem a tendncia a


adquirir um estado intermedirio entre o estado inicial e a purificao.
Os sistemas de armazenamento da gua de tipos II e III devem ser construdos com materiais que
no facilitem a contaminao qumica ou bacteriana.
O laboratrio deve seguir a RDC 302/2005 da ANVISA, que no item 6.2.7 descreve: O laboratrio
clnico e o posto de coleta laboratorial devem definir o grau de pureza da gua reagente utilizada
nas suas anlises, a forma de obteno, o controle da qualidade.
Controle da Qualidade da gua
A slica (contaminante fracamente ionizado) uma das primeiras substncias que podem eluir dos
leitos de resina de troca inica quando se aproximam da saturao. A liberao de substncias
fortemente ionizadas ocorre em seguida, aumentando a condutividade.
Para realizar o controle da qualidade da gua para uso no laboratrio, so indicados alguns testes:

1. Determinar a quantidade de silicato presente na gua. O silicato o primeiro elemento


a aparecer na gua quando a coluna est atingindo seu ponto de saturao e comea a se
tornar imprpria para utilizao. Para determinao qualitativa de silicatos na gua, a
Labtest disponibiliza o produto Silicato MA Ref. 603.

2. Medir a condutividade da gua. Condutividade a capacidade que a gua possui em


conduzir corrente eltrica, quanto maior a condutividade, maior a quantidade de ons
presentes na gua. A medida da condutividade deve ser realizada com um condutivmetro.
Unidade: S= microsiemens.

3. Realizar o controle microbiolgico da gua. Dever ser feito mensalmente e sempre


aps manuteno do equipamento. O controle microbiolgico da gua definido como
Unidades Formadoras de Colnia por mL de gua (UFC/mL). Cada laboratrio dever ter
seu procedimento de coleta e medida
Para obter uma gua que contenha somente partculas menores que 0,22 , utilizar um filtro
com poro de dimetro nominal igual a 0,22 .
Criar um sistema de registro da condutividade, da absorbncia encontrada no teste do Silicato MA
e do controle microbiolgico com as datas de realizao. Repetir este teste de controle da
qualidade da gua, no mnimo semanalmente. Registrar todas as aes tomadas quando um dos
parmetros se mostrar fora da especificao desejada.
Armazenamento
De modo geral, como a gua purificada se encontra em um estado antinatural e tem tendncia a
retornar ao estado anterior purificao, devem-se tomar cuidados no armazenamento.
recomendvel obter a gua purificada na quantidade suficiente para um dia de trabalho.

Limpeza do Material de Laboratrio


A utilizao de material limpo fundamental para a qualidade dos resultados, pois a introduo de
contaminantes pode inibir ou potencializar as reaes de modo indesejvel. Contaminantes
presentes no material de trabalho podero atuar como reagentes adicionais, que iro agir como
inibidores ou ativadores e at mesmo podem ser da mesma qualidade do analito, produzindo
resultados falsamente elevados.
Os diversos procedimentos no laboratrio podem requerer formas distintas de limpeza do material.
Assim, na determinao de traos de elementos como clcio, ferro, cobre e outros, tratar a vidraria
com cido clordrico a 50% ou cido ntrico a 30%, enxaguar com gua de torneira e em seguida
com gua destilada ou deionizada.
Entretanto, um modelo bsico que tem aplicao geral no laboratrio pode ser proposto. Em
primeiro lugar devemos nos preocupar com a preveno, para impedir que reagentes e protenas
fiquem aderidos a pipetas, tubos de ensaio e outros materiais.
Logo aps o uso desprezar o resduo e imergir a vidraria em uma soluo de detergente (prprio
para uso em laboratrios) a 0,5% ou, no mximo, a 1,0%. Solues de detergentes muito
concentradas dificultam sua remoo da vidraria e os detergentes aderidos podem atuar como
inibidores ou ativadores de outras reaes. A vidraria dever ficar imersa na soluo de detergente
por aproximadamente 2 horas. O material deve ser enxaguado com gua de torneira e passado
pelo menos duas vezes em gua purificada. Secar em estufa.
Em analisadores semiautomticos com cubeta de fluxo, aspirar no final da rotina diria uma
soluo de detergente a 0,5% e deixar agir. Antes do incio da nova rotina, enxaguar bem com
gua purificada. Quinzenalmente aspirar para a cubeta 10 mL de uma soluo de hipoclorito de
sdio a 2,5%. Deixar agir por 20 minutos e enxaguar em seguida com gua purificada. O
hipoclorito de sdio no indicado para uso em metais por sua ao corrosiva. Seguir as
orientaes do fabricante do analisador.
As multicubetas dos analisadores automticos aps o uso devem ser imediatamente esvaziadas e
colocadas em soluo de detergente a 0,5% por aproximadamente 1 hora, lavados ento com
gua de torneira e enxaguadas com gua destilada ou deionizada. Secar em estufa a 37 C.
Seguir as orientaes do fabricante do analisador.

Reaes
As reaes correspondem ao resultado da atuao de um ou mais reagentes sobre o analito para
formar o produto. Existem vrios modelos de reao e aquele a ser escolhido para determinado
sistema analtico ir depender dos reagentes a serem utilizados ou disponveis e das facilidades
instrumentais.
Reao de Aglutinao: So utilizadas partculas ligadas a antgenos ou anticorpos que reagem
com um analito produzindo uma reao visvel a olho nu ou ao microscpio. Na maioria dos
formatos analticos as reaes positivas se manifestam por presena de aglutinao. Em algumas
reaes de aglutinao utiliza-se o modelo da inibio de aglutinao e as reaes positivas se
manifestam pela ausncia de aglutinao.
Reao de turvao e precipitao: As reaes de turvao ocorrem por precipitao de um
analito, na maioria das vezes uma protena, por ao de um reagente que pode ser um anticorpo e
o precipitado permanece na forma de suspenso que ser quantificado por espectrofotometria. O
comportamento cintico dessas reaes normalmente de ponto final, ou seja, o produto formado
atinge o seu ponto mximo de deteco e permanece inalterado por um determinado tempo em
funo de sua estabilidade.
Reao Colorimtrica: Reao Colorimtrica aquela em que o produto formado tem uma cor e
a intensidade da cor medida na faixa visvel do espectro (380 - 680 nm).
Reao Ultravioleta (UV): So reaes cujos produtos formados absorvem energia radiante ("luz")
na poro do ultravioleta prximo, mais especificamente em 340 ou 365 nm.

A reao colorimtrica ou a reao ultravioleta pode ser utilizada em vrios modelos, como
reao de ponto final e reao cintica.
Reao de Ponto Final
As reaes de aglutinao, turvao ou precipitao so, em muitas situaes, reaes de ponto
final, mas o termo especialmente dedicado quelas reaes que formam um produto cuja
concentrao chega a um ponto mximo, permanecendo inalterada por um determinado tempo em
funo da estabilidade do produto formado. Estas reaes podem ser colorimtrica ou ultravioleta.
Um nmero bastante elevado de ensaios utiliza as reaes de ponto final onde a concentrao do
produto formado medida fotometricamente. Podemos mencionar alguns exemplos, como as
determinaes qumicas ou enzimticas de albumina, colesterol, glicose e triglicrides.
A Figura 1 mostra graficamente uma reao de ponto final. A diviso em trs etapas mostra o incio
e incremento na formao do produto, a etapa de estabilidade, e o decaimento do produto por
perda da estabilidade.

Figura 1: T0 - T1 Tempo de formao do produto. T1 - T2 - Tempo em que a reao se


completou e permanece estvel. Neste intervalo ser realizada a medio da quantidade de
produto da reao. T2 - T3 - Perda da estabilidade do produto formado.

Utilizao do Branco de Reagente


necessrio utilizar o Branco do Reagente como referncia sempre que a absorbncia da mistura
de reagentes no comprimento de onda utilizado, for diferente da absorbncia da gua.
No teste de Protenas Totais, por exemplo, vemos que em 545 nm o reagente tem uma
absorbncia. Ao utilizarmos o reagente como Branco, para zerar o equipamento, estamos
eliminando a contribuio desta absorbncia nos resultados.

Figura 2: A1 - Absorbncia do Reagente (Branco da Reao); A2 - Absorbncia do Padro


(Amostra); A2 A1 = Absorbncia da Reao
Utilizao do Branco de Amostra
indicado quando a contribuio fotomtrica da amostra no comprimento de onda utilizado altera
significativamente o resultado final.

Figura 3: A1 Absorbncia do branco da amostra (mistura do 1 reagente com a amostra); A2


Absorbncia da Reao mais absorbncia do branco da amostra;
A2 menos A1 = Absorbncia corrigida da Reao

Reao Cintica
So reaes onde a velocidade da formao do produto medida durante um intervalo de tempo,
que pode ser horas, minutos ou segundos e a denominao cintica decorrente do
relacionamento da reao com o tempo. Muitos consideram que as reaes cinticas so aquelas
em que se mede a formao de produto usando pequenos intervalos de tempo, minuto a minuto,
na faixa ultravioleta do espectro (340 ou 365 nm). Estas reaes, sem dvida, so cinticas, mas
tambm o so aquelas reaes em que se mede a formao de um produto em 5, 10 ou 30
minutos de incubao. As medies da atividade da fosfatase alcalina e amilase, entre outras, so
realizadas utilizando reaes cinticas.
Reao Cintica Contnua
As reaes que utilizam medidas contnuas da formao de produtos so denominadas "reaes
de cintica contnua".

Figura 4: a-b - fase inicial da reao onde a velocidade no constante; b-c - reao com
velocidade constante onde so obtidas as diferenas de absorbncia/minuto (abs/min), usadas
para calcular o resultado; c - reduo da velocidade de reao por esgotamento do substrato.
Na reao de cintica contnua quando no se dispe de um fotmetro com temperatura
controlada, deve-se utilizar reao cintica de tempo fixo.
Reao Cintica de Tempo Fixo com medio em Ponto Final
As reaes cinticas de tempo fixo com medio em ponto final requerem um rigoroso controle do
tempo e da temperatura de incubao, para que os resultados tenham a qualidade esperada. Um
dos erros mais comuns neste tipo de reao ocorre no controle do tempo de incubao. Deve-se
marcar o tempo no momento em que a amostra entra em contato com o substrato, que j deve
estar na temperatura de incubao, isto , dentro do banho-maria. Quando houver vrias amostras
a serem dosadas, pipet-las com intervalos de tempo, 10 a 15 segundos. Quando o tempo se
completar, interromper a reao com os mesmos intervalos.

Figura 5: T0 - T1 - Intervalo de tempo onde ocorre a reao; T1 - Interrupo da reao


enzimtica; T1 - T2 - Intervalo de estabilidade do produto da reao
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Um mesmo analito pode ser determinado tanto por uma reao cintica contnua como por uma
reao de cintica de tempo fixo e podemos citar como exemplo a determinao da Gama Glutamil
Transferase.
Reao Cintica de Dois Pontos
As reaes cinticas so geralmente aplicadas nas determinaes de atividade de enzimas, mas
podem ser utilizadas para determinao de analitos, habitualmente ensaiados por reaes de
ponto final. A creatinina comumente dosada com uma reao de ponto final, mas pode-se
tambm utilizar uma reao cintica de dois pontos. Neste caso, a reao de ponto final aplicada
em metodologias manuais e a reao cintica utilizada, principalmente, em metodologias
automatizadas.
Quando se dispe de facilidades instrumentais para medidas fotomtricas contnuas em tempos
reduzidos, pode-se medir em modo cintico de dois pontos vrios analitos habitualmente
ensaiados por reaes de ponto final. Se uma determinao de glicose, usando a enzima glicose
oxidase, medida em 10 minutos na reao de ponto final, pode-se realizar a mesma
determinao usando um instrumento capaz de medir a reao em um tempo de 5 minutos ou
menos, quando se tem a certeza de que as medies das amostras desconhecidas, calibradores e
controles sero realizadas no mesmo tempo de reao e que a velocidade de reao a mesma
para amostras, controles e calibradores.
As reaes cinticas de dois pontos podem ser utilizadas para diminuir o tempo de reao,
minimizar a ao de interferentes ou estender a linearidade do sistema analtico. Comumente, as
reaes cinticas de dois pontos utilizam a fase inicial da reao com uma medio aos 30
segundos, que servir como branco, e outra medio aos 90 segundos. Utiliza-se ento o delta da
reao para calcular a concentrao do analito.

Figura 6: A diferena de absorbncia: (T2-T1) usada para clculo do resultado.


A escolha do intervalo de medio mais adequado ir depender da melhor linearidade, da
eliminao de interferentes ou da melhor sensibilidade. Observar que a velocidade da reao
maior nos tempos iniciais, onde logicamente a sensibilidade maior.
Existem reaes cinticas de dois pontos em que os intervalos so maiores, como no caso da
frutosamina, quando necessrio um tempo mais longo na fase inicial para maximizar a
eliminao de interferentes. Deve-se enfatizar que o controle da temperatura tambm
fundamental nas reaes cinticas de dois pontos.

Observaes
Na reao Cintica Contnua e Cintica de 2 Pontos, importante que o equipamento tenha
cubeta termostatizada.
Na reao Cintica de Tempo Fixo imprescindvel um rigoroso controle da temperatura e do
tempo de incubao.

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Reao Crescente e Reao Decrescente


Reao Crescente So caracterizadas pelo aumento da concentrao do produto formado ou de
um dos reagentes.
Reao Decrescente So caracterizadas pela diminuio da concentrao do produto ou de um
dos reagentes.

Modo de Leitura
Monocromtica - A absorbncia utilizada para clculo o resultado da leitura realizada em um
nico comprimento de onda.
Bicromtica A absorbncia utilizada para clculo o resultado da diferena entre as leituras
realizadas no comprimento de onda primrio e no comprimento de onda secundrio. As leituras
bicromticas so utilizadas para minimizar a ao de interferentes, principalmente a lipemia.

Concluso
As reaes representam a base do trabalho no Laboratrio Clnico e o conhecimento dos vrios
modelos relevante para uma atuao adequada e interveno em muitas dificuldades tcnicas
encontradas no dia a dia do trabalho.
Para finalizar, procuramos sintetizar nas duas figuras abaixo, as principais reaes utilizadas no
Laboratrio, classificando-as de acordo com o produto formado ou o modelo da reao.
REAO

AGLUTINAO

PRECIPITAO

COLORIMTRICA

ULTRA VIOLETA

Figura 7: Reaes segundo o produto formado

REAO COLORIMTRICA

PONTO FINAL

COM BRANCO
DE AMOSTRA

SEM BRANCO
DE AMOSTRA

CINTICA

CONTNUA

TEMPO FIXO

DOIS PONTOS

Figura 8: Reaes segundo o modelo da reao ou o procedimento

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INTERVENO EM PROBLEMAS TCNICOS


Um problema tcnico ocorre quando existe uma dificuldade em se obter o resultado de um
determinado ensaio ou quando a reao no se mostra com o desempenho adequado ou
esperado.
A criao de um modelo de orientao, capaz de identificar todas as causas de problemas e com
habilidades suficientes para indicar as formas de soluo, uma tarefa bastante difcil, pois so
inmeras as causas e fatores responsveis por problemas tcnicos. Entretanto, estas dificuldades
no impedem a criao de um modelo experimental com possibilidades de fornecer ajuda efetiva.

Modelo experimental
A forma inicial para abordar um problema tcnico consiste em caracterizar o erro que est
ocorrendo.
Se a calibrao ou os resultados de controles ou amostras de paciente apresentam uma
variabilidade muito grande, seja nas determinaes em duplicata ou no dia a dia, est ocorrendo
um Erro Aleatrio.
Este erro pode ser devido s seguintes causas: amostra inadequada, erros na medio da
amostra, oscilao da temperatura ou tempos incorretos de incubao, tcnica mal conduzida,
vidraria contaminada, defeitos no fotmetro e gua de m qualidade.
Se os resultados mostram valores consistentemente elevados ou diminudos, est ocorrendo um
Erro Sistemtico, que tem como causas principais os seguintes fatores: amostras inadequadas
seja por erros de medida, de conservao ou de preparo, temperatura ou tempo incorreto de
incubao, erros de calibrao, reagentes contaminados, inadequadamente conservados ou
preparados de modo incorreto, defeito no fotmetro, bias do analista e gua de m qualidade.
Ocorrendo um problema tcnico, deve ser feita uma investigao para encontrar a causa e
introduzir as medidas de correo.
Deve-se, em primeiro lugar, fazer uma reviso de todo o processo operacional, procurando as
causas mais bvias como: pipetas utilizadas, principalmente a usada na medida da amostra;
volume correto de amostra e reagente; relao correta do volume amostra/reagente; omisso ou
troca de reagentes; desempenho do fotmetro; protocolo adequado de acordo com orientao do
fabricante e correo dos clculos dos resultados.
evidente que um conhecimento adequado da metodologia, das causas de erro e a experincia
com a metodologia iro contribuir decisivamente para identificar as causas do problema e
encontrar uma soluo.
Deve ser criado um esquema de avaliao dos problemas, que, para convenincia, pode ser
dividido em 3 subunidades: pr analtica, analtica e ps-analtica.
A idia estabelecer pontos de verificao em cada passo da metodologia, visando identificar o
erro e ajudar na soluo do problema.
Cada mtodo deve ter seu esquema prprio, pois eles diferem em etapas e procedimentos.
Relacionaremos a seguir um roteiro bsico contemplando as trs fases analticas.

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Fase pr-analtica
No existem meios fsicos de controlar a ao dos efeitos pr-analticos como existem os materiais
de controle para a fase analtica.
Para realizar esse controle deve-se basear em treinamento de pessoal, padronizao dos
procedimentos e registro das atividades.
Preparo do paciente
Definir procedimentos da adequao ao preparo do paciente.
1. Prtica de exerccio fsico.
2. Jejum de acordo com a necessidade do analito a ser determinado.
3. Dieta.
4. Drogas Teraputicas (Efeito Fisiolgico in vivo e in vitro).
5. Postura.
6. Variao circadiana
7. Consumo de lcool.
8. Fumo
Coleta e Obteno da amostra
1. Conferncia da identificao do paciente.
2. Definio do momento correto para obteno da amostra.
3. Uso do anticoagulante correto de acordo com o mtodo a ser utilizado.
4. Preservao correta da amostra.
Processamento da amostra
1. Separao das clulas no tempo correto.
2. Ateno para necessidade de extrao ou outro processo preparativo.
3. Armazenamento correto (temperatura de armazenamento, proteo da luz).
4. Condio da amostra e adequao para o teste: Amostra ictrica, turva ou hemolisada.

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Fase analtica
ANALISADOR MANUAL E SEMIAUTOMTICO
Amostra (amostra de paciente, material calibrador e controle)
1. Certificar-se da correta limpeza da vidraria.
2. Conferir a pipeta utilizada de acordo com o volume requerido.
3. Usar ponteiras adequadas para a pipeta automtica em uso.
4. Verificar o procedimento de pipetagem.
5. Criar mecanismos que impeam a troca de amostras.
6. Verificar a condio das amostras (presena de interferentes).
7. Verificar condies de reconstituio, armazenamento e estabilidade de material calibrador
e controles.
Reagente
1. Conferir o preparo de reagentes (quando for o caso).
2. Verificar se o reagente est dentro de sua validade e se foi armazenado corretamente.
3. Verificar modificaes visuais no reagente (turvao, precipitao, mudana da cor).
Incubao
1. Monitorar o tempo e a temperatura de incubao.
2. Certificar-se de que a adio de amostra ao substrato seja efetuada na temperatura de
incubao.
3. Na determinao de enzimas, aps a mistura de amostra e substrato, observar o tempo
crtico de incubao.
4. O nvel de gua no banho-maria deve ser superior ao nvel de reagentes nos tubos de
ensaio.
Procedimento
1. Certificar-se de que a manuteno preventiva do equipamento est adequada.
2. Verificar os Zeros mecnico e eltrico do equipamento.
3. A cubeta de medio deve estar ntegra, limpa e corretamente posicionada.
4. Verificar o volume mnimo de reagente necessrio para a medio.
5. Utilizar a proporo amostra/reagente de acordo com o mtodo em uso.
6. Conferir se o protocolo est correto, de acordo com as orientaes do fabricante do
reagente (modo de reao, filtro, volumes, tempo de incubao....).
7. Verificar se os valores dos controles esto dentro dos limites estabelecidos.
8. Analisar os mapas de controle verificando se existem tendncias ou desvios.
9. Verificar se o Fator de Calibrao est se mantendo (histrico de fatores).

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ANALISADOR AUTOMTICO
Amostra (amostra de paciente, material calibrador e controle)
1. Verificar a condio das amostras (presena de interferentes).
2. Verificar condies de reconstituio, armazenamento e estabilidade de material calibrador
e controles.
Reagente
1. Conferir o preparo correto de reagentes (quando for o caso).
2. Verificar se o reagente est dentro de sua validade e se foi armazenado corretamente.
3. Verificar modificaes visuais no reagente (turvao, precipitao, modificao da cor).
4. Verificar a estabilidade do reagente onboard.
Procedimento
1. Certificar-se de que a manuteno preventiva do equipamento est adequada.
2. Verificar se a manuteno diria foi realizada.
3.

Certificar-se de que amostras e reagentes esto posicionados corretamente.

4. Certificar-se de que no h presena de bolhas de ar na superfcie das amostras e dos


reagentes colocados no analisador.
5. Conferir se o protocolo est correto, de acordo com as orientaes do fabricante do
reagente (modo de reao, filtro, volumes, tempo de incubao....).
6. Verificar se o Fator de Calibrao est se mantendo (histrico de fatores).
7. Verificar se os valores dos controles esto dentro dos limites estabelecidos.
8. Analisar os mapas de controle verificando se existem tendncias ou desvios.

Fase ps-analtica
Clculos
1. Verificar conformidade dos clculos.
2. Verificar se o resultado encontrado est dentro da linearidade do mtodo.
3. Verificar se foi feita diluio da amostra e se a diluio foi considerada no momento

dos clculos.
Resultados ou relatrios
1. Liberar laudo legvel, impedindo erros na interpretao.
2. Verificar se houve erros de transcrio.
Os problemas tcnicos ocorrem em situaes inesperadas, muitas vezes em metodologias
que esto operando em condies estveis no laboratrio. Portanto, na ocorrncia de uma
dificuldade com determinado mtodo, deve-se procurar uma das causas de erro
mencionadas acima, para encontrar a soluo para o problema.

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Referencias
1- CLSI document C3-A4 Preparation and Testing of Reagent Water in the Clinical Laboratory;
Approved Guideline Fourth Edition.
2- Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Burtis CA, Ashood ER, 4a edio, The W.B. Saunders Co,
Philadelphia, 2006
3- Critrios para Uso de Amostras Informativo Labtest
4- Guia Tcnico Informativo Labtest

Labtest Diagnstica SA
Reagentes e Reaes Interveno em Problemas Tcnicos
Atualizao: Outubro 2010
Frida Wilke Alves Basques

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