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Diagnstico

laboratorial de doenas
sexualmente transmissveis,
incluindo o vrus da
imunodeficincia humana

Publicado pela Organizao Mundial da Sade em 2013 sob o ttulo Laboratory diagnosis of sexually transmitted
infections, including human immunodeficiency virus
Organizao Mundial da Sade 2013
A Organizao Mundial da Sade concedeu os direitos de traduo e publicao da presente edio em portugus
Coordenao de Laboratrio do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais, que a nica responsvel pela
qualidade e fidelidade da traduo em portugus. Em caso de qualquer inconsistncia entre as edies em ingls e
portugus, a edio original em ingls dever ser considerada a edio juridicamente vinculativa e autntica.
Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana /
Coordenao de Laboratrio do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais 2014.
1.Doenas sexualmente transmissveis diagnstico. 2.Infeces por HIV - diagnstico. 3.Tcnicas e procedimentos de
diagnstico. 4.Laboratrios.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

2013

2015

Responsveis pela publicao em ingls:

Responsveis pela publicao em portugus:

Editor-chefe

Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais

Magnus Unemo

Fbio Mesquita

Centro de Colaborao da OMS para Gonorreia e outras


DST

Diretor do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais

Hospital Universitrio de rebro, rebro, Sucia

Adele Schwartz Benzaken

Editores

Diretora-Adjunta do Departamento de DST, AIDS e


Hepatites Virais

Ronald Ballard

Miriam Franchini

Centros de Controle e Preveno de Doenas


Atlanta, Georgia, Estados Unidos da Amrica

Coordenadora de Laboratrio do Departamento de DST,


AIDS e Hepatites Virais

Catherine Ison

Traduo:

Sade Pblica da Inglaterra (anteriormente Agncia de


Proteo Sade)

Nazle Mendona Collao Vras

Londres, Reino Unido

Reviso tcnica:

David Lewis

Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Instituto Nacional de Doenas Transmissveis

Roberta Barbosa Lopes Francisco

Joanesburgo, frica do Sul

Jos Boullosa

Francis Ndowa

Bruna Lovizutto Protti

Organizao Mundial da Sade

Ana Flvia Pires

Genebra, Sua

Mariana Villares

Rosanna Peeling

Regina Comparini

Escola de Higiene e Medicina Tropical de Londres

Pmela Cristina Gaspar


Reviso ortogrfica:
Angela Gasperin Martinazzo
Projeto grfico e diagramao:
Fernanda Dias Almeida Mizael
Marcos Cleuton de Oliveira

Sumrio
Siglas e abreviaturas

vii

Prefcio xi
Agradecimentos xiii
1

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis


Edward W. Hook III, Francis Ndowa, David Mabey, Manju Bala e Ye Tun

Gesto da qualidade no laboratrio


Catherine Ison e Ronald Ballard

11

Micoplasmas genitais
Jrgen Skov Jensen e Magnus Unemo

17

4 Gonorreia

Magnus Unemo e Catherine Ison

23

61

Infeces por clamdia


Barbara Van Der Pol e Magnus Unemo

6 Tricomonase

Yaw Adu-Sarkodie, Magnus Unemo, e Barbara Van Der Pol

83

Vaginose bacteriana
Yaw Adu-Sarkodie e Catherine Ison

95

8 Candidase

Yaw Adu-Sarkodie e Catherine Ison

101

105

Infeces pelo vrus da herpes simples (HSV)


Laurent Blec

10 Sfilis

Ronald Ballard e Edward W. Hook III

121

11 Linfogranuloma venreo (LGV)



Ronald Ballard

147

12 Cancro mole

David Lewis

149

13 Donovanose (granuloma inguinal)



David Lewis

157

14 Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)



Suzanne Garland

161

15 Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)



Bharat S. Parekh, Dennis Ellenberger, Larry Westerman, Chunfu Yang

e John N. Nkengasong

175

Sumrio

Anexos

vi

Anexo 1. Microscopia e princpios de colorao



Catherine Ison

189

Anexo 2. Princpios dos testes point-of-care rpidos



Rosanna Peeling

197

Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente


transmissveis

Cheng Y. Chen e Magnus Unemo

205

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)



Stefania Starnino e Jo-Anne R. Dillon

223

Anexo 5. Materiais de laboratrio



Stefania Starnino e Jo-Anne R. Dillon

245

Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Siglas e abreviaturas
ACT

gar cistena tripticase

AEQ

Avaliao externa da qualidade

AIDS

DNA

cido desoxirribonucleico; do ingls


deoxyribonucleic acid

Sndrome da imunodeficincia
adquirida; do ingls acquired
immunodeficiency syndrome

DP

Desvio padro

dsDNA

DNA de fita dupla; do ingls doublestranded DNA

AIQ

Avaliao interna da qualidade

DST

Doenas sexualmente transmissveis

ARV

Antirretroviral

EA

ster de acridnio

AVAI

Anos de vida ajustados por


incapacidade

ECD

Ensaio cintico duplo

EDL

Ensaios desenvolvidos por laboratrios

BD

Becton, Dickinson and Company

EIA

bDNA

DNA em cadeia ramificada; do ingls


branched chain DNA

Imunoensaio enzimtico; do ingls


enzyme immunoassay

EID

Ensaio de imunofluorescncia direta

ELISA

Ensaio imunossorvente ligado enzima;


do ingls enzyme-linked immunosorbent
assay

EM

Espectrometria de massa

EQI

Ensaio de quimioluminescncia

EUCAST

Comit Europeu para o Teste a


Susceptibilidade Antimicrobiana;
do ingls European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing

C2CA

Amplificao crculo a crculo; do ingls


circle-to-circle amplification

CCUG

Coleo de Culturas da Universidade de


Gotemburgo (Gotemburgo, Sucia)

CDC

Centros de Controle e Preveno de


Doenas; do ingls Centers for Disease
Control and Prevention (Atlanta,
Gergia, Estados Unidos da Amrica);

CH/CH2

Captura hbrida/captura hbrida II

CIM

Concentrao inibitria mnima

FCE

Fluido cerebroespinal

CIQ

Controle interno da qualidade

FDA

CLSI

Instituto de Padres Clnicos e


Laboratoriais; do ingls Clinical and
Laboratory Standards Institute

Administrao de Alimentos e Drogas


dos Estados Unidos da Amrica; do
ingls United States of America Food
and Drug Administration

CO2

Dixido de carbono

FITC

CQ

Controle de qualidade

Isotiocianato de fluorescena; do ingls


fluorescein isothiocyanate

CSPS

Controle de substncias prejudiciais


sade

FO

Fluido oral

FRET

Transferncia de energia de
ressonncia por fluorescncia; do ingls
fluorescence resonance energy transfer

FTA-Abs

Absoro do anticorpo treponmico


fluorescente; do ingls fluorescent
treponemal antibody absorption

Acelerao da gravidade

GASP

Programa de Vigilncia da
Susceptibilidade Antimicrobiana;
do ingls Gonococcal Antimicrobial
Susceptibility Surveillance Programme

GC

Meio gar base GC

Ct

Ciclo limiar

CV

Carga viral

CV

Coeficiente de variao

CVA

Cofatores vitaminas aminocidos

CVV

Candidase vulvovaginal

DBS

Mancha de sangue seco; do ingls dried


blood spot

DIP

Diagnstico infantil precoce

DMC

DNA metiltransferase
citosina-especfica

Siglas

vii

gG

Glicoprotena G

GKNP

Soluo glicose-potssio-sdio-fosfato

GQ
HBV

LR

Tipos de baixo risco; do ingls low-risk


types

Garantia de qualidade

LSIL

Vrus da hepatite B; do ingls hepatitis


B virus

Leso intraepitelial de baixo grau; do


ingls low-grade intraepithelial lesion

MALDI-TOF

Ionizao e dessoro a laser assistida


por matriz tempo de vo; do ingls
matrix-assisted laser desorption
ionizationtime of flight

MH

Mueller-Hinton

MIF

Microimunofluorescncia

MOMP

Protena principal da membrana


externa; do ingls major outer
membrane protein

MTM

Meio de Thayer-Martin modificado

HCV

Vrus da hepatite C; do ingls hepatitis


C virus

HIV

Vrus da imunodeficincia humana; do


ingls human immunodeficiency virus

HIVDR

HPA

Resistncia do HIV s drogas da terapia


antirretroviral; do ingls HIV drug
resistance
Ensaio de proteo da hibridizao; do
ingls hybridization protection assay

HPV

Papilomavrus humano; do ingls


human papillomavirus

NAAT

Teste de amplificao de cido nucleico;


do ingls nucleic acid amplification test

HR

Tipos de alto risco; do ingls high-risk


types

NAH

HSH

Homens que fazem sexo com homens

HSIL

Leso intraepitelial de alto grau; do


ingls high-grade intraepithelial lesion

Ensaios de hibridizao de cidos


nucleicos no amplificados; do ingls
non-amplified nucleic acid hybridization
assays

NASBA

Amplificao baseada na sequncia de


cido nucleico; do ingls nucleic acid
sequence-based amplification

NCTC

Coleo Nacional de Cultura Tipo;


do ingls National Collection of Type
Cultures

NIBSC

Instituto Nacional de Padres e Controle


Biolgicos; do ingls National Institute
for Biological Standards and Control

HSV

Vrus da herpes simples; do ingls


herpes simplex virus

ICT

Teste imunocromatogrfico; do ingls


immunochromatographic test

IF

Imunofluorescncia

IFA

Ensaio de imunofluorescncia; do ingls


immunofluorescence assay

IgA/IgG/IgM Imunoglobulinas A, G, M

viii

IGD

Infeco gonoccica disseminada

NIC

Neoplasia intraepitelial cervical

IMDM-VGA

Meio de Dulbecco modificado por


Iscove; do ingls Iscoves modified
Dulbecco medium

nvCT

Nova variante de Chlamydia trachomatis

NYC

gar New York City

OMS

Organizao Mundial da Sade

IP

Imunoperoxidase

Pap

Papanicolau

ISO

Organizao Internacional de
Padronizao; do ingls International
Organization for Standardization

PBS

Soluo salina tamponada com fosfato;


do ingls phosphate-buffered saline
solution

KOH

Hidrxido de potssio

PCR

LGV

Linfogranuloma venreo

Reao em cadeia da polimerase; do


ingls polymerase chain reaction

LIA

Imunoensaio em linha; do ingls line


immunoassay

PET

Teste de enzima pr-formada; do ingls


preformed enzyme test

LJ

Grfico de Levey-Jennings

PID

Doena inflamatria plvica; do ingls

LPMN

Leuccitos polimorfonucleares

LPS

Lipopolissacardeo

pelvic inflammatory disease

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

PIP

Prolilaminopeptidase; do ingls
prolyliminopeptidase

POC

Teste point-of-care

POP

Procedimento operacional padro

PR

Regies da protease; do ingls protease


regions

PRR

Papilomatose respiratria recorrente

RCA
RCUT

RHR

TPHA

Ensaio de hemaglutinao para


Treponema pallidum; do ingls
Treponema pallidum haemagglutination
assay

TPPA

Amplificao por crculo rolante; do


ingls rolling circle amplification

Ensaio de aglutinao passiva de


partculas para Treponema pallidum;
do ingls Treponema pallidum passive
particle agglutination assay

TRUST

Teste de utilizao rpida de


carboidrato; do ingls rapid
carbohydrate utilization test

Teste da toluidina vermelha com soro


no aquecido; do ingls toluidine red
unheated serum test

TSB

Caldo triptona de soja; do ingls


trypticase soy broth

UE

Unio Europeia

UFC

Unidades formadoras de colnia

Departamento de Sade Reprodutiva


e Pesquisa; do ingls Department of
Reproductive Health and Research

RNA

cido ribonucleico; do ingls ribonucleic


acid

UG

lcera genital de etiologia sexualmente


transmissvel

RPR

Reagina plasmtica rpida

UK NEQAS

RT

Transcriptase reversa; do ingls reverse


transcriptase

SARA

Artrite reativa adquirida sexualmente;


do ingls sexually acquired reactive
arthritis

Servio Nacional de Avaliao Externa


da Qualidade do Reino Unido; do ingls
United Kingdom National External
Quality Assessment Service

UNAIDS

Amplificao por deslocamento de


cadeia; do ingls strand displacement
amplification

Programa Conjunto das Naes Unidas


sobre HIV/AIDS; do ingls Joint United
Nations Programme on HIV/AIDS

UNG

Uretrite no gonoccica

UNGNC

UNG no clamidial

SDC

Sensibilidade dicotmica calibrada

VB

Vaginose bacteriana

SGQ

Sistema de gesto de qualidade

VDRL

SNP

Polimorfismo de nucleotdeo simples; do


ingls single nucleotide polymorphism

Laboratrio de Pesquisa de Doenas


Venreas; do ingls Venereal Disease
Research Laboratory

SPG

Sacarose-fosfato-glutamato

VPN

Valor preditivo negativo

spp.

Espcies

VPP

Valor preditivo positivo

TARV

Terapia antirretroviral

WB

Western blot

TC

Captura de alvo; do ingls target capture

WR

TDR/OMS

Programa Especial para Pesquisa e


Treinamento em Doenas Tropicais
da OMS; do ingls WHO Special
Programme for Research and Training in
Tropical Diseases

Reao de Wasseman; do ingls


Wasserman reaction

TMA

Amplificao mediada por transcrio;


do ingls transcription-mediated
amplification

TOC

Teste de cura; do ingls test-of-cure

SDA

Siglas

ix

Prefcio
As doenas sexualmente transmissveis (DST), incluindo aquelas causadas pelos vrus da imunodeficincia humana
tipos 1 e 2, permanecem como uma rea de importante foco para a sade pblica. Isso se deve alta morbidade
associada s DST, tais como as sequelas de infeces no trato reprodutivo, cncer cervical, sfilis congnita,
gravidez ectpica e infertilidade, assim como a morbidade de doenas relacionadas ao HIV e morte pela sndrome da
imunodeficincia adquirida (AIDS). As estratgias de sade pblica para o controle das DST incluem a promoo de um
comportamento sexual mais seguro e oferta de preservativos (preveno primria), assim como o gerenciamento eficaz
e precoce de pacientes com DST, usando tanto abordagens de gesto sindrmica quanto etiolgicas.
Na abordagem de gesto sindrmica, o gerenciamento fsica e economicamente acessvel e eficiente de indivduos
portadores de DST baseia-se na utilizao de fluxogramas (algoritmos) para cada DST. Os fluxogramas permitem o
diagnstico de DST comuns, a oferta de tratamentos atuais e apropriados para cada pas, o aconselhamento na gesto
de parceiros sexuais e a nfase na importncia dos testes para HIV no mesmo dia da visita ao profissional de sade.
Os fluxogramas devem ser baseados na etiologia local e os dados de susceptibilidade antimicrobiana obtidos por
meio de pesquisas laboratoriais peridicas. Em geral, os testes de laboratrio no so realizados para a maioria dos
pacientes com DST que recebem gesto sindrmica. No entanto, pode ser apropriado coletar espcimes para exames
laboratoriais dos pacientes que no responderam s terapias de primeira gerao, para definir o diagnstico e/ou
determinar se a falha do tratamento se deve a resistncia antimicrobiana. Nos pases que podem custear a abordagem
do diagnstico etiolgico, os exames laboratoriais desenvolvem um papel muito maior em termos de diagnstico
de patgenos de DST especficos e determinao de susceptibilidade antimicrobiana. Os laboratrios tambm
desempenham um papel-chave na vigilncia das DST e nos programas de pesquisa tanto em naes com menos
recursos quanto naquelas mais ricas.
A Organizao Mundial da Sade publicou uma verso anterior deste manual, intitulada Diagnstico laboratorial de
doenas sexualmente transmissveis, em 1999, com o objetivo de oferecer um guia completo de procedimentos-padro
para isolar, detectar e diagnosticar as DST por microbiologistas e tecnlogos mdicos. O guia foi concebido como um
manual de bancada, sintonizado com as necessidades e capacidades dos laboratrios nos diferentes nveis do sistema
de sade. O manual, subsequentemente, mostrou-se muito popular tanto em laboratrios nacionais como particulares.
Desde a publicao do manual de 1999, houve uma srie de avanos fundamentais nos procedimentos de diagnstico,
em especial no que se refere amplificao de cido nucleico e testes rpidos, assim como as metodologias e
recomendaes dos testes de susceptibilidade antimicrobiana. Um conjunto de especialistas internacionais atualizaram
extensivamente os captulos do manual de 1999. Alm disso, a verso revisada inclui novos captulos abordando
uma srie de tpicos, a exemplo das tcnicas de diagnstico de Mycoplasma genitalium, os testes rpidos para
DST e gesto da qualidade de laboratrios. Embora este manual atualizado aborde os mais importantes patgenos
causadores de DST, ele no deve ser visto como completo, cabendo ao leitor consultar outras fontes de referncia
para maiores informaes, por exemplo, no que diz respeito s polticas nacionais dirigidas s DST, guias para teste de
susceptibilidade microbiana, questes mdico-legais e testes de DST em menores.
Este novo manual, Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da
imunodeficincia humana, fornece o conhecimento bsico sobre os princpios dos testes laboratoriais no contexto das
abordagens de triagem e diagnstico, assim como o teste de susceptibilidade antimicrobiana, como componentes do
controle das DST. Assim como na publicao de 1999, este manual trata de cada doena em um captulo separado,
fornecendo informao detalhada quanto coleta, transporte e testagem laboratorial de espcimes. Dois anexos teis,
abordando equipamentos, testes, meios, reagentes e corantes, encontram-se no final do manual.

Prefcio

xi

Prev-se que o manual atualizado ser informativo para administradores, gerentes de programas, equipes de mdicos
e enfermeiros, assim como para o pblico-alvo primrio, que continua sendo formado pelos microbiologistas e
tecnlogos mdicos. O manual deve constituir uma ferramenta til para auxiliar na escolha dos testes diagnsticos
mais apropriados no cenrio individual, idealmente por meio de comits nacionais e/ou locais de especialistas
em aconselhamento. O manual tambm uma fonte valiosa de informaes para estudantes e estagirios, tanto
dentro quanto fora do ambiente de laboratrio. Finalmente, prev-se que a ampliao de produtos e metodologias
de diagnstico continuar nos prximos anos e, dessa forma, ser importante para todos os leitores manterem-se
atualizados quanto aos progressos mais recentes no campo.

xii

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Agradecimentos
O Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana, foi
revisado utilizando a estrutura testada e comprovada do manual de 1999, criada por Eddy Van Dyck, do Instituto de
Medicina Tropical, Anturpia, Blgica; Andr Z. Meheus, da Universidade de Anturpia, Blgica; e Peter Piot, DiretorExecutivo do Programa Conjunto das Naes Unidas sobre HIV/AIDS (UNAIDS). O Departamento de Sade Reprodutiva e
Pesquisa (RHR), da Organizao Mundial da Sade (OMS) em Genebra, Sua, reconhece e expressa sua gratido para
com a viso desses autores e agradece-lhes a permisso para atualizar o manual, a fim de garantir que este mantenha
sua relevncia global, incorporando a ele novas tecnologias e mtodos de diagnstico.
Especialistas experientes e qualificados em diferentes reas da medicina diagnstica atualizaram o documento
para garantir que a diversidade de mtodos disponveis para o diagnstico das doenas sexualmente transmissveis
(DST) estivesse nele representada, tornando-o o mais atual possvel nessa rea da medicina, que est em constante
mutao. A OMS/RHR gostaria de agradecer a diversos especialistas e suas instituies pela dedicao e entusiasmo,
que garantiram a alta qualidade e a perspectiva global deste documento no que diz respeito ao diagnstico das DST.
Agradecimentos sinceros so dirigidos a Yaw Adu-Sarkodie, Manju Bala, Ronald Ballard, Alan Herring, Edward W. Hook
III, Catherine Ison, David Mabey, Rosanna Peeling e Magnus Unemo, que revisaram o manual de 1999 e determinaram
as sees que necessitavam de mudanas e atualizaes, alm de identificar os novos captulos a ser adicionados. O
grupo tambm props uma lista de possveis autores para a reviso dos captulos existentes e a elaborao dos novos
captulos, e indicaram alguns dos possveis revisores desses contedos.
A OMS/RHR gostaria de agradecer aos seguintes autores, que revisaram a primeira verso dos captulos e continuaram
o trabalho para sua finalizao: Manju Bala, Ronald Ballard, Laurent Blec, Fatim Cham, Jo-Anne Dillon, Suzanne
Garland, Edward W. Hook III, Catherine Ison, David Lewis, Bharat Parekh, Rosanna Peeling, Ye Tun, Magnus Unemo e
Barbara Van Der Pol. Os seguintes funcionrios do Departamento da OMS forneceram informaes e orientaes para
a finalizao do manual: Nathalie Broutet, Lori Newman e Igor Toskin. Francis Ndowa liderou o processo de reviso do
manual.
A OMS/RHR tambm reconhece e agradece aos autores remanescentes: Cheng Y. Chen, Dennis Ellenberger, Jrgen
Skov Jensen, John Nkengasong, Stefania Starnino, Larry Westerman e Chunfu Yang pelo grande esforo e tempo
empregados para garantir que a qualidade dos captulos fosse a mais alta possvel.
A OMS/RHR grata s seguintes pessoas por concordarem em revisar os captulos relacionados aos seus respectivos
campos de especializao: Rajesh Bhatia, Xiang-Sheng Chen, Charlotte Gaydos, Monica Lahra, Jrme Le Goff, Jeanne
Marrazzo, Allan Ronald e Patricia Totten.
A OMS/RHR tambm reconhece a dedicao de Fatim Cham, que conferiu os comentrios dos revisores, compilou os
captulos e garantiu a harmonizao entre os diferentes captulos e anexos.
A OMS/RHR agradece a assistncia fornecida pelos Centros de Controle e Preveno de Doenas (CDC), em Atlanta,
Gergia, pela edio das cpias da verso final do manual e o auxlio da equipe da Green Ink, Reino Unido, pelo design,
layout e reviso.

Agradecimentos

xiii

Captulo 1
Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis
1.1 Introduo
Mais de 30 bactrias, vrus e patgenos parasitas
so transmitidos sexualmente e constituem um grupo
de infeces denominadas doenas sexualmente
transmissveis (DST). Embora alguns patgenos possam
ser adquiridos por meio de outras rotas de transmisso
que no a sexual, epidemiologicamente o contato sexual
mais importante para a sua transmisso de uma
pessoa para a outra (Tabela 1.1).
Os testes laboratoriais e os testes rpidos (TR) ou
point-of-care (POC) so instrumentos potencialmente
poderosos para a gesto e controle das DST, por
facilitarem a preveno da transmisso das DST e
suas sequelas. O alto nmero de DST, assim como a
variedade dos possveis testes para cada DST tornam
difcil a escolha do teste de diagnstico apropriado. No
momento, uma ampla variedade de testes disponveis
para as DST apresentam atributos e possveis limitaes
que podem influenciar sua aplicao, a fim de aumentar
o controle das DST. Alm disso, em uma era de recursos
limitados, a deciso sobre em quais e em quantas DST
se deve investir para a realizao de testes, quem deve
ser testado e quais dos mltiplos testes disponveis
devem ser utilizados para um determinado propsito
pode ser difcil. A seleo do teste deve refletir um
processo de priorizao que considera a prevalncia
da infeco, o impacto e complicao das infeces
nos indivduos e populaes, as caractersticas de
desempenho do teste, os custos do teste e a razo pelo
qual o teste est sendo realizado.
Os testes para DST podem ser utilizados para uma
variedade de diferentes propsitos que, por sua vez,
podem afetar a escolha do teste. Essas diferentes
razes para testagem incluem fins de vigilncia,
validao de algoritmos de gesto sindrmica, garantia
de qualidade (GQ), diagnstico de pessoas com sinais
ou sintomas de possveis DST, triagem de pessoas
de risco assintomticas, e testes de susceptibilidade

antimicrobiana. Alguns elementos-chave para esses


termos esto descritos a seguir:
Vigilncia. Vigilncia a coleta sistemtica,
agrupamento e anlise de dados que determinam a
frequncia de uma infeco em uma comunidade ou
populao. um elemento essencial de planejamento
para o controle das DST. Investimentos em vigilncia
para infeces com baixo impacto direto na sade
pblica no devem ser altamente priorizados se os
recursos so limitados, se a infeco for incomum
(por exemplo, cancro mole, especialmente em
naes desenvolvidas) ou se estiver associada a uma
baixa morbidade (por exemplo, piolhos pubianos).
Geralmente, o tempo necessrio para a obteno do
resultado de um teste com propsito de vigilncia
no um fator crtico. Em alguns casos, o espcime
coletado para vigilncia tambm pode ser utilizado
para o monitoramento de outros fatores clinicamente
importantes, como a resistncia antimicrobiana (por
exemplo, na Neisseria gonorrhoeae).
Validao da gesto sindrmica. O diagnstico
sindrmico um elemento til para o controle de
DST, oferecendo uma avaliao rpida quanto ao
diagnstico, a qual pode ser utilizada para guiar a
terapia oportuna de pessoas com sinais ou sintomas
de uma infeco. Em lugares em que o diagnstico
sindrmico representa um elemento importante para
a gesto das DST, o teste laboratorial peridico de
pacientes diagnosticados e tratados utilizando os
algoritmos de gesto sindrmica para DST deve ser
realizado para garantir que o diagnstico sindrmico
esteja conseguindo identificar as infeces que
so alvos de interveno. Em situaes em que o
diagnstico sindrmico no esteja resultando no
tratamento de sua DST-alvo, necessrio haver
empenho para avaliar as razes do fracasso. As
informaes adquiridas por meio do uso peridico de
testes para avaliar a qualidade dos servios clnicos

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis

podem ser usadas como uma forma de melhorar o


tratamento do paciente.
Garantia/melhoria da qualidade. A grande rea
da GQ inclui tanto o controle de qualidade, para
assegurar que os testes estejam sendo realizados
conforme o esperado, quanto a avaliao da
qualidade, para garantir que os testes sejam
utilizados adequadamente e que todas as etapas
necessrias gesto dos pacientes sejam seguidas
de forma correta. A preciso dos testes de DST pode
ser impactada por muitos fatores, incluindo a variao
nos reagentes, o funcionamento dos equipamentos e
a proficincia tcnica. Como resultado, recomenda-se
a realizao de testes peridicos de espcimespadro para avaliar a proficincia laboratorial e
garantir a preciso esperada do teste. Espcimespadro podem ser obtidos a partir de organizaes
certificadas, ou ento ser gerados no prprio
laboratrio. A avaliao de espcimes-padro pode
identificar a necessidade de novo treinamento ou
de uma avaliao da qualidade dos componentes
individuais do teste laboratorial.
Diagnstico. Os sintomas das DST comuns tendem
a ser no especficos e, tipicamente, apresentam
uma variedade de possveis agentes causadores
que podem requerer diferentes tratamentos. Como
resultado, os testes de diagnstico so teis tanto
para a obteno de um diagnstico preciso quanto
para guiar a gesto de parceiros sexuais, assim
como a GQ de algoritmos de gesto sindrmica,
como notado acima. Quando os testes so usados
para diagnstico, o tempo necessrio para a
disponibilizao dos resultados a fim de guiar a
gesto deve ser considerado para a escolha do

teste, uma vez que as pessoas infectadas podem


transmitir a doena para outros, sofrer complicaes
na infeco ou abandonar o acompanhamento
no intervalo entre a testagem e a notificao
do resultado do teste (1, 2). Quando o teste de
diagnstico realizado como parte dos servios
clnicos, pode ser til monitorar o intervalo entre a
testagem e o tratamento das pessoas com testes
positivos, como uma medida de qualidade de
atendimento.
Triagem. A triagem um elemento essencial para
uma gesto tima das DST e para a elaborao de
estratgias de controle baseadas nas contribuies
da gesto sindrmica e dos testes de diagnstico.
Todas as DST podem ocorrer de forma assintomtica
ou no ser reconhecidas pela pessoa infectada.
Apesar da ausncia de sintomas identificados, as
pessoas com infeces assintomticas podem
estar em risco de transmisso para outros e de
complicaes da infeco. Como resultado, a triagem
(isto , o teste de pessoas em alto risco sem sinais
ou sintomas reconhecidos) ir identificar as pessoas
infectadas, reduzindo, desse modo, o risco de
complicaes ou de transmisso de infeces. Assim
como no teste de diagnstico, o intervalo de tempo
entre o teste e o incio do tratamento, bem como a
proporo de pessoas recebendo o tratamento, caso
alguns indivduos abandonem o acompanhamento,
so medidas teis de qualidade. A triagem por DST
pode ser mais eficiente em termos de custo quando
puder ser direcionada a subgrupos de populaes
de alto risco; normalmente, esse direcionamento
melhor realizado utilizando-se dados de vigilncia.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas
Patgeno

Manifestaes clnicas e outras doenas associadas

Infeces bacterianas
Neisseria gonorrhoeae

GONORREIA
Homens: corrimento uretral (uretrite), epididimite, orquite, infertilidade
Mulheres: cervicite, endometrite, salpingite, doena inflamatria plvica,
infertilidade, ruptura prematura de membranas, perihepatite; comumente
assintomtica

Chlamydia trachomatis

INFECO CLAMIDIAL
Homens: corrimento uretral (uretrite), epididimite, orquite, infertilidade
Mulheres: cervicite, endometrite, salpingite, doena inflamatria plvica,
infertilidade, ruptura prematura de membranas, perihepatite; comumente
assintomtica
Ambos os sexos: proctite, faringite, sndrome de Reiter
Recm-nascidos: conjuntivite, pneumonia

Chlamydia trachomatis
(sorotipos L1L3)

Treponema pallidum

Haemophilus ducreyi

Klebsiella (Calymmatobacterium)
granulomatis

Mycoplasma genitalium

LINFOGRANULOMA VENREO
Ambos os sexos: lcera, inchao inguinal (bubo), proctite
SFILIS
Ambos os sexos: lcera primria (cancro) com adenopatia local, erupes na
pele, condiloma lata; danos sseos, cardiovasculares e neurolgicos
Mulheres: perda da gravidez (aborto, natimorto), parto prematuro
Recm-nascidos: natimorto, sfilis congnita
CANCRO MOLE
Ambos os sexos: lceras genitais doloridas; podem ser acompanhadas por
bubo
DONOVANOSE (GRANULOMA INGUINAL)
Ambos os sexos: inchaos nodulares e leses ulcerativas das reas inguinal
e anogenital
Homens: corrimento uretral (uretrite no gonoccica)
Mulheres: cervicite, endometrite, provvel doena inflamatria plvica
Homens: corrimento uretral (uretrite no gonoccica)
Mulheres: cervicite, endometrite, provvel doena inflamatria plvica

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis

Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas (continuao)
Patgeno

Manifestaes clnicas e outras doenas associadas

Infeces virais
Vrus da imunodeficincia humana
(HIV)

Sndrome da imunodeficincia adquirida (AIDS)


Ambos os sexos: doenas relacionadas ao HIV, AIDS

Vrus da herpes simples tipo 2


HERPES GENITAL
Vrus da herpes simples tipo 1 (menos Ambos os sexos: leses vesiculares anogenitais e ulceraes
comum)
Recm-nascidos: herpes neonatal (frequentemente fatal)

Papilomavrus humano

Vrus da hepatite B

Citomegalovrus

Vrus do molusco

VERRUGAS GENITAIS
Homens: verrugas penianas e anais; carcinoma no pnis
Mulheres: verrugas vulval, anal e cervical; carcinoma cervical, carcinoma
vulval, carcinoma anal
Recm-nascidos: papiloma de laringe
HEPATITE VIRAL
Ambos os sexos: hepatite aguda, cirrose heptica, cncer de fgado
INFECO POR CITOMEGALOVRUS
Ambos os sexos: febre subclnica ou no especfica, inchao difuso no
linfonodo, doenas hepticas, etc.
MOLUSCO CONTAGIOSO
Ambos os sexos: ndulos firmes e umbilicados na pele, genitais ou
generalizados

SARCOMA DE KAPOSI
Herpesvrus associado ao sarcoma de
Ambos os sexos: tipo de cncer agressivo em pessoas imunossuprimidas
Kaposi (herpesvrus humano tipo 8)
Infeces por protozorios

Trichomonas vaginalis

TRICOMONASE
Homens: Corrimento uretral (uretrite no gonoccica); frequentemente
assintomtico
Mulheres: vaginose com corrimento vaginal abundante e espumoso,
nascimento prematuro, bebs de baixo peso ao nascer
Recm-nascidos: baixo peso ao nascer

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas (continuao)
Patgeno

Manifestaes clnicas e outras doenas associadas

Infeces por fungos

Candida albicans

CANDIDASE
Homens: infeco superficial na glande do pnis
Mulheres: vulvo-vaginite com secreo vaginal espessa e aspecto de
coalhada, prurido ou queimao vulvar

Infeces parasitrias
Phthirus pubis
Sarcoptes scabiei

INFESTAES POR PIOLHOS PUBIANOS


SARNA

Determinao de susceptibilidade
antimicrobiana. Para algumas DST (vale
ressaltar como exemplo a N. gonorrhoeae),
o desenvolvimento continuado de resistncia
tem levado, periodicamente, a mudanas na
terapia recomendada. A vigilncia sistemtica
da susceptibilidade antimicrobiana e/ou o teste
de isolados especficos para a susceptibilidade a
agentes antimicrobianos utilizados em terapias
fornecem informaes que podem ser usadas para
ajustar as recomendaes de tratamento de forma
antecipada, preferencialmente antes que a falha
teraputica se torne um problema. A determinao
da susceptibilidade antimicrobiana melhor realizada
em isolados clnicos vivos de culturas de organismos
e tipicamente melhor utilizada para guiar terapias
recomendadas populao do que para a gesto
individual de pacientes. Na maioria das vezes, a
vigilncia da resistncia antimicrobiana melhor
conduzida por laboratrios de referncia, utilizando
espcimes coletados a partir de um espectro de
localidades geograficamente representativo e de
populaes de interesse.

1.2 Tipos de testes de diagnstico


O progresso cientfico tem fornecido uma ampla
gama de testes para a identificao das DST. Esses
testes apresentam grande variedade no seu nvel de
complexidade (isto , os requisitos tcnicos para um
timo desempenho do teste), nos custos necessrios
para realiz-los (tanto materiais como em relao a mo
de obra) e em termos de desempenho. Dessa forma,

cada tipo de teste de diagnstico tem suas vantagens e


desvantagens. Como resultado, em alguns contextos, o
teste mais preciso pode no ser o mais adequado, caso
seja to oneroso que no possa ser realizado em um
grande nmero de pessoas em risco, ou to complexo
que os resultados no estaro disponveis a tempo para
guiar a gesto de pacientes. Finalmente, em alguns
casos, os testes laboratoriais para DST esto disponveis
em uma variedade de formas e plataformas, o que
influencia o nmero de testes que podem ser realizados
em um determinado intervalo de tempo. Desse modo, o
rendimento do teste (o nmero de testes completados
em um determinado intervalo de tempo) tambm
considerado na seleo de testes. Em alguns contextos,
volumes maiores ou menores de testagem tornam alguns
testes ou plataformas preferveis.
Em geral, os testes de diagnstico podem ser separados
em pelo menos trs tipos. Primeiro, a deteco direta
de microrganismos a finalidade mais bvia para o
diagnstico das DST. Pode ser realizada por meio de
microscopia e colorao apropriada ou preparao a
fresco para a visualizao de patgenos. A cultura, a
deteco de antgeno ou a deteco de cido nucleico,
por meio da amplificao ou no, so frequentemente
mais sensveis que a microscopia. No entanto, podem
implicar necessidades tcnicas mais complexas para um
timo desempenho do teste, o que aumenta o intervalo
entre a coleta do material e a disponibilidade dos
resultados do teste (o teste rpido ajuda a superar essa
ltima possvel limitao). Cada uma dessas abordagens
apresenta suas prprias vantagens e desvantagens.
A microscopia, principalmente quando realizada

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis

na presena do paciente, pode fornecer resultados


imediatos para auxiliar nas decises de gesto,
mas, como outros testes, necessita equipamentos
especializados (como microscpios), eletricidade ou
procedimentos especiais de colorao, alm de depender
do treinamento e experincia do microscopista.
Em contraste, outros testes laboratoriais, como a cultura
ou a amplificao de cido nucleico, podem necessitar
mtodos especiais para o transporte do espcime e
equipamentos e procedimentos especializados para
um timo desempenho, atrasando, dessa forma,
a disponibilidade dos resultados para a tomada de
decises imediatas.
Em segundo lugar, para muitas DST importantes (a sfilis
e o HIV representam exemplos comuns), a deteco
da resposta do hospedeiro para a infeco (anticorpos)
representa um teste de diagnstico mais favorvel. A
vantagem dos testes sorolgicos que eles podem
ser teis no s para o propsito de diagnstico, mas
tambm para a vigilncia. Todos os testes sorolgicos
apresentam resultados falso-positivos ocasionais. O
problema dos testes sorolgicos falso-positivos pode
frequentemente ser reduzido por meio de um segundo
teste sorolgico confirmatrio, o qual tem como alvo um
antgeno diferente do teste sorolgico inicial de triagem
(o uso de teste confirmatrio discutido em maiores
detalhes na seo de testes sorolgicos para sfilis e
HIV). Alguns testes sorolgicos podem ser capazes de
diferenciar infeces adquiridas recentemente daquelas
mais antigas ou previamente tratadas por meio da
deteco da imunoglobulina M (IgM) para infeces
recentes. Uma deficincia do diagnstico sorolgico
que os anticorpos para um patgeno causador
de DST podem persistir por um longo perodo aps
um tratamento bem-sucedido. Dessa forma, o teste
sorolgico de populaes pode ser uma indicao do
total cumulativo de infeces, em vez do nmero de
infeces adquiridas mais recentemente.
Em terceiro lugar, existem os testes que detectam
metablitos microbianos, como materiais que alteram
o pH das secrees genitais e aminas biognicas. Em
certos contextos, esses testes so teis para o propsito
de diagnstico. Um exemplo disso a importncia

do teste de pH ou sopro/amina para o diagnstico de


vaginose bacteriana.

1.3 Desempenho do teste


Em ltima anlise, o valor dos testes para a deteco
das DST tambm depende muito do seu desempenho
(Tabela 1.2). Como medidas do desempenho, os
clculos da sensibilidade e da especificidade (3) desde
que realizados com base em um tamanho amostral
suficientemente grande representam estimativas
confiveis do desempenho geral dos testes. No entanto,
os valores preditivos (tanto positivo como negativo)
desses testes podem variar substancialmente de
populao para populao, dependendo da prevalncia
da infeco na comunidade.
Assim, os testes que apresentam taxas substanciais de
falso-positivos e os testes para infeces relativamente
incomuns (isto , de baixa prevalncia) podem
apresentar um valor preditivo positivo baixo, mesmo
havendo alta sensibilidade para a deteco da infeco.
Em geral, a literatura cientfica revisada por especialistas
fornece estimativas confiveis de testes de sensibilidade
e especificidade. No entanto, para qualquer situao
especfica, a prevalncia local da doena ir determinar
parcialmente o valor preditivo dos testes laboratoriais.
Assim, a vigilncia para determinar a prevalncia local
da doena fornece dados importantes para a escolha do
teste para DST.

1.4 Tipos de laboratrios e funes


Embora o mtodo tradicional para o diagnstico de DST
se constitua em anlises laboratoriais para determinar
os agentes etiolgicos, nem todos os testes precisam
ser realizados em todos os laboratrios, para todos os
propsitos. O diagnstico laboratorial de DST tende a
ser dispendioso em termos de equipamento, reagentes,
infraestrutura e manuteno. Ainda mais importante,
especialmente em lugares com recursos limitados,
as amostras da maioria dos pacientes com DST so
processadas em locais sem instalaes laboratoriais
(2). Para adequao s situaes em que no se dispe
de instalaes laboratoriais, a Organizao Mundial da
Sade desenvolveu guias sobre o uso da abordagem
sindrmica para a gesto de algumas DST e defende seu
uso desde meados da dcada de 80, aps avaliaes de

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

campo sobre o seu desempenho (3). Subsequentemente,


uma srie de estudos de campo mostraram que a
abordagem sindrmica funciona bem no tratamento de
homens com corrimento uretral sintomtico e na gesto
de homens e mulheres com lcera genital bacteriana (4,
5). No entanto, esse no o caso para o diagnstico e
gesto de infeces cervicais por N. gonorrhoeae ou C.
trachomatis, exceto nos casos em que o exame mostra
mucopus, eroses e friabilidade cervicais, ou quando h
um histrico de sangramento entre as menstruaes e
durante a relao sexual (6). No entanto, o diagnstico
sindrmico acompanhado de tratamento tem a vantagem
de proporcionar cuidados imediatos ao paciente na sua
primeira procura por avaliao, alm de ser de baixo
custo no h incidncia de custos laboratoriais diretos
sobre o paciente, o prestador de servio ou o Estado.
O uso da abordagem sindrmica tambm permite a
padronizao do diagnstico e tratamento e a elaborao
de relatrios em um ambiente ou situao em particular.
Os pacientes com suspeita de DST podem ser
direcionados a instituies de ateno primria sade,
clnicas de planejamento familiar, mdicos particulares
e s prprias clnicas especializadas em DST (7 ).

Inevitavelmente, porm, a abordagem sindrmica tem


o potencial de superdiagnosticar e tratar pacientes que
possam no estar infectados com qualquer ou algum dos
organismos presumidos como causadores da sndrome
em questo (8).
Dessa forma, para apoiar a abordagem sindrmica
voltada ao diagnstico, os laboratrios clnicos locais
devem ser incentivados a realizar os testes necessrios
para facilitar a gesto clnica de pessoas com DST ou em
risco para esses agravos. Em alguns lugares em que o
transporte de espcime no representa um problema, a
economia de escala torna o processamento do espcime
em laboratrios centrais to rpido quanto e mais
eficiente do que quando realizado em stios locais. Nem
todos os laboratrios precisam realizar as atividades
do laboratrio central, como o teste de susceptibilidade
antimicrobiana.
Os sistemas de laboratrio podem ser arbitrariamente
categorizados em trs nveis, com base nos nveis
dos servios de cuidado e tratamento inerentes a
cada categoria. Entretanto, deve-se ter em mente
que a infraestrutura laboratorial e as capacidades de

Tabela 1.2: Efeito da sensibilidade, especificidade e prevalncia no valor preditivo positivo, usando somente o
teste primrio ou, adicionalmente, o teste suplementar
Prevalncia na populao = 1%
A

Sensibilidade/especificidade do
teste primrio

99%/99%

99%/99,9%

99%/99%

99,5%/99,5%

99,5%/99,5%

Sensibilidade/especificidade do
teste suplementar/confirmatrio

ND

ND

99%/99%

ND

99,5%/99,5%

1000

1000

11

1000

15

Nmero total

980

989

985

Negativos verdadeiros

980

989

985

Total

20

11

10

15

10

Positivos verdadeiros

10

10

10

10

10

Falso-positivos

10

Valor preditivo positivo (VPP)

50%

91%

100%

67%

100%

Nmero testado
Negativos

Falso-negativos
Positivos

ND: no determinado.

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis

diagnstico podem variar imensamente entre os pases


com recursos limitados e aqueles industrializados.
Considere as seguintes categorias como um guia geral:
1. Laboratrios perifricos que apoiam o nvel
de servio de sade primrio, apresentando
equipamentos laboratoriais limitados e equipe
de laboratrio minimamente treinada. Esses
laboratrios so projetados para fornecer
diagnstico rpido de DST no prprio local.
2. Laboratrios de nvel intermedirio, que do suporte
aos laboratrios do servio de sade primria e
clnicas e hospitais de nvel intermedirio.
3. Laboratrios centrais que apoiam as clnicas de
sade tercirias, incluindo as clnicas de referncia
especializadas em DST, assim como clnicas e
laboratrios de cuidado sade de menor nvel.
Embora os testes rpidos possam carecer de
sensibilidade, normalmente apresentam boa
especificidade e podem oferecer uma economia na
gesto de algumas condies, como corrimento vaginal,
no nvel de cuidados de sade perifricos.
Este manual descreve testes abrangendo desde a
abordagem bsica econmica at os procedimentos mais
sofisticados e de alto custo. Os gestores de programas
e os especialistas de laboratrios, em colaborao com
os agentes polticos, devem determinar a viabilidade e
utilidade da incorporao dos testes em diferentes nveis
de centros de sade. A escolha tambm depender das
abordagens usadas pelos diferentes nveis de centros de
sade: a abordagem sindrmica (bsica ou modificada),
a abordagem etiolgica, ou ambas.

1.5 Sintetizando
No existe um nico teste ideal para a deteco de
agentes causadores de DST. Para uma tomada de
deciso programtica, as vrias DST e as populaes
impactadas devem ser consideradas como uma matriz
para definir no somente qual teste laboratorial o mais
apropriado para a comunidade em questo, mas tambm
qual a proporo do total de recursos disponveis
(oramento, pessoal, etc.) deve ser alocada para cada
DST a ser testada (Tabela 1.3).

As decises quanto escolha de testes devem ser


conduzidas no contexto da prevalncia da infeco
em questo, do impacto da infeco na comunidade,
dos recursos disponveis para apoiar a testagem e
tratamento e da priorizao da infeco em relao a
outras DST. Alm disso, fatores como a complexidade,
o tempo para obter o resultado do teste e os custos so
consideraes essenciais para a escolha dos testes
de diagnstico. Modelos matemticos demonstraram
claramente que em situaes e ambientes nos quais
os resultados so disponibilizados no momento
da avaliao inicial do paciente e onde h atraso
no tratamento, quando o mesmo no iniciado
no momento da avaliao, testes menos sensveis
oferecidos nas unidades de sade podem de fato
aumentar o nmero de pessoas tratadas e reduzir as
complicaes das infeces quando comparados a
testes mais sensveis, que necessitam de mais tempo
para gerarem o resultado (2).
Tabela 1.3: Possveis fatores que influenciam a
escolha dos testes para DST
1. Finalidade do teste
Vigilncia
Garantia de qualidade
Avaliao do diagnstico sindrmico
Diagnstico
Triagem
Teste de susceptibilidade antimicrobiana
2. Consideraes especficas em relao ao teste
Desempenho (sensibilidade, especificidade, valor
preditivo)
Coleta de espcime e necessidades de transporte
Prevalncia
Morbidade associada
Recursos
Finanas
Pessoal
Infraestrutura (servios, etc.)
Importncia relativa em relao a outras prioridades

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

1.6 Referncias
1. Geisler WM et al. The natural history of
untreated Chlamydia trachomatis infection in
the interval between screening and returning for
treatment. Sexually Transmitted Diseases, 2008,
35(2):119123.
2. Gift TL et al. The rapid test paradox: when fewer
cases detected lead to more cases treated:
a decision analysis of tests for Chlamydia
trachomatis. Sexually Transmitted Diseases, 1999,
26(4):232240.
3. Kuypers J, Gaydos CA, Peeling RW. Principles of
laboratory diagnosis of STIs. In: Holmes KK et al.,
eds. Sexually transmitted diseases, 4th ed. Nova
York, McGraw-Hill Medical, 2008:937958.
4. Adler MW et al. Sexual health and care: sexually
transmitted infections: guidelines for prevention and
treatment. [Occasional paper]. Londres, ODA, 1996
5.

Management of patients with sexually transmitted


diseases. Genebra, Organizao Mundial da Sade,
1991 (WHO Technical Report Series No. 810).

6. Alary M et al. Evaluation of clinical algorithms


for the diagnosis of gonococcal and chlamydial
infections among men with urethral discharge or
dysuria and women with vaginal discharge in Benin.
Sexually Transmitted Infections, 1998, 74(Suppl.
1):S4449.
7. Moherdaui F et al. Validation of national algorithms
for the diagnosis of sexually transmitted diseases
in Brazil: results from a multicentre study. Sexually
Transmitted Infections, 1998, 74(Suppl. 1):S3843.
8. Vuylsteke B. Current status of syndromic
management of sexually transmitted infections
in developing countries. Sexually Transmitted
Infections, 2004, 80(5):333334.

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis

10

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 2
Gesto de qualidade no laboratrio
2.1 Introduo
A finalidade de um sistema de qualidade garantir que
todos os laudos emitidos por laboratrios e utilizados
para a gesto de pacientes sejam de alta qualidade. Para
manter um servio de alta qualidade, os laboratrios
devem investir em um programa de melhoria de
qualidade e se credenciarem junto a um organismo
nacional ou internacional idneo, como a Organizao
Internacional de Padronizao (ISO, do ingls
International Organization for Standardization; www.iso.
org). A certificao envolve uma auditoria externa sobre
a capacidade do laboratrio de fornecer um servio de
alta qualidade, por meio da definio de uma prtica
padro, a qual confirmada por uma reviso realizada
por especialistas. Entretanto, isso no inclui a avaliao
do grau de adequao do teste para o diagnstico de

uma infeco em particular ou para a populao a ser


testada (ver Captulo 1).
Para uma compreenso comum partilhada, a Tabela 2.1
define os termos utilizados nesse captulo.
A certificao um procedimento que demanda tempo
e altos custos e no pode ser realizada por muitos
laboratrios, mas todos os laboratrios deveriam
trabalhar no sentido de melhorar qualquer procedimento
que afete a preciso da informao que orienta a gesto
de pacientes. Em vrias partes do mundo, tm sido
desenvolvidos mecanismos para fortalecer os sistemas
laboratoriais por meio da implementao de melhorias
realizadas passo a passo, de acordo com uma lista de
verificao (1-5).

Tabela 2.1: Definio de termos-chave utilizados no captulo de gesto de qualidade


Certificao

Auditoria externa dos procedimentos do laboratrio, que contribui para a qualidade do laudo.

Sistema de gesto Estrutura para uma abordagem sistemtica para a gesto da qualidade dos procedimentos
de qualidade (SGQ) laboratoriais.
Garantia de
qualidade (GQ)

Processo sistemtico para garantir o cumprimento dos requisitos de qualidade para um produto
ou servio.

Documento contendo a descrio detalhada dos procedimentos individuais para cada protocolo
Procedimento
ou teste usado no laboratrio. A finalidade de um POP garantir que as operaes sejam
operacional padro
realizadas corretamente e sempre da mesma forma. Um POP deve estar sempre disponvel no
(POP)
laboratrio.
Avaliao interna
da qualidade (AIQ)

Realizada por meio do reenvio e testagem de amostras clnicas annimas selecionadas


randomicamente no mesmo laboratrio para garantir a reprodutibilidade dos resultados.

Avaliao externa Processo que permite a introduo de amostras de contedo conhecido, porm no divulgado no
da qualidade (AEQ) procedimento de testes de rotina de um laboratrio, a partir de uma fonte independente.
Controle interno da
Procedimento usado para detectar problemas e falhas em um ou mais reagentes de um teste.
qualidade (CIQ)
Avaliao dos
testes

Processo sistemtico e extenso que compara diferentes sistemas projetados para executar
funes iguais ou similares.

Validao dos
testes

Procedimento usado para examinar todo o processo que est sendo utilizado, a fim de verificar
se os resultados esto corretos.

CSPS

Controle de substncias prejudiciais sade


Gesto de qualidade no laboratrio

11

2.2 Gesto de qualidade


O sistema de qualidade deve ser descrito em um
manual de qualidade que apresenta o sistema de gesto
para o laboratrio. Ele serve para notificar a gerncia
e os funcionrios do prprio laboratrio e fornecer
informaes para os clientes dos servios laboratoriais e
para qualquer organismo de certificao.

Organizao e gesto
Uma estrutura organizacional necessria para
o laboratrio, na qual estejam claros os papis
e responsabilidades de cada indivduo. Trata-se
normalmente de uma estrutura hierrquica, dirigida por
um diretor ou pelo chefe do departamento, com chefes
de sees ou unidades, um gerente de laboratrio e uma
gama de cientistas da sade, de diferentes reas. Um
indivduo deve assumir a liderana pela qualidade, o que
pode constituir tanto uma funo especfica como uma
parte integral de um trabalho mais amplo. O manual de
qualidade deve incluir um organograma das funes dos
diferentes indivduos e de suas linhas de gerncia e a
descrio de suas responsabilidades. Cada funcionrio
deve ter a descrio detalhada de seu trabalho, a qual
deve ser revisada anualmente.

Treinamento dos funcionrios e registro


Todos os funcionrios do laboratrio devem ser
devidamente treinados e registrados, quando possvel,
junto a um organismo nacional. Os funcionrios devem
receber treinamento em todos os mtodos que iro
empregar em suas atividades dirias e ser regularmente
avaliados quanto sua competncia. Ser mantido
um registro do treinamento de cada empregado. Estes
tambm devem participar de formao contnua para
ampliar suas experincias e competncias. A auditoria
dos procedimentos laboratoriais parte de um bom
sistema de qualidade e ser um requisito para a
certificao. As responsabilidades individuais devem
ser estabelecidas por meio das seguintes reunies dos
vrios grupos do laboratrio:
As reunies dos gerentes ou funcionrios snior
devem incluir o diretor ou chefe de laboratrio, o
gerente do laboratrio, os chefes de cada seo, o
gerente de GQ, o chefe de segurana do laboratrio
e o assistente pessoal do diretor. Esse grupo deve

12

se encontrar regularmente em geral, de seis a oito


vezes por ano para discutir assuntos relevantes,
incluindo finanas, administrao, contratao de
pessoal, equipamentos, AIQ e AEQ, certificao e
quaisquer outras questes levantadas que afetem a
oferta dos servios laboratoriais. Nessas reunies,
devem-se elaborar atas com os pontos de ao a
serem revisados nos encontros seguintes.
As reunies de todos os funcionrios devem incluir
todos os nveis de funcionrios do laboratrio. Esse
grupo deve se encontrar pelo menos oito vezes por
ano para discutir assuntos relevantes, incluindo
finanas, administrao, contratao de pessoal,
segurana, certificao e quaisquer outras questes
levantadas. Nessas reunies, devem-se elaborar
atas com os pontos de ao a serem revisados nos
encontros seguintes.
As reunies de gesto de segurana devem incluir
o diretor ou o chefe do laboratrio, o gerente do
laboratrio, o chefe de segurana do laboratrio,
o vice-chefe de segurana, os chefes das sees,
um representante dos funcionrios e, se disponvel,
um conselheiro de sade e segurana. Esse grupo
deve se encontrar em intervalos de seis meses,
ou conforme apropriado. As atas devem ser
disponibilizadas a todos e afixadas no quadro de
avisos do laboratrio.
As reunies anuais de gerncia tambm devem ser
realizadas e os respectivos relatrios apresentados,
a fim de possibilitar a reviso do desempenho
completo do laboratrio e dos servios prestados aos
consumidores.

Procedimentos operacionais padro


Todos os procedimentos utilizados no laboratrio devem
ser documentados como POP e so fundamentais para
reduzir os erros decorrentes de variaes nos testes.
Devem incluir os principais detalhes dos reagentes
e metodologias, incluindo os controles internos e os
critrios interpretativos. Os POP devem ser escritos
pelos indivduos que executam o mtodo/teste e
autorizados por um funcionrio snior. Necessitam
apresentar referncia cruzada quanto avaliao de
risco e informaes de segurana (CSPS qumico e

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

biolgico), devendo ser revisados e atualizados. Nenhum


procedimento ser realizado no laboratrio sem que os
POP estejam num lugar apropriado e de fcil acesso
no laboratrio para o uso dirio. Os POP devem ser
revisados regularmente, verificados e autorizados pelo
tcnico snior como parte do SGQ. Em alguns pases, o
POP local pode ser baseado no POP nacional.
A avaliao e validao de testes essencial em
qualquer laboratrio para fornecer uma avaliao
baseada em evidncias sobre a capacidade de
desempenho do teste, antes que este seja incorporado
ao servio oferecido.
A avaliao um processo sistemtico e extensivo,
que compara diferentes sistemas projetados para
executar funes iguais ou similares. Exemplos de
avaliaes na microbiologia incluem a comparao
de diferentes mtodos projetados para detectar o
mesmo marcador/alvo, a comparao de diferentes
meios de cultura para isolar o mesmo organismo ou
a comparao de diferentes equipamentos com a
mesma funo. Os resultados da avaliao devem ser
encaminhados s partes interessadas, por exemplo,
por meio de uma publicao. Quando dois conjuntos
de reagentes (kits) apresentam caractersticas de
desempenho equivalentes, deve-se dar preferncia
quele que seja mais fcil de usar, de menor custo,
mais rpido ou que requeira amostras de mais fcil
obteno.
A validao usada para examinar todo o processo
que est sendo utilizado, a fim de verificar se os
resultados esto corretos. Cada laboratrio deve
validar suas habilidades para alcanar resultados
aceitveis, segundo o mtodo ou sistema em
questo. Para documentar tais habilidades, os
laboratrios devem produzir um arquivo de validao
para cada mtodo ou sistema. O arquivo necessita
incluir uma ampla gama de informaes e envolver
nfases diferentes, conforme o laboratrio esteja
utilizando um sistema comercial ou se desenvolveu
um sistema prprio (in-house). Tipicamente, o
arquivo deve incluir sees como dados de avaliao,

de qualidade, POP relevantes, registro de erros e


reclamaes de consumidores.
A inteno da validao fornecer provas
documentais de que um teste para diagnstico
ou a pea de um equipamento est de acordo
com as especificaes do fabricante. Isso
pode envolver resultados de experimentos para
determinar sua preciso, sensibilidade, viabilidade e
reprodutibilidade. A validao pode ser extensiva (por
exemplo, para validar um novo mtodo desenvolvido
internamente pelo laboratrio) ou de mbito limitado
(por exemplo, para validar um mtodo comercial) que
j est em uso e sofreu pequenas modificaes.
Para os mtodos j em uso e que no possuem
uma validao especfica, importante providenciar
provas documentais que justifiquem os motivos para
seu uso. Normalmente, suficiente preparar um
documento baseado em evidncias histricas, como
o resultado de comparaes ou de outros estudos;
cpia de artigos publicados; resultados da AEQ, da
AIQ e do CIQ; etc. Os registros do trabalho podem ser
cruzados com referncias, caso seja apropriado para
o relatrio de validao.

Garantia de qualidade (GQ)


A GQ fundamental para o trabalho do laboratrio, a fim
de manter a qualidade dos servios e garantir que os
resultados sejam tanto precisos quanto reprodutveis,
sendo a preciso o grau de concordncia entre o valor
mdio obtido por uma ampla srie de resultados do teste
e um valor de referncia aceito, e a reprodutibilidade
a habilidade de produzir essencialmente o mesmo
resultado de diagnstico, independentemente das
variaes de operador, lote do teste, laboratrio ou
equipamento auxiliar validado.
Existem dois elementos principais da GQ: avaliao
da qualidade, ambas as AIQ e AEQ; e o controle de
qualidade, o qual engloba a avaliao e a validao
dos testes, CIQ e avaliao e monitoramento dos
equipamentos (Figura 2.1).

teste em amostras conhecidas, pastas de trabalho,


publicaes relevantes, dados contnuos de controle

Gesto de qualidade no laboratrio

13

Avaliao da qualidade
Avaliao interna
da qualidade

Avaliao externa
da qualidade

Controle de qualidade
Avaliao e
validao de
testes

Controle interno
da qualidade

Avaliao e
monitoramento
de equipamentos

Figura 2.1
Diferentes elementos que contribuem para a garantia de qualidade (GQ)

Controle de qualidade (CQ)


O CIQ usado para detectar problemas ou falhas em
um ou mais reagentes de um teste. Por exemplo, para
sistemas de cultura, uma ou mais linhagens de controle
conhecidas podem ser usadas para garantir que o meio
permite o crescimento do organismo desejado, e, se for
um meio seletivo, se este tambm inibe os organismos
no desejados. Isso ir detectar a ausncia ou a
concentrao inadequada de um fator de crescimento ou
de um agente seletivo.
Para testes moleculares, o CIQ deve incluir o controle
da amostragem, o controle do isolamento do cido
nucleico, um controle de amplificao, um controle de
contaminao e um controle de inibio. Isso ir prevenir
resultados falso-positivos das reaes em cadeia da
polimerase por meio da deteco da falha de um ou mais
reagentes, da amplificao, da ciclagem da temperatura
ou inibio da reao.
Para qualquer teste sorolgico, as amostras do CQ
devem ser includas diariamente, alm do CIQ fornecido
pelo kit e das amostras para o CQ externo, quando
disponvel, sendo todas elas testadas da mesma
forma que o espcime do paciente. O intervalo para
as amostras de CQ para cada laboratrio deve ser
estabelecido utilizando-se pelo menos 20 medies ao
longo de um perodo de tempo; os valores de mdia,
desvio-padro (DP) e coeficiente de variao (CV) so
ento calculados. Os grficos de Levey-Jennings devem
ser preparados para cada controle, comparando-se
os resultados do CQ de cada corrida. As comparaes
devem ficar entre dois DP e os resultados no devem
ser relatados se o valor do CQ for maior que trs DP.
Esses grficos necessitam ser revisados regularmente
para verificar se h quaisquer resultados ou tendncias

14

anormais. Deve-se estabelecer um novo intervalo para


cada lote novo de reagentes do CQ.

Avaliao e monitoramento de equipamentos


essencial que todos os laboratrios verifiquem
regularmente o desempenho dos equipamentos e
registrem os dados obtidos (6). Isso pode ser feito por
meio da manuteno de um inventrio de equipamentos,
revisado de forma regular. O fluxo laminar de segurana
microbiolgica deve ser monitorado e registrado
semanalmente quanto ao fluxo de ar; a temperatura
de todas as incubadoras, banhos-maria, geladeiras e
congeladores ser registrada diariamente. Qualquer erro
deve ser reportado ao gerente do laboratrio.

Avaliao da qualidade
Avaliao interna da qualidade (AIQ)
A AIQ realizada pelo reenvio e testagem de amostras
clnicas annimas selecionadas randomicamente no
mesmo laboratrio, a fim de garantir a reprodutibilidade
dos resultados. Todos os espcimes da AIQ devem
ser submetidos a anlises de rotina, sem receber
qualquer tratamento especial. Para que o esquema
fornea informaes relevantes e teis, a AIQ deve ser
realizada regularmente em todos os tipos de amostras.
As amostras so selecionadas por um funcionrio
treinado, o qual no pode ser a mesma pessoa que
realizar os testes. As amostras devem ser selecionadas
randomicamente para evitar vis, sendo reintroduzidas
no sistema do laboratrio da mesma maneira que as
amostras normais.
O nmero de espcimes testados e a frequncia
dos testes dependem do nmero total de espcimes

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

recebidos. Sugere-se que aproximadamente 1% do total


recebido seja retestado mensalmente.
Os resultados devem ser conferidos e comparados
por uma pessoa diferente. Em caso de quaisquer
discrepncias, o teste ser repetido e investigado.
Avaliao externa da qualidade (AEQ)
A AEQ realizada pela distribuio de painis de
proficincia por prestadores de AEQ, como o Servio
Nacional de Avaliao Externa da Qualidade do Reino
Unido (UK NEQAS, do ingls United Kingdom National
External Quality Assessment Service; http://www.
ukneqas.org.uk), o Sistema de Avaliao de Qualidade
Internacional (http://qasidirect.com), a Faculdade de
Patologistas Americanos (http://www.cap.org) e o
Programa de Avaliao da Qualidade RCPA Pty Ltd
da Austrlia (http://www.rcpaqap.com.au), ou, ainda,
por meio de troca de amostras entre laboratrios
de referncia, visando acessar o amplo espectro de
tcnicas e ensaios realizados no laboratrio clnico.
Cientistas devidamente treinados devem realizar a AEQ,
e execut-la, tanto quanto possvel, de acordo com
prticas laboratoriais normais. Uma vez que as amostras
da AEQ so normalmente fceis de serem identificadas,
existe a possibilidade de que estas sejam manejadas
de forma que excede os procedimentos laboratoriais
normais, por exemplo: manipulao por funcionrios
snior, repetio de testes, etc., devendo-se tomar
medidas para evitar que isso ocorra.
A AEQ proporciona vrios benefcios ao laboratrio:

Processamento das amostras:


1. As amostras devem ser reconstitudas, se
necessrio e se possvel. Isso deve ser realizado em
um fluxo laminar de segurana de microbiologia de
nvel 1, uma vez que provvel que os riscos no
sejam conhecidos.
2. O exame ou procedimento requerido deve ser
realizado de acordo com o POP.
3. As amostras residuais devem ser estocadas at
que os resultados sejam conhecidos, a fim de
possibilitar a repetio do teste caso ocorra alguma
discrepncia.
4. Quando o provedor externo receber os resultados,
estes devem ser registrados e o desempenho do
laboratrio deve ser documentado.
5. Quaisquer falhas ou discrepncias devem ser
investigadas por meio da repetio do teste.
6. Os resultados devem ser revisados por um cientista
snior experiente e compartilhados com os
funcionrios do laboratrio, incluindo sucessos e
falhas, para permitir uma discusso completa.

2.3 Indicadores de qualidade


Os laboratrios devem considerar o estabelecimento de
indicadores que reflitam a qualidade de seus resultados.
Metas para tempos de resposta podem ser utilizadas
para tentar reduzir o perodo entre o recebimento da
amostra e a entrega do resultado ao paciente.

Fornece aos funcionrios uma ideia sobre seu


desempenho dentro do laboratrio;
Permite comparar o desempenho entre laboratrios,
nacional e internacionalmente;
Melhora o nvel dos exames;
Identifica possveis problemas;
Demonstra a clientes, colegas e organismos
de certificao que h um compromisso com a
qualidade;
Educa os funcionrios, fornecendo uma melhor
compreenso do impacto de resultados incorretos.

Gesto de qualidade no laboratrio

15

O SGQ crucial para melhorar e manter a


preciso e reprodutibilidade dos resultados
produzidos pelo laboratrio.
Todos os laboratrios devem se esforar para
melhorar a qualidade e o trabalho, visando a
certificao.
A estrutura organizacional e as reunies
regulares dos funcionrios de diferentes nveis
so necessrias para revisar o sistema de
qualidade do laboratrio.
A avaliao e validao dos testes so
essenciais para fornecer uma base de
evidncia antes que os testes sejam utilizados
no laboratrio.

4. Yao K et al. Improving quality management


systems of laboratories in developing countries: an
innovative training approach to accelerate laboratory
accreditation. American Journal of Clinical
Pathology, 2010, 134(3):401409.
5. Westerman LE et al. A quality management systems
approach to CD4 testing in resource-poor settings.
American Journal of Clinical Pathology, 2010,
134(4):556567.
6. Fonjungo PN et al. Laboratory equipment
maintenance: A critical bottleneck for strengthening
health systems in sub-Saharan Africa. Journal of
Public Health Policy, 2012, 33:3445.

A GQ engloba o CQ e a avaliao da qualidade.


Os laboratrios devem usar indicadores
para monitorar a qualidade dos seus testes
laboratoriais.

2.4 Referncias
1. Dobbs T et al. A comprehensive evaluation of the
proficiency testing program for the HIV-1 BED
incidence assay. Journal of Clinical Microbiology,
2011, 49(10):34703473.
2. Alemnji GA et al. Strengthening national laboratory
health systems in the Caribbean Region. Global
Public Health, 2012, 7(6):648660.
3. Nkengasong JN et al. Laboratory systems and
services are critical in global health: time to end
the neglect? American Journal of Clinical Pathology,
2010, 134(3):368373.

16

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 3
Micoplasmas genitais
3.1 Introduo
Micoplasma o nome comum para os membros da
classe Mollicutes. Os micoplasmas so bactrias
muito pequenas de vida livre, com tamanhos variando
normalmente de 0,3 a 0,5 m. Elas no apresentam
uma parede celular rgida, como outras bactrias, o que
torna essas ltimas resistentes penicilina e outros
antibiticos. O M. genitalium, o M. hominis e as duas
espcies de Ureaplasma, U. urealyticum (anteriormente
conhecido como U. urealyticum, biotipo 2) and U. parvum
(anteriormente conhecido como U. urealyticum, biotipo 1)
so encontrados comumente no trato urogenital humano.
importante esclarecer que antes de o U. urealyticum
e o U. parvum serem reconhecidos como espcies
diferentes, ambos eram designados como U. urealyticum,
tornando difcil a interpretao dos resultados de estudos
prvios. A Tabela 3.1 apresenta as doenas associadas a
esses microrganismos.
O M. genitalium encontrado em 1-3% de homens e
mulheres sexualmente ativos, segundo estudos de base
populacional. Os ureaplasmas podem ser encontrados
no colo do tero ou na vagina de 40-80% de mulheres
assintomticas, sexualmente ativas, e o M. hominis

em 20-50% (1-4). Por conseguinte, os ureaplasmas e


o M. hominis devem ser primariamente considerados
comensais quando detectados no trato genital inferior.
No entanto, esses micoplasmas so reconhecidos como
a causa de doenas extragenitais em pacientes com
deficincia de clulas B (hipo e agamaglobulinemia) e em
prematuros (5).
O M. genitalium teve forte e uniforme associao com a
uretrite no gonoccica (UNG) em mais de 30 estudos,
e foi detectado na uretra de 15-25% dos homens com
UNG sintomtica comparados a 5-10% daqueles que no
apresentavam a doena (1). Em estudos que avaliaram
sua associao com a UNG no clamidial (UNGNC),
essa associao mostrou-se normalmente mais forte,
indicando que o M. genitalium e o C. trachomatis atuam
como causas separadas de UNG. Em vrios estudos,
o M. genitalium foi encontrado em mais de um tero
dos homens com UNGNC (1). Dentre as populaes
clnicas com doenas sexualmente transmissveis (DST),
aproximadamente 90% dos homens infectados por M.
genitalium apresentam sinais microscpicos de uretrite,
e praticamente trs em cada quatro homens infectados
reportam sintomas desse agravo (6, 7 ).

Tabela 3.1: Doenas associadas aos micoplasmas urogenitais


Doenas associadasa
Espcie

Vaginose
Uretrite Cervicite bacteriana

Endometrite Nascimento Infertilidade Transmisso


e/ou PID
prematuro (mulheres) do HIV

M. genitalium

++++

+++

+++

+/

M. hominis

++++

+/

+/

ND

Ureaplasmas
(no-diferenciados)

+/

+++

ND

+/

ND

U. urealyticum

ND

ND

ND

ND

ND

ND

U. parvum

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND: no determinado; PID: doena inflamatria plvica (do ingls pelvic inflammatory disease)
a
++++ associao forte, +++ associao na maioria dos estudos, + associao apenas em alguns estudos, +/ resultados conflitantes.

Microplasmas genitais

17

Vrios estudos clnicos mostraram uma forte correlao


entre o M. genitalium e UNG persistente ou recorrente,
provavelmente devido ao tratamento microbiolgico
de baixa eficcia das tetraciclinas. O M. genitalium
foi erradicado em menos de um tero dos pacientes
infectados aps tratamento com doses-padro de
tetraciclinas (8). O M. genitalium foi encontrado em at
41% dos homens com uretrite persistente ou recorrente
aps tratamento com doxiciclina (9, 10).
Mais recentemente, foi reportada falha no tratamento
com dose nica de 1g de azitromicina em 28% dos
homens positivos para M. genitalium com UNG e, na
maioria dos pacientes, a falha estava correlacionada
com a resistncia aos macroldeos desenvolvida durante
o tratamento com dose nica (11).
Em contraste com a consistncia dos estudos
associando o M. genitalium a UNG, o papel dos
ureaplasmas nessa doena controverso e no h
evidncias que suportem o papel do M. hominis como
causa de uretrite (5). Claramente, a identificao
de ureaplasma em um homem com UNG no indica
necessariamente que o microrganismo a causa da
doena, considerando a alta taxa de colonizao. Esse
o caso mesmo quando a cultura quantitativa aplicada.
Dessa forma, no se conhece a proporo exata de
casos nos quais os ureaplasmas so responsveis pela
doena. A diviso dos ureaplasmas em duas espcies, U.
urealyticum e U. parvum, levou a estudos sugerindo que
o U. urealyticum pode estar associado a UNG em homens
jovens com poucos parceiros (12) ou quando presente
em ttulos altos. Dessa forma, as culturas-padro
que no so capazes de discriminar as duas espcies
parecem ser de valor muito limitado.
O M. genitalium tem sido associado com a cervicite;
porm, essa associao mais fraca que a existente
entre M. genitalium e uretrite masculina, possivelmente
devido s dificuldades e critrios diferentes utilizados
no diagnstico de cervicite em mulheres (1). Entretanto,
em uma srie de estudos, a associao mostrou-se to
forte quanto a de C. trachomatis (7 ). Em estudos nos
quais foram descritos sinais de uretrite em mulheres,
esta foi significantemente associada a infeces por M.
genitalium (1).
O M. genitalium foi detectado no endomtrio de 60%
das mulheres positivas para a infeco no colo do tero,
18

e sua presena em bipsias endometriais mostrou-se


fortemente associada a endometrite histolgica, com
doena inflamatria plvica (PID, do ingls pelvic
inflammatory disease) recorrente (13, 14). Cicatrizes
tubrias tm sido indiretamente relacionadas infeco
por M. genitalium, uma vez que uma proporo
significativamente alta de mulheres com infertilidade por
fator tubrio apresentam anticorpos contra a bactria
quando comparadas a mulheres com infertilidade devida
a outras causas.
O M. genitalium foi detectado no fluido sinovial de um
paciente com artrite reativa adquirida sexualmente
(SARA, do ingls sexually acquired reactive arthritis) (16)
e experincias clnicas tm mostrado que a SARA no
incomum aps uma UNG positiva para M. genitalium.
No entanto, no se apresentaram estudos sistemticos
e a identificao de M. genitalium no fluido sinovial no
foi reproduzida. Demonstrou-se tambm que mulheres
infectadas por HIV com elevados ttulos de M. genitalium
eram mais propensas a disseminar o HIV (17 ), mas
apenas recentemente comprovou-se que a infeco por
M. genitalium predispe infeco por HIV (18). No h
indicaes de que o M. hominis ou ureaplasmas possam
desenvolver um papel similar.
O M. genitalium uma causa comum de uretrite
em homens e mulheres, e causa cervicite e
infeco no trato genital superior em mulheres.
O M. hominis e os ureaplasmas so comumente
encontrados em indivduos saudveis. Sua
associao com infeces urogenitais ainda
precisa de provas conclusivas.

3.2 Viso geral dos mtodos disponveis para


o diagnstico de M. genitalium
Para fins prticos, o diagnstico de M. genitalium
limitado ao teste de amplificao de cidos nucleicos
(NAAT, do ingls nucleic acid amplification test),
uma vez que a cultura extremamente lenta (vrios
meses), desafiadora e de baixa sensibilidade (19). At o
momento, nenhum ensaio sorolgico, ensaio de deteco
de antgeno ou testes remotos provaram ser teis para o
diagnstico de infeces urogenitais por M. genitalium.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

O NAAT o nico mtodo prtico para o


diagnstico de M. genitalium.

3.3 Condies dos espcimes para coleta,


transporte e armazenamento
A coleta de amostras deve ser realizada de acordo com
o descrito para C. trachomatis (Captulo 5). As hastes e
meios para transporte no devem conter substncias
inibitrias de NAAT. tambm adequado que se use
um sistema de transporte compatvel com o ensaio de
deteco de C. trachomatis, uma vez que a testagem
desse organismo de mxima prioridade. Entretanto,
vale ressaltar que a carga microbiana de M. genitalium
100 vezes menor que a de C. trachomatis (20); assim,
devem-se evitar os sistemas de transporte que diluem
o espcime desnecessariamente. Infelizmente, no h
uma orientao clara quanto ao espcime ideal para a
deteco de M. genitalium, uma vez que os materiais
de coleta, os mtodos de preparao de amostras e
os sistemas de deteco variam entre os estudos. Se
apenas um espcime de cada paciente for testado,
acredita-se que o primeiro jato de urina, para homens, e
hastes com secreo vaginal, para mulheres, contenham
as maiores cargas microbianas.

3.4 Deteco de M. genitalium por NAAT


A deteco por NAAT o nico mtodo vivel para
a deteco de M. genitalium, mas nenhum dos
ensaios comerciais disponveis obteve a aprovao
da Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica e, atualmente, a maioria recebeu
avaliaes muito limitadas em publicaes. A grande
parte dos ensaios de reao em cadeia da polimerase
(PCR, do ingls polymerase chain reaction) baseia-se
na deteco do gene da adesina MgPa do M. genitalium
(21). No entanto, algumas partes do gene MgPa so
altamente variveis e iniciadores desenhados para essas
regies no apresentaro um bom desempenho para
espcimes clnicos (21, 22). Embora possa ocorrer o
no pareamento de uma nica base em vrias posies
do iniciador senso em algumas cepas, o ensaio de PCR
em tempo real para MgPa utilizando o sistema TaqMan,
descrito por Jensen et al. (23), tem sido amplamente
utilizado em todo o mundo, gerando bons resultados.
Alm disso, a PCR convencional para MgPa, descrita
como uma das primeiras PCR para M genitalium (24)

ou suas modificaes (25), mostrou-se altamente


reprodutvel e tem a vantagem de que o fragmento
amplificado pode ser sequenciado para um ensaio
de tipagem robusto. O gene do RNAr 16S tambm
pode ser usado como alvo nas PCR do M. genitalium.
Entretanto, devido homologia entre M. genitalium e
M. pneumoniae, o desenho de iniciadores e sondas
especficos e sensveis relativamente difcil.
Para alguns ensaios de PCR para o gene do RNAr 16S,
a deteco de M. genitalium baseia-se na amplificao
com iniciadores universais para Mollicutes (micoplasma
e ureaplasma) e subsequente hibridizao com sondas
especficas para espcie. Embora essa abordagem
permita a deteco de vrias espcies de micoplasma a
partir de uma mesma reao primria de amplificao,
a competio, especialmente com a amplificao do
gene do RNAr 16S de ureaplasma, ir resultar em baixa
sensibilidade para a deteco do DNA de M. genitalium,
que pode ser significativa mesmo quando este
encontrado em baixa quantidade (21, 23).
Vrios testes de PCR em tempo real foram desenvolvidos
para M. genitalium (21). Embora a PCR convencional
otimizada possa apresentar a mesma sensibilidade
que os ensaios em tempo real, esses ltimos so
menos propensos a contaminao. Dessa forma, a
combinao de alta sensibilidade, especificidade,
solidez e risco reduzido de contaminao por produtos
de PCR, caracterstica desse tipo de ensaio, sugere
que a PCR em tempo real deve ser mantida como o
mtodo principal para o diagnstico de M. genitalium. A
quantificao do DNA de M. genitalium no parece ser
de muito valor para os diagnsticos de rotina.
Como uma alternativa PCR, o ensaio de amplificao
mediada por transcrio (TMA, do ingls transcriptionmediated amplification) para o RNAr 16S tem sido
disponibilizado somente para pesquisa (Gen-Probe,
So Diego, CA, EUA). A vantagem dessa abordagem
a presena de mltiplas cpias de molculas de
RNAr 16S por clula, levando a um provvel aumento
na sensibilidade da deteco em comparao com a
sensibilidade dos ensaios de PCR que tm como alvo
genes de cpias nicas. Esse ensaio TMA apresentou-se
como um teste sensvel, especfico e de alto rendimento
para a deteco de M. genitalium, mas pouqussimos
estudos o realizaram para determinar se de fato ele
superior aos outros NAAT (26).
Microplasmas genitais

19

Na ausncia de um NAAT completamente validado


comercialmente, de mxima importncia que os
laboratrios que realizam o diagnstico de M. genitalium
validem cuidadosamente e assegurem a qualidade
de seus ensaios in-house; ver os Captulos 1 e 2 e o
Anexo 3 sobre NAAT e sua garantia de qualidade e a
validao de NAAT no aprovados. Em geral, a maioria
dos ensaios multiplex exibe certa falta de sensibilidade
no diagnstico de M. genitalium, uma vez que esse
organismo est normalmente presente em nveis muito
baixos, mesmo em pacientes sintomticos (20, 23).

A preparao de amostras e a sensibilidade dos


ensaios devem ser ideais para a testagem do
M. genitalium, uma vez que esse patgeno est
presente em concentraes 100 vezes menores
que a de C. trachomatis. Muitos ensaios
multiplex apresentam uma sensibilidade um
pouco menor que ensaios com um nico alvo.
Os NAAT para o gene MgPa de M. genitalium
devem ser cuidadosamente desenhados para
evitar regies variveis do gene.
Consequentemente, devem ser feitos mximos esforos
para otimizar a preparao das amostras, por meio
do uso de centrifugao em alta velocidade, a fim de
concentrar o espcime e evitar a perda de DNA durante
a extrao.

3.5 Resistncia antimicrobiana e teste de


susceptibilidade do M. genitalium
O teste da susceptibilidade antimicrobiana do M.
genitalium muito complexo, sendo vivel somente
em laboratrios de referncia especializados. A
determinao da concentrao inibitria mnima
(CIM) por diluio em caldo utilizando-se um inculopadro empregada como o mtodo de referncia,
mas a determinao da CIM do M. genitalium apenas
pelo crescimento em cultura de clulas tambm j
foi aplicada com sucesso (27 ). A falha no tratamento
de infeces por M. genitalium levou ao aumento
da ateno dirigida resistncia nessa espcie. No
entanto, o M. genitalium cultivvel somente em poucos
laboratrios no mundo, e uma vez que seu crescimento
muito lento para permitir resultados significativos
para o paciente, testes moleculares para as mutaes

20

mediadoras de resistncia tm sido utilizados em um


nmero crescente de estudos e, em alguns pases, no
trabalho dirio de clnicas.
Vrios estudos clnicos mostraram que as tetraciclinas
so menos eficazes do que a azitromicina na erradicao
do M. genitalium (8) e, embora a CIM in vitro sugira que
a espcie susceptvel tetraciclina, as experincias
clnicas contradizem esse dado. Nenhum teste molecular
foi aplicado para detectar a resistncia tetraciclina. A
resistncia de macroldeos foi documentada por meio
do isolamento de cepas de M. genitalium de pacientes
apresentando falha teraputica com azitromicina
(28), demonstrando-se que as principais mutaes
mediadoras de resistncia ocorrem na regio V do gene
do RNAr 23S, principalmente a A2058G e A2059G
(numerao de acordo com E. coli), mas uma srie de
outras combinaes foram detectadas em espcimes
de pacientes que no responderam terapia com
azitromicina.
Essas mutaes podem ser detectadas diretamente
em espcimes clnicos por meio do sequenciamento de
produtos de PCR, permitindo a gerao de informao
clnica til na ausncia de cultura. Alguns estudos
demonstraram que o tratamento com dose nica de 1g
de azitromicina leva ao desenvolvimento de resistncia
ou seleo de variantes resistentes pr-existentes
(28, 29), e dados preliminares sugerem que o nvel
comunitrio de resistncia aos macroldeos em M.
genitalium altamente dependente do uso da dose
nica de 1g de azitromicina para o tratamento de
infeces por C. trachomatis. Isso ilustrado pela
baixa prevalncia de resistncia em pases que usam
doxiciclina como droga primria para UNG, e por nveis
de resistncia que chegam a 100% na Groenlndia,
onde a azitromicina usada no tratamento de UNG e
a prevalncia de C. trachomatis extremamente alta
(30). A moxifloxacina demonstrou ser um tratamento de
segunda gerao eficaz (31), mas algumas publicaes
do Japo sugerem que pode desenvolver-se a resistncia
fluoroquinolona relacionada gatifloxacina (32) e que
foram isoladas cepas com resistncia combinada de alto
nvel a quinolonas e macroldeos (J. S. Jensen, dados
no publicados, abril de 2013). Embora tenham sido
encontradas mutaes em regies determinantes de
resistncia a quinolonas, suas correlaes clnicas no
foram estabelecidas.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

A resistncia a macroldeos em M.
genitalium muito comum em pacientes que
apresentam falha teraputica azitromicina,
e a moxifloxacina a segunda gerao de
tratamento mais frequentemente utilizada.
A resistncia a macroldeos em M. genitalium,
mediada por mutaes especficas no gene do
RNAr 23S, pode ser detectada por amplificao
por PCR e sequenciamento desse gene a partir
do espcime clnico.
Mutaes em M. genitalium em regies
determinantes de resistncia a quinolonas
foram encontradas em pacientes que falharam
o tratamento com esse grupo de antibiticos,
mas suas correlaes clnicas no foram
estabelecidas.

3.6 Referncias
1. Taylor-Robinson D, Jensen JS. Mycoplasma
genitalium: from chrysalis to multicolored
butterfly. Clinical Microbiology Reviews, 2011,
24(3):498514.
2. Andersen B et al. Mycoplasma genitalium:
prevalence and behavioural risk factors in the
general population. Sexually Transmitted Infections,
2007, 83(3):237241.
3. Manhart LE et al. Mycoplasma genitalium among
young adults in the United States: an emerging
sexually transmitted infection. American Journal of
Public Health, 2007, 97(6):11181125.
4. McCormack WM et al. Sexual activity and vaginal
colonization with genital mycoplasmas. Journal
of the American Medical Association, 1972,
221(12):13751377.
5. Totten PA, Taylor-Robinson D, Jensen JS. Genital
mycoplasmas. In: Holmes KK et al., eds. Sexually
transmitted diseases, 4th ed. New York, McGrawHill Medical, 2008:709736.
6. Falk L, Fredlund H, Jensen JS. Symptomatic
urethritis is more prevalent in men infected with
Mycoplasma genitalium than with Chlamydia

trachomatis. Sexually Transmitted Infections, 2004,


80(4):289293.
7. Anagrius C, Lor B, Jensen JS. Mycoplasma
genitalium: prevalence, clinical significance, and
transmission. Sexually Transmitted Infections, 2005,
81(6):458462.
8. Manhart LE, Broad JM, Golden MR. Mycoplasma
genitalium: should we treat and how? Clinical
Infectious Diseases, 2011, 53(Suppl 3):S129S142.
9. Horner P et al. Role of Mycoplasma genitaliumand
Ureaplasma urealyticum in acute and chronic
nongonococcal urethritis. Clinical Infectious
Diseases, 2001, 32(7):9951003.
10. Wikstrm A, Jensen JS. Mycoplasma genitalium:
a common cause of persistent urethritis among
men treated with doxycycline. Sexually Transmitted
Infections, 2006, 82(4):276279.
11. Bradshaw CS et al. Azithromycin failure in
Mycoplasma genitalium urethritis. Emerging
Infectious Diseases, 2006, 12(7):11491152.
12. Wetmore CM et al. Ureaplasma urealyticum is
associated with nongonococcal urethritis among
men with fewer lifetime sexual partners: a casecontrol study. Journal of Infectious Diseases, 2011,
204(8):12741282.
13. Cohen CR et al. Association between Mycoplasma
genitalium and acute endometritis. The Lancet,
2002, 359(9308):765766.
14. Haggerty CL et al. Failure of cefoxitin and
doxycycline to eradicate endometrial Mycoplasma
genitalium and the consequence for clinical cure of
pelvic inflammatory disease. Sexually Transmitted
Infections, 2008, 84(5):338342.
15. Svenstrup HF et al. Mycoplasma genitalium,
Chlamydia trachomatis, and tubal factor
infertilitya prospective study. Fertility and
Sterility, 2008, 90(3):513520.
16. Taylor-Robinson D et al. Mycoplasma genitalium in
the joints of two patients with arthritis. European
Journal of Clinical Microbiology and Infectious
Diseases, 1994, 13(12):10661069.

Microplasmas genitais

21

17. Manhart LE et al. High Mycoplasma genitalium


organism burden is associated with shedding of
HIV-1 DNA from the cervix. Journal of Infectious
Diseases, 2008, 197:733736.
18. Mavedzenge SN et al. The association between
Mycoplasma genitalium and HIV-1 acquisition in
African women. AIDS, 2012, 26(5):617624.
19. Jensen JS, Hansen HT, Lind K. Isolation of
Mycoplasma genitalium strains from the male
urethra. Journal of Clinical Microbiology, 1996,
34(2):286291.
20. Walker J et al. The difference in determinants of
Chlamydia trachomatis and Mycoplasma genitalium
in a sample of young Australian women. BMC
Infectious Diseases, 2011, 11:35.
21. Shipitsyna E et al. Guidelines for the laboratory
diagnosis of Mycoplasma genitalium
infections in East European countries. Acta
Dermatovenereologica, 2010, 90(5):461467.
22. Ma L et al. Genetic variation in the complete MgPa
operon and its repetitive chromosomal elements
in clinical strains of Mycoplasma genitalium. PLoS
One, 2010, 5(12):e15660.
23. Jensen JS et al. Use of TaqMan 5 nuclease realtime PCR for quantitative detection of Mycoplasma
genitalium DNA in males with and without urethritis
who were attendees at a sexually transmitted
disease clinic. Journal of Clinical Microbiology,
2004, 42(2):683692.
24. Jensen JS et al. Polymerase chain reaction for
detection of Mycoplasma genitalium in clinical
samples. Journal of Clinical Microbiology, 1991,
29(1):4650.

reaction assay for Mycoplasma genitalium. Sexually


Transmitted Diseases, 2003, 30(10):756763.
26. Wroblewski JK et al. Comparison of transcriptionmediated amplification and PCR assay results
for various genital specimen types for detection
of Mycoplasma genitalium. Journal of Clinical
Microbiology, 2006, 44(9):33063312.
27. Hamasuna R, Osada Y, Jensen JS. Antibiotic
susceptibility testing of Mycoplasma genitalium
by TaqMan 5 nuclease real-time PCR.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005,
49(12):49934998.
28. Jensen JS et al. Azithromycin treatment failure
in Mycoplasma genitalium-positive patients with
nongonococcal urethritis is associated with induced
macrolide resistance. Clinical Infectious Diseases,
2008, 47(12):15461553.
29. Twin J et al. Transmission and selection of
macrolide resistant Mycoplasma genitalium
infections detected by rapid high resolution melt
analysis. PLoS One, 2012, 7(4):e35593.
30. Gesink DC et al. Mycoplasma genitalium presence,
resistance and epidemiology in Greenland.
International Journal of Circumpolar Health, 2012,
71:18.
31. Bradshaw CS, Chen MY, Fairley CK. Persistence
of Mycoplasma genitalium following azithromycin
therapy. PLoS One, 2008; 3(11):e3618.
32. Hamasuna R et al. P3S7.09 mutations on gyrA
or parC genes of Mycoplasma genitalium and
efficacies of treatment with fluoroquinolones
against M genitalium-related urethritis. Sexually
Transmitted Infections, 2011, 87(Suppl. 1):A302.

25. Dutro SM et al. Development and performance


of a microwell-plate-based polymerase chain

22

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 4
Gonorreia
4.1 Introduo
A gonorreia, causada pela Neisseria gonorrhoeae
(gonococo), uma doena antiga, transmitida quase
exclusivamente por contato sexual. Em 2008, de acordo
com estimativas da Organizao Mundial da Sade
(OMS), havia, globalmente, 106 milhes de novos
casos entre adultos. Isso coloca a gonorreia como a
mais prevalente doena sexualmente transmissvel
(DST) bacteriana, junto com a infeco por Chlamydia
trachomatis (tambm com 106 milhes de novos
casos) (1). Por conseguinte, a gonorreia, incluindo
suas complicaes severas, causa morbidade e custos
econmicos substanciais, e mantm-se, mundialmente,
como um importante problema de sade pblica.
de grande preocupao o fato de essa bactria ter
desenvolvido resistncia a praticamente todos os
antibiticos introduzidos para o seu tratamento, e
teme-se que a gonorreia possa se tornar no tratvel em
certas circunstncias (2,3).
O gnero Neisseria contm duas principais espcies
patognicas a humanos, N. gonorrhoeae e N.
meningitidis, e, aproximadamente, 30 espcies no
patognicas, tais como N. lactamica, N. sicca, N.
cinerea, N. flavescens, N. subflava e N. mucosa. Esses
organismos habitam predominantemente o trato
respiratrio superior como comensais, mas podem
ser esporadicamente encontrados no trato urogenital
inferior. Os gonococos so Gram-negativos, aerbicos,
capnoflicos (preferem concentraes aumentadas
[3-7%] de dixido de carbono [CO2]), no flagelados,
no esporulados e constituem cocos produtores de
oxidase e catalase, tipicamente dispostos em pares
(diplococos) com os lados cncavos adjacentes; isto ,
em microscopia, eles aparecem com a morfologia tpica
de um rim ou gro de caf. A N. gonorrhoeae exigente
e requer meios de cultura complexos e nutricionalmente
enriquecidos para seu crescimento in vitro.

A N. gonorrhoeae infecta apenas humanos, colonizando


superfcies de mucosa, constituindo o agente etiolgico
das infeces do trato urogenital inferior uretrite
em homens e cervicite em mulheres. A infeco
urogenital assintomtica ocorre em uma minoria dos
homens, mas mais comum (pelo menos 50%) nas
mulheres. A infeco do reto (proctite) e da faringe,
comumente assintomtica, pode ocorrer em ambos
os sexos, dependendo do comportamento sexual, mas
predominantemente encontrada em homens que
fazem sexo com homens (HSH). Se no detectada e
no tratada ou tratada de forma imprpria, a infeco
pode migrar para o trato genital superior e causar uma
infeco gonoccica complicada (por exemplo, a doena
inflamatria plvica [PID, do ingls pelvic inflammatory
disease], alm de sequelas relacionadas, como a
gravidez ectpica e infertilidade) em mulheres, e, em
homens, edema peniano e epididimite. Tambm pode
causar conjuntivite em adultos; porm, mais comumente,
a infeco dos olhos se apresenta na forma de oftalmia
neonatal em recm-nascidos. A infeco gonoccica
disseminada (IGD), a qual uma entidade distinta e no
uma complicao, pode ocorrer em ambos os sexos,
mas raramente encontrada. A Tabela 4.1 resume as
manifestaes clnicas das infeces gonoccicas.

A N. gonorrhoeae causa a DST bacteriana


globalmente mais comum (em 2008, foi to
comum quanto a infeco por clamdia), a qual
inclui um espectro de doenas em diferentes
rgos, incluindo o trato urogenital, faringe,
reto e conjuntiva.
As complicaes e sequelas associadas
infeco por N. gonorrhoeae no tratada
incluem PID, gravidez ectpica, infertilidade,
edema peniano, epididimite e IGD.

Gonorreia

23

4.2 Viso geral dos mtodos de diagnstico


disponveis
A gonorreia frequentemente assintomtica,
especialmente em mulheres, e quando ocorre na
faringe e no reto. Os sintomas, quando presentes,
podem ser inespecficos (ver Tabela 4.1). Portanto,
os procedimentos laboratoriais so necessrios para
diagnstico, deteco de casos e teste para a avaliao
da cura. O diagnstico de gonorreia estabelecido pela
identificao de N. gonorrhoeae em secrees genitais e
extragenitais.
A Tabela 4.2 resume os mtodos recomendados para o
diagnstico da gonorreia, assim como o desempenho e
outras caractersticas desses mtodos.
Um esfregao para microscopia corretamente
preparado com colorao de Gram para identificar
diplococos Gram-negativos intracelulares em leuccitos

polimorfonucleares (LPMN) sensvel (95%) e especfico


(97%) para o diagnstico de gonorreia em homens
sintomticos com corrimento uretral. Em mulheres, no
entanto, o esfregao de secrees cervicais detecta
apenas 40-60% de espcimes com cultura positiva,
o que pode refletir o baixo nmero de gonococos em
mulheres. Resultados falso-positivos podem ocorrer
e a especificidade (80-95%) depende da experincia
do microscopista. O exame microscpico direto no
recomendado para o diagnstico de infeces no
reto ou faringe, devido ao grande nmero de outros
organismos presentes e baixa sensibilidade. A triagem
de indivduos assintomticos por microscopia no
recomendada.
Por muitas dcadas, a cultura de N. gonorrhoeae foi
considerada o padro ouro para o diagnstico tanto
da gonorreia genital quanto extragenital. A cultura,
em circunstncias otimizadas, sensvel, altamente

Tabela 4.1: Manifestaes clnicas de infeces gonoccicasa


Gonorreia descomplicadaa

Gonorreia complicadab

Uretra

Corrimento purulento, abundante


Corrimento claro, escasso
Disria

Complicaes
masculinas

Colo do tero

Orifcio cervical frivel, avermelhado


Corrimento purulento
Disria
Salpingite
Desconforto abdominal inferior
unilateral ou bilateral

Edema peniano
Abscesso nas glndulas de Tyson
Abscesso nas glndulas de Cowper
Vesiculite seminal
Epididimite
Infertilidade (raro)

Complicaes
femininas

Endometrite
Salpingite
Abscesso das glndulas de
Bartholin
Linfagite
Abscesso tubo-ovariano
Gravidez ectpica
Infertilidade

Infeco
gonoccica
disseminada
(IGD)

Bacteremia
Febre
Dermatite (leses na pele: macular,
eritematosa, pustular, necrtica,
hemorrgica)
Tenossinovite
Articulaes; artrite sptica
Endocardite
Meningite

Reto

Secreo purulenta, abundante


Dor pungente ou com queimao
Tenesmo
Sangue nas fezes

Faringe

Faringite leve
Ligeira irritao na garganta
Eritema

Conjuntiva

24

Secreo purulenta, abundante


Ceratite e ulcerao da crnea;
perfurao, extruso do cristalino
Cicatriz, opacificao do cristalino
Cegueira

Como mencionado acima, a infeco gonoccica pode ser assintomtica, principalmente em mulheres, na faringe e reto.

Estudos epidemiolgicos e biolgicos forneceram evidncias fortes de que a gonorreia facilita significativamente a transmisso do HIV.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

especfica, de baixo custo e, o mais importante, permite


o teste de susceptibilidade antimicrobiana. A resistncia
antimicrobiana em gonococos um problema severo
em todo o mundo e, como a cultura o nico mtodo

que permite testar a susceptibilidade antimicrobiana,


crucial manter e, quando necessrio, fortalecer a
capacidade de realizar a cultura em todos os pases.

Tabela 4.2: Testes de diagnstico comuns (junho de 2012) para a deteco de N. gonorrhoeae
Microscopiaa

Cultura

NAAT

Haste com secreo


endocervical

Sima

Sim

Sim

Haste com secreo


vaginal

No

Simb

Sim (alguns ensaios)

No
No

No
No

Simc
Sim

Sima

Sim

Sim

Haste com amostra retal No

Sim

Nod

Haste com amostra da


orofaringe

No

Sim

Nod

Haste com amostra da


conjuntiva

Sim

Sim

Nod

Sensibilidadee

Baixa-altaa

Moderada-alta

Muito alta

Especificidadee

Moderada-altaa Muito alta

Moderada-muito alta

Custos

Baixo

Moderado

Alto-muito alto

Instrumentao

Microscpio

Microbiologia de rotina

Grande infraestrutura

Rendimento/
automatizao

Moderado/no

Moderado/no

Alto/possvel

Complexidade tcnica

Baixa

Moderada

Alta

Nvel de infraestrutura
do laboratrio

Perifrico

Perifrico-intermedirio

Intermedirio-central

Mltiplos patgenos de
uma mesma amostra

No

No

C. trachomatis, T. vaginalis e HPV, em


algumas plataformas

Tipos de espcime

Urina
Feminina
Masculina
Haste com secreo
uretral

Desempenho

Outras consideraes

Outros comentrios

Coleta de amostra, trans- Os NAAT apresentam uma sensibilidade


porte e armazenamento
superior quando comparados cultura,
principalmente para amostras do reto
rigorosos so cruciais para
e faringe. Entretanto, a especificidade
manter a viabilidade.
pode ser abaixo da ideal, tornando Esse o nico mtodo que
se necessrio o uso de um NAAT
permite o teste de susceptibilidade antimicrobiana.
suplementar confirmatrio.

Gonorreia

25

HPV: papilomavrus humano; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos.


A microscopia apresenta uma alta sensibilidade e especificidade em homens sintomticos (com uretrite), baixa sensibilidade em homens
assintomticos e em infeces endocervicais, no sendo recomendada para espcimes vaginais, de urina, reto ou faringe.
a

No um espcime ideal, sendo aplicado principalmente em meninas impberes ou mulheres que realizaram histerectomia.

A urina no a amostra ideal para a deteco de N. gonorrhoeae em mulheres, devido baixa sensibilidade.

No h NAAT licenciado internacionalmente para o uso em amostras extragenitais, mas existem evidncias crescentes de que os NAAT so mais
sensveis para essas regies que a cultura. Recomenda-se que o NAAT positivo para espcimes do reto e da laringe sejam confirmados com um
teste confirmatrio (NAAT utilizando outra sequncia-alvo) para evitar resultados falso-positivos.
d

e
As estimativas de sensibilidade e especificidade variam amplamente, dependendo das diferentes sensibilidades e especificidades dos ensaios de
uma mesma metodologia, assim como em relao queles usados para comparao (o padro ouro).

Nas duas ltimas dcadas, os testes de amplificao


de cidos nucleicos (NAAT, do ingls nucleic acid
amplification test) foram desenvolvidos e introduzidos
para a deteco especfica do DNA/RNA da N.
gonorrhoeae. Esses testes so geralmente mais sensveis
do que a cultura para o diagnstico da gonorreia,
especialmente em amostras do reto e faringe (4-6).
No entanto, a Administrao de Alimentos e Drogas
dos Estados Unidos da Amrica (FDA, do ingls United
States of America Food and Drug Administration) ainda
no aprovou nenhum NAAT comercialmente licenciado
para uso em espcimes do reto e faringe. Alm disso,
a especificidade de vrios NAAT para gonococos
mostrou-se abaixo do ideal para o diagnstico de
amostras urogenitais e, em particular, amostras
extragenitais, o que resulta em baixo valor preditivo
positivo, principalmente em populaes de baixa
prevalncia.
At o momento, no h ensaios de imunofluorescncia
direta, imunoensaios enzimticos ou testes
rpidos remotos para a deteco de antgeno
com caractersticas de desempenho apropriadas
(sensibilidade e especificidade) ao diagnstico de
gonorreia descomplicada ou complicada. Alm disso, no
h mtodos comerciais e internacionais aprovados para
a deteco de anticorpos gonoccicos no soro, e esses
mtodos no podem diferenciar infeces atuais de
passadas. Estes no devem, ainda, ser utilizados devido
baixa sensibilidade e especificidade para o diagnstico
de gonorreia descomplicada e complicada em pacientes.
Para um desempenho apropriado de todos os mtodos
de diagnstico, fundamental seguir precisamente os
procedimentos operacionais padro, de acordo com as
recomendaes do fabricante na coleta, transporte e
armazenamento de amostras, assim como na execuo,
incluindo o controle de qualidade (CQ) do ensaio especfico.
26

A microscopia sensvel e especfica em


homens sintomticos com corrimento uretral.
A cultura, em circunstncias otimizadas,
sensvel, altamente especfica, de baixo
custo e permite o teste de susceptibilidade
antimicrobiana.
Os NAAT geralmente apresentam sensibilidade
superior quando comparados cultura,
principalmente para amostras do reto e
faringe. Entretanto, a especificidade de vrios
NAAT para gonococos abaixo da ideal para
o diagnstico de amostras urogenitais e,
em particular, amostras extragenitais, que
resultam em VPP baixos em populaes de
baixa prevalncia.

4.3 Coleta, transporte e armazenamento de


espcimes
As regies anatmicas apropriadas para a coleta de
espcimes dependem do sexo, idade e comportamento
sexual do indivduo; das manifestaes clnicas; e do
mtodo diagnstico, incluindo suas caractersticas
de desempenho (sensibilidade e especificidade). Em
mulheres, o canal endocervical o local primrio de
coleta para a utilizao em cultura e microscopia; para
o NAAT, colhe-se o material do canal endocervical ou
vagina. Os lugares secundrios incluem a uretra, o reto e
a orofaringe. Em homens heterossexuais, os espcimes
para cultura e microscopia devem ser coletados da
uretra e, para o NAAT, uma amostra de urina. Em HSH
e homens e mulheres com sinais clnicos indicativos e/
ou prtica sexual oral e/ou anal, amostras adicionais
devem ser coletadas do reto e da faringe. Os NAAT

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

apresentam maior sensibilidade para essas infeces


do que a cultura e podem aumentar a deteco de
casos (4, 6), embora, como mencionado, no existam
conjuntos de reagentes (kits) comerciais licenciados
para uso nessas reas. Para a cultura, que requer
organismos vivos, a amostra deve ser coletada em
reas com clulas epiteliais colunares ou cuboides e, se
o carvo no puder ser includo no meio de transporte
no nutritivo, devem-se usar preferencialmente hastes
com extremidades de dacron ou rayon, revestidas por
carvo estril. Para os diagnsticos utilizando NAAT,
devem-se seguir detalhadamente as recomendaes do
fabricante quanto coleta, transporte e armazenamento
das amostras. O uso de antisspticos, analgsicos e
lubrificantes durante a coleta do espcime deve ser
evitado, uma vez que estes podem inibir os gonococos.
Toda coleta de espcime deve ser realizada antes do
incio do tratamento antimicrobiano.
Endocrvice: insira 2-3cm de uma haste no orifcio
do colo do tero, girando-a, gentilmente, por 5-10
segundos. Amostras endocervicais no devem ser
coletadas em meninas impberes ou mulheres que
fizeram histerectomia; em vez disso, os espcimes
so colhidos no vestbulo da vagina. Adicionalmente,
amostras de urina tambm devem ser coletadas para o
diagnstico por NAAT.
Uretra: os espcimes so coletados na uretra, no
mnimo uma hora aps o paciente ter urinado. Coleta-se
a secreo diretamente em uma haste. Se no houver
corrimento evidente, a uretra deve ser despida em
direo ao orifcio para extrair o exsudado. Se o
exsudado no for obtido, insira 2-3cm de uma haste fina
na uretra, girando-a, gentilmente, por 5-10 segundos.
Em mulheres, deve-se massagear a uretra contra a

A s condies de coleta, transporte e


armazenamento de espcimes pode variar de
acordo com o ensaio de deteco e pode ter
uma influncia significativa na sensibilidade do
teste.
A seleo de espcimes e ensaios de deteco
apropriados crucial para o diagnstico
eficiente.

snfise pbica e usar a mesma tcnica aplicada para


homens. No exame de mulheres, a cultura das duas
amostras, endocervical e da uretra, pode aumentar a
deteco de casos.
Vagina (somente para NAAT): a haste deve ser girada
contra a parede posterior da vagina por cinco segundos.
As hastes com secreo vaginal podem ser obtidas
tanto pelo paciente quanto pelo mdico, com igual
utilidade (7, 8).
Primeiro jato de urina (somente para NAAT): o
paciente no precisa limpar a rea genital. Colete
10-20mL do primeiro jato de urina em um coletor estril,
no mnimo, uma hora depois que o paciente tiver urinado.
Reto: insira 2-3cm de uma haste no reto, girando-a
contra a parede retal por 10 segundos. Se ocorrer
contaminao por fezes, descarte a haste e use
outra para a obteno do espcime. Em pacientes
sintomticos, espcimes anorretais devem ser obtidos
preferencialmente sob viso direta aps a insero de
um protoscpio.
Orofaringe: utilize uma haste para coletar a amostra da
regio da faringe posterior, acima da borda inferior do
palato mole e das criptas tonsilares.
Conjuntiva: recolha a plpebra inferior e mova uma
haste fina ao longo da superfcie da conjuntiva palpebral
inferior em direo ao canto mediano do olho.

4.4 Diagnstico presuntivo: microscopia


4.4.1 Preparao de lminas para colorao
Prepare o esfregao como descrito no Anexo 1
(Microscopia). Fixe o esfregao seco por calor,
utilizando uma placa de aquecimento ou passando
trs vezes a lmina pela chama, mantendo a lamnula
voltada para cima. Evite superaquecer a lmina, uma
vez que isso provoca a distoro das clulas. A lmina
deve estar apenas morna ao ser tocada com a parte de
trs do punho.
Alm de ser simples e rpida, a microscopia aps a
colorao com azul de metileno (Figura 4.1) um mtodo
confivel para o diagnstico de gonorreia em homens
com uretrite purulenta (9). Entretanto, essa tcnica no
permite a diferenciao de cocos Gram-negativos e,

Gonorreia

27

portanto, apresenta baixa especificidade. A colorao


de Gram para identificar diplococos Gram-negativos
intracelulares em LPMN o mtodo de escolha para o
diagnstico presuntivo de N. gonorrhoeae (Figura 4.2).

Organismos extracelulares podem ser observados, mas,


sozinhos, eles so insuficientes para o diagnstico,
embora sejam usados algumas vezes para essa finalidade
quando em combinao com sintomas clnicos.

Figura 4.1
Microscopia da colorao de azul de metileno do
exsudado uretral masculino, mostrando diplococos
intracelulares em LPMN (1000x).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.

Figura 4.2
Microscopia da colorao de Gram do exsudado
uretral masculino, mostrando diplococos Gramnegativos intracelulares em LPMN (1000x).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010

Tabela 4.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras

28

Local
anatmico

Instrumento
de coleta

Procedimento de
amostragem

Endocrvice

Haste/plsticoa
(ou escova
endocervical
ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).

Use um espculo
vaginal e limpe o
ectocrvice. Insira
2-3cm de uma
haste e gire-a por
5-10 segundos.

Microscopia

Cultura

NAAT

Gire uma fina


camada sobre a
lmina e deixe-a
secar ao ar livre
(ver Anexo 1).
A sensibilidade
para amostras
endocervicais
abaixo da ideal.

Realize inoculao
imediata em
meio gonoccico
seletivo e incube
imediatamente. Se a
coleta e inoculao no
puderem ser realizadas
no mesmo lugar,
deve-se utilizar meio de
transporte gonoccico
no nutritivo ou
nutritivo.b
Espcimes em meio de
transporte no nutritivo
devem ser inoculados
no laboratrio o mais
rpido possvel e, no
mximo, em 48 horas
(ver tambm seo
4.5).

Coloque no
instrumento
de coleta do
fabricante.
Transporte e
armazene de
acordo com
as instrues
de fabricante.
Se o meio de
transporte no for
providenciado pelo
fabricante, use
meio de transporte
apropriado para
estabilizar o cido
nuclico, por
exemplo, tubos
GeneLock.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 4.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)


Local
anatmico

Instrumento
de coleta

Procedimento de
amostragem

Uretra
(coletada aps
1h aps
ltima urina)

Haste/
alumnioc
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).

Colete a secreo
diretamente na
haste. Insira
2-3cm da haste
na uretra e gire-a
gentilmente por
5-10 segundos.

Vagina

Haste/plsticoa
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).

A amostra pode
NA
ser obtida por
mdicos ou pelo
prprio paciente.
Gire a haste contra
a parede vaginal
posterior por 5
segundos.

Urina (coletada Copo para


O paciente no
1 hora aps coleta de urina deve limpar a rea
ltima urina)
estril.
genital. Colete o
primeiro jato de
urina (em geral,
menos de 25mL).

Microscopia

Cultura

NAAT

Gire uma fina


camada sobre a
lmina e deixe-a
secar ao ar livre
(ver Anexo 1).

Para o transporte e
armazenagem, ver
cultura de amostras
endocervicais.

Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.

Usada para meninas


impberes ou mulheres
com histerectomia.
Para o transporte e
armazenagem, ver
cultura de amostras
endocervicais.

Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.d

NA

Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.

NA

Reto

Haste/plsticoa
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).

Insira 2-3 cm da
NA
haste no reto e
gire-a contra todas
as paredes retais
por 10 segundos.

Para o transporte e
armazenagem, ver
cultura de amostras
endocervicais.

Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.d

Orofaringe

Haste/plsticoa
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).

Utilize uma haste


NA
para coletar a
amostra da regio
da faringe posterior
e criptas tonsilares.

Para o transporte e
armazenagem, ver
cultura de amostras
endocervicais.

Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.d

Gonorreia

29

Tabela 4.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)


Local
anatmico

Instrumento
de coleta

Procedimento de
amostragem

Conjuntiva

Haste/
alumnioc
(ou conjunto
de coleta
especfico
para ensaio de
NAAT).

A secreo
purulenta deve ser
removida com uma
haste. Retraia a
plpebra inferior.
Mova uma haste ao
longo da superfcie
da conjuntiva
palpebral inferior.

Microscopia

Cultura

NAAT

Gire uma fina


camada sobre a
lmina e deixe-a
secar ao ar livre
(ver Anexo 1).
Principalmente
para neonatos.

Para o transporte e
armazenagem, ver
cultura de amostras
endocervicais.

Para o transporte
e armazenagem,
ver cultura
de amostras
endocervicais para
NAAT.d

NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos.


a

Hastes de plstico com extremidades de dacron ou rayon.

Deve-se utilizar o meio de transporte para N. gonorrhoeae no nutritivo apropriado, como o Amies ou Stuart (estocar a 4C antes do transporte),
ou o meio de transporte nutritivo (crescimento), como o Jembec, o Transgrow, o Gono-Pak ou o Sistema Intray GC (armazenar a 361C antes do
transporte).
b

Hastes de alumnio com extremidades de dacron ou rayon.

Ainda no h NAAT para amostras extragenitais de gonococos aprovado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da
Amrica (FDA, do ingls United States of America Food and Drug Administration); no entanto, para espcimes do reto e faringe, NAAT adequados
mostraram-se mais sensveis que a cultura (4-6), os quais podem ser teis caso haja dados de validao.
d

4.4.2 Procedimento de colorao de Gram

5. Contraste com safranina ou fucsina por um minuto.

1. Cubra o esfregao fixado com cristal de violeta por


30 segundos. Lave delicadamente com gua fria da
torneira.

6. Lave com gua corrente e seque suavemente com


um papel absorvente.

2. Inunde a lmina com soluo de iodo por 30


segundos. Lave gentilmente com gua fria da
torneira.
3. Proceda descolorao com acetona, acetonaetanol ou apenas etanol, at que a cor roxa pare
de ser liberada do esfregao. melhor segurar a
lmina utilizando uma luva, perto da gua corrente.
O tempo para descolorao depender do agente
qumico utilizado e da espessura do esfregao
ser menor (tipicamente alguns segundos) para a
acetona e ir requerer maior tempo (at um minuto)
para o lcool. A descolorao excessiva deve ser
evitada; caso contrrio, a bactria Gram-positiva
aparecer como Gram-negativa. Desconsidere
as pores mais espessas de um esfregao no
uniforme, as quais ainda podem liberar a cor azul.
4. Lave rapidamente em gua corrente para parar a
descolorao e seque o excesso de gua.

30

4.4.3 Procedimento da colorao de azul de


metileno
1. Cubra o esfregao com azul de metileno por 30-60
segundos.
2. Lave com gua corrente e seque suavemente com
um papel absorvente.

4.4.4 Leitura do esfregao e interpretao


Use um microscpio de luz e um leo de imerso de
boa qualidade, examinando a lmina com uma objetiva
de 100x (ocular de 10x). Os gonococos aparecem como
diplococos Gram-negativos no interior dos LPMN.
Sempre descreva exatamente o que se v no esfregao:
clulas epiteliais, LPMN, morfologia de bactrias e
localizao intracelular e extracelular. Uma lmina deve
ser examinada por no mnimo dois minutos antes que se
conclua que esta no apresenta diplococos intracelulares
Gram-negativos.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

4.4.5 Controle de qualidade (CQ) da microscopia


utilizando-se esfregaos com colorao
de Gram
O CQ deve ser realizado em intervalos regulares,
utilizando-se uma gama de bactrias com diferentes
reaes Gram e/ou espcimes-controle. Isso dever ser
feito sempre que se utilizar um novo lote de reagentes.

A microscopia sensvel e especfica em


homens sintomticos com corrimento uretral.
Entretanto, a microscopia apresenta uma
sensibilidade mais baixa em homens
assintomticos e em infeces endocervicais,
no fornecendo um diagnstico definitivo para
essas infeces.
A microscopia no recomendada para o
diagnstico de infeces no reto e na faringe.

principalmente em espcimes de pacientes


assintomticos que possuem um pequeno nmero
de organismos. Quando se estima que o tempo de
deslocamento ser superior a 48 horas, ideal utilizar
um meio de transporte nutritivo, (crescimento) que
incorpore um meio de cultura e fornea uma atmosfera
com concentrao de CO2 aumentada. O mximo de
sobrevivncia e recuperao de gonococos a partir de
um meio de transporte no nutritivo obtido quando o
inoculado em meio de transporte de Stuart ou Amies
(ver Anexo 4) armazenado em um refrigerador a 2-8C
antes que o mesmo seja transportado para o laboratrio.
Esse meio retarda o crescimento de gonococos,
prevenindo a perda da viabilidade. Em contrapartida,
o mximo de sobrevivncia a partir de um meio de
transporte nutritivo (crescimento) obtido quando os
espcimes so pr-incubados em um meio de transporte
a 361C durante a noite, antes do transporte para o
laboratrio; resultados aceitveis so obtidos se o tempo
de transporte no exceder dois dias (11).

4.5 Cultura e identificao de N. gonorrhoeae


(presuntivo e definitivo)

A viabilidade de uma cultura para o diagnstico de


gonorreia depende de uma srie de fatores:

4.5.1 Transporte e cultura

Nmero de lugares de amostragem;

A cultura continua sendo essencial para o teste de


susceptibilidade antimicrobiana (ver seo 4.8). Os
gonococos so altamente susceptveis s condies
ambientais (temperatura, dessecao, oxidao e
substncias txicas) e o transporte dos espcimes
da clnica para o laboratrio (Tabela 4.3) reduzir a
viabilidade dos organismos. Os espcimes inoculados
diretamente em um meio de cultura seletivo nutritivo (ver
abaixo) no consultrio mdico o mtodo ideal, mas caso
isso no seja vivel, as hastes devem ser inseridas em
um meio de transporte no nutritivo, como o de Stuart
ou Amies (ver Anexo 4) ou inoculadas em um sistema
de transporte nutritivo (crescimento) como o Transgrow
(10, 11), o Jembec (10, 11), o Gono-Pak ou o Sistema
InTray GC. Com a utilizao de um meio de transporte
no nutritivo, a taxa de isolamento aps o transporte
de espcimes na temperatura ambiente (20-25C) de
aproximadamente 100% no intervalo de seis horas e mais
de 90% em 12 horas.

Tcnica e hastes utilizadas para a coleta dos


espcimes;

Aps 48 horas, no entanto, o nmero de gonococos


diminui e a recuperao pode no ser mais possvel,

Condies e durao do transporte;


Composio e qualidade do meio de cultura;
Condies de inoculao e incubao;
Reagentes e tcnicas utilizadas para a identificao
da espcie N. gonorrhoeae.
A prevalncia das cepas gonoccicas susceptveis s
concentraes de antibiticos, normalmente utilizadas
nos meios de cultura seletivos de gar, negligenciada na
maioria dos pases. Sendo assim, recomenda-se que os
meios de cultura seletivos nutritivos, como o de ThayerMartin (13), o meio de Thayer-Martin modificado (MTM;
ver Anexo 4) e o gar New York City (14) sejam utilizados
para o diagnstico de rotina de gonorreia. Se os recursos
permitirem, para espcimes urogenitais, tambm ideal
que se utilize uma placa com meio de cultura no seletivo
para cada amostra. Em algumas reas geogrficas, at

Gonorreia

31

5% dos gonococos podem ser susceptveis a vancomicina


usada em meio de cultura com concentrao de 3-4mg/L
(15); dessa forma, recomenda-se o uso de suplementos
seletivos com a concentrao de vancomicina
reduzida de 2mg/L ou com lincomicina (1mg/L), que
menos inibitria para a bactria contaminante que a
vancomicina. Se as amostras do reto e da faringe so
testadas frequentemente, recomenda-se o uso de altos
nveis de concentrao de vancomicina.

(dependendo da cepa gonoccica e do meio de cultura;


Figura 4.4). Aps a incubao adicional, as colnias
podem atingir 3mm em dimetro e tornarem-se menos
suaves. Frequentemente, aparece na placa uma mistura
de diferentes tipos de colnias.

4.5.2 Controle de qualidade (CQ) dos meios de


cultura
Cada lote de meio deve ser controlado quanto
esterilidade, habilidade de sustentar o crescimento de
gonococos e capacidade de inibir outros microrganismos
contaminantes. Para a avaliao da habilidade de
crescimento e o CQ de todos os mtodos diagnsticos,
as cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS de
2008 (16) esto disponveis a partir de fontes da OMS
(ver seo 4.8.3.3). Para o controle da inibio de
microrganismos no gonoccicos, podem-se utilizar as
cepas de referncia de, por exemplo, Escherichia coli
(ATCC 25922), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228),
N. sicca (ATCC 9913) e Candida albicans (ATCC 14053).

Figura 4.3
Jarro de anaerobiose com vela para a incubao de
placas de cultura de N. gonorrhoeae.

4.5.3 Inoculao de cultura e incubao


Gire a haste contendo o espcime por, aproximadamente,
um quarto da superfcie da placa, preferencialmente
placas de Petri com um dimetro de 90mm. Use uma
ala bacteriolgica estril para espalhar o inculo na
parte remanescente do meio para garantir o crescimento
isolado de colnias. Alternativamente, o espcime pode
ser inoculado sobre toda a superfcie da placa em um
padro Z e, em seguida, com listras em direo borda;
isso pode gerar colnias mais isoladas. Incubar as placas
inoculadas imediatamente a 361C em uma atmosfera
mida (umidade de aproximadamente 70-80%) contendo
51% de CO2 (jarro de anaerobiose com vela com bola
de algodo ou toalhas umedecidos [Figura 4.3], jarro
com envelopes geradores de CO2 ou incubadores de CO2
com uma vasilha com gua ou outro equipamento para
aumentar a umidade). Examine as placas aps 18-24
horas e, se negativas, novamente aps 48 horas. Aps
24 horas de incubao, colnias tpicas podem variar
em dimetro, de 0,5-1mm, e, em aparncia, de cinza a
brancas, transparentes a opacas e convexas a planas

32

Figura 4.4
Colnias tpicas de N. gonorrhoeae em meios de
cultura gonoccicos de gar seletivos (esquerda:
MTM) e no seletivos (direita: MTM sem antibiticos
adicionados), mostrando leve inibio de
crescimento pelos antibiticos seletivos.
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

4.5.4 Identificao presuntiva de N. gonorrhoeae


aps cultura
A identificao presuntiva de colnias com aparncia
de gonococos em um meio seletivo pode ser feita
utilizando-se colorao de Gram (ver seo 4.4.2) e
um teste de oxidase. O teste de oxidase detecta a
presena de citocromo c oxidase; o teste melhor
realizado ao esfregar algumas colnias diretamente
em uma tira de papel-filtro umedecido com o reagente
(soluo aquosa a 1% de tetrametil para-fenilenodiamina
dihidrocloreto), preparado tanto in-house quanto
comercialmente (por exemplo, oxidase BACTIDROP).
Um teste positivo muda a cor de transparente para
roxo em poucos (mximo de 30) segundos (Figura 4.5).
Alternativamente, o teste de oxidase pode ser realizado
colocando uma gota do reagente oxidase em poucas
colnias representativas em um meio de cultura puro.
Deve-se tomar cuidado, uma vez que o reagente
toxico para a bactria e, se apenas poucas colnias
esto presentes, estas devem ser subcultivadas antes
do teste. A observao de diplococos Gram-negativos
com colnias de morfologia tpica em um meio seletivo,
oxidase-positivos, a partir de espcimes genitais,
oferece uma identificao confivel e suficiente de N.
gonorrhoeae para o diagnstico presuntivo e altamente
preditiva de N. gonorrhoeae quando os espcimes so
cultivados em gar seletivo para gonococos, a partir de

amostras de pacientes de alto risco. Em situaes em


que os recursos so limitados, isso suficiente para
que se inicie o tratamento. No entanto, para fornecer
um diagnstico definitivo de gonorreia, necessrio
confirmar a identificao de N. gonorrhoeae por meio da
eliminao de espcies intimamente relacionadas, como
N. meningitis, N. lactamica e N. cinerea, que tambm
podem crescer em meios seletivos para isolamento
primrio de gonococos. Sugere-se sempre confirmar
a identificao de colnias Gram-negativas e oxidasepositivas de amostras extragenitais, uma vez que h
maior probabilidade de se isolar espcies de Neisseria
em vez de N. gonorrhoeae nesses lugares, principalmente
na faringe. Qualquer isolado gonoccico que ir ser
analisado subsequentemente, por exemplo, por teste de
susceptibilidade antimicrobiana (ver seo 4.8) ou por
determinao de tipos fenotpicos ou genticos, tambm
dever ter sua identificao confirmada.

4.5.5 Controle de qualidade (CQ) dos reagentes


para o teste de oxidase
O CQ deve ser realizado em intervalos regulares e sempre
que se for utilizar um novo lote de reagentes. Podem-se
usar as cepas de referncia oxidase-positivas, como N.
gonorrhoeae (cepa de referncia da OMS de 2008; 16), e
negativas, como S. epidermidis (ATCC 12228) ou E. coli
(ATCC 25922).

Figura 4.5
Colnias roxas oxidase-positivas de N. gonorrhoeae em uma placa de cultura (foto esquerda, placa de gar
direita) e papel-filtro ( direita, tambm mostrando uma reao negativa que permanece amarela), aps
reao com soluo aquosa a 1% de tetrametil para-fenilenodiamina dihidrocloreto.

Gonorreia

33

4.5.6 Confirmao da identificao de N.


gonorrhoeae aps cultura
Trs abordagens podem ser utilizadas para a
confirmao: o uso de testes bioqumicos que diferenciam
a Neisseria divergente e outras espcies intimamente
relacionadas e que fornecem uma identificao completa
das espcies; o uso de reagentes imunolgicos; ou o
uso de deteco molecular, que especfica para N.
gonorrhoeae, mas que apenas confirma a identidade de
N. gonorrhoeae e no determina a espcie de isolados
de reaes negativas. A escolha entre essas abordagens
depender do nmero de isolados a serem testados, sua
especialidade e custos. Em laboratrios que identificam
isolados gonoccicos com pouca frequncia, sugere-se
o uso de conjuntos de reagentes (kits) comerciais
disponveis para fornecer a identificao completa.
Em laboratrios que identificam muitos isolados, a N.
gonorrhoeae frequentemente confirmada por meio
de reagentes especficos e, ento, se algum deles for
inesperadamente negativo, dever ser testado em
seguida utilizando-se um conjunto bioqumico. Nenhum
teste 100% sensvel ou especfico; portanto, se
houver recursos, recomenda-se frequentemente que os
isolados clnicos de N. gonorrhoeae sejam confirmados
por meio de uma combinao de testes bioqumicos e
imunolgicos (ou testes moleculares, quando disponveis).
Essa abordagem especialmente recomendada para os
laboratrios de referncia.
4.5.6.1 Testes que diferenciam as espcies de
Neisseria
Tradicionalmente, a habilidade de N. gonorrhoeae de
produzir cido a partir da utilizao de glicose, detectada
pela mudana de cor de um indicador de pH devido ao
seu pH reduzido, em comparao, por exemplo, com
N. meningitidis, que utiliza, adicionalmente, a maltose,
tem sido o principal mtodo de identificao desse
patgeno (Tabela 4.4). O nico padro de utilizao de
carboidratos a deteco por meio de inoculao de
culturas puras em gar cistena tripticase (ACT) contendo
glicose, maltose e sacarose, respectivamente, em uma
concentrao final de 1-2%, seguida por 24 horas de
incubao (Figura 4.6; 17 ).

34

Figura 4.6
Produo de cido a partir da utilizao de
carboidrato em meio gar cistena tripticase (ACT).
Os tubos da esquerda para a direita so meios
base de ACT sem carboidrato, meio ACT contendo
1% de glicose e meio ACT contendo 1% de maltose.
O isolado bacteriano inoculado N. gonorrhoeae.
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.

essencial que esse teste seja realizado utilizando-se


uma cultura pura; pode ser necessria pelo menos
uma subcultura, resultando em um maior tempo para a
confirmao da identificao em relao aos testes mais
rpidos descritos adiante.
O teste de utilizao rpida de carboidrato (RCUT,
do ingls rapid carbohydrate utilization test) (18, 19),
que depende de enzimas pr-formadas e no do seu
crescimento, utilizando meio lquido inoculado com
colnias puras crescidas em abundncia, tambm
eficiente, produzindo resultados em quatro horas.
A deteco rpida de enzimas pr-formadas tambm
exige uma cultura pura (a qual deve sempre ser
selecionada a partir de um meio no seletivo), mas
no requer incubao ao longo da noite para o teste
e fornece resultados mais rpidos. Para todos esses
testes, importante seguir precisamente as instrues
do fabricante. Basicamente, esses testes detectam
enzimas diferentes da via de aminopeptidase e
incluem o Gonochek-II (E-Y Laboratories) (17, 19) e o
teste de enzima pr-formada (PET, do ingls preformed
enzyme test; Key Scientific) para Neisseria (17). O teste
Gonochek-II utilizado para diferenciar as espcies

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 4.4: Utilizao de carboidratos (acar) e atividade enzimtica de diferentes espcies de Neisseria e
outras espcies oxidase-positivas como a Moraxella catarrhalis e Kingella denitrificans
Atividade bioqumica
Espcies

Glicose

Maltose Lactose

Saccharose Frutose
(sacarose) (Levulose) ONPGa

N. gonorrhoeae

+ ()

N. meningitidis

+ ()

(+)

N. lactamicad

N. polysaccharead

+/

N. cineread

(+)

N. subflavad,e

+/

+/

N. sicca

N. mucosa

N. flavescens

M. catarrhalis

(+)

K. denitrificans

ONPG, orto-nitrofenil--galactosidase.

GGT, -glutamil-aminopeptidase (transferase).

PIP, prolyl aminopeptidase (hidroxiprolina aminopeptidase; HPA, prolina arilamidase; PRO)

GGTb

PIPc

N. lactamica normalmente cresce em meios seletivos para gonococos, mas tambm podem aparecer essas outras Neisseria saprfita no
patognicas.

Incluem os biotipos subflava, flava e perflava, os quais diferem em suas atividades contra sacarose e frutose.

+/-, no consistente para a espcie; + (-), maioria positiva, mas existem linhagens negativas; - (+),maioria negativa mas existem linhagens
positivas.

de Neisseria por meio da deteco de trs enzimas


pr-formadas (Prolyl aminopeptidase [PIP, do ingls
prolyliminopeptidase], -glutamil-aminopeptidase e
-galactosidase).
Uma mudana para a cor azul indica que h hidrlise
do 5-bromo-4-cloro-3-indolil--galactosdeo pela
-galactosidase, que indicativo de N. lactamica.
Uma cor amarela indica a hidrlise de -glutamilparanitroanilida por -glutamil-aminopeptidase, que
caracterstico de N. meningitidis. Na ausncia de
mudana de colorao, a tampa primria removida e
substituda pela secundria, que apresenta um corante
diazo (que um revelador de cor) e o tubo invertido.
Se a cor vermelha observada, isso indica a hidrlise
de L-prolina-4- metoxinaftilamida e a presena de
PIP, fornecendo uma identificao presuntiva de N.

gonorrhoeae. Os testes PET para Neisseria funcionam


com um princpio similar, com pequenas variaes. Aps
a incubao a 37C por 30 minutos, a mudana de cor
ocorre de acordo com o descrito para Gonochek-II. Se
no houver colorao aps 30 minutos, uma gota do
reagente do PET adicionada e a cor registrada aps
mais dois minutos.
importante observar que algumas espcies de Neisseria
saprfitas, como N. cinerea, N. polysaccharea e N.
subflava, podem aparecer em meios especializados
para gonococos aps 24-48 horas de incubao; essas
espcies apresentam PIP e, portanto, podem produzir
falso-positivos com o GONOchek-II e os kits de PET
para Neisseria. Falso-negativos tambm podem ocorrer
com isolados de N. gonorrhoeae que no apresentam a
expresso de enzimas prolilaminopeptidase funcionais, e

Gonorreia

35

existe uma disseminao mundial de clones gonoccicos


PIP-negativos (20). Isolados ocasionais de N. meningitidis
colhidos em locais urogenitais no apresentam
-glutamil-aminopeptidase.
No se recomenda a verificao de espcies utilizando
apenas os testes de enzimas pr-formadas. Entretanto,
uma combinao da utilizao de carboidratos e
a deteco de enzimas pr-formadas, disponvel
comercialmente em kits rpidos, fornece uma
identificao mais confivel.
essencial que se sigam rigorosamente as instrues
dos fabricantes para esses testes. O API NH (bioMerieux)
e o RapID NH (Remel) (17) so dois exemplos desses kits
que, infelizmente, podem ser muito onerosos para lugares
com recursos limitados. Ambos contm substratos
desidratados em uma srie de cpulas ou poos, que so
preenchidos com uma suspenso de colnias a serem
identificadas; aps 2-4 horas de incubao a 37C, as
reaes de colorao so registradas. Um nmero de
perfil produzido e a identificao obtida por meio da
comparao com um banco de dados (em papel ou pela
internet). O API NH possui 10 poos (permitindo 13 testes
de identificao), que incluem o teste de -lactamase,
quatro testes de utilizao de carboidrato e oito testes
bioqumicos para diferentes reaes enzima-substrato
(Figura 4.7). O RapID NH consiste em duas cavidades
de carboidrato e 11 poos bioqumicos para diferentes
reaes enzima-substrato (ver as principais reaes para
distinguir as espcies de Neisseria na Tabela 4.4).

4.5.6.2 Controle de qualidade (CQ) para ensaios


bioqumicos de verificao de espcies
Cada lote novo de ensaios disponveis comercialmente
ou de reagentes in-house deve passar pelo controle de
qualidade, utilizando-se cepas bacterianas de referncia
apropriadas, como N. gonorrhoeae (cepa de referncia
da OMS de 2008; 16), N. meningitidis (ATCC BAA-335),
N. lactamica (ATCC 23970), N. sicca (ATCC 9913) e N.
cinerea (ATCC 14685). Alm disso, toda vez que se realiza
o ensaio de confirmao de espcie, as mesmas cepas
de referncia devem ser includas como controle.
Recentemente, a espectrometria de massa (EM) por
ionizao e dessoro a laser assistida por matriz
tempo de vo (MALDI-TOF, do ingls matrix-assisted
laser desorption ionization time of flight) comeou
a ser introduzida em laboratrios com bons recursos
para a verificao de espcies da maioria das
espcies bacterianas, incluindo as de Neisseria (21). O
equipamento para esse mtodo sofisticado dispendioso.
Entretanto, o custo para isolados com espcie verificada
baixo e o mtodo fcil de ser realizado, alm de muito
rpido. A EM MALDI-TOF parece distinguir efetivamente
entre espcies de Neisseria comensais e patognicas,
alm de distinguir a N. meningitidis da N. gonorrhoeae.
No entanto, so necessrias avaliaes adicionais.
Quando o sistema EM MALDI-TOF utilizado para a
verificao de espcies de N. gonorrhoeae, importante
seguir precisamente as instrues do fabricante.

Figura 4.7
Conjunto de identificao API NH demonstrando o perfil de N. gonorrhoeae.

36

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

4.5.6.3 Testes especficos para N. gonorrhoeae


A confirmao por testes especficos para N. gonorrhoeae
pode ser de base imunolgica ou molecular, sendo
especialmente til em laboratrios que lidam com um
grande nmero de isolados para identificao e que
podem pagar por esses testes relativamente mais
onerosos. Tais ensaios so realizados diretamente em
colnias mediante placas de isolamento seletivas e no
exigem o uso de subculturas puras. Isso significa que um
isolado pode ser identificado pelo menos 24 horas antes
do que os ensaios rpidos de carboidrato ou enzima
substrato.
O teste Phadebact Monoclonal GC (Boule) o conjunto
disponvel comercialmente mais popular (17, 19),
que contm uma mistura de anticorpos monoclonais
direcionados porina principal da membrana externa
PorB (Por). Esses anticorpos so absorvidos, por meio
do seu segmento Fc, pela protena A de Staphylococcus
aureus e, quando misturados com o antgeno gonoccico,
ocorre a aglutinao. O teste requer uma suspenso
leve do organismo a ser testado (aproximadamente uma
densidade de 0,5 de acordo com a escala nefelomtrica
de McFarland; ver Anexo 4) feita no tampo do fabricante
ou em soluo salina tamponada com fosfato (PBS, do
ingls phosphate-buffered saline solution), estril a 0,9%,
que ento fervida por 10 minutos e esfriada antes do
seu uso. A suspenso deve ser fervida imediatamente
aps preparada, uma vez que atrasos resultaro em lise
da bactria e liberao do DNA bacteriano, o que pode
causar auto-aglutinao e dificuldade na leitura do teste.
Uma gota da suspenso misturada por dois minutos
a cada um dos dois reagentes, que permitem, alm da
identificao, a determinao do sorogrupo em WI (IA;
PorB1a) e WII/III (IB; PorB1b) (Figura 4.8). O reagente
de colorao azul, para auxiliar na leitura da reao
de aglutinao. O teste apresenta alta sensibilidade
e especificidade, pois uma mistura de anticorpos
especficos (em vez de um nico anticorpo) a um antgeno
conservado. Falso-negativos no so habituais, mas
podem ocorrer.
O reagente imunofluorescente MicroTrak do teste de
confirmao de cultura de N. gonorrhoeae (Trinity
Biotech) (16, 17) usa um conjunto similar de anticorpos
monoclonais a PorB, mas ligado fluorescena. Um

esfregao fino de quatro ou cinco colnias emulsificado


em gua destilada sobre uma lmina de microscpio,
fixado e coberto com o reagente. Aps a incubao a
37C em uma cmara mida, a lmina lavada, seca, e
ento examinada para verificar a presena de diplococos
verdes fluorescentes sob a objetiva de imerso de 100x,
utilizando um microscpio fluorescente. Esse teste
tambm era altamente sensvel e especfico e podia ser
usado diretamente no meio primrio de isolamento, mas,
infelizmente, teve seu uso recentemente descontinuado.

Figura 4.8
Reao de duas cepas de N. gonorrhoeae (A,
poos 1 e 2, e B, poos 5 e 6) com reagentes de
coaglutinao Phadebact WI (poos 1 e 5) e WII/III
(poos 2 e 6).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.

O GonoGen II (17, 19) tambm emprega um painel


semelhante de anticorpos, mas, nesse teste, os
anticorpos monoclonais so adsorvidos em uma
suspenso de partculas sol-metlica. Quando a cultura
emulsificada nesse tampo solubilizante, a membrana
externa do organismo removida, liberando os
complexos contendo PorB na soluo. Esses complexos
PorB liberados so, ento, capturados por partculas de
anticorpo/sol-metlicas. A mistura amostra/reagente
filtrada por meio de um aparato de matriz especial; os
complexos anticorpo/sol-metlicos de PorB so retidos
pela matriz, resultando em um ponto vermelho. As
partculas anticorpo/sol-metlicas que no se ligaram ao
PorB iro passar pela matriz fornecendo um resultado
negativo (que varia de branco a rosa-claro).

Gonorreia

37

4.5.6.4 Controle de qualidade (CQ) de testes


imunolgicos de identificao
Cada lote novo de ensaios disponveis comercialmente
ou de reagentes in-house deve passar pelo controle
de qualidade, utilizando-se cepas de referncia de N.
gonorrhoeae para controles positivos de ambos os
sorogrupos WI (IA, PorB1a; por exemplo, a cepa G de
referncia da OMS de 2008; 16) e WII/III (IB, PorB1b; por
exemplo, a cepa K de referncia da OMS de 2008; 16)
e controles negativos de outras espcies intimamente
relacionadas (por exemplo, N. lactamica, ATCC 23970).
Alm disso, cepas de referncia idnticas devem ser
includas todas as vezes que o mtodo for executado.
A confirmao molecular da identidade do patgeno
pode ser realizada utilizando os NAAT descritos na seo
4.6, o que, todavia, mais provavelmente aplicvel aos
laboratrios de referncia.

A cultura sensvel e altamente especfica em


circunstncias otimizadas, relativamente de
baixo custo e fornece organismos viveis para o
teste de susceptibilidade antimicrobiana.
Devido ao elevado nvel de resistncia
antimicrobiana em gonococos no mundo,
essencial que se mantenha e, em vrios lugares,
que se fortalea a capacidade de realizao de
culturas para permitir a vigilncia da resistncia
antimicrobiana.
Para uma cultura sensvel e especfica,
necessrio otimizar e garantir a qualidade da
coleta, transporte e armazenamento de amostras
e metodologia de cultura.

4.6 Deteco molecular


4.6.1 Introduo e ensaios moleculares
A deteco molecular de sequncias especficas dos
cidos nucleicos (DNA/RNA) de N. gonorrhoeae mais
comumente realizada utilizando-se kits disponveis
comercialmente para a deteco tanto de N. gonorrhoeae
como C. trachomatis no mesmo conjunto, algumas vezes
simultaneamente, o que frequentemente apresenta
pouco ou nenhum custo adicional direto. Os primeiros

38

testes moleculares desenvolvidos foram os ensaios


de hibridizao de cidos nucleicos no amplificados
(NAH, do ingls non-amplified nucleic acid hybridization
assays), como o PACE 2 (Gen-Probe) e Captura Hbrida
2 (CH2) CT/NG (Digene Corporation). Os ensaios NAH
baseiam-se na ligao de sondas especficas a cidos
nucleicos complementares e subsequente amplificao
do sinal para detectar a ligao. No entanto, os ensaios
NAH so substancialmente menos sensveis que os
NAAT e no devem ser usados para diagnstico quando
os NAAT estiverem disponveis.
Atualmente, os NAAT so usados principalmente para a
deteco de N. gonorrhoeae. Os NAAT para gonococos
detectam uma regio do DNA ou do RNAr especfica
para N. gonorrhoeae, e essa regio varia entre os
diferentes kits (ver Tabela 4.5). A sequncia-alvo
amplificada utilizando uma variedade de mtodos (Tabela
4.5) para produzir mltiplas cpias, que podem ser
facilmente detectadas. Para informaes bsicas sobre
os ensaios NAH e as diferentes tecnologias para NAAT,
ver Anexo 3 e Captulo 5 (C. trachomatis). Os NAAT
para gonococos so altamente sensveis e especficos
(mas a especificidade varia substancialmente entre os
NAAT) e podem ser usados com espcimes coletados
de forma no invasiva (por exemplo, urina, para homens,
e hastes com secreo vaginal, para mulheres). Isso
permite no apenas um nmero maior de pacientes
atendidos nas clnicas ou postos de cuidados primrios
de sade, mas tambm fornece os pr-requisitos
para uma triagem efetiva. Os NAAT, normalmente,
podem ser realizados em um dia til, fornecendo uma
resposta mais rpida que a cultura (mnimo de 2-3 dias)
e podem ser frequentemente usados em combinao
com a automao, permitindo um alto rendimento.
A sensibilidade dos NAAT frequentemente citada
como sendo maior que a da cultura, o que reflete uma
maior tolerncia a inadequaes nos processos de
coleta, transporte e armazenamento de amostras. As
desvantagens em utilizar os NAAT para a deteco
de N. gonorrhoeae incluem o custo de equipamentos
e reagentes, a atual ausncia de NAAT comercial
licenciado para espcimes extragenitais, a incapacidade
de realizar o teste de susceptibilidade antimicrobiana e
a especificidade abaixo do ideal de alguns ensaios NAAT
(ver sees 4.6.2-4). Apesar dessas desvantagens, o uso

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

de NAAT apropriados, ademais da cultura (para o teste


de susceptibilidade antimicrobiana), deve ser motivado
mesmo para lugares com poucos recursos. Tal pode ser
facilitado pela criao e apoio de laboratrios regionais
de referncia que forneam servios de diagnstico
utilizando esses mtodos. Os laboratrios regionais de
referncia oferecem muitas vantagens, como o maior
volume de testes realizados, adeso rigorosa a boas
prticas laboratoriais e melhoria na especializao
tcnica. O uso de laboratrios regionais pode reduzir o
custo ao se utilizarem ensaios de maior sensibilidade
e resulta em tempos de resposta equivalentes ou
reduzidos.
Os NAAT geralmente oferecem maior
sensibilidade, especialmente para amostras do
reto e da faringe (embora no sejam licenciados);
so normalmente muito especficos e podem ser
utilizados em amostras coletadas de forma no
invasiva.
Os ensaios moleculares so mais tolerantes a
inadequaes na coleta, transporte e condies de
armazenamento, alm de serem objetivos.
A especificidade de muitos NAAT para gonococos
inferior ideal (ver sees 4.6.2-4), o que
resulta em VPP baixo em populaes de baixa
prevalncia; NAAT suplementares que tenham
como alvo outras sequncias podem ser
necessrios para confirmao.
Se os NAAT aprovados internacionalmente no
podem ser utilizados, altamente recomendado
que a efetividade do NAAT proposto para uso
local seja estritamente validada antes que
o teste seja usado, e que a qualidade seja
garantida contra pelo menos um NAAT aprovado
internacionalmente.
Novos ensaios NAAT esto sendo rapidamente
disponibilizados e no podem ser antecipados nesse
documento. importante que se acesse constantemente
a literatura relevante para a avaliao de alta qualidade
dos novos ensaios, a fim de determinar o que melhor se
enquadra a cada laboratrio.

4.6.2 Tipos de espcimes para NAAT para N.


gonorrhoeae
Diferentes tipos de espcimes podem ser usados nos
NAAT, incluindo os de coleta invasiva, como espcimes
de Papanicolau (Pap) lquidos, hastes com secrees
cervicais e hastes com secrees da uretra (homens);
e no invasivos, como hastes com secrees vaginais
e urina (homens e mulheres). Entretanto, os diferentes
fabricantes produzem NAAT que so licenciados para
tipos de espcimes distintos, sendo, portanto, essencial
verificar as instrues do fabricante ou conduzir uma
extensiva validao de testes in-house. Deve-se notar
que a urina no uma amostra ideal para a deteco de
N. gonorrhoeae em mulheres, devido sua sensibilidade
reduzida (22). essencial que se sigam precisamente
as instrues do fabricante referentes s amostras
aprovadas; coleta, transporte e armazenamento de
amostras; e ao desempenho do NAAT.
No existem NAAT licenciados para uso em amostras
extragenitais (do reto e faringe), mas h fortes evidncias
de que os NAAT so mais sensveis para esses locais
do que a cultura (4-6). A validao de dados existe para
apoiar o seu uso, mas se recomenda que um exame
positivo, em ambos os lugares, seja confirmado por
um teste suplementar (um NAAT com outra sequnciaalvo) para prevenir resultados falso-positivos (23, 24).
A escolha do NAAT para espcimes da faringe deve ser
feita com cautela para evitar aqueles que apresentam
reao cruzada com espcies comensais de Neisseria ou
N. meningitidis.

4.6.3 Especificidade dos NAAT para N.


gonorrhoeae
Historicamente, h uma preocupao quanto
especificidade do alvo escolhido, uma vez que as
espcies do gnero Neisseria so intimamente
relacionadas geneticamente, e um grande nmero de
Neisseria comensais encontrado na faringe, reto e,
algumas vezes, no trato genital inferior. A identificao
da sequncia-alvo especfica para N. gonorrhoeae tem
sido um desafio, e a reao cruzada com vrias espcies
de Neisseria no gonoccicas foi descrita para alguns
kits, incluindo N. meningitidis, N. cinerea, N. flavescens,
N. lactamica, N. sicca e N. subflava (22-28). A gerao
mais recente de kits atualmente disponveis no mercado

Gonorreia

39

Tabela 4.5: NAAT aprovados pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica (FDA)
para a deteco de N. gonorrhoeae (junho de 2012)
Teste

APTIMA
Combo 2
(AC2)

Cobas Amplicor

Cobas 4800

Probetec ET

Probetec GC
Qx

Tempo
real CT/
NG

Fabricante

Gen-Probe

Roche

Roche

Becton,
Dickinson

Becton,
Dickinson

Abbott

Alvo

RNAr 16S

Gene da DNA
metiltransferase
citosinaespecfica

Regio
Repetida
Direta 9 (DR9)

PivNg
(homlogo
da protena
inversora de
pili)

Pili (regio
diferente da
Probetec ET)

Opa genes

Tecnologia

Amplificao
mediada por
transcrio
(TMA,
do ingls
transcriptionmediated
amplification

Reao em
cadeia da
polimerase
(PCR, do ingls
polymerase
chain reaction)

PCR em
tempo real

Amplificao
por
deslocamento
de cadeia
(SDA, do
ingls strand
displacement
amplification)

SDA

PCR em
tempo real

Teste
suplementar
disponvel

Sim
(diferentes
regies do
RNAr 16S)

No

No

No

No

No

tem melhorado muito quanto a esse quesito, o qual,


entretanto, ainda permanece como um fator a ser
considerado na seleo de kits apropriados para o tipo
de espcime a ser testado, uma vez que nem todos os
NAAT para gonorreia so iguais nesse ponto (26-28).

4.6.4 Sensibilidade, especificidade e


prevalncia: os efeitos no valor preditivo
positivo (VPP)
A prevalncia de gonorreia na populao a ser testada
deve ser considerada juntamente com a sensibilidade
e especificidade do NAAT a ser usado, uma vez que
isso afetar o VPP do teste e, desse modo, o nmero
de falso-positivos obtidos. Tal demonstrado na Tabela
4.6. Um VPP de >90% (usando um NAAT simples ou um
NAAT de triagem alm de um NAAT suplementar com
alvo diferente) foi sugerido como requisito mnimo ao se
utilizar um NAAT para a deteco de N. gonorrhoeae.

40

Deve-se notar que, mesmo quando a sensibilidade e a


especificidade de um NAAT acima de 95%, o VPP em
uma populao de tanto 1% quanto 5% ainda , para
a maioria dos NAAT, menor que 90%, enquanto que,
em uma prevalncia de 10%, o VPP da maioria (mas
no todos) dos NAAT maior que 90%. Esse aspecto
particularmente importante para NAAT duplos que
detectam tanto N. gonorrhoeae como C. trachomatis,
porque a prevalncia entre essas duas infeces pode
diferir acentuadamente. Em muitos pases, as infeces
por clamdia so comumente detectadas em uma
prevalncia consideravelmente maior que a da gonorreia
e os algoritmos para testar as duas infeces juntas
talvez no precisem de um teste suplementar para a
deteco de C. trachomatis, mas pode ser necessrio
que os exames positivos para gonorreia sejam testados
por um segundo NAAT (com outra sequncia-alvo) para a
obteno de VPP aceitveis.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

4.6.5. NAAT no aprovados pela Administrao


de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica (FDA)
Testes de amplificao de cidos nucleicos in-house que
utilizam como alvo, por exemplo, o gene cppB, gene da
DNA metiltransferase citosina-especfica (DMC), genes
opa e o pseudogene porA, foram descritos (24, 29-32)
e so extensivamente utilizados em alguns pases.
Os de maior xito so aqueles que tm como alvo o
pseudogene porA e os genes opa, tanto separados como
em combinao. O pseudogene porA ausente nas
espcies de Neisseria comensais (sendo o gene porA em
N. meningitidis bastante diferente) e, consequentemente,
esse alvo mostrou-se altamente especfico para N.
gonorrhoeae. Entretanto, muitos pases recentemente
descreveram isolados raros de N. gonorrhoeae contendo
um porA meningoccico no lugar do pseudogene porA
gonoccico, resultando em NAAT com resultados
falso-negativos (33-36). Os NAAT que apresentam
como alvo o gene cppB podem variar em sensibilidade
e especificidade, uma vez que alguns isolados de N.
gonorrhoeae no carregam esse gene; reciprocamente,
algumas cepas de N. meningitidis tambm no o
apresentam e geram reao cruzada. Alm disso, os
NAAT que tm como alvo os genes DMC podem mostrar
reao cruzada com espcies de Neisseria comensais.
Consequentemente, os NAAT para os genes cppB e
DMC no so recomendados. Os NAAT in-house podem
necessitar maior conhecimento tcnico; no entanto,
costumam ter sensibilidade e especificidade altas,
alm de envolver menor custo, podendo constituir uma
opo eficiente, principalmente, para nmeros pequenos
de amostras. Tambm foram desenvolvidos ensaios
de reao em cadeia da polimerase multiplex que
detectam, por exemplo, N. gonorrhoeae, C. trachomatis,
Mycoplasma genitalium, e Trichomonasis vaginalis; no
entanto, esses testes necessitam de maior avaliao
concernente s suas caractersticas de desempenho.
Consequentemente, existem, no mundo, muitos
NAAT disponveis comercialmente ou desenvolvidos
internamente para N. gonorrhoeae sendo utilizados.
Se qualquer NAAT no aprovado pela FDA for utilizado,
processos regulatrios regionais, como os da Unio

Tabela 4.6: Efeitos da prevalncia no valor preditivo


positivo (VPP) de testes simples
Testes
Sensibilidade
Especificidade
Prevalncia de
10%
VPP Prevalncia de
5%
Prevalncia de
1%

A
97,8%
99,2%

B
96,4%
97,9%

C
98,0%
99,7%

93%

84%

97%

87%

73%

95%

55%

35%

77%

Europeia e/ou nacionais, devem fornecer garantias


da qualidade e desempenho do NAAT diagnstico.
altamente recomendado que somente os NAAT
aprovados internacionalmente sejam utilizados.
Se isso no for possvel, essencial que o NAAT
proposto seja rigorosamente validado para as
necessidades locais contra, pelo menos, um NAAT
aprovado internacionalmente, antes de ser utilizado
e subsequentemente usado com controles positivo,
negativo e de inibio adequados, assim como para fins
de participao de um sistema de avaliao externa da
qualidade (AEQ) apropriado.

4.6.6 Controle de qualidade (CQ) e avaliao da


qualidade (AQ) dos NAAT
O controle interno da qualidade (CIQ) deve ser includo
em cada teste rodado. A avaliao interna da qualidade
(AIQ) deve ser realizada regularmente por meio de
novos testes em amostras cujo resultado original seja
velado. O nmero e a frequncia dessas AIQ dependero
do nmero total de testes realizados; um exemplo
de 1-5% do total testado a cada ms. A AIQ pode ser
alcanada por meio do uso de painis de espcimes de
fornecedores de AIQ apropriados, tais como o Servio
Nacional de Avaliao Externa da Qualidade do Reino
Unido (UK NEQAS, do ingls United Kingdom National
External Quality Assessment Service; www.ukneqas.
org.uk), ou o Controle de Qualidade dos Diagnsticos
Moleculares (QCMD, do ingls Quality Control of
Molecular Diagnostics; www.qcmd.org), os quais
entregam espcimes para vrios pases, ou por meio de
trocas mais informais de amostras entre laboratrios.

Gonorreia

41

4.7 Testes point-of-care (POC) (testes


rpidos)
Nenhum teste POC (teste rpido) est disponvel
para a deteco de antgeno com caractersticas de
desempenho apropriadas, por exemplo, sensibilidade
e especificidade; dessa forma, nenhum deles pode
ser recomendado para o diagnstico de gonorreia
complicada ou descomplicada. No entanto, alguns testes
POC novos, utilizando tecnologia recente, esto sendo
desenvolvidos e, com caractersticas de desempenho
apropriadas, seriam extremamente teis para o
diagnstico rpido no local, por exemplo, em clnicas
ou em campo. Em populaes recursos limitados e alta
prevalncia da infeco, principalmente, a diminuio da
sensibilidade pode ser aceitvel em vista da possibilidade
de testar e tratar enquanto o paciente estiver no local do
atendimento (37, 38). Os testes POC podem tambm ser
utilizados nesses lugares para aumentar a especificidade
dos algoritmos de gesto sindrmica, o que reduzir o
tratamento em excesso e encontrar muitas infeces
assintomticas, principalmente em mulheres. Para o
diagnstico de gonorreia em homens, a microscopia
aps a colorao de Gram um tipo de teste POC;
entretanto, esse mtodo no apresenta sensibilidade
adequada para mulheres.
Nenhum teste POC com sensibilidade apropriada
est disponvel; dessa forma, nenhum pode ser
recomendado para o diagnstico de gonorreia.
Entretanto, alguns testes POC novos, utilizando
tecnologia avanada, esto sendo desenvolvidos e,
com caractersticas de desempenho apropriadas,
seriam extremamente teis para o diagnstico
rpido e tratamento imediato do paciente.

4.8 Teste de susceptibilidade antimicrobiana


4.8.1 Introduo
A N. gonorrhoeae desenvolveu resistncia a todos os
antibiticos prvios de primeira gerao para o seu
tratamento como, por exemplo, penicilina, tetraciclina
e fluoroquinolonas , deixando apenas as cefalosporinas
de amplo espectro, ceftriaxona e cefixima, como os
nicos antibiticos recomendados para o tratamento
de infeces gonoccicas em muitos pases (2).

42

Durante a dcada passada, a susceptibilidade s


cefalosporinas de amplo espectro tambm diminuiu em
muitas regies do mundo, e a falha teraputica com
cefixima foi igualmente observada em vrios pases
(39-44). Recentemente, identificou-se a primeira cepa
gonoccica amplamente resistente a drogas (XDR, do
ingls extensively-drug resistant; 2) com ndice elevado
de resistncia tambm ceftriaxona (a ltima opo
disponvel para o tratamento emprico de primeira
gerao) (3, 43). Se as cepas resistentes ceftriaxona
se espalharem pelo mundo, a gonorreia no ser mais
tratvel com regimes antimicrobianos simples em
algumas circunstncias e, especialmente, em alguns
lugares (2). Consequentemente, o monitoramento local,
regional e global da susceptibilidade antimicrobiana da
N. gonorrhoeae crucial. A OMS revisou e reformulou
o Programa de Vigilncia da Susceptibilidade
Antimicrobiana Gonoccica (GASP; do ingls Gonococcal
Antimicrobial Susceptibility Surveillance Programme)
Global da OMS. Para mais informaes sobre a
vigilncia essencial da resistncia antimicrobiana no
mundo e sobre o GASP Global da OMS, ver os Padres
de Vigilncia da OMS para Resistncia Gonoccica
Antimicrobiana, Apndice 4. Em junho de 2012, a OMS
tambm divulgou o plano de ao global da OMS para
o controle da disperso e do impacto da resistncia
antimicrobiana em Neisseria gonorrhoeae (disponvel
em: www.who.int/ reproductivehealth/publications/
rtis/9789241503501/en/).
O mtodo de diluio em gar recomendado como
o padro ouro para o teste da susceptibilidade
antimicrobiana ou para a determinao da concentrao
mnima inibitria (CMI; em g/mL ou mg/L) de isolados
gonoccicos para drogas antimicrobianas. Entretanto,
esse mtodo pode ser trabalhoso e menos adequado para
a testagem de susceptibilidade de rotina, principalmente
se for realizado em um pequeno nmero de cepas. Dessa
forma, o mtodo-padro e de qualidade garantida, o
Etest, intimamente relacionado ao mtodo de diluio
em gar, comumente utilizado. Uma determinao
qualitativa da susceptibilidade antimicrobiana pode
ser obtida usando um ensaio de disco-difuso.
Vrios mtodos de disco-difuso tambm esto em
uso; entretanto, eles exigem uma padronizao bem
estabelecida e CQ apropriado para atingir um alto nvel
de reprodutibilidade e interpretao correta, a fim de

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

refletir adequadamente os valores de CMI dos diferentes


agentes antimicrobianos. Os mtodos de disco-difuso
tm baixo custo, mas apenas so recomendados quando
a determinao da CMI no pode ser realizada, devido
limitao de recursos ou outros motivos. Se o mtodo
de disco-difuso for utilizado, recomenda-se que a
identificao de qualquer resistncia nova, emergente
ou rara seja confirmada pela determinao da CMI. A
produo de -lactamase normalmente determinada
por um teste de cefalosporina cromognica, utilizando
discos ou solues de nitrocefina.
Todos os mtodos para o teste de susceptibilidade
antimicrobiana devem ser realizados a partir de culturas
puras e frescas (18-24 horas) de N. gonorrhoeae,
retiradas de um meio de cultura no seletivo. O isolado
tambm deve ser verificado apropriadamente quanto
espcie e subcultivado pelo menos uma vez. No teste
de susceptibilidade antimicrobiana, importante seguir
precisamente todos os passos do mtodo escolhido,
incluindo a seleo e o uso do meio gar, os reagentes
(p antimicrobiano, tiras para Etest, discos e tampes), a
inoculao, a incubao e a interpretao.
Devido ao elevado nvel de resistncia
antimicrobiana em gonococos no mundo e ao receio
de que a gonorreia possa se tornar no tratvel em
certas circunstncias e, principalmente em alguns
lugares, essencial monitorar a susceptibilidade
antimicrobiana de N. gonorrhoeae.
A determinao da CMI realizada pelo mtodo de
diluio em gar ou Etest.
Uma determinao qualitativa da susceptibilidade
antimicrobiana pode ser obtida usando mtodos de
disco-difuso.
Os mtodos de disco-difuso necessitam de
padronizao e CQ apropriados e, sobretudo,
no medem, mas apenas refletem a CMI. Esses
mtodos s devem ser utilizados quando a
determinao da CMI no pode ser realizada em
razo, por exemplo, de limitaes de recursos.
Em todos os testes de susceptibilidade
antimicrobiana, essencial seguir precisamente
o mtodo escolhido, o qual deve ser devidamente
padronizado, validado e com qualidade garantida.

4.8.2 Escolha dos antibiticos inclusos no teste


de susceptibilidade antimicrobiana
A lista de antibiticos a serem testados deve incluir
drogas recomendadas nacional e regionalmente,
utilizadas para o tratamento de infeces gonoccicas,
bem como as drogas recomendadas pelo programa
local de vigilncia susceptibilidade antimicrobiana. No
entanto, principalmente nos laboratrios de referncia,
antibiticos adicionais podem ser testados, tais como
antibiticos recomendados para tratamento em outros
lugares, antibiticos candidatos para tratamentos futuros
e drogas teis para estudos longitudinais locais de N.
gonorrhoeae.

4.8.3 Determinao da CMI (diluio em gar e


Etest)
4.8.3.1 Meios de gar recomendados
O meio recomendado para a determinao da CMI dos
diferentes antibiticos, usando diluio em gar ou
Etest, para isolados de N. gonorrhoeae, um meio gar
base GC apropriado, a exemplo do meio base GC Difco,
acrescido de um suplemento de crescimento definido a
1%* ou IsovitaleX/Vitox a 1%. Como um exemplo, ver o
meio GCVIT descrito no Anexo 4.
*De acordo com o Instituto de Padres Clnicos e
Laboratoriais (CLSI, do ingls Clinical and Laboratory
Standards Institute; 45): 1,1g de L-cistena; 0,03g de
guanina HCL; 3mg de tiamina HCl; 13mg de cido
para-aminobenzoico (PABA); 0,01g de B12; 0,1g de
cocarboxilase; 0,25g de NAD; 1g de adenina; 10g de
L-glutamina; 100g de glucose e 0,02g de nitrato frrico
(em 1L de H2O). O suplemento de crescimento sem
cistena necessrio para os testes de diluio em gar
com carbapenmicos e clavulanato.
4.8.3.2 Critrios de interpretao
Os critrios de interpretao para susceptibilidade,
susceptibilidade intermediria (reduzida) e resistncia
recomendados mediante a determinao da CMI esto
descritos na Tabela 4.7. Esses critrios so do CLSI (45),
com exceo do critrio para azitromicina (para o qual
o CLSI (45) no postulou nenhum critrio), que pertence
ao Comit Europeu para o Teste a Susceptibilidade
Antimicrobiana (EUCAST, do ingls European Committee

Gonorreia

43

on Antimicrobial Susceptibility Testing; www.eucast.


org). O EUCAST outra organizao que postula critrios
de interpretao para os testes de susceptibilidade

antimicrobiana para N. gonorrhoeae; em geral,


seus pontos crticos so levemente inferiores aos
recomendados pela CLSI.

Tabela 4.7: Critrios de interpretao da CMI para categorizar a N. gonorrhoeae em categorias de


susceptibilidade de acordo com a CLSI, com exceo do critrio para a azitromicina, da EUCAST
CMI (mg/L)
Antibiticos

Susceptvel (S)

Susceptibilidade
intermediria (I)

Resistente (R)

Ceftriaxona

0,25

ASDa

ASDa

Cefotaxima

0,5

ASDa

ASDa

Cefixima

0,25

ASDa

ASDa

Cefpodoxima

0,5

ASDa

ASDa

Benzilpenicilina

0,06

0,12-1

Ciprofloxacina

0,06

0,12-0,5

Ofloxacina

0,25

0,5-1

Espectinomicina

32

64

128

Azitromicinab

0,25

0,5

1c

CMI: concentrao mnima inibitria.


a
ASD: a ser determinado. Devido ausncia de um nmero adequado de cepas resistentes e correlaes baseadas em evidncia entre a CMI dos
isolados e o resultado do tratamento, os pontos crticos ainda no podem ser determinados.

O CLSI (45) ainda no postulou os pontos crticos para a azitromicina e, consequentemente, so fornecidos os pontos crticos do Comit Europeu
para o Teste Susceptibilidade Antimicrobiana (EUCAST, do ingls European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing; www.eucast.org).
b

Nas Amricas do Norte e do Sul, um ponto crtico de resistncia de 2mg/L frequentemente usado, de acordo com a recomendao dos Centros
de Controle e Preveno de Doenas dos Estados Unidos da Amrica (www.cdc.gov/std/GISP2007/).

4.8.3.3 Controle de qualidade (CQ) para a determinao


da CMI (diluio em gar e Etest)
Idealmente, uma seleo apropriada da cepa de
referncia de N. gonorrhoeae da OMS de 2008
(16) deveria ser includa em cada lote de teste de
susceptibilidade, e sempre que um novo lote de
antibitico em p, meio gar ou tiras de Etest so
usados. A CMI de cada antibitico e a cepa de referncia
devem ser documentadas em um grfico de CQ. Para
os valores de CMI aceitveis de diferentes antibiticos
no CQ, ver Tabela 4.8. As cepas de referncia de N.
gonorrhoeae da OMS de 2008 (16) tambm esto
disponveis na Coleo Nacional de Culturas Tipo (NCTC,
do ingls National Collection of Type Cultures; www.
hpacultures.org.uk/collections/nctc.jsp), denominadas

44

de NCTC 13477-13484, e na Coleo de Culturas da


Universidade de Gotemburgo, Sucia (CCUG; www.
ccug.se), denominadas de CCUG 57595-57602. As
cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS de
2008 (16) tambm podem ser utilizadas para o CQ em
outros testes laboratoriais fenotpicos e de gentica
para N. gonorrhoeae, bem como nos sistemas de AEQ.
Os Padres de Vigilncia da OMS para Resistncia
Gonoccica Antimicrobiana, Apndice 4, descrevem em
detalhes as aplicaes das cepas de referncia de N.
gonorrhoeae da OMS de 2008 (16) e as instrues para
seu uso. No entanto, no necessrio utilizar todas
as oito cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS
de 2008 (16) para o CQ no teste de susceptibilidade
antimicrobiana. Muitos locais utilizam principalmente a

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

WHO G, WHO K, WHO M, WHO O e a WHO P. O painel


de N. gonorrhoeae da OMS de 2008, o painel original
(cepas A-E) e as cepas de referncia adicionais de N.
gonorrhoeae tambm esto disponveis em fontes da
OMS, tais como o Centro de Colaborao da OMS para
HIV e DST, Sidney, Austrlia, e o Centro de Colaborao
da OMS para Gonorreia e outras DST, rebro, Sucia.

4.8.4 Mtodo de diluio em gar para a


determinao da CMI
4.8.4.1 Introduo
O mtodo de diluio em gar recomendado
como padro ouro para o teste quantitativo de
susceptibilidade antimicrobiana ou determinao da
CMI de isolados gonoccicos a antibiticos. Agentes
antimicrobianos so incorporados em gar base GC

Tabela 4.8: Intervalos aceitveis da CMI, categorizao da susceptibilidade antimicrobiana (modificado da


referncia 16) e algumas caractersticas adicionais de determinao de tipo para as cepas de referncia de
N. gonorrhoeae da OMS de 2008 recomendadas para CQ. Incluem-se os intervalos aceitveis da CMI para N.
gonorrhoeae ATCC 49226 recomendados pela CLSI
Agentes
antimicrobianos
(mg/L)

Cepas de referncia da OMS

ATCC
49226a

WHO F

WHO G

WHO K

WHO L

WHO M

WHO N

WHO O

WHO P

Penicilina G

0,016
0,064 (S)

0,251,0
(I)

1,04,0
(R)

1,04,0
(R)

4,016,0
(R)

4,016,0
(R)

>32 (R)

0,125
0,5
(I)

0,251,0

Cefixima

<0,016
(S)

<0,016
(S)

0,251,0
(SR)b

<0,016
(S)

<0,016
(S)

0,004
0,032

<0,002
(S)

0,004
0,016
(S)

0,032
0,125
(SR)b

0,008
0,032
(S)

0,002
0,008
(S)

<0,016
0,032
(S)
0,016
0,064
(S)

<0,016
(S)

Ceftriaxona

0,125
0,5
(SR)b
0,064
0,25
(SR)b

0,002
0,008
(S)

0,004
0,016

Eritromicina

0,25
1,0 (S)

0,5
2,0 (I)

0,5
2,0 (I)

1,0
4,0 (I)

0,5
2,0 (I)

0,251,0
(S)

0,5
2,0 (I)

2,0
8,0 (R)

1,0
2,0c

Azitromicina

0,064
0,25 (S)

0,125
0,5
(S)

0,125
0,5 (S)

0,25
1,0 (I)

0,1250,5
(S)

0,064
0,25 (S)

0,125
0,5
(S)

1,0
4,0 (R)

0,5
1,0c

Ciprofloxacina

0,002
0,008 (S)

0,064
0,25 (I)

>32 (R)

>32 (R)

1,04,0
(R)

2,08,0
(R)

0,004
0,016 (S)

0,002
0,008
(S)

0,001
0,008

Espectinomicina

1664
(S)

832
(S)

832 (S)

832 (S)

832 (S)

832 (S)

>1024
(R)

832
(S)

8,032,0

Produo de
-lactamase

No

No

No

No

Sim

Sim

Sim

No

No

Sorotipo

Arst

Arst

Bpyust

Brpyust

Bpyust

Arst

Boys

Bopt

NG-MASTd

ST3303

ST621

ST1424

ST1422

ST3304

ST556

ST495

ST3305

PIP-negativoe

No

Sim

No

No

No

Sim

No

No

Note-se que as CMI exatas mostradas devem ser usadas e interpretadas com cautela, pois foram definidas utilizando-se apenas um mtodo Etest
especfico e, consequentemente, podem diferir ao se utilizarem outros mtodos. Entretanto, os fentipos de resistncia identificados (categorizao
SIR) devem ser consistentes entre os diferentes mtodos.
a

Intervalos aceitveis da CMI (CLSI; 45).

SR: susceptibilidade reduzida, pois os isolados com essas CMI apresentam os determinantes primrios para resistncia s cefalosporinas de
amplo espectro.
b

Intervalo estabelecido pelo Laboratrio Nacional de Microbiologia, Canad.

Determinao do tipo de sequncias de mltiplos antgenos de N. gonorrhoeae.

No produz a enzima prolilaminopeptidase (PIP, do ingls prolyliminopeptidase), o que pode resultar na identificao duvidosa ou falso-negativa
de espcies de N. gonorrhoeae utilizando alguns testes bioqumicos ou de enzima-substrato (17, 20).
e

Gonorreia

45

acrescido de suplemento de crescimento definido a 1%


ou IsovitaleX/Vitox a 1% (ver seo 4.8.3.1) em diluies
seriadas duplicadas. Os isolados de N. gonorrhoeae a
serem testados crescem ao longo da noite em meio
gar GC no seletivo, sendo posteriormente suspensos
em caldo Mueller-Hinton (MH) ou soluo salina estril
(ou equivalente). Aproximadamente 104 unidades
formadoras de colnias (UFC) so, ento, inoculadas
na superfcie do meio contendo o antibitico e em
duas placas com meio controle sem antibitico, com
o repicador de Steer, o inoculador mltiplo ou uma
ala calibrada. As placas so finalmente incubadas ao
longo da noite e subsequentemente examinadas quanto
ao seu crescimento. A CMI do agente antimicrobiano
para um isolado a concentrao mais baixa que inibe
seu crescimento. A tcnica de diluio em gar por
pontos crticos uma modificao do mtodo completo
de diluio em gar para a CMI, que um mtodo
similar, mas com meio gar contendo apenas uma ou
duas concentraes de antibiticos, que podem ser
usadas para categorizar os isolados como resistentes
(usando uma placa de gar contendo exatamente a
concentrao do ponto crtico para resistncia) ou com
susceptibilidade intermediria (usando uma placa de
gar contendo exatamente a concentrao do ponto
crtico para susceptibilidade intermediria). A tcnica
de ponto crtico til para triar um grande nmero de
isolados.
4.8.4.2 Preparo de solues antimicrobianas
Os ps ou pastilhas antimicrobianos prprios para
serem dissolvidos devem ser obtidos diretamente de
companhias farmacuticas ou outros fornecedores
validados. Uma vez que a maioria dos antibiticos no
so 100% puros, a concentrao incorporada nas
placas de gar deve basear-se na atividade ou potncia
(droga ativa por mg) do antibitico, como especificado
pelo fabricante. As instrues do fabricante quanto
dissoluo do p antimicrobiano, a data de expirao e
as instrues para armazenamento devem ser seguidas
detalhamente. Os antibiticos so incorporados ao meio
gar em dissolues dobradas, por exemplo, usando um
esquema no qual uma parte da soluo do antibitico
adicionada para nove partes de gar (ver seo 4.8.4.3).

Por exemplo, prepare solues-estoque por meio da


dissoluo de 128mg ou o peso equivalente a 128mg do
ingrediente ativo em uma quantidade mnima do solvente
apropriado (normalmente 5-10mL; siga precisamente
as instrues do fabricante), diluindo-as em seguida
com gua destilada (ou outro solvente recomendado)
para o volume exato de 25mL. Essas solues-estoque
contm o produto antimicrobiano a uma concentrao
de 5120mg/L, que prtica para preparar as solues
com as quais de fato se trabalhar. Caso no haja
contra indicaes pelo fabricante, os solventes listados
na Tabela 4.9 podem ser utilizados para a preparao
das solues-estoque. As solues-estoque podem
ser esterilizadas por membrana de filtrao (filtro
de 0,22m) e armazenadas em alquotas em tubos
devidamente selados a -20C ou, preferencialmente, a
-70C, por at seis meses. Quando descongeladas, as
solues devem ser usadas imediatamente, no devendo
ser congeladas novamente para uso posterior.
Para uso subsequente, prepare uma srie de diluies
dobradas para cada antibitico contendo concentraes
do agente antimicrobiano 10 vezes maior que a
concentrao final a ser obtida no gar. Um exemplo de
esquema padronizado para a preparao de diluies
com as quais se trabalhar mostrado na Tabela 4.10.
O intervalo de concentraes utilizado no teste de
susceptibilidade antimicrobiana deve ser adaptado a
cada antibitico e aos nveis de resistncia local. Para
muitos antibiticos, existe uma grande variao no
padro de susceptibilidade dos isolados gonoccicos
de diferentes pases. Para se diminuir o nmero de
concentraes a serem testadas, necessrio haver
uma aproximao da variao da susceptibilidade local
aos antibiticos testados. Caso seja desconhecida,
essa aproximao pode ser obtida por meio da
determinao dos limites inferior e superior do intervalo
de susceptibilidade desses antibiticos a um pequeno
nmero de isolados. Em geral, mais relevante e
importante conhecer o limite superior dos valores da CMI
do que o inferior.
4.8.4.3 Preparo de placas para o mtodo de diluio
em gar
Para cada antibitico e concentrao de antibitico a ser
testada, prepare um volume de, por exemplo, 89mL de

46

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

gar base GC adequado, tais como o meio base Difco


GC (3,6 g de gar base GC e 89mL de gua destilada),
em uma garrafa de vidro, que servir para a preparao
de quatro placas. Autoclave o meio gar na garrafa e,
ento, deixe esfriar a at uma temperatura de 50C
em banho-maria, antes de adicionar assepticamente
suplementos estreis (1mL de suplemento/IsoVitalex/
Vitox) e 10mL de soluo antimicrobiana pronta para
ser utilizada, isto , na concentrao a ser testada
(ver Tabela 4.10). Imediatamente, misture de forma
gentil, invertendo a garrafa trs vezes; remova a tampa
da garrafa, passe o bocal pela chama e derrame,
aproximadamente, 20-25mL do meio nas placas
(90mm de dimetro) para formar uma camada de
aproximadamente 3,5-4,5mm. Certifique-se de eliminar
as bolhas, movendo as placas gentilmente ou flambando
rapidamente a superfcie do gar, por exemplo, com o
auxlio da chama de um bico de Bunsen. Uma vez que
o gar esteja solidificado em temperatura ambiente,
Tabela 4.9: Solventes usados na preparao de
solues antimicrobianas para a determinao da
CMI, utilizando o mtodo de diluio em gara
Antibitico

Solvente

Ceftriaxona

gua destilada

Cefixima

Tampo fosfato a 0,1mol/L

Benzilpenicilina

gua destilada

Ciprofloxacina

gua ou HCL a 0,1mol/L

Azitromicina
Eritromicina

Etanol a 95% ou cido actico


glacialb
Etanol a 95% ou cido actico
glacialb

Espectinomicina

gua destilada

Gentamicina

gua destilada

Canamicina

gua destilada

Tetraciclina

gua destilada

Cloranfenicol

Etanol a 95%

Se o solvente ou o mtodo para a dissoluo do antibitico em p


fornecido pelo fabricante, siga precisamente as instrues includas.

b
Para o cido actico glacial, use gua destilada para a metade do
volume e adicionar o cido actico glacial gota a gota, at que este se
dissolva; no exceder 2,5L/mL.

estoque as placas invertidas em sacos plsticos selados,


a 4C, at que sejam utilizadas. Nessas condies, no
h perda significativa da atividade antimicrobiana por at
duas semanas. Entretanto, para penicilina, que menos
estvel, recomenda-se que as placas sejam usadas em
uma semana. Da mesma forma, placas com gar sem
antibiticos devem ser preparadas para ser utilizadas
como controle negativo.
4.8.4.4 Procedimento da determinao da CMI
utilizando diluio em gar
Preparao do inculo bacteriano: use uma ala ou
uma haste estril para coletar a N. gonorrhoeae a partir
de uma cultura pura de 18-24 horas em um meio gar
no seletivo para gonococos, e prepare uma suspenso
homogeneizada de clulas (equivalente a 0,5 no padro
nefelomtrico de McFarland, aproximadamente 108 UFC
por mL) em 1mL de caldo MH ou soluo salina estril
(a soluo deve ser usada em no mximo 15 minutos).
Dilua em 1:10 a suspenso em caldo MH ou soluo
salina estril para obter 107UFC/mL. Cuidadosamente,
transfira 0,5mL de cada suspenso para o repicador
correspondente ou para o poo do inoculador mltiplo.
Inoculao de placas: as placas de gar devem secar
antes da inoculao, isto , devem ser colocadas em
uma incubadora na posio invertida com a tampa
aberta. O repicador ou o inoculador mltiplo deve
transferir aproximadamente 1-2L de cada suspenso
para a superfcie do gar em reas circulares com
dimetros de 5-7mm, resultando em um inculo
bacteriano final de aproximadamente 104 UFC por local.
Ao testar um pequeno nmero de isolados, pode-se
utilizar uma ala plstica estril de 1L. Inocule
primeiramente uma placa de controle negativo (no
contendo antibitico), seguindo com a srie de placas
contendo concentraes diferentes de antibitico,
comeando com a de menor concentrao de cada
antibitico.
Finalmente, inocule uma segunda placa de controle
negativo para garantir que no houve contaminao
durante a inoculao. As cepas de referncia de N.
gonorrhoeae da OMS de 2008 (16) so recomendadas
como CQ (ver Tabela 4.8). Deixe o inculo secar e incube
as placas invertidas por 20-24 horas a 361C em uma
atmosfera enriquecida com CO2 a 51% com umidade

Gonorreia

47

Tabela 4.10: Preparo de diluies dos agentes antimicrobianos para a determinao da CMI, utilizando o
mtodo de diluio em gar
Soluo antimicrobiana

Volume
de gua
destilada

Concentrao
final na diluio
de 1:10 em gar
(mg/L)

Passo

Concentrao
(mg/L)

5120

Estoque

5120

Estoque

2560

256

5120

Estoque

1
1

1280

128

5120

Estoque

640

64

Passo 4

320

32

Passo 4

160

16

Passo 4

80

Passo 7

40

Passo 7

20

10

5
6
7
8
9

640
640
640
80
80

Fonte

Volume
(mL)

Concentrao da
diluio com a
qual se trabalhar
(mg/L)

10

80

Passo 7

11

10

Passo 10

0,5

Passo 10

2,5

0,25

Passo 10

1,25

0,125

Passo 13

0,625

0,06

Passo 13

0,3125

0,03

Passo 13

0,156

0,016

Passo 16

0,08

0,008

0,04

0,004

0,02

0,002

12
13
14
15
16
17

10
10
1,25
1,25
1,25
0,156

18

0,156

Passo 16

19

0,156

Passo 16

Figura 4.9
Resultados da determinao da CMI para N. gonorrhoeae usando o mtodo de diluio em gar. O meio
contendo 0,5mg/L de penicilina (placa esquerda) mostra a inibio de vrias cepas gonoccicas, enquanto
todas as cepas crescem satisfatoriamente no meio controle (placa a direita).

48

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

alta (70-80%). Esterilize os alfinetes e poos: envolva-os


em papel alumnio e os autoclave, colocando-os em
forno quente a 160C por duas horas ou mergulhando-os
em etanol a 70%; em seguida, passe-os pela chama.

2. Deixe que as tiras do Etest alcancem a temperatura


ambiente por aproximadamente 30 minutos. Um
pacote de Etest aberto dever ser armazenado em
um recipiente hermtico com dessecante.

Leitura dos resultados: os resultados das cepas


de referncia da OMS de 2008 (ver Tabela 4.8 para
valores aceitveis da CMI de diferentes antibiticos) e
as placas de controle negativo (deve haver crescimento
puro e aderente de gonococos em ambas as placas)
devem ser revisados e aprovados antes de se ler os
outros resultados. Se no forem aprovados, verificar os
possveis problemas e repetir o teste. Para os isolados
testados, registre a CMI como a menor concentrao
de agente antimicrobiano que inibe completamente o
crescimento.

3. Use uma ala ou uma haste estril para coletar


a N. gonorrhoeae a partir de uma cultura pura
de 18-24 horas em um meio gar no seletivo
para gonococos e prepare uma suspenso
homogeneizada de clulas (0,5 no padro
nefelomtrico de McFarland, aproximadamente 108

Interpretao de resultados: interprete os


resultados para os isolados testados em categorias de
susceptibilidade (ver Tabela 4.7).

4.8.5 Mtodo Etest para a determinao da CMI


4.8.5.1 Introduo
O Etest uma tcnica quantitativa para a determinao
da CMI de agentes antimicrobianos contra
microrganismos. O Etest utiliza tiras plsticas calibradas
com uma escala de CMI em g/mL (mg/L) e um
cdigo para identificar o agente antimicrobiano. Um
gradiente de concentrao pr-definido de antibiticos
imobilizado na outra superfcie da tira. Uma vez aplicado
na superfcie de uma placa de gar, o antibitico se
difunde no meio. A N. gonorrhoeae inoculada no meio
(antes da adio da tira) mostrar uma zona elptica
de inibio de crescimento aps incubao ao longo
da noite, se susceptvel ao teste antimicrobiano. A CMI
dever ser lida como uma interseco da elipse e da
escala gradiente marcada na tira. As instrues do
fabricante devero ser seguidas cuidadosamente quanto
ao armazenamento das tiras, desempenho e leitura dos
resultados do Etest.
4.8.5.2 Procedimento de determinao da CMI usando
Etest
1. Seque (retire a umidade visvel, mas no enxugue
em excesso) o nmero de placas de gar GCVIT (ver
Anexo 4) necessrias.

UFC por mL) em 1mL de soluo salina estril ou


PBS (a suspenso deve ser usada em no mximo 15
minutos). No use um caldo nutritivo para preparar
a suspenso.
4. Mergulhe uma haste estril na suspenso e remova
o excesso de fluido, pressionando e girando a haste
contra a parede do tubo.
5. Passe a haste por toda a superfcie do gar da
placa com GCVIT, uniformemente, em trs direes
(Figura 4.10) para produzir uma camada aderente.
6. Recoloque a tampa da placa e deixe a superfcie de
gar secar por aproximadamente 10 minutos.
7. Pressione o aplicador do Etest em uma tira do Etest
para colet-la (ou use uma pina estril), coloque-a
na superfcie do gar e empurre o pisto para baixo
para soltar a tira.
8. Confira se a tira est em completo contato
com o gar e remova possveis bolses de ar,
cuidadosamente, com o auxlio de uma ala da
menor para a maior concentrao do antibitico.
9. Coloque no mximo quatro tiras de Etest por placa
de 140-150mm e uma tira por placa de 90mm.
10. Uma vez aplicada no gar, a tira de Etest no deve
ser removida (o antibitico prontamente liberado).
11. Incube, imediatamente, as placas invertidas por
20-24 horas a 361C em uma atmosfera mida
(70-80%) rica em CO2 a 51% (incubador de CO2
ou, caso este no esteja disponvel, um jarro de
anaerobiose com vela com umidade adicional).

Gonorreia

49

1. Pincele a cultura de cima


para baixo com um trao nico
sobre toda a superfcie de gar.

2. Gire a placa 90 e pincele de


cima para baixo com um trao
nico sobre toda a superfcie
de gar.

3. Gire a placa 45 e pincele,


novamente, de cima para baixo
com um trao nico sobre toda
a superfcie de gar.

Figura 4.10
Pincelagem da placa de cultura para Etest.

4.8.5.3 Leitura e interpretao dos resultados do Etest


aps incubao
1. Os resultados das cepas de referncia da OMS de
2008 (ver Tabela 4.8 para as CMI aceitveis dos
diferentes antibiticos), quando includas como
CQ, devem ser revisados e aprovados antes que
os outros resultados sejam lidos. Se no forem
aprovados, verificar os possveis problemas e
repetir o teste. Para os isolados testados, leia as
placas apenas se observar crescimento suficiente e
se a elipse de inibio for claramente visvel. Caso
contrrio, o teste dever ser repetido com maior
crescimento.
2. Leia a CMI exata onde a elipse (zona) intercepta a
escala de CMI na tira do Etest (Figura 4.11). Se a
elipse de inibio intercepta a tira do Etest entre
dois valores de CMI, o valor mais alto deve ser
considerado. Sempre leia o ponto final da completa
inibio de todo o crescimento, incluindo nvoas,
microcolnias e macrocolnias isoladas.
3. O crescimento ao longo de toda a tira implica a
ausncia de inibio, isto , a CMI maior que (>)
a maior concentrao da tira. Se a elipse de inibio
est abaixo da tira e no a intercepta, a CMI
menor que (<) a concentrao mais baixa da tira.
4. Interprete os resultados para os isolados testados
em uma categoria de susceptibilidade (ver Tabela
4.7).

50

Figura 4.11
Resultado da determinao da CMI em N.
gonorrhoeae usando o Etest. A CMI da penicilina G
(PG) determinada no ponto em que a elipse cruza a
tira (0,094mg/L).

4.8.6 Mtodo de disco-difuso


4.8.6.1 Introduo
Os ensaios de disco-difuso so tcnicas qualitativas
para categorizar os isolados como susceptveis,
susceptveis intermedirios (ou susceptibilidade
reduzida) ou resistentes para os diferentes antibiticos.
Consequentemente, esses mtodos no determinam a
CMI exata dos antibiticos contra os microrganismos;
entretanto, eles devem refletir a CMI. Os mtodos de
disco-difuso usam discos disponveis comercialmente,
impregnados com uma concentrao conhecida de

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

antibitico. O agente antimicrobiano no disco se difunde


sobre a superfcie de gar inoculada com o isolado
bacteriano e produz um gradiente de concentrao que
maior prximo ao disco e diminui proporcionalmente
ao se distanciar do disco. Aps a incubao, a zona
de inibio visvel, a qual deve ser medida e,
subsequentemente, interpretada em uma categoria
de susceptibilidade. Vrios mtodos de disco-difuso
so usados internacionalmente; entretanto, todos
exigem uma padronizao rigorosa e CQ apropriado
para obter um alto nvel de reprodutibilidade e reflexo
suficiente da CMI dos antibiticos analisados. A principal
diferena entre eles a potncia dos discos (contedo
de antibitico) e o gar utilizado, o que resulta em
diferentes pontos crticos para a categorizao da
susceptibilidade. Os mtodos de disco-difuso do
CLSI (45) e da Sociedade Britnica para Quimioterapia
Antimicrobiana (BSAC, do ingls British Society for
Antimicrobial Chemotherapy; www.bsac.org.uk) so
usados e recomendados em vrias regies (46). Este

manual da OMS descreve o mtodo do teste de discodifuso de sensibilidade dicotmica calibrada (SDC) (47,
48). O mtodo SDC usado para o teste e vigilncia
da susceptibilidade antimicrobiana gonoccica, por
exemplo, na OMS do Pacfico Ocidental ou do Sudeste da
sia. NOTA: o meio gar, o procedimento e os critrios
de interpretao do mtodo SDC difere dos outros
mtodos de disco-difuso. Se esses mtodos forem
utilizados, necessrio que suas instrues sejam
estritamente seguidas.
4.8.6.2 Meio gar recomendado para o mtodo SDC
O meio de teste utilizado no mtodo SDC para isolados
de N. gonorrhoeae o gar-chocolate, incluindo o gar
base Columbia (o da Oxoid adequado; outras marcas
comerciais devem ser avaliadas quanto qualidade) com
8% de sangue de cavalo achocolatado a 70C por 30
minutos (ver Anexo 4). Outros meios no foram validados
e no devem ser utilizados sem uma avaliao estrita e
provveis ajustes dos critrios interpretativos.

Tabela 4.11: Critrios interpretativos para categorizar a N. gonorrhoeae em categorias de susceptibilidade


utilizando o mtodo SDC; o halo de inibio deve ser medido em mm, e no o dimetro da zona

Antibitico

Contedo do
disco

Categorias de susceptibilidade
Resistncia

Susceptibilidade
reduzida

Susceptibilidade

Benzilpenicilina

0,5UI

<3mm

3-9mm

9mm

Azitromicina

15g

<8mm

8mm

- cido nalidxico

30g

0mm

0mm

>6mm

- Ciprofloxacina

1g

6mm

>6mm

>6mm

- Ceftriaxona

0,5g

ASDc

5-9mm

>9mm

- Cefpodoxima

10g

ASDc

12mm

>12mm

Espectinomicina

100g

<6mm

6mm

Teste de ciprofloxacinaa

Teste de ceftriaxonab

Para testar a susceptibilidade de fluoroquinolonas (ciprofloxacina), ambos os discos com cido nalidxico e ciprofloxacina devem ser utilizados e
interpretados simultaneamente.

b
Para testar a susceptibilidade de ceftriaxonas, ambos os discos com ceftriaxona e cefpodoxima devem ser utilizados e interpretados
simultaneamente.

ASD: a ser determinado. Devido ausncia de um nmero adequado de cepas resistentes e correlaes baseadas em evidncias entre as CMI dos
isolados e o resultado do tratamento, os pontos crticos ainda no podem ser determinados. Os isolados com susceptibilidade reduzida/resistncia
ceftriaxona devem ser confirmados pelo teste de CMI (diluio em gar ou Etest) pelo laboratrio local ou, idealmente, em um Laboratrio de
Referncia da OMS.

Gonorreia

51

4.8.6.3 Critrios interpretativos para o mtodo SDC

secar). Se s estiverem disponveis colnias


pequenas (<1mm), talvez seja necessrio coletar
3-5 colnias antes que o material esteja visvel na
ponta do arame.

A Tabela 4.11 descreve os critrios interpretativos para


susceptibilidade, susceptibilidade reduzida e resistncia,
recomendados para o uso do mtodo SDC (48).
4.8.6.4 Controle de Qualidade (CQ) do mtodo SDC

3.

As cepas de referncia de N. gonorrhoeae WHO C, WHO


K e WHO P (se a azitromicina for examinada) devem ser
includas em cada srie de testes de susceptibilidade
antimicrobiana e sempre que um novo lote de meio
gar ou discos for utilizado. O halo de inibio para
cada antibitico e a cepa de referncia devem ser
documentados em um grfico de CQ. Para os raios
anulares aceitos no CQ, ver Tabela 4.12.

girando o arame pelo menos 10 vezes com a ponta


em contato com o fundo do tubo de teste. Confirme
que o material se desprendeu da ponta, misture
o inculo pelo menos 10 vezes utilizando uma
pipeta de Pasteur estril e verifique se a soluo
est homognea. Um inculo muito denso causar
uma pequena diminuio nos tamanhos da zona.
Um inculo pouco denso causar um aumento
considervel nos tamanhos da zona.

4.8.6.5 Procedimento do mtodo SDC


1.

2.

Prepare uma suspenso em 2,5mL de soluo


salina estril (aproximadamente 107 UFC por mL),

Seque (retire a umidade visvel, mas no enxugue


em excesso) o nmero de placas de gar chocolate
(ver Anexo 4) necessrias. Seque as placas
invertidas, com as tampas removidas, a 361C,
por uma hora.

4.

Use a mesma pipeta para transferir toda a


suspenso para a superfcie da placa de gar
chocolate j seca.

5.

Distribua o inculo, balanando a suspenso, at


que esta cubra toda a superfcie do gar.

Selecione a maioria das colnias de N. gonorrhoeae


(com pelo menos 1-2mm de dimetro, crescidas
ao longo da noite) em meio gar no seletivo para
gonococos com uma ala de plstico (1L) ou fio de
nicromo reto (aps pass-lo pela chama e deix-lo

6.

Remova o excesso de inculo com uma pipeta de


Pasteur estril.

7.

Deixe a placa secar por aproximadamente 10-15


minutos, temperatura ambiente (as placas no

Borda do crescimento aderente


Halo de
inibio
Borda do disco

Figura 4.12
O halo de inibio (mm) a menor distncia medida da borda do disco para a borda do crescimento aderente.
A borda do crescimento aderente corresponde normalmente borda mais acentuada da zona de inibio.
Fonte: Reproduzido do Teste de Susceptibilidade Antibitica SDC (http://web.med.unsw.edu.au/cdstest/).

52

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

ou um jarro de anaerobiose com vela com umidade


adicional.

devem ser deixadas no lugar por mais de 15


minutos aps o inculo estar seco).

10. Mea o halo de inibio com uma rgua de


plstico calibrada em mm ou com compassos
de calibre vernier (Figura 4.12) Os resultados das
cepas de referncia da OMS, usadas como CQ,
devem ser lidos e aprovados antes que se leiam
os outros resultados (ver Tabela 4.12). Se no
forem aprovados, devem-se verificar os possveis
problemas e repetir o teste.

8. Aplique os discos de antibitico (mantido


temperatura ambiente) placa inoculada usando
uma pina estril ou um distribuidor de disco.
Podem-se aplicar at seis discos em uma
placa de 90mm. Os discos devem ser aplicados
uniformemente e no devem ser removidos aps o
contato inicial com o gar.
9. Incube as placas por 18 horas a 361C em
uma atmosfera rica em CO2 a 51% (70-80% de

11. Interprete os tamanhos da zona em categorias de


susceptibilidade (ver Tabela 4.11).

umidade). Pode-se utilizar uma incubadora de CO2

Tabela 4.12: Antibiticos, potncia dos discos e raio de inibio anular aceitvel para as cepas de referncia
de N. gonorrhoeae da OMS, recomendados para o controle de qualidade (CQ)
Cepa/antibitico

Potncia do disco

Halo de inibio (mm)

N. gonorrhoeae ACM 5239 (WHO C)


Azitromicina

15g

8,9-12,5

Benzilpenicilina

0,5UI

2,1-4,1

Cefpodoxima

10g

10,9-14,5

Ceftriaxona

0,5g

8,2-11,0

Ciprofloxacina

1g

12,7-16,3

cido nalidxico

30g

11,3-14,5

Espectinomicina

100g

6,9-8,9

Cefpodoxima

10g

7,6-11,1

Ceftriaxona

0,5g

7,3-9,3

15g

3,8-7,4

N. gonorrhoeae WHO K

N. gonorrhoeae WHO P
Azitromicina

4.8.7 Deteco de resistncia penicilina


mediada por plasmdeo
A N. gonorrhoeae pode carregar plasmdeos produtores
de uma enzima (-lactamase [penicilinase]) que inativa
penicilinas tais como a benzilpenicilina, penicilina,
ampicilina e amoxicilina. Vrios mtodos qualitativos
foram utilizados para detectar a produo de
-lactamase por microrganismos.
O mtodo da cefalosporina cromognica simples,
sensvel, especfico e amplamente utilizado para

detectar a -lactamase em gonococos. Quando o anel


-lactmico da cefalosporina cromognica, a nitrocefina,
hidrolisado pela -lactamase, ocorre uma mudana
de colorao do amarelo para o vermelho. O teste est
comercialmente disponvel em vrios formatos, e a
nitrocefina liofilizada tambm pode ser adquirida para
uso em testes in-house (49). Tambm existem outros
mtodos menos padronizados e de qualidade garantida
para detectar a -lactamase, tais como o mtodo
acidomtrico e o teste Iodomtrico.

Gonorreia

53

4.8.7.1 Mtodo do disco de nitrocefina


1. Hidrate, em gua destilada, o disco de nitrocefina
em uma lmina de vidro ou em uma placa vazia
limpa.
2. Selecione vrias colnias da cultura pura de
gonococos crescida ao longo da noite com uma ala
estril e risque na superfcie do disco.
3. Uma reao positiva normalmente produz cor
vermelha em um minuto. Entretanto, reaes
positivas fracas podem demorar um pouco mais
para revelar a cor, mas isso muito raro. Um
resultado negativo no mostrar mudana de cor
(continuar amarelo).
4.8.7.2 Mtodo de soluo de nitrocefina
O mtodo de soluo de nitrocefina realizado tanto ao
gotejar o reagente diretamente nas colnias crescendo
em meio seletivo ou no seletivo, como por meio da
inoculao da soluo em uma lmina de vidro/papelfiltro com colnias.

Pode-se utilizar soluo de nitrocefina disponvel


comercialmente ou preparada in-house utilizando o p
de nitrocefina.
Teste direto na placa:
1. Adicione uma gota da soluo de nitrocefina
diretamente nas colnias de gonococos puras
isoladas no meio gar. As placas de diluio em
gar ou Etest podem ser utilizadas aps a leitura da
CMI dos antibiticos examinados.
2. Uma mudana de cor na soluo de nitrocefina do
amarelo para o vermelho em um minuto indica um
resultado positivo. No entanto, reaes muito raras,
fracamente positivas, podem demorar um pouco
mais para serem reveladas. Um resultado negativo
no mostrar mudana de colorao (continuar
amarelo) (Figura 4.13).
Teste na lmina/papel-filtro:
1. Adicione uma gota da soluo de nitrocefina em
uma lmina de vidro limpa/papel-filtro.

Figura 4.13
Atividade da -lactamase em N. gonorrhoeae determinada em placa de cultura com cefalosporina
cromognica, nitrocefina. O meio da esquerda demonstra uma reao positiva (vermelho) e o meio da direita
demonstra uma reao negativa (permanece amarelo).

54

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

2. Selecione vrias colnias da cultura pura de


gonococos crescida ao longo da noite com uma ala
estril e a emulsifique na gota de nitrocefina.
3. Uma mudana de cor do amarelo para o vermelho
em um minuto indica um resultado positivo.
Reaes muito raras, fracamente positivas, podem
demorar um pouco mais para serem reveladas.
Um resultado negativo no mostrar mudana de
colorao (continuar amarelo).
4.8.7.3 Mtodo acidomtrico
Coloque uma tira de papel-filtro em uma placa de
Petri limpa e vazia. Sature o papel com soluo
de penicilina (tampo fosfato a 0,05mol/L, pH 8,0;
prpura de bromocresol e benzilpenicilina sem tampo
a 50g/L [armazenado congelado]). Com uma ala
bacteriolgica, espalhe 10-20 colnias em uma rea
de aproximadamente 5mm do papel-filtro. Incube o
papel-filtro inoculado temperatura ambiente por 30
minutos com a placa de Petri tampada. A atividade da
-lactamase resultar em mudana de cor do azul para o
amarelo, normalmente visvel em menos de 10 minutos.
4.8.7.4 Teste iodomtrico
Prepare uma mistura de penicilina-iodo fresca,
adicionando 1,1mL de soluo de iodo (1,5mg de
potssio iodado e 0,3g de iodo em 100mL de tampo
fosfato a 0,1mol/L, pH 6,4, estocada em garrafa fum a
4C) para um recipiente contendo 0,15mL de soluo de
benzilpenicilina (1 milho de Unidades Internacionais por
mL, estocada a -20C). A mistura de reagente deve ser
usada em uma hora. Uma ala contendo o organismo
em teste removida das colnias crescidas em placa
de gar e emulsificada em uma gota da mistura iodopenicilina em uma placa de vidro. Uma gota de soluo
de amido (4g/L em gua destilada, autoclavada e
estocada a 4C) adicionada, acrescentando uma cor
roxa escura mistura. Um resultado negativo indicado
quando essa cor permanece por cinco minutos. Uma
mudana de cor para transparente em cinco minutos
(normalmente em um minuto) indica um teste positivo.

4.9 Preservao dos isolados de N.


gonorrhoeae
Para manter a viabilidade das cepas de N. gonorrhoeae
em meio gar gonoccico, necessrio a subcultura
a, pelo menos, cada 48 horas. Consequentemente,
mtodos efetivos para a preservao em longo prazo das
cepas gonoccicas so essenciais.

4.9.1 Conservao em rampas de gar chocolate


(50, 51)
Armazenamento por at nove meses (as cepas so
mantidas viveis durante o transporte por at cinco dias):
Uma cultura pura crescida ao longo da noite em
meio gar gonoccico inoculada em uma rampa
com 3mL de gar chocolate em uma garrafa Bijou
de policarbonato com tampa de rosca (volume de
5mL; deve-se usar garrafa plstica) e incubada com
a tampa de rosca frouxa por no mnimo 24 horas
a 361C em atmosfera rica em CO2 a 51% ou
at que o crescimento visvel esteja presente na
superfcie do gar. Utiliza-se ento parafina lquida
estril para preencher completamente a rampa
de gar; a tampa de rosca apertada e a garrafa
Bijou estocada a 37C. Quando os gonococos so
necessrios para teste, uma ala bacteriolgica
estril inserida atravs da cobertura de parafina
para remover algumas N. gonorrhoeae crescidas,
sendo ento inoculada em um meio de cultura
seletivo para gonococos. Aps incubao, por
48 horas a 361C em atmosfera rica em CO2 a
51%, as colnias gonoccicas so prontamente
discernveis e podem ser subcultivadas para exame
apropriado (glbulos de parafina tambm estaro
presentes, mas podem ser facilmente distinguidos
das colnias gonoccicas). A rampa original coberta
de parafina pode voltar a ser armazenada para uso
futuro.

Gonorreia

55

4.9.2 Conservao por congelamento ou


liofilizao

disponvel, pode-se utilizar leite desnatado estril) e


preservadas por liofilizao.

Armazenamento por at 1-3 meses:


Todas as colnias crescidas em uma placa de
cultura pura em meio gar para gonococos podem
ser inoculadas em um pequeno recipiente contendo
0,5mL de caldo nutritivo estril (por exemplo, caldo
nutritivo, caldo triptona de soja, caldo de infuso de
crebro-corao) com glicerol a 15-20%, suspenso
com pipeta estril e imediatamente congelado
a -20-25C. No indicado o armazenamento
prolongado a essa temperatura, uma vez que os
gonococos perdero a viabilidade.
Armazenamento em longo prazo:
Todas as colnias crescidas em uma placa de
cultura pura em meio gar para gonococos podem
ser inoculadas em um pequeno recipiente contendo
0,5-1mL de caldo nutritivo crioprotetor estril com
glicerol a 15-20%, suspensas com pipeta estril e
imediatamente congeladas a -70C.
Todas as colnias crescidas em uma placa de cultura
pura em meio gar para gonococos podem ser
inoculadas em um pequeno criorecipiente contendo
meio crioprotetor estril (por exemplo, caldo nutritivo
com glicerol a 15-20%), suspensas com pipeta e
imediatamente congeladas em nitrognio lquido.
Todas as colnias crescidas em uma placa de
cultura pura em meio gar para gonococos podem
ser inoculadas em um pequeno recipiente contendo
aproximadamente 0,5-1,0mL de fluido Microbank
estril com cryobeads (disponveis comercialmente),
suspensas por meio da inverso do recipiente
por cinco vezes. Subsequentemente, remove-se
o mximo de lquido possvel e o recipiente
imediatamente congelado a -70C.
Todas as colnias crescidas em uma placa de cultura
pura em meio gar para gonococos podem ser
inoculadas em um caldo nutritivo estril (por exemplo,
caldo nutritivo, caldo triptona de soja, caldo de
infuso de crebro-corao) com glicerol a 15-20%
(alternativamente, se nenhum caldo nutritivo estiver

56

4.10 Recuperao de isolados de N.


gonorrhoeae congelados
Remova do congelador ou nitrognio lquido o criotubo
contendo o isolado e no o deixe descongelar. Utilizando
a ponta de uma pipeta Pasteur estril, remova
gentilmente uma pequena amostra de suspenso
bacteriana congelada (ou uma criobead) e a transfira
para um meio gar de cultura para gonococos. Use uma
ala para riscar o inculo de colnias simples isoladas
e incube a placa de cultura por 24 horas a 361C, em
atmosfera rica em CO2 a 51%. Retorne imediatamente
o criotubo ao congelador.

4.11 Referncias
1. Global incidence and prevalence of selected curable
sexually transmitted infections2008. Genebra,
Organizao Mundial da Sade, 2012 (http://
www.who. int/reproductivehealth/publications/
rtis/2008_STI_ estimates.pdf, acessado em 2 de
abril de 2013).
2. Tapsall JW et al. Meeting the public health challenge
of multidrug- and extensively drug-resistant
Neisseria gonorrhoeae. Expert Review of AntiInfective Therapy, 2009, 7(7):821834.
3. Ohnishi M et al. Is Neisseria gonorrhoeae initiating
a future era of untreatable gonorrhea?: detailed
characterization of the first strain with high-level
resistance to ceftriaxone. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 2011, 55(7):35383545.
4. Bachmann LH et al. Nucleic acid amplification
tests for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae and
Chlamydia trachomatis rectal infections. Journal of
Clinical Microbiology, 2010, 48(5):18271832.
5. Mimiaga MJ et al. Gonococcal, chlamydia, and
syphilis infection positivity among MSM attending
a large primary care clinic, Boston, 2003 to
2004. Sexually Transmitted Diseases, 2009,
36(8):507511.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

6. Schachter J et al. Nucleic acid amplification tests


in the diagnosis of chlamydial and gonococcal
infections of the oropharynx and rectum in men who
have sex with men. Sexually Transmitted Diseases,
2008, 35(7):637642.
7. Masek BJ et al. Performance of three nucleic acid
amplification tests for detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by use
of self-collected vaginal swabs obtained via an
Internet-based screening program. Journal of
Clinical Microbiology, 2009, 47(6):16631667.
8. Hobbs MM et al. From the NIH: proceedings of
a workshop on the importance of self-obtained
vaginal specimens for detection of sexually
transmitted infections. Sexually Transmitted
Diseases, 2008, 35(1):813.
9. Taylor SN, DiCarlo RP, Martin DH. Comparison of
methylene blue/gentian violet stain to Grams stain
for the rapid diagnosis of gonococcal urethritis
in men. Sexually Transmitted Diseases, 2011,
38(11):995996.
10. Martin JE, Lester A. Transgrow, a medium for
transport and growth of Neisseria gonorrhoeae and
Neisseria meningitidis. HSMHA Health Reports,
1971, 86(1):3033.
11. Taylor E, Phillips I. Assessment of transport and
isolation methods for gonococci. British Journal of
Venereal Disease, 1980, 56(6):390393.
12. Jephcott AE, Bhattacharyya MN, Jackson DH.
Improved transport and culture system for the rapid
diagnosis of gonorrhoea. British Journal of Venereal
Disease, 1976, 52(4):250252.
13. Thayer JD, Martin JE. An improved selective
medium for cultivation of N. gonorrhoeae and
N. meningitidis. Public Health Reports, 1966,
81:559562.
14. Faur YC et al. A new medium for the isolation of
pathogenic Neisseria (NYC medium). 1. Formulation
and comparisons with standard media. Health
Laboratory Science, 1973, 10:4452.

15. Mirrett S, Reller LB, Knapp JS. Neisseria


gonorrhoeae strains inhibited by vancomycin in
selective media and correlation with auxotype.
Journal of Clinical Microbiology, 1981, 14(1):9499.
16. Unemo M et al. Phenotypic and genetic
characterization of the 2008 WHO Neisseria
gonorrhoeae reference strain panel intended for
global quality assurance and quality control of
gonococcal antimicrobial resistance surveillance
for public health purposes. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, 2009, 63(6):11421151.
17. Alexander S, Ison C. Evaluation of commercial kits
for the identification of Neisseria gonorrhoeae.
Journal of Medical Microbiology, 2005,
54(9):827831.
18. Tapsall JW, Cheng JK. Rapid identification of
pathogenic species of Neisseria by carbohydrate
degradation tests. Importance of glucose in media
used for preparation of inocula. British Journal of
Venereal Disease, 1981, 57(4):249252.
19. Dillon JR, Carballo M, Pauz M. Evaluation of
eight methods for identification of pathogenic
Neisseria species: Neisseria-Kwik, RIM-N, GonobioTest, Minitek, Gonochek II, GonoGen, Phadebact
Monoclonal GC OMNI Test, and Syva MicroTrak
Test. Journal of Clinical Microbiology, 1988,
26(3):493497.
20. Unemo M et al. Global transmission of
prolyliminopeptidase-negative Neisseria
gonorrhoeae strains: implications for changes
in diagnostic strategies. Sexually Transmitted
Infections, 2007, 83(1):4751.
21. Ilina EN et al. Direct bacterial profiling by matrixassisted laser desorption-ionization time-of-flight
mass spectrometry for identification of pathogenic
Neisseria. Journal of Molecular Diagnostics, 2009,
11(1):7586.
22. Cook RL et al. Systematic review: noninvasive
testing for Chlamydia trachomatis and Neisseria
gonorrhoeae. Annals of Internal Medicine, 2005,
142(11):914925.

Gonorreia

57

23. Alexander S. The challenges of detecting


gonorrhoea and chlamydia in rectal and pharyngeal
sites: could we, should we, be doing more? Sexually
Transmitted Infections, 2009, 85(3):159160.
24. Whiley DM et al. Exploring best practice for nucleic
acid detection of Neisseria gonorrhoeae. Sexual
Health, 2008, 5(1):1723.

33. Whiley DM et al. False-negative results using


Neisseria gonorrhoeae porA pseudogene
PCRa clinical gonococcal isolate with an N.
meningitidis porA sequence, Australia, March 2011.
Eurosurveillance, 2011, 16(21):pii:19874.

25. Palmer HM et al. Evaluation of the specificities of


five DNA amplification methods for the detection
of Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical
Microbiology, 2003, 41(2):835837.

34. Eastick K, Winter A, Jamdar S. Identification of


Neisseria gonorrhoeae isolates with a recombinant
porA gene in Scotland, United Kingdom, 2010 to
2011. Eurosurveillance, 2012, 17(9):pii:20101.

26. Tabrizi SN et al. Evaluation of six commercial nucleic


acid amplification tests for detection of Neisseria
gonorrhoeae and other Neisseria species. Journal of
Clinical Microbiology, 2011, 49(10):36103615.

35. Golparian D, Johansson E, Unemo M. Clinical


Neisseria gonorrhoeae isolate with a N. meningitidis
porA gene and no prolyliminopeptidase activity,
Sweden, 2011 danger of false-negative genetic
and culture diagnostic results. Eurosurveillance,
2012, 17(9):pii:20102.

27. McNally LP et al. Low positive predictive value


of a nucleic acid amplification test for nongenital
Neisseria gonorrhoeae infection in homosexual men.
Clinical Infectious Diseases, 2008, 47(2):e2527.
28. Golparian D, Tabrizi SN, Unemo M. Analytical
specificity and sensitivity of the APTIMA Combo 2
and APTIMA GC assays for detection of commensal
Neisseria species and Neisseria gonorrhoeae on the
Gen-Probe Panther instrument. Sexually Transmitted
Diseases, 2013, 40(2):175178.
29. Whiley DM et al. A real-time PCR assay for the
detection of Neisseria gonorrhoeae in genital and
extragenital specimens. Diagnostic Microbiology and
Infectious Diseases, 2005, 52(1):15.
30. Hjelmevoll SO et al. A fast real-time polymerase
chain reaction method for sensitive and specific
detection of the Neisseria gonorrhoeae porA
pseudogene. Journal of Molecular Diagnostics,
2006, 8(5):574581.

58

opa genes. Diagnostic Microbiology and Infectious


Diseases, 2008, 61(1):612.

36. Ison CA et al. Evolution of Neisseria gonorrhoeae


is a continuing challenge for molecular detection
of gonorrhoea: false-negative gonococcal porA
mutants are spreading internationally. Sexually
Transmitted Infections, 2013, 89(3):197-201.
37. Huppert J, Hesse E, Gaydos CA. Whats the point?
How point-of-care STI tests can impact infected
patients. Point of Care, 2010, 9(1):3646.
38. Gift TL et al. The rapid test paradox: when fewer
cases detected lead to more cases treated:
a decision analysis of tests for Chlamydia
trachomatis. Sexually Transmitted Diseases, 1999,
26(4):232240.
39. Yokoi S et al. Threat to cefixime treatment of
gonorrhea. Emerging Infectious Diseases, 2007,
13(8):12751277.

31. Tabrizi SN et al. Evaluation of opa-based real-time


PCR for detection of Neisseria gonorrhoeae. Sexually
Transmitted Diseases, 2005, 32(3):199202.

40. Unemo M et al. Two cases of verified clinical


failures using internationally recommended first-line
cefixime for gonorrhoea treatment, Norway, 2010.
Eurosurveillance, 2010, 15(47):pii:19721.

32. Goire N et al. A duplex Neisseria gonorrhoeae realtime polymerase chain reaction assay targeting
the gonococcal porA pseudogene and multicopy

41. Ison CA et al. Gonorrhoea treatment failures to


cefixime and azithromycin in England, 2010.
Eurosurveillance, 2011, 16(14):pii:19833.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

42. Unemo M et al. First Neisseria gonorrhoeae strain


with resistance to cefixime causing gonorrhoea
treatment failure in Austria, 2011. Eurosurveillance,
2011, 16(43):pii:19998.
43. Unemo M et al. High-level cefixime- and
ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae in
France: novel penA mosaic allele in a successful
international clone causes treatment failure.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2012,
56(3):12731280.

51. Tapsall JW, Phillips EA, Morris LM. Chromosomally


mediated intrinsic resistance to penicillin in
penicillinase producing strains of Neisseria
gonorrhoeae isolated in Sydney: guide to treatment
with Augmentin. Genitourinary Medicine, 1987,
63(5):305308.

44. Unemo M, Nicholas RA. Emergence of multidrugresistant, extensively drug-resistant and


untreatable gonorrhea. Future Microbiology, 2012,
7(12):14011422.
45. Cockerill F et al. Performance standards for
antimicrobial susceptibility testing: twenty-first
informational supplement, M100-S21 and Vol. 31,
No. 1. Wayne, PA, Clinical and Laboratory Standards
Institute, 2011 (www.clsi.org).
46. Dillon J-A R, Starnino S. Manual de laboratorio:
identificacin y evaluacin de la susceptibilitad
de Nesisseria gonorrhoeae a los antibiticos para
el programa de vigilancia de la susceptibilidad de
los gonococos a los agentes antimicrobianos en
America Latina y el Caribe (GASP-LAC) (segunda
edicin). Canada, University of Saskatchewan, 2011
(http:// www.gasp-lac.net).
47. Bell SM. The CDS disc method of antibiotic
sensitivity testing (calibrated dichotomous
sensitivity test). Pathology, 1975, 7(4 Suppl):Suppl
148.
48. The CDS antibiotic susceptibility test (http://web.
med. unsw.edu.au/cdstest).
49. OCallaghan CH et al. Novel method for detection
of b-lactamases by using a chromogenic
cephalosporin substrate. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 1972, 1(4):283288.
50. Cody RM. Preservation and storage of pathogenic
Neisseria. Health Laboratory Science, 1978,
15(4):206209.

Gonorreia

59

60

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 5
Infeces por clamdia
5.1 Introduo
A Clamydia trachomatis, agente etiolgico da clamdia,
causa morbidade e custos econmicos substanciais
no mundo. Em 2008, a Organizao Mundial da
Sade (OMS) estimou a ocorrncia de 106 milhes
de novos casos de clamdia urogenital entre adultos,
mundialmente. Isso coloca a clamdia como a mais
prevalente doena sexualmente transmissvel (DST)
bacteriana, junto com a gonorreia (tambm com 106
milhes de novos casos).
A C. trachomatis classifica-se em trs biovariantes, cada
uma contendo vrios sorotipos e gentipos (dependendo
do mtodo utilizado para classificao). As biovariantes
so definidas com base no tipo de infeco, localizao
comum da infeco (tropismo por tecido) e virulncia
relativa da doena (Tabela 5.1), dividindo-se entre
aquelas que causam tracoma (a maior causa de cegueira
evitvel em todo o mundo, endmica em muitos pases
em desenvolvimento), as que causam infeces genitais
(a DST bacteriana mais frequente no mundo) e as que
causam linfogranuloma venreo (LGV, uma doena de
lcera genital que afeta os tecidos linfoides) (ver Captulo
11).
A biovariante ocular consiste dos sorotipos A-C, os quais
so encontrados predominantemente em infeces na
conjuntiva. O tropismo por esse tecido no absoluto,
uma vez que esses organismos, especialmente o
sorotipo B, tambm podem ser isolados de infeces
genitais, mas a frequncia dessas ocorrncias rara.
A biovariante predominante consiste dos sorotipos
D-K, os quais so transmitidos sexualmente e infectam
o epitlio genital, causando uretrite em homens e
cervicite (e uretrite) em mulheres (Tabela 5.2). Infeces
urogenitais assintomticas ocorrem em at 50% dos
homens e at 90% das mulheres. Se no for detectada
e tratada, a infeco pode ascender para o trato genital
superior, causando epididimite em homens e doena
plvica inflamatria (PID, do ingls pelvic inflammatory
disease) e sequelas relacionadas (gravidez ectpica,

infertilidade por fator tubrio) em mulheres. Esses


sorotipos tambm podem ser isolados a partir de
infeces oculares em recm-nascidos, adquiridos
durante a passagem por um canal de parto infectado,
mas no so amplamente responsveis por tracoma. Os
recm-nascidos ainda podem desenvolver pneumonia
por clamdia, devido exposio a esses sorotipos
durante o parto vaginal (no confundir com infeco por
C. pneumoniae).
Finalmente, a biovariante LGV, que consiste dos
sorotipos L1-L3, tambm uma biovariante transmitida
sexualmente, mas com preferncia tecidual por clulas
linfoides e com uma progresso da doena mais
agressiva. As infeces por LGV so consequentemente
mais invasivas e mais propensas a causar infeces
sistmicas que as outras biovariantes. A LGV endmica
em muitas regies em desenvolvimento no mundo. Alm
disso, desde 2003, surtos de proctites e proctocolites
por LGV foram documentados entre homens que fazem
sexo com homens (HSH) na Europa e Amrica do Norte,
onde, previamente, apenas se observavam casos
espordicos dessas infeces (ver Captulo 11).

A C. trachomatis causa a DST bacteriana


mundialmente mais comum, a qual inclui um
espectro de doenas encontradas em diversos
tecidos (isto , genital, ocular, linftico e bronquial).
Resultados negativos associados a infeces
por C. trachomatis no tratadas incluem PID,
gravidez ectpica, infertilidade por fator tubrio,
epididimites, prostatites, dentre outros.

5.2 Reviso dos mtodos de diagnstico


disponveis
Embora a clamdia seja altamente prevalente, o
conhecimento sobre essa infeco era bastante limitado
nos servios de sade pblica antes da dcada de 80,
devido a limitaes nos mtodos de diagnstico. As
tcnicas de diagnstico precoce desenvolveram-se mais
no mbito dos esforos para deter o tracoma do que
para conter a prpria DST. A sorologia foi utilizada para
distinguir infeces agudas

Infeces por clamdia

61

Tabela 5.1: Caractersticas e infeces associadas a diferentes sorotipos de C. trachomatis


Sorotipo

Caractersticas

Tropismo por tecido/


biovariante

Infeco

A-C (incl. Ba)

No invasivo

Clulas epiteliais/tracoma

Cegueira endmica
causada por tracoma

D-K (incl. Da, Ia, Ja)

No invasivo

Clulas epiteliais/tracoma

Urogenital, conjuntivite,
pneumonia neonatal

L1, L2, L3
(incl. L2a, L2b)

Invasivo

Clulas linfticas/LGV

LGV

LGV: linfogranuloma venreo

Tabela 5.2: Manifestaes clnicas da infeco por C. trachomatis


Infeco genital

Primria

Sequelas

Mulheres

Cervicite, corrimento purulento


abundante, colo do tero resistente
a altas temperaturas, disria, dor
plvica, sensibilidade a movimentos
cervicais

Doena inflamatria plvica, gravidez


ectpica, salpingite, infertilidade por
fator tubrio

Homens

Corrimento uretral, disria, dor


testicular

Epididimite, prostatite

Infeces no genitais

Primria

Sequelas

Reto

Corrimento, dor retal, sangue nas


fezes

Proctite

Orofaringe

Faringite, leve dor de garganta

Linfonodos

Inflamao linftica

Ocular

Conjuntivite

Pneumonia neonatal

Pneumonia

Cicatrizes, cegueira por tracoma

Nota: estudos forneceram evidncias de que as infeces por C. trachomatis podem facilitar a transmisso do HIV; entretanto, o odds ratio
relativamente baixo.

de crnicas, mas esta no apresenta sensibilidade


e especificidade suficientes para o diagnstico
de infeces agudas, nem para obter estimativas
populacionais de exposio ao longo da vida. A
cultura foi padronizada na dcada de 70, tornando o
isolamento do organismo uma importante ferramenta
de diagnstico. No entanto, a necessidade de manter a
viabilidade do espcime, que exige condies rigorosas
de transporte e armazenamento, limitou a disponibilidade
desse teste apenas aos mdicos que trabalham em
laboratrios mais desenvolvidos. Ensaios de deteco de
antgeno, ensaios de imunofluorescncia direta (EID) e o
ensaio imunossorvente ligado enzima (ELISA, do ingls
enzyme-linked immunosorbent assay) de fase slida
foram desenvolvidos no incio da dcada de 80, tornando

62

o diagnstico de clamdia mais acessvel. Conforme mais


testes ELISA foram sendo desenvolvidos, vrios ensaios
point-of-care (POC), rpidos, tornaram-se disponveis.
Os EID, ELISA e POC apresentavam baixa sensibilidade
quando comparados cultura, e especificidade inferior
ideal. Entretanto, a rapidez para a liberao do resultado
e as necessidades menos restritivas para o transporte do
espcime tornaram esses ensaios uma opo atraente,
especialmente em lugares de alta prevalncia.
Outro grande avano no diagnstico de clamdia foi
a utilizao de sequncias de cido nucleico no lugar
de antgenos como alvos de deteco. A sensibilidade
dos ensaios de hibridizao de cidos nucleicos no
amplificados (NAH, do ingls non-amplified nucleic

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

acid hybridization assays) inicialmente desenvolvidos


foi similar da cultura, mas novamente houve
questionamentos quanto sua especificidade. A
incluso de Neisseria gonorrhoeae no mbito do teste
tornou esse ensaio extremamente atraente. Os testes
de amplificao de cidos nucleicos (NAAT, do ingls
nucleic acid amplification test) foram desenvolvidos
em seguida. Os NAAT usam mtodos enzimticos para
amplificar exponencialmente o DNA ou RNA alvo em
bilhes de cpias. O produto amplificado detectado
por diversos meios, o que confere a cada ensaio
caractersticas nicas de desempenho. Similares ao
teste NAH, os NAAT combinaram a testagem de clamdia
e gonorreia a partir de uma mesma amostra. Devido
s caractersticas superiores de desempenho, como,
por exemplo, sensibilidade, especificidade, variedade
dos tipos de espcimes, automao e independncia
para manter a viabilidade do organismo, os NAAT so
fortemente recomendados para o diagnstico e triagem
de infeces por clamdia. Para informaes adicionais
sobre as caractersticas de desempenho dos diferentes
mtodos para o diagnstico de clamdia, ver a pgina da
internet sobre clamdia, www.chlamydiae.com.

5.3 Coleta, transporte e condies de


armazenamento de espcimes

Questes associadas avaliao dos ensaios e


variedade dos desempenhos (1,2) ressaltam a
necessidade da verificao de ensaios e da estrita
garantia de qualidade (GQ) em cada laboratrio, no
apenas antes da adoo de um mtodo, mas tambm
de forma regular. Para maiores informaes sobre
esse tpico, ver Captulo 2 e Anexo 3. Para obter as
caractersticas de desempenho adequadas a todos os
mtodos de diagnstico, crucial seguir precisamente
as recomendaes do fabricante no concernente
coleta, ao transporte e ao armazenamento das amostras,
bem como aquelas relativas ao desempenho de ensaios
especficos, incluindo os controles de qualidade.

As amostras endocervicais devem ser obtidas por meio


da insero de 2-3cm do aparato de coleta no orifcio,
seguida de um giro de 360 completos. As amostras
endocervicais no devem ser coletadas em meninas
pr-pberes; em vez disso, os espcimes devem ser
colhidos no vestbulo da vagina, obtendo-se tambm
uma amostra de urina. As amostras da uretra so
coletadas por meio da insero de 2-3cm de uma
haste na uretra, seguida de giro completo para obter o
material celular. A coleta inadequada tem sido descrita
como um problema comum, que afeta negativamente a
sensibilidade da cultura.

As tecnologias para o diagnstico de clamdia


continuam avanando e apresentam melhor
sensibilidade.
Devido s caractersticas de desempenho
superiores, os NAAT so fortemente recomendados
para o diagnstico e triagem de infeces por
clamdia. Entretanto, a escolha do teste depende
dos recursos disponveis e da infraestrutura do
laboratrio.

A coleta, o transporte e as condies de armazenamento


de espcimes (Tabela 5.3) dependem, em muitos
casos, do tipo do ensaio. Essa seo ir apresentar
algumas diretrizes gerais, mas os detalhes relacionados
a qualquer ensaio de diagnstico especfico devem
ser seguidos de acordo com as instrues de uso
apropriadas.
As regies anatmicas de amostragem iro variar
dependendo da apresentao e histrico clnico do
paciente e da sensibilidade do ensaio. Para a cultura, que
requer organismos vivos, a amostra deve ser coletada
a partir de lugares com clulas epiteliais colunares ou
cuboides, as quais tm maior probabilidade de estar
ativamente infectadas. Dessa forma, nas mulheres,
devem-se coletar as amostras do orifcio endocervical
e, nos homens, do epitlio uretral. Esse ltimo, quando
necessrio, tambm pode servir como local de coleta de
amostras em mulheres. A coleta em ambos os locais,
na testagem de mulheres, aumentar a identificao de
casos.

Embora outros ensaios, diferentes da cultura e dos


NAAT, no necessitem de organismos viveis, a
sensibilidade limitada desses ensaios requer a coleta de
uma quantidade suficiente de organismos para que se
obtenha um resultado positivo. Alm disso, os mtodos
de deteco de antgeno geralmente necessitam de
organismos intactos. Assim, as mesmas restries de
amostragem necessrias para a cultura geralmente se
aplicam a esses mtodos de diagnstico. Alguns ELISA
foram aprovados para uso em amostras de urina de

Infeces por clamdia

63

homens, uma vez que esse mtodo de amostragem lava


os organismos da uretra. Se o volume do primeiro jato de
urina for cuidadosamente controlado (em geral, menos
de 25mL), e o paciente no tiver urinado durante a hora
anterior, provvel que a carga do microrganismo esteja
suficientemente concentrada para que seja detectvel
por esses ensaios. Isso no verdadeiro para a urina
de mulheres, uma vez que a ocorrncia de infeces
na uretra menos comum e a urina no contempla
amostras do tecido cervical.
Os NAAT apresentam a vantagem de depender de
cidos nucleicos que no necessitam de organismos
intactos ou viveis. Como resultado, esses ensaios
aumentaram nossa capacidade de coletar amostras
menos invasivas, que requerem ambientes clnicos.
Os NAAT so altamente sensveis quando se utilizam
amostras colhidas pelo prprio paciente (por exemplo,
hastes contendo secrees vaginais ou urina masculina).
Os NAAT tambm so teis para o teste de resduos
de citologia em meio lquido, permitindo a triagem em
mulheres por meio do teste de Papanicolau (Pap). As
hastes contendo secreo vaginal podem ser obtidas
pelo prprio paciente ou pelo mdico, com o mesmo
grau de validade (3, 4). Insira a haste na vagina e gire-a
para que sejam coletadas amostras de todas as paredes
vaginais.
Em alguns casos, dependendo dos sinais clnicos e
prticas sexuais, necessrio coletar amostras no
genitais. A cultura pode identificar infeces no reto
e na orofaringe, mas a sensibilidade nesses casos
relativamente baixa, devido microbiota contaminante.
No entanto, os NAAT apresentam alta sensibilidade para
essas infeces, embora nenhum fabricante se refira
a esse tipo de amostra. O uso de NAAT em amostras
extragenitais de homens que fazem sexo com homens
aumenta substancialmente a identificao de casos
(5-8). As amostras do reto podem ser coletadas tanto
pelo prprio paciente como pelo mdico, por meio da
insero de uma haste com extremidades de dacron
no reto at um limite confortvel (2-3cm), seguida de
um giro de 360. No mais necessrio visualizar o
reto para a coleta adequada da amostra, em razo
do aumento de sensibilidade dos ensaios NAAT. Para
qualquer indivduo que reporte a prtica de relao anal
receptiva, aconselha-se testar uma amostra do reto. A

64

coleta de amostra pelo paciente para o uso em NAAT


pode aumentar a captao da triagem e reduzir o tempo
dos trmites clnicos (9, 10). As amostras da orofaringe
so colhidas a partir da faringe posterior e das criptas
tonsilares. Essas amostras devem ser coletadas ao se
identificarem infeces transmitidas durante o sexo oral.
preciso tambm obter uma amostra da nasofaringe
em caso de recm-nascidos com suspeita de terem
contrado pneumonia clamidial durante o parto. Esse
tipo de amostra ser utilizado para cultura ou EID, no
tendo sido ainda avaliado rigorosamente por outros
sistemas. No entanto, devido carga bacteriana baixa,
os NAAT tendem a ser mais eficazes e, portanto,
necessrio realizar mais pesquisas nessas reas. Uma
haste deve ser inserida pela narina at que se possam
coletar amostras da parede da faringe. Amostras da
conjuntiva devem ser colhidas por meio da retrao da
plpebra inferior, passando-se uma haste ao longo da
superfcie da conjuntiva palpebral inferior em direo ao
canto mediano do olho. Em caso de suspeita de LGV, ver
Captulo 11.
Dada a necessidade de uma avaliao rigorosa antes
que um teste de diagnstico seja aprovado pela
Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica (FDA, do ingls United States of
America Food and Drug Administration), a qual inclui
triagens clnicas em mltiplos locais e comparao
com os padres apropriados, o desempenho do ensaio
aprovado pela FDA bem documentado. Dessa forma,
utilizamos esse nvel de avaliao como o padro para a
determinao de ensaios de alta qualidade. A Tabela 5.4
resume as caractersticas de desempenho dos diferentes
testes diagnsticos aprovados para a deteco de C.
trachomatis.
As condies de coleta, transporte e
armazenamento de espcimes variam de acordo
com o ensaio de deteco e podem influenciar
significativamente a sensibilidade do teste.
A seleo do espcime apropriado e do ensaio de
deteco crucial para um diagnstico efetivo.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 5.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras


Local

Aparato de
coleta

Procedimento de NAAT
amostragem

Cultura

EID

POC

Endocrvice

Haste/
plsticoa,
escova ou
vassoura
para citologia
em meio
lquido

Use uma haste


de limpeza
para remover o
excesso de muco
antes da coleta
da amostra. O
uso de vassoura
para a coleta s
vlido para NAAT.
Insira 2-3cm
do aparato de
coleta no orifcio
endocervical
e gire 360. A
coleta de clulas
endocervicais
essencial para o
procedimento de
EID.

Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante
ou use meio
lquido para
citologia.
Armazene e
transporte a
amostra de
acordo com
as instrues
do manual.

Coloque a
amostra
diretamente
em meio de
transporte
apropriado
para clamdia
(por exemplo,
tampo SPG
com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C
para inoculaes
em 24h ou a
-70C para
armazenamentos
mais longos.

Passe a
amostra pela
lmina (uma
fina camada)
e deixe-a
secar ao ar
livre.

Coloque a
amostra no
tampo de
extrao do
kit e siga as
instrues do
manual.

Uretra

Haste/
alumniob

Insira 2-3cm da
haste na uretra
e gire 360. A
coleta de clulas
epiteliais cuboides
essencial para
o EID.

Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Armazene e
transporte a
amostra de
acordo com
as instrues
do manual.

Coloque a
amostra
diretamente
em meio de
transporte
apropriado
para clamdia
(por exemplo,
tampo SPG
com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C
para inoculaes
em 24h ou a
-70C para
armazenamentos
mais longos.

Passe a
amostra pela
lmina (uma
fina camada)
e deixe-a
secar ao ar
livre.

Coloque a
amostra no
tampo de
extrao do
kit e siga as
instrues do
manual.

Infeces por clamdia

65

Tabela 5.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)

66

Local

Aparato
de coleta

Procedimento
de amostragem

NAAT

Cultura

EID

POC

Urina

Copo
estril para
coleta de
urina

O paciente no
deve limpar a
rea genital.
Obter o primeiro
jato (em geral,
menos de 25mL).

Coloque a
amostra no
aparato de coleta
do fabricante.
Armazene e
transporte a
amostra de acordo
com as instrues
do manual.

NA

NA

NA

Vagina

Haste/
plsticoa

As amostras
podem ser
obtidas pelo
mdico ou pelos
pacientes. Gire a
haste para que
esta entre em
contato com toda
a parede vaginal.

Coloque a
NA
amostra no
aparato de coleta
do fabricante.
Armazene e
transporte a
amostra de acordo
com as instrues
do manual. Vrios
ensaios toleram
esfregaos secos
recebidos sem
meio.

NA

Siga as
instrues
do
manualc.

Reto

Haste/
plsticoa

Insira 2-3cm da
haste no reto e
gire 360.

Atualmente,
nenhum fabricante
faz referncia
a esse tipo de
amostrad. Trate-a
como uma amostra
endocervical. As
amostras podem
ser enviadas sem
o meio, caso o
ensaio utilizado
aceite esse tipo
de amostragem
para espcimes
endocervicais.

Passe a
amostra
pela
lmina
(uma fina
camada)
e deixe-a
secar ao
ar livre.

NA

Coloque a amostra
diretamente em
meio de transporte
apropriado para
clamdia (por
exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C
para inoculaes
em 24h ou a
-70C para
armazenamentos
mais longos.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 5.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)


Local

Aparato Procedimento
de coleta de amostragem

NAAT

Cultura

EID

POC

Orofaringe

Haste/
plsticoa

Atualmente, nenhum
fabricante faz
referncia a esse
tipo de amostrad.
Trate-a como
uma amostra
endocervical. As
amostras podem
ser enviadas sem o
meio, caso o ensaio
utilizado aceite esse
tipo de amostragem
para espcimes
endocervicais.

Coloque a amostra
diretamente em
meio de transporte
apropriado para
clamdia (por
exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).

Passe a
amostra pela
lmina (uma
fina camada)
e deixe-a
secar ao ar
livre.

NA

Passe a haste na
faringe posterior
e nas criptas
tonsilares.

Nasofaringe Haste/
(para
alumniob
casos de
suspeita de
pneumonia
neonatal)

Passe a haste na NA
nasofaringe ou
colete o aspirado
traqueobronqueal.

Coloque a amostra
diretamente em
meio de transporte
apropriado para
clamdia (por
exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C para
inoculaes em 24h
ou a -70C para
armazenamentos
mais longos.

NA

NA

Conjuntiva

Passe a haste
na superfcie
da conjuntiva
palpebral inferior.

Coloque a amostra
diretamente em
meio de transporte
apropriado para
clamdia (por
exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C para
inoculaes em 24h
ou a -70C para
armazenamentos
mais longos.

Passe a
amostra pela
lmina (uma
fina camada)
e deixe-a
secar ao ar
livre.

NA

Haste/
alumniob

NA

Infeces por clamdia

67

EID: ensaio de imunofluorescncia direta; NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care; SPG:
sacarose-fosfato-glutamato.
a

Hastes de plstico com extremidades de dacron ou de rayon.

Hastes de alumnio com extremidades de dacron ou de rayon.

Somente alguns testes POC esto licenciados para espcimes vaginais.

Os dados indicam que os NAAT apropriados apresentam um bom desempenho para esse tipo de amostra, mas nenhum fabricante se refere a
espcimes extragenitais.
d

Tabela 5.4: Testes diagnsticos avaliados* (at junho de 2012) para a deteco de C. trachomatis
NAAT

Cultura

EID

POC

Hastes com amostra


endocervical

Sim

Sim

Sim

Sim

Meio lquido para


citologia

Sim (alguns testes)

No

No

No

Obtidas pelo
paciente

Sim (alguns testes)

No

No

Sim (alguns testes)

Coletadas pelo
mdico

Sim (alguns testes)

No

No

Sim (alguns testes)

Tipos de espcimes

Hastes com amostras


vaginais

Urina
Mulheres

Sim

Homens

Sim

No
No

No
No

No
No

Hastes com amostras Sim


da uretra de homens

Sim

Sim

Sim

Hastes com amostras Noa


do reto

Simb

Simb

No

Hastes com amostras Noa


da orofaringe

Simb

Simb

No

Hastes com amostras Noa


da conjuntiva

Sim

Sim

No

Desempenho
Sensibilidadec

Muito alta

Moderada-alta

Baixa-moderada

Baixa-moderada

Especificidade

Muito alta

Muito alta

Moderada

Muito alta

Custo

Muito alto

Moderado

Baixo

Baixo

Transporte e
armazenamento

Em temperatura
ambiente por at
60 dias (checar o
manual)

4C por 24h

Temperatura
ambiente

NA

Instrumentao

Grande presena de
instrumentao

Microbiologia de
rotina/virologia

Microscpio de
fluorescncia

Pequena-nenhuma

Rendimento/
automatizao

Alto/sim

Baixo/no

Baixo/no

Baixo/no

Outras consideraes

68

-70C aps 24h

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 5.4: Testes de diagnstico avaliados* (at junho de 2012) para a deteco de C. trachomatis (continuao)
NAAT

Cultura

EID

POC

Complexidade tcnica Alta

Alta

Moderada (habilidade Baixa


em microscopia)

Nvel de
infraestrutura do
laboratrio

Referncia

Referncia

Central

Local

Mltiplos patgenos
de uma mesma
amostra

N. gonorrhoeae,
Trichomonas
vaginalis e HPV em
algumas plataformas

No

No

No

Outros comentrios

Devido s
caractersticas
de desempenho
superiores,
os NAAT so
altamente

Outras consideraes

O rigor na coleta
Altamente
e no transporte
recomendado para
essencial
a identificao
para manter a
imediata de
viabilidade do
infeces na
teste essa a
conjuntiva.
maior barreira
recomendados
nesse ensaio para
para o diagnstico
a sensibilidade.
e triagem.
O potencial para
Requer adeso
obter isolados
estrita aos
protocolos devido
viveis til em
ao potencial de
testes adicionais,
contaminao do
como o de
laboratrio.
determinao de
Alguns exigem
gentipos e o teste
grandes lotes, o
de susceptibilidade
que pode aumentar
a antibiticos.
o tempo de retorno
do resultado.

As infeces
identificadas
podem ser tratadas
antes que o
paciente deixe a
clnica.

EID: ensaio de imunofluorescncia direta; HPV: papilomavrus humano; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care.
* Avaliado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica.
a
Os dados indicam que os NAAT apropriados apresentam um bom desempenho para esse tipo de amostra, mas nenhum fabricante se refere a
espcimes extragenitais.
b

Comparada aos NAAT modernos, a sensibilidade da cultura e do EID tende a ser ainda menor para esse tipo de espcime.

A estimativa das sensibilidades varia muito, dependendo das diferentes sensibilidades dos ensaios de uma mesma metodologia, bem como
dos ensaios utilizados para comparao (o padro ouro). Os NAAT so superiores a qualquer outra classe de testes quanto sensibilidade e
apresentam excelente especificidade.

Fonte: Adaptado de Unemo M, Papp JR. Infections caused by Chlamydia trachomatis. In: Morse SA et al., eds. Atlas of sexually transmitted diseases
and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010:4063.

Infeces por clamdia

69

5.4 Teste de amplificao de cido nucleico


(NAAT)
A deteco molecular de sequncias especficas
de cidos nucleicos e a subsequente validao e
comercializao desses ensaios trouxe grandes
melhorias para a deteco laboratorial de C. trachomatis.
Testes NAH, como o PACE 2 e o PACE 2C da Gen-Probe
(Gen-Probe, EUA), que se baseiam na ligao de sondas
de cidos nucleicos complementares especficas
e subsequente amplificao do sinal para detectar
a ligao, foram os primeiros a ser desenvolvidos.
Esses testes so aproximadamente 10-15% menos
sensveis que os NAAT e no devem ser utilizados se os
NAAT estiverem disponveis e forem economicamente
acessveis. Os NAAT apresentam caractersticas de
desempenho superiores quando comparados a qualquer
outro tipo de teste para a deteco de infeces por
clamdia (11-14) e, dessa forma, so o tipo de ensaio
recomendado pelos Centros de Controle e Preveno
de Doenas dos Estados Unidos da Amrica (CDC,
do ingls Centers for Disease Control and Prevention),
alm de outros organismos regulatrios e assessores,
para o diagnstico tanto de infeces genitais como
extragenitais e para a triagem de infeces por clamdia
(15). O teste confirmatrio de amostras positivas
para C. trachomatis no mais recomendado. Os
NAAT validados e eficientes apresentam uma srie de
vantagens que independem do fabricante. Eles so
claramente os ensaios disponveis mais sensveis, o
que tambm permite o agrupamento de amostras em
lugares com limitaes de recursos; eles no necessitam
que a viabilidade do organismo seja mantida; a maioria
dos ensaios disponveis comercialmente pode testar
tanto a clamdia quanto a gonorreia; e esses ensaios
apresentam uma gama mais ampla de tipos de amostras
teis, que incluem coletas menos invasivas de urina ou
de amostras vaginais, alm das amostras endocervicais
e uretrais previamente requeridas. Ademais, esses
ensaios so bem adequados para a automatizao, o que
resulta no aumento da padronizao e na GQ na extrao
e na deteco, bem como no aumento significativo
do rendimento. Entretanto, os ensaios NAAT tambm
compartilham algumas dificuldades. As tecnologias de
amplificao exigem uma instrumentao substancial e
no so apropriadas para muitos laboratrios localizados

70

em pases com poucos recursos. Esses ensaios tambm


so susceptveis contaminao do ambiente, devido
amplificao exponencial das sequncias-alvo. Qualquer
atividade que envolva um tubo aberto de amostra
amplificada uma fonte em potencial para a formao
de aerossol e contaminao do ambiente. Uma vez que
as instalaes laboratoriais e os equipamentos (por
exemplo, pipetas) se contaminam, sua recuperao pode
ser extremamente difcil.
Outra questo envolve o potencial de resultados falsonegativos. O processo de extrao de cido nucleico
fundamental para o procedimento, mas difcil
de ser garantido para cada amostra. A amplificao
requer concentraes precisas de sal, nucleotdeos
e enzimas para ocorrer de forma eficiente, o que
exige grande preciso no uso da pipeta. A enzima que
promove a amplificao tambm pode ser sensvel a
componentes de sangue, muco e urina. Dessa forma,
um resultado negativo pode, na verdade, refletir uma
ausncia do cido nucleico-alvo, em virtude da coleta
ou extrao inadequadas da amostra ou deficincia
na amplificao, ao invs de uma efetiva ausncia de
sequncia-alvo. A proporo de amostras inibitrias
pode variar dependendo da metodologia do teste e,
conforme os mtodos utilizados, pode chegar a 7,5%
em certas populaes (16). Entretanto, o desempenho
desses testes ainda altamente prefervel ao da cultura,
que pode fornecer resultados falso-negativos devido
perda da viabilidade dos organismos, e ao de outros
mtodos diferentes da cultura cuja sensibilidade
menor (ou no mximo igual) desta e que tambm
apresentam especificidade abaixo do ideal. Dessa forma,
embora haja a necessidade de cuidados laboratoriais
apropriados, as vantagens dos NAAT prevalecem
substancialmente em relao s desvantagens. O uso
dos NAAT deve ser incentivado mesmo em lugares
com limitaes de recursos, por meio da criao de
laboratrios de referncia regionais que possam fornecer
os servios de diagnstico utilizando esses mtodos.
Os laboratrios de referncia regionais oferecem
muitas vantagens, que resultam de grandes volumes de
testes, adeso rigorosa s boas prticas laboratoriais e
melhoria na especializao tcnica. O uso de laboratrios
regionais pode implicar reduo de custos na utilizao
de ensaios de alta sensibilidade. Apesar da necessidade

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

de enviar amostras para uma instituio regional, o


tempo para o retorno do resultado pode ser equivalente
ou at menor, considerando-se o grande volume de
testagem e o uso de automatizao de alto rendimento.
Por essas razes, os laboratrios que no podem custear
a realizao dos ensaios NAAT mais sensveis devem
considerar a utilizao dos servios de um laboratrio
de referncia regional ao invs de utilizar ferramentas de
diagnstico menos sensveis.
Atualmente, quatro companhias possuem NAAT
aprovados pela FDA e disponveis comercialmente
para a deteco de C. trachomatis. Os ensaios
comercializados por esses fabricantes esto descritos
a seguir. Todos os NAAT aprovados e comercialmente
disponveis detectam o LGV como positivo para C.
trachomatis, sem, entretanto, distinguir os resultados
como positivos L1-L3. Para essa finalidade, necessria
a determinao do gentipo (ver Captulo 11).
importante notar que, no mundo, h muitos outros
NAAT para C. trachomatis disponveis comercialmente
ou desenvolvidos internamente por laboratrios (17,
18). Se NAAT no aprovados pela FDA forem utilizados,
processos regulatrios regionais (como os da Unio
Europeia [UE]) e/ou nacionais devem fornecer garantias
da qualidade e desempenho do NAAT para diagnstico. O
uso de NAAT aprovados internacionalmente altamente
indicado. Se isso no for possvel, recomenda-se
que o NAAT proposto pela instituio local tenha sua
eficincia rigorosamente validada e sua qualidade
assegurada em relao a, pelo menos, um NAAT
aprovado internacionalmente antes de sua utilizao
e, subsequentemente, que o teste seja usado com os
devidos controles positivos, negativos e de inibio. A
participao em sistemas idneos de avaliao externa
da qualidade tambm fortemente recomendada (ver
Captulo 2 e Anexo 3). Para informaes bsicas sobre
as diferentes tecnologias de NAAT, ver Anexo 3.

Tecnologias moleculares oferecem a melhor


sensibilidade, com excelente especificidade.
Ensaios moleculares reduzem a necessidade de
condies estritas de transporte e armazenamento
e eliminam anlises subjetivas (por exemplo,
microscopia).
Se NAAT aprovados internacionalmente no
puderem ser utilizados, altamente recomendado
que o NAAT proposto pela instituio local tenha
sua eficincia estritamente validada e a sua
qualidade assegurada em relao a pelo menos,
um NAAT aprovado internacionalmente, antes de
sua utilizao.
Novos ensaios esto sendo rapidamente
disponibilizados e no podem ser previstos neste
documento. importante o acesso contnuo
literatura para a realizao de avaliaes de alta
qualidade dos novos ensaios, a fim de determinar o
que melhor se adequa a cada laboratrio.

5.4.1 Ensaios moleculares da Abbott


Os ensaios RealTime CT/NG e somente CT, da Abbott,
so realizados pelo sistema automatizado m2000
(Abbott Molecular, EUA). Esse ensaio substituiu o
aprovado pela FDA, LCx, o qual foi um dos primeiros
NAAT disponveis comercialmente. O ensaio da reao
em cadeia da polimerase (PCR, do ingls polymerase
chain reaction) RealTime utiliza o m2000sp, um
instrumento automatizado de preparao de amostra,
que extrai o DNA utilizando um sistema de captura
baseado em partcula magntica. Em seguida extrao,
o instrumento m2000p carrega a mistura principal
de reagentes (master mix) na placa de PCR, adiciona
as amostras purificadas e, ento, est pronto para a
amplificao em tempo real e deteco no m2000rt (19).
Esse termociclador em tempo real detecta a amplificao
pela fluorescncia emitida quando sondas se ligam
especificamente a sequncias-alvo amplificadas durante
cada ciclo de amplificao. O ensaio passa a incluir dois
alvos, isto , duas sequncias no plasmdeo crptico
(7-10 cpias por organismo) para C. trachomatis, a
fim de garantir a deteco da nova variante sueca
de C. trachomatis (nvCT), a qual causou milhares de
resultados falso-negativos na Sucia e em alguns outros

Infeces por clamdia

71

pases nrdicos que utilizaram NAAT disponibilizados,


na poca, pela Roche e pela Abbott (20-22). O sistema
pode detectar mltiplos sinais, que permitem ao ensaio
identificar clamdia, gonorreia e um controle interno no
competitivo para medir potenciais inibies em cada
amostra. A sequncia de controle interno baseada no
DNA de planta, adicionado durante a extrao de DNA,
para fornecer uma medida da eficincia dessa extrao
e possveis inibies da PCR. Esse o nico ensaio que
fornece uma indicao precisa do sucesso do isolamento
do DNA. O sistema capaz de processar 96 amostras
por corrida, incluindo trs controles, permitindo que
186 amostras e seis controles sejam testados em
aproximadamente oito horas.
As amostras aprovadas incluem urina e hastes com
secrees vaginais, endocervicais e uretrais. As
amostras so coletadas utilizando o kit multi-Collect
fornecido pelo fabricante e so mantidas estveis a
2-30C por at 14 dias antes de serem testadas. O
kit compreende um dispositivo de coleta nico para
todos os tipos de amostra que podem ser processadas
simultaneamente no sistema m2000. A alta estabilidade
das hastes contendo amostras e da urina a temperatura
ambiente torna esse ensaio atraente para os
estabelecimentos de sade pblica que enviam amostras
para o laboratrio de referncia.
O ensaio RealTime CT/NG apresenta sensibilidade
analtica excelente, sendo comparvel at ao ensaio
APTIMA Combo 2 (23). O processo de purificao de
DNA desenhado para remover possveis inibidores,
enquanto o controle interno fornece um alerta em caso
de inibio. O desenho do processo tambm prev a
remoo de fluorforos que ocorrem naturalmente e
que podem interferir no desempenho do teste. O uso da
tecnologia de deteco de fluorescncia homognea com
iniciadores de PCR especficos combina amplificao
e deteco em um sistema fechado de nico passo.
A natureza fechada do sistema reduz a possibilidade
de contaminao cruzada e o uso do controle
negativo fornece ao usurio um mtodo rpido para a
identificao de contaminao do ambiente.

5.4.2 Ensaio de diagnstico da Becton,


Dickinson (BD)
O ensaio da BD para clamdia e gonorreia aprovado
pela FDA, o ProbeTec ET (Becton, Dickinson and
Company, EUA), foi o primeiro ensaio em tempo real
disponvel comercialmente. Esse teste usa amplificao
por deslocamento de cadeia (SDA, do ingls strand
displacement amplification) isotrmico para amplificar e
detectar as sequncias-alvo, simultaneamente, a 52,5C.
A amplificao de uma sequncia do plasmdeo crptico
de clamdia ocorre em uma placa selada com um leitor
de transferncia de energia fluorescente. Esse esquema
foi desenhado para minimizar possveis contaminaes
ambientais cruzadas, uma vez que as amostras
amplificadas nunca so abertas.
As amostras aprovadas para o teste ProbeTec incluem
urina e hastes com secreo endocervical e amostra
da uretra. Mais uma vez, as evidncias sugerem que
hastes com secrees vaginais so um tipo de amostra
til, e esto sendo realizados estudos para investigar o
desempenho do ensaio com outros tipos de amostras.
As amostras em hastes so coletadas utilizando-se o
kit fornecido pelo fabricante e permanecem estveis
a temperatura ambiente por at seis dias antes da
realizao do teste. O primeiro jato de urina estvel por
at 24 horas a 4C. Se um conservante for adicionado
amostra, a estabilidade da urina estendida para dois
dias a temperatura ambiente ou 4-6 dias a 4C.
Esse ensaio pode detectar tanto clamdia quanto
gonorreia e permite um timo controle externo de
amplificao (14). A escolha do teste solicitado
especfica em relao fita (isto , cada fita de oito
amostras deve ser testada para a mesma combinao de
organismos) de clamdia ou gonorreia.
No entanto, o uso do controle de amplificao
especfico em relao placa, de modo que, ao se
realizar uma opo, esta ser aplicada a todas as
amostras da placa. O teste apresenta-se no formato de
96 poos, com poos diferentes para cada sequnciaalvo. Dessa forma, se for solicitado o teste para clamdia
e gonorreia e o controle de amplificao, para cada um
desses sero utilizados os poos de trs colunas e um
total de 32 amostras e controles podero ser testados
em uma placa. Alternativamente, se s for pedido o teste

72

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

para clamdia, um total de 96 amostras podero ser


analisadas em uma placa.
Uma vez que o ensaio foi desenhado para ser um
sistema fechado, no foram includos mtodos
enzimticos para degradar contaminantes de
amplificaes anteriores. Infelizmente, ocorreram vrios
episdios de contaminao do ambiente a partir da
amostra bruta. Esses eventos podem implicar semanas
para a completa limpeza e recuperao do ambiente, o
que muitas vezes resulta em atrasos dispendiosos e na
necessidade de relocao para uma rea nunca exposta
previamente ao ensaio. Os laboratrios que utilizam
esse ensaio devem aderir rigorosamente a um plano
de monitoramento ambiental para detectar eventos de
contaminao em tempo hbil. Um ensaio de segunda
gerao que parece ser mais resistente a esse tipo de
contaminao est sendo avaliado.
A BD tambm desenvolveu um ensaio de ltima gerao
aprovado pela FDA, o ProbeTec ET CTQx/GCQX no
Sistema Viper com XTR (Viper). Esse ensaio totalmente
automatizado e pode gerar 278 resultados em uma nica
jornada de trabalho de oito horas. Ele usa uma qumica
em dupla, que inclui uma deteco de amplificao
pareada com cada reao de deteco de clamdia
ou gonorreia. O sistema altamente resistente e tem
excelentes caractersticas cronolgicas de andamento
(24).

5.4.3 Ensaio de diagnstico da Gen-Probe


O ensaio APTIMA Combo 2 (Gen-Probe, EUA), aprovado
pela FDA, baseado no princpio de captura do RNAralvo (com a inteno de reduzir ou eliminar a inibio
da amplificao), isto , no isolamento das sequncias
de RNAr-alvo utilizando oligonucleotdeos de captura e
esferas magnticas com DNA, seguido pela amplificao
utilizando a tecnologia de amplificao mediada por
transcrio (TMA, do ingls transcription-mediated
amplification) de uma sequncia do RNAr 23S de C.
trachomatis. A amplificao detectada por meio da
cintica da emisso de luz por sondas de DNA marcadas
e complementares regio-alvo. Os dados confirmando
a ausncia de inibio por esse ensaio foram obtidos
principalmente por meio do uso de amostras negativas
de pacientes, misturadas com cepas laboratoriais de C.
trachomatis (25).

As amostras aprovadas incluem urina; hastes com


secrees vaginais, endocervicais e uretrais; e amostras
coletadas com meio lquido para citologia (12, 26).
As amostras coletadas por hastes utilizam o meio de
transporte fornecido pelo fabricante e so estveis por
at 60 dias a temperatura ambiente, o que as torna
ideais para o transporte a laboratrios distantes. O
primeiro jato de urina estvel por at 24 horas aps
a coleta e, uma vez colocado no meio do fabricante,
permanece estvel a temperatura ambiente por at
30 dias. O teste APTIMA Combo 2 tambm detecta
N. gonorrhoeae (RNAr 16S) e, no total, podem ser
analisadas aproximadamente 500 amostras durante
um perodo de oito horas, utilizando um sistema
automatizado (o sistema TIGRIS). A popularidade desse
ensaio est aumentando rapidamente em muitos
pases devido sua alta sensibilidade, especificidade,
estabilidade estendida da amostra e automatizao do
processo.
Uma vez que as amostras continuam seladas aps
a amplificao, espera-se que a possibilidade de
contaminao cruzada do ambiente seja muito baixa.
Entretanto, o monitoramento ambiental altamente
recomendado na ausncia de uma medida de controle
enzimtica, ou de outra natureza, da degradao
do produto amplificado. O fabricante recomenda
a adeso rigorosa a procedimentos de limpeza e
descontaminao. A reprodutibilidade deve ser
monitorada. Alm disso, para uma especificidade
ideal, esto disponveis ensaios confirmatrios que
detectam o RNAr 16S especfico de C. trachomatis e o
RNAr 16S especfico de N. gonorrhoeae (APTIMA GC;
outra sequncia de RNAr 16S comparada utilizada
no APTIMA Combo 2). Esses ensaios so ideais para a
confirmao de resultados positivos, assim como para a
repetio de testes (26).

5.4.4 Ensaio de diagnstico da Roche


O ensaio Cobas Amplicor CT/NG (Roche Diagnostics,
EUA), tambm aprovado pela FDA, utiliza a tecnologia de
PCR para amplificar as sequncias de DNA-alvo, fazendo
uso de pares de iniciadores biotinilados especficos
em relao a um organismo. Na clamdia, o alvo est
localizado no plasmdeo crptico. Seguindo um processo
de amplificao intermediado por trs temperaturas,

Infeces por clamdia

73

os produtos so hibridizados em esferas magnticas


cobertas por sondas com sequncias especficas
para cada espcie, localizadas nas sequncias dos
iniciadores. O processo de deteco baseado em
interaes entre biotina e avidina. Um equipamento
Cobas pode testar aproximadamente 96 amostras,
incluindo espcimes e controles, em um perodo de
oito horas. As amostras so coletadas em um meio
de transporte disponvel comercialmente. A urina e as
amostras em hastes so estveis a 4C por at sete
dias. Os tipos de espcimes aprovados incluem hastes
com amostras endocervicais e uretrais, meio lquido
para citologia e o primeiro jato de urina, embora a
urina de mulheres no deva ser utilizada para o teste
de gonorreia. Demonstrou-se que hastes contendo
secreo vaginal geraram resultados aceitveis por essa
plataforma (27, 28).
Esse ensaio inclui uma medida de inibio baseada
em uma sequncia de DNA irrelevante, adicionada
previamente em cada tubo de reao. Isso tem como
objetivo fornecer evidncias de que um resultado
negativo seja realmente negativo, e no meramente
influenciado por contedos na amostra. O ensaio
tambm utiliza, na mistura de amplificao, uma
enzima (uracil-N-glicosilase) que degrada sequncias
previamente amplificadas com base na presena de
dUTP no lugar de dTTP no produto amplificado. Isso
fornece ao usurio uma rede de segurana para evitar
pequenos espirros e formao de aerossol, o que ocorre
frequentemente ao se manusear um grande nmero de
amostras, alm de aumentar a reprodutibilidade dos
resultados.
O Cobas TaqMan CT v2.0, com a marca CE na Europa,
um ensaio de segunda gerao fabricado pela Roche.
Essa plataforma usa PCR em tempo real e pode ser
acoplada a um sistema de processamento automtico
para minimizar o tempo de manuseio por tcnicos. O
ensaio pode ser utilizado apenas para clamdia, sem
estar associado ao teste de gonorreia. O ensaio de ltima
gerao da Roche (Cobas 4800 CT/NG), que tambm
pode detectar N. gonorrhoeae, j foi aprovado pela FDA.
Esse ensaio usa a tecnologia de PCR em tempo real em
uma plataforma totalmente automatizada. Os iniciadores

74

utilizados tanto no Cobas TaqMan CT v2.0 como no


Cobas 4800 CT/NG j foram redesenhados e incluem
dois alvos para clamdia, a fim de garantir a deteco da
cepa sueca nvCT (20-22). O segundo alvo no se localiza
no plasmdeo, mas em regies conservadas do gene
ompA que codifica a principal protena da membrana
externa (MOMP). As caractersticas de desempenho se
enquadram no observado para outros NAAT. Esse ensaio
fornece um controle de amplificao e um processo de
preveno de contaminao cruzada juntamente com
um sistema totalmente automatizado, que pode testar
at 278 amostras em um turno de oito horas. O ensaio
funciona bem tanto em amostras invasivas quanto
em amostras vaginais para mulheres e em urina para
homens, e ainda est sob avaliao para meios lquidos
de citologia.

5.4.5 Outros ensaios NAAT


Os ensaios descritos anteriormente baseiam-se na
informao disponvel poca de preparo deste
manual. Atualmente, vrios outros NAAT esto em
desenvolvimento e avaliao e, devido rpida mudana
nesse campo de atuao, pode-se esperar a divulgao
de novos testes. Os laboratrios devem revisar a
literatura conforme a descrio desses novos mtodos
for disponibilizada. Alm disso, em muitos lugares,
os ensaios aprovados pela FDA no so prontamente
liberados ou no podem ser executados devido
necessidade de instrumentao especializada ou altos
custos. Em consequncia, os ensaios comercialmente
disponveis que no foram revisados pela FDA e aqueles
desenvolvidos in-house so utilizados como mtodos
que oferecem maior sensibilidade comparados a outras
classes de deteco (por exemplo, EID ou ELISA). Se um
NAAT no aprovado pela FDA for utilizado, processos
regulatrios regionais (como os da UE) e/ou nacionais
devem garantir a qualidade e desempenho do NAAT
diagnstico (17, 18). Nesses casos, tambm essencial
que os laboratrios se mobilizem para a validao
rigorosa do desempenho desses ensaios NAAT antes
do seu uso para o fornecimento de resultados aos
pacientes; ver tambm o Captulo 2 e o Anexo 3 sobre
NAAT e sua validao e GQ.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

5.5 Mtodos de deteco no baseados em


cidos nucleicos
5.5.1 Ensaio de imunofluorescncia direta (EID)
O EID utiliza um anticorpo monoclonal marcado com
fluorescncia que permite a visualizao microscpica
de corpos elementares de C. trachomatis em esfregaos
celulares coletados da conjuntiva, uretra e endocrvice.
Este continua sendo o nico tipo de teste que apresenta
a capacidade de avaliar diretamente a qualidade do
espcime; entretanto, o EID possui sensibilidade abaixo
da ideal, mesmo em relao cultura.
Dois ensaios de anticorpos com fluorescncia direta, o
MicroTrak de colorao direta (Trinity Biotech, Irlanda) e
o Pathfinder de colorao direta (BioRad Laboratories,
EUA) esto disponveis para a colorao de esfregaos
a partir de amostras coletadas da uretra, endocrvice,
reto, orofaringe e conjuntiva para a visualizao de
corpos elementares de clamdia. O ensaio MicroTrak
utiliza um anticorpo monoclonal marcado com
fluorescena especfico para a MOMP de C. trachomatis e
no apresenta reao cruzada com C. pneumoniae.
Em contrapartida, o reagente Pathfinder usa um
anticorpo policlonal especfico para o lipopolissacardeo
(LPS) que mais amplamente reativo e colore tanto C.
pneumoniae quanto C. trachomatis. O uso mais comum
de EID a colorao de esfregaos de amostras da
conjuntiva, principalmente em recm-nascidos de
pases desenvolvidos. Os EID oferecem as vantagens
de rpido retorno de resultado, alta especificidade
e deteco de organismos no viveis. Alm disso,
nenhum outro ensaio comercial apresenta uma clusula
regulamentar para amostras da conjuntiva ou permite
avaliar diretamente a qualidade do espcime. Entretanto,
os EID possuem sensibilidade substancialmente mais
baixa que a dos NAAT, so de execuo trabalhosa
no se mostrando adequados para altas demandas
de diagnstico e necessitam de microscopistas
especializados. Os resultados negativos devem
ser interpretados com cuidado em razo do baixo
desempenho desses testes, o que pode resultar na no
deteco de infeces.

5.5.2 Testes point-of-care (POC)


Os testes ELISA apresentam baixa sensibilidade
e especificidade inferior ideal (especialmente os
ELISA que detectam LPS) quando comparados aos
NAAT, o que pode requerer um teste confirmatrio de
resultados positivos. Os resultados negativos devem ser
interpretados com cautela devido ao baixo desempenho
do teste, que pode resultar na no deteco de
infeces. Por causa das limitaes apresentadas pelos
ELISA, estes no devem ser utilizados quando qualquer
outra opo de teste estiver disponvel.
No entanto, diferentemente dos ELISA, os testes
point-of-care (POC) (testes rpidos), que utilizam a
tecnologia ELISA, apresentam vantagens que tornam
seu uso conveniente para determinados lugares.
Vrios testes POC, comumente baseados no fluxo
lateral e captura de antgenos por membrana em tiras
imunocromatogrficas (TIC), foram desenvolvidos
para diagnosticar infeces por C. trachomatis. Muitos
desses testes foram criados e comercializados,
mas no passaram por uma avaliao apropriada e
detalhada. Entretanto, quando comparados aos NAAT,
os testes rpidos apresentam claramente sensibilidade
insuficiente e s devem ser utilizados quando no houver
estruturas laboratoriais adequadas. O Anexo 2 discute
os princpios dos testes POC. Mesmo com a baixa
sensibilidade dos testes POC, em lugares com limitaes
de recursos e com populaes de alta prevalncia, a
queda da sensibilidade pode ser aceitvel em troca da
possibilidade de testar e tratar enquanto o paciente
ainda est no local da testagem.
Em um estudo de anlise de decises, realizado por
Gift et al., quando a taxa de retorno do paciente para
tratamento foi de 65% ou menos, o diagnstico rpido
por POC proporcionou um aumento no nmero de
pacientes tratados, ainda que tenham sido identificadas
menos infeces (30). Os testes POC podem tambm ser
utilizados nesses locais para aumentar a especificidade
dos algoritmos de gerenciamento sindrmico, o que
ir reduzir o tratamento excessivo e triar infeces
assintomticas.
Os testes rpidos POC oferecem maior oportunidade
de alcanar populaes que no tm acesso a clnicas
e fornecer-lhes tratamento imediato. Em algumas

Infeces por clamdia

75

situaes, o impacto dessa ampliao no tratamento


pode compensar a menor sensibilidade desses testes
quando comparados aos NAAT.
Os testes rpidos POC oferecem maior
oportunidade de alcanar populaes que no
tm acesso a clnicas e fornecer-lhes tratamento
imediato. Em algumas situaes, o impacto dessa
ampliao no tratamento pode compensar a menor
sensibilidade desses testes quando comparados
aos NAAT.

5.6 Metodologias a serem utilizadas apenas


nos laboratrios de referncia
5.6.1 Cultura
At o incio dos anos 80, o mtodo principal e padro
ouro para o diagnstico de infeces por C. trachomatis
era a inoculao associada centrifugao dos
espcimes clnicos em clulas viveis susceptveis
de culturas de tecidos, seguida da demonstrao de
incluses clamidiais caractersticas aps incubao. Em
resumo, o espcime coletado utilizando hastes com
extremidades de dacron ou citoescovas e colocado em
um meio de transporte, como, por exemplo, tampo
sacarose-fosfato-glutamato (SPG) (ver Anexo 4),
contendo soro fetal bovino e antibiticos tais como
vancomicina, gentamicina e nistatina, para inibir
o crescimento de outra bactria ou fungo. Embora
atualmente esse mtodo deva ser reservado para uso
em laboratrios de referncia, importante manter a
habilidade de obter isolados extrados de pacientes, e
isso requer o uso de cultura de tecidos.
5.6.1.1 Cultura de C. trachomatis em linhagens de
clulas McCoy
Diviso de frascos
Verifique se o meio foi esterilizado antes de sua
utilizao.
Verifique visualmente as monocamadas quanto
aderncia e ausncia de contaminao
microbiana.
Proceda utilizando uma tcnica estril,
trabalhando em uma capela de conteno de

76

risco biolgico. Aspire o meio do frasco aderente


usando uma pipeta estril e um frasco a vcuo.
Lave a monocamada com 10mL de soluo
glicose-potssio-sdio-fosfato (GKNP) (ver Anexo
4) e aspire.
Adicione 4mL de tripsina e incube as clulas a
temperatura ambiente at que a monocamada se
desprenda do frasco (em aproximadamente 3-7
minutos). Bata levemente nas laterais do frasco
para remover as clulas.
Adicione 4mL do meio de Dulbecco modificado
por Iscove (IMDM-VGA, do ingls Iscoves
modified Dulbecco medium) (ver Anexo 4) para
inativar a tripsina e agite vigorosamente. Use o
lquido para lavar qualquer clula remanescente
na parede do frasco.
Adicione 1mL da suspenso de clulas para cada
frasco novo de 175cm2 e complete com o meio
IMDM-VGA para um volume final de 75mL. Ao
utilizar frascos de 75cm2, adicione 0,5mL de
clulas e complete com meio para um volume
final de 35mL.
Incube os frascos a 37C por 48-96 horas, com
as tampas bem fechadas.
Cultivo em placas de microtitulao e tubos de ensaio
Siga os passos 1-6 descritos acima.
Cada placa necessita de 15mL de suspenso
celular diluda. Calcule o volume total necessrio
com base no nmero de placas desejado.
Exemplo: 10 placas requerem 150mL de
IMDM-VGA. Cada tubo de ensaio necessita de
1mL de meio de Eagle modificado (MEM-VG, do
ingls Modified Eagles Medium) (Ver Anexo 4).
Calcule o volume total necessrio com base no
nmero de tubos de ensaio desejados.
Para cada 50mL de IMDM-VGA das placas de
microtitulao, adicione 1mL de suspenso
celular do frasco tripsinizado. Exemplo: 150mL
de IMDM-VGA necessita de 3mL de clulas. Para
cada 100mL de IMDM-VGA dos tubos de ensaio,
adicione 1mL das clulas.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Coloque a suspenso de clulas diludas em


um hemacitmetro. Conte cinco quadrados (os
quatro cantos e o meio); a mdia do nmero de
clulas por quadrado multiplicado por 105 para
fornecer o nmero de clulas por mililitro. As
placas de microtitulao necessitam de 1-1,4 x
10 6 clulas/mL (10-14 clulas por quadrado); os
tubos de ensaio requerem 7-10 x 105 clulas/
mL para que sejam aderentes em 48 horas. Se
o nmero de clulas contadas estiver fora do
intervalo, ajuste a concentrao adicionando
IMDM-VGA ou mais clulas ao frasco, como for
mais apropriado. Conte novamente e ajuste at
que se atinja a concentrao correta.
Adicione 200L em cada poo. Sele as placas
com a pelcula de vedao. Adicione 1mL em
cada tubo de ensaio e tampe bem. Incube a 37C
at que as placas sejam utilizadas (48-96 horas).
Inoculao em placas de microtitulao
Confira a aderncia da monocamada de clulas
McCoy. As clulas devem estar encostadas umas
nas outras e levemente amontoadas. O meio
deve estar transparente.
Os espcimes a seguir devem ser testados no
formato de microtitulao: cervicais, uretrais,
vaginais, do reto, da orofaringe e da conjuntiva.
Agite vigorosamente (em vrtice) as amostras por
cinco segundos e ento, se possvel, sonifique
por 20 segundos. Durante a sonificao, deve-se
utilizar proteo nos ouvidos e olhos.
Os espcimes que exibirem ampla contaminao
bacteriana (por exemplo, meio de transporte
turvo ou mudana de pH no meio) podem causar
toxicidade cultura de tecido. Esses espcimes
devem ser testados das seguintes formas: sem
estarem diludos; diludos a 1:2; e diludos a 1:10
(em SPG).
Trabalhe em uma capela de conteno de risco
biolgico, colocando metade de cada espcime
no criotubo com o mesmo nmero do espcime.

Aspire as placas contendo as monocamadas


aderidas.
Adicione 100L de cada espcime e imerja na
monocamada celular. Cada espcime deve ser
inoculado em trs monocamadas consecutivas.
Aps completar a inoculao em cada placa,
adicione 200L de IMDM-VGA em cada poo.
Sele as placas com a pelcula de vedao e
centrifugue a 1.400g por uma hora a 30C.
Incube a 37C por 48 horas.
Armazene os espcimes a -70C at que
os resultados estejam disponveis. Todos os
espcimes positivos so armazenados por mais
de duas semanas.
Remova o meio das placas. Fixe as
monocamadas cobrindo-as com metanol por 10
minutos. Remova o metanol.
Inoculao em tubos de ensaio
Somente os espcimes excepcionais so
cultivados em tubos de ensaio. Alguns exemplos
incluem bipsias endometriais ou tubrias e
tecidos linfticos.
Confira a aderncia das clulas McCoy nos
tubos; as clulas devem estar encostadas umas
nas outras e levemente alongadas. O meio deve
estar transparente.
Agite vigorosamente (em vrtice) os espcimes
por cinco segundos e ento sonifique-os por 20
segundos. Durante a sonificao deve-se utilizar
proteo nos ouvidos e olhos.

Os espcimes que exibirem ampla contaminao


bacteriana (por exemplo, meio de transporte
turvo ou mudana de pH no meio) podem causar
toxicidade cultura de tecido. Esses espcimes
devem ser testados das seguintes formas: sem
estarem diludos; diludos a 1:2; e diludos a 1:10
(em SPG).

Trabalhando na capela, etiquete e aspire trs


tubos de ensaio por espcime. Adicione 0,2mL

Infeces por clamdia

77

de espcime a cada tubo. Acrescente 1mL de


IMDM-VGA.
Centrifugue a 2.500g por uma hora a 30C.
Incube a 37C por 72 horas.
Armazene todos os espcimes a -70C at que
os resultados estejam disponveis. Todos os
espcimes positivos so armazenados por tempo
indeterminado.
Aspire o meio de um tubo por espcime e fixe-o
cobrindo a monocamada com metanol por 10
minutos.
Marque com anticorpos fluorescentes.
Siga as instrues do manual para o anticorpo
anticlamdia especfico utilizado. Em geral:
Adicione o antissoro monocamada fixada
(aps a remoo do metanol). Cada poo de
microtitulao recebe 40L utilizando-se uma
micropipeta multicanal.
Incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
Lave gentilmente trs vezes com soluo
salina tamponada com fosfato (PBS, do ingls
phosphate-buffered saline solution) (ver Anexo 4).
As lamnulas redondas de 13mm so removidas
dos tubos de ensaio e, utilizando-se fluido de
montagem, colocadas em lminas de vidro com
lamnulas de 22x50mm. Mantenha as culturas
marcadas no escuro at que sejam lidas. As
culturas devem ser lidas no mesmo dia em que
forem marcadas.
Na maioria dos laboratrios, a cultura no mais
adequada como teste de diagnstico, uma vez que
apresenta menor sensibilidade que os NAAT, implica
tempo de retorno do resultado significativamente
longo, demanda o uso de amostras invasivas, requer
condies de manipulao mais restritivas para
preservar a viabilidade de C. trachomatis, tecnicamente
complexa e no possui uma metodologia padronizada
internacionalmente e de qualidade garantida. A cultura
hoje requisitada predominantemente para uso em
casos mdico-legais, devido suposio de 100% de

78

especificidade (mas pode ocorrer contaminao cruzada


entre amostras), e para o teste de cura, que solicitado
em menos de 14 dias aps o tratamento. Na verdade,
a especificidade dos NAAT tanta que esses ensaios
tambm deveriam ser aceitos para os casos mdicolegais; mas a confiana na cultura reflete a lentido
das mudanas nos padres legais. O teste de cura
raramente realizado, dada a eficincia dos tratamentos
de dose nica disponveis. No entanto, alguns estudos
recentes indicaram uma eficcia de erradicao abaixo
do ideal para o uso de 1g de azitromicina. Se realizado,
o teste normalmente executado em mais de duas
ou trs semanas aps o tratamento em cada local. Na
maioria dos casos, os ensaios de NAAT so apropriados
para essa finalidade, uma vez que a perda de DNA da
infeco inicial j deve estar completa nesse momento.
Entretanto, o tempo ideal para a realizao do teste de
cura pode diferir para os NAAT baseados em RNA.
Dessa forma, a menos que os isolados dos organismos
sejam requeridos para fins de pesquisa, no h uma
justificativa vlida para o uso da cultura como um
mtodo de diagnstico de rotina. Isso consistente com
as recomendaes das diretrizes laboratoriais atuais
para doenas sexualmente transmissveis dos CDC (15).
Os isolados recuperados nos locais em que a cultura
ainda realizada deveriam ser preservados em um
repositrio de espcimes para estudos epidemiolgicos.
Esses estudos podem incluir a investigao da
susceptibilidade antimicrobiana (ver adiante) e a
determinao de gentipos. Esta ltima pode ser
realizada mediante tcnicas moleculares e no necessita
o uso de organismos viveis (31-33). Assim, os
repositrios de amostras positivas para NAAT tambm
devem ser mantidos nas diferentes regies do mundo.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

A cultura apresenta uma sensibilidade abaixo da


ideal quando comparada aos NAAT disponveis
comercialmente e aprovados internacionalmente, e
no pode ser recomendada para diagnstico se um
NAAT apropriado estiver disponvel e for acessvel
economicamente.
A capacidade da realizao de cultura deve ser
mantida em alguns laboratrios de referncia,
e o repositrio de isolados deve ser conservado
para possveis estudos genticos e/ou fenotpicos
futuros.

5.6.2 Teste de susceptibilidade antimicrobiana


No h evidncias inequvocas da emergncia de
resistncia adquirida homotpica (fenotpica e genotpica)
e estvel aos antibiticos recomendados em isolados
clnicos de C. trachomatis, embora registros de casos
tenham sugerido a resistncia bacteriana como
causa de falhas teraputicas. Alm disso, o teste
de susceptibilidade antimicrobiana in vitro para C.
trachomatis nunca foi realizado rotineiramente; no h
uma metodologia aceita universalmente, padronizada,
reprodutvel e com qualidade garantida; e tambm no
foi realizada uma correlao baseada em evidncias
entre a atividade in vitro e a eficincia in vivo (desfechos
de tratamentos clnicos) (34).
O teste de susceptibilidade antimicrobiana para C.
trachomatis envolve grande demanda de mo de
obra, requer experincia em cultura de tecidos e s
vivel em laboratrios de referncia. Entretanto,
no se deve excluir a possibilidade de uma futura
emergncia e propagao da resistncia antimicrobiana
clinicamente relevante em C. trachomatis. Isso enfatiza
a necessidade de uma avaliao adequada dos atuais
mtodos de teste de susceptibilidade antimicrobiana e
do desenvolvimento de um mtodo efetivo, padronizado,
objetivo e de qualidade garantida, assim como uma
correlao apropriada entre a atividade in vitro e o
resultado do tratamento. Esse mtodo pode ser til no
futuro para o monitoramento de possveis resistncias
antimicrobianas, estudos de tratamentos clnicos e
acesso atividade in vitro de novos antibiticos. Na
ocorrncia de eventos de propagao de resistncia
antimicrobiana clinicamente relevante em C. trachomatis,

os repositrios de isolados sero de utilidade para a


avaliao retrospectiva em instituies de pesquisa.

5.6.3 Sorologia
Os mtodos sorolgicos para o diagnstico das infees
por clamdia esto entre as tecnologias mais modernas
disponveis. Esses mtodos identificam e, em alguns
casos, titulam o nvel da resposta do anticorpo aos
antgenos da clamdia. Enquanto o primeiro ensaio,
fixao complementar e microimunofluorescncia
(MIF) dependiam de organismos inteiros, os ensaios
subsequentes foram desenvolvidos para apresentar
respostas especficas a protenas individuais ou classes
de anticorpos. A sorologia pode ajudar o diagnstico e/
ou a triagem de infeces complicadas de C. trachomatis
(artrite reativa, PID, gravidez ectpica, infertilidade
por fator tubrio); diagnosticar pneumonia neonatal e
infeces de LGV (ver Captulo 11); e pode ainda ser
til em pesquisa e estudos epidemiolgicos, como, por
exemplo, para o histrico cumulativo de exposies
de uma populao amostral a infeces por clamdia.
Entretanto, importante que os resultados sorolgicos
sejam sempre interpretados com cautela e no fora de
contexto.
Em uma infeco primria aguda por clamdia,
podem-se detectar IgM especficas, assim como IgG
e IgA. No entanto, muitas vezes a resposta sistmica
de anticorpo retardada ou no mensurvel aps
infeco urogenital descomplicada. Em contrapartida,
nveis altos de anticorpos contra C. trachomatis podem
persistir muito tempo aps a eliminao da infeco.
Consequentemente, devido baixa sensibilidade e
especificidade, a mensurao de anticorpos contra
clamdia de pouco valor para o diagnstico de
infeces agudas por C. trachomatis e no deve
ser usada para o diagnstico de rotina de infeces
descomplicadas por C. trachomatis.

Infeces por clamdia

79

No utilize a sorologia para o diagnstico de


infeces urogenitais descomplicadas por C.
trachomatis.
Somente use a sorologia como uma possvel ajuda
para o diagnstico e/ou triagem de infeces
complicadas por C. trachomatis, pneumonia
neonatal e infeces de LGV, assim como em
estudos epidemiolgicos.

5.7 Referncias
1. Schachter J et al. Confirming positive results
of nucleic acid amplification tests (NAATs) for
Chlamydia trachomatis: all NAATs are not created
equal. Journal of Clinical Microbiolowgy, 2005,
43(3):13721373.
2. Martin DH et al. Use of multiple nucleic acid
amplification tests to define the infected-patient
gold standard in clinical trials of new diagnostic
tests for Chlamydia trachomatis infections. Journal
of Clinical Microbiology, 2004, 42(10):47494758.
3. Masek BJ et al. Performance of three nucleic acid
amplification tests for detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by use
of self-collected vaginal swabs obtained via an
Internet-based screening program. Journal of
Clinical Microbiology, 2009, 47(6):16631667.
4. Hobbs MM et al. From the NIH: proceedings of
a workshop on the importance of self-obtained
vaginal specimens for detection of sexually
transmitted infections. Sexually Transmitted
Diseases, 2008, 35(1):813.
5. Bachmann LH et al. Nucleic acid amplification
tests for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae and
Chlamydia trachomatis rectal infections. Journal of
Clinical Microbiology, 2010, 48(5):18271832.
6. Mimiaga MJ et al. Gonococcal, chlamydia, and
syphilis infection positivity among MSM attending
a large primary care clinic, Boston, 2003 to
2004. Sexually Transmitted Diseases, 2009,
36(8):507511.

80

7. Annan NT et al. Rectal chlamydiaa reservoir


of undiagnosed infection in men who have sex
with men. Sexually Transmitted Infections, 2009,
85(3):176179.
8. Schachter J et al. Nucleic acid amplification tests
in the diagnosis of chlamydial and gonococcal
infections of the oropharynx and rectum in men who
have sex with men. Sexually Transmitted Diseases,
2008, 35(7):637642.
9. 9. Rosenberger JG et al. Reactions to selfsampling for ano-rectal sexually transmitted
infections among men who have sex with men: a
qualitative study. Archives of Sexual Behavior, 2011,
40(2):281288.
10. 10. Dodge B et al. Field collection of rectal samples
for sexually transmitted infection diagnostics among
men who have sex with men. International Journal
of STD and AIDS, 2010, 21(4):260264.
11. 11. Black CM et al. Head-to-head multicenter
comparison of DNA probe and nucleic acid
amplification tests for Chlamydia trachomatis
infection in women performed with an improved
reference standard. Journal of Clinical Microbiology,
2002, 40(10):37573763.
12. 12. Gaydos CA et al. Performance of the APTIMA
Combo 2 assay for detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in female
urine and endocervical swab specimens. Journal of
Clinical Microbiology, 2003, 41(1):304309.
13. 13. Horner P et al. Enhanced enzyme immunoassay
with negative-gray-zone testing compared to
a single nucleic acid amplification technique
for community-based chlamydial screening of
men. Journal of Clinical Microbiology, 2005,
43(5):20652069.
14. Van Der Pol B et al. Multicenter evaluation of the
BDProbeTec ET System for detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in urine
specimens, female endocervical swabs, and male
urethral swabs. Journal of Clinical Microbiology,
2001, 39(3):10081016.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

15. Association of Public Health Laboratories (APHL).


Laboratory diagnostic testing for Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Expert
consultation meeting summary report, 1315
January 2009 Atlanta, GA. Silver Spring, MD,
APHL, 2009 (http://www.aphl.org/ aphlprograms/
infectious/std/Documents/ID_2009Jan_ CTGCLabGuidelines-Meeting-Report.pdf).
16. Mahony J et al. Urine specimens from pregnant
and nonpregnant women inhibitory to amplification
of Chlamydia trachomatis nucleic acid by PCR,
ligase chain reaction, and transcription-mediated
amplification: identification of urinary substances
associated with inhibition and removal of inhibitory
activity. Journal of Clinical Microbiology, 1998,
36(11):31223126.
17. Unemo M et al. Can the Swedish new variant of
Chlamydia trachomatis (nvCT) be detected by UK
NEQAS participants from seventeen European
countries and five additional countries/regions in
2009? Eurosurveillance, 2009, 14(19). pii:19206.
18. Reischl U, Straube E, Unemo M. The Swedish new
variant of Chlamydia trachomatis (nvCT) remains
undetected by many European laboratories as
revealed in the recent PCR/NAT ring trial organised
by INSTAND e.V., Germany. Eurosurveillance, 2009,
14(32):pii:19302.
19. Marshall R et al., eds. New automated real time
PCR technology for the detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. 11th
International Symposium on Human Chlamydial
Infections. Niagra-on-the-Lake, Ontario, 2006.
20. Unemo M et al. The Swedish new variant of
Chlamydia trachomatis: genome sequence,
morphology, cell tropism and phenotypic
characterization. Microbiology, 2010, 156(Pt
5):13941404.
21. Ripa T, Nilsson P. A variant of Chlamydia trachomatis
with deletion in cryptic plasmid: implications for use
of PCR diagnostic tests. Eurosurveillance, 2006,
11(11):E061109.2.

22. Unemo M, Clarke IN. The Swedish new variant of


Chlamydia trachomatis. Current Opinion in Infectious
Diseases, 2011, 24(1):6269.
23. Gaydos CA et al. Performance of the Abbott
RealTime CT/ NG for detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Journal of
Clinical Microbiology, 2010, 48(9):32363243.
24. Felder RA et al. Process evaluation of a fully
automated molecular diagnostics system. Journal
of the Association for Laboratory Automation, 2009,
14(5):262268.
25. Chong S et al. Specimen processing and
concentration of Chlamydia trachomatis added can
influence false-negative rates in the LCx assay but
not in the APTIMA Combo 2 assay when testing for
inhibitors. Journal of Clinical Microbiology, 2003,
41(2):778782.
26. Boyadzhyan B et al. Comparison of the APTIMA CT
and GC assays with the APTIMA Combo 2 assay, the
Abbott LCx assay, and direct fluorescent-antibody
and culture assays for detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Journal of
Clinical Microbiology, 2004, 42(7):30893093.
27. Schachter J et al. Vaginal swabs are appropriate
specimens for diagnosis of genital tract infection
with Chlamydia trachomatis. Journal of Clinical
Microbiology, 2003, 41(8):37843789.
28. Gaydos CA et al. Evaluation of dry and wet
transported intravaginal swabs in detection of
Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
infections in female soldiers by PCR. Journal of
Clinical Microbiology, 2002, 40(3):758761.
29. Huppert J, Hesse E, Gaydos CA. Whats the point?
How point-of-care STI tests can impact infected
patients. Point of Care, 2010, 9(1):3646.
30. Gift TL et al. The rapid test paradox: when fewer
cases detected lead to more cases treated:
a decision analysis of tests for Chlamydia
trachomatis. Sexually Transmitted Diseases, 1999,
26(4):232240.

Infeces por clamdia

81

31. Bandea CI et al. Chlamydia trachomatis serovars


among strains isolated from members of rural
indigenous communities and urban populations in
Australia. Journal of Clinical Microbiology, 2008,
46(1):355356.
32. Lima HE et al. Genotyping of Chlamydia trachomatis
from endocervical specimens in Brazil. Sexually
Transmitted Diseases, 2007, 34(9):709717.
33. Pedersen LN, Herrmann B, Mller JK. Typing
Chlamydia trachomatis: from egg yolk to
nanotechnology. FEMS Immunology and Medical
Microbiology, 2009, 55(2):120130.
34. Wang SA et al. Evaluation of antimicrobial resistance
and treatment failures for Chlamydia trachomatis:
a meeting report. Journal of Infectious Diseases,
2005, 191(6):917923.

82

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 6
Tricomonase
6.1 Introduo
O Trichomonas vaginalis o agente etiolgico da
doena sexualmente transmissvel (DST) no viral
mais prevalente em todo o mundo. Em 2008, a
Organizao Mundial da Sade estimou a ocorrncia
de 276,4 milhes de novos casos de T. vaginalis
mundialmente entre adultos com 15-49 anos. Isso
representa, substancialmente, mais casos de DST do
que os causados por Chlamydia tracomatis e Neisseria
gonorrhoeae juntas (1). Apesar da alta prevalncia de
infeces causadas por T. vaginalis, os esforos para
o controle das DST tm, historicamente, subestimado
esse patgeno. Embora T. vaginalis possa causar
um corrimento vaginal anormal (tricomonase) em
mulheres e ser responsvel por at 10-12% dos
casos de uretrites no gonoccicas em homens (2), a
infeco pode ser assintomtica em pelo menos 50%
das mulheres e 70-80% dos homens (3). Assim, o
diagnstico laboratorial essencial para complementar
as estratgias de gesto sindrmica para o tratamento
dessa infeco.
O T. vaginalis um protozorio mvel, ovoide, em
formato de pera e flagelado (10-20m de comprimento).
Os organismos apresentam quatro flagelos anteriores
livres e um quinto flagelo imerso em uma membrana
ondulada que se estende anteriormente at cerca de dois
teros da clula. Esse flagelo impele o protozorio com
movimentos irregulares.
A epidemiologia de infeces por T. vaginalis difere
em dois importantes aspectos de outras infeces que
causam corrimento vaginal. Primeiro, a faixa etria
em que a infeco incide distinta daquela na qual
ocorre a infeco por clamdia ou gonorreia. Nessas
ltimas, em menor medida no que se refere infeco
gonoccica, o pico de prevalncia ocorre em mulheres
com 15-25 anos, enquanto que as infeces por T.
vaginalis apresentam o seu pico substancialmente
mais tarde na vida (entre 40-50 anos de idade). Essa
diferena na distribuio relevante para orientar

os programas de controle de DST e definir os alvos


apropriados para a triagem. A distribuio especfica da
infeco em homens por idade ainda no foi estudada
adequadamente.
A segunda diferena que, embora o T. vaginalis
dependa da transmisso sexual para mover-se de
hospedeiro para hospedeiro, a distribuio das infeces
diagnosticadas em laboratrio altamente desigual
entre homens e mulheres, com uma razo de sexos de
at 4:1 (6-8). Essa distribuio demonstrada pelas
taxas de infeco de parceiros masculinos de mulheres
infectadas, que varia de 22% a 72% (9), e dos poucos
estudos realizados simultaneamente em homens e
mulheres. Isso ocorre provavelmente pelo fato de a
infeo em homens ser mais transitria, pelo curto
perodo em que a deteco do organismo possvel e
pela ausncia de triagem e diagnstico em homens. O
T. vaginalis adere membrana mucosa associada ao
epitlio escamoso, mas no invade a mucosa. Devido
ao ambiente da uretra masculina, menos provvel que
o organismo se mantenha nesse local do que no meio
vaginal. Existem dados limitados sobre a patognese
da infeco por T. vaginalis em homens (8). Em homens
e mulheres, o organismo normalmente promove uma
resposta inflamatria robusta, que resulta no corrimento
tpico da doena j instalada. Ver Tabela 6.1 para a
descrio das manifestaes clnicas da infeco por T.
vaginalis.
O diagnstico de tricomonase baseado no odor,
qualidade e quantidade de corrimento vaginal, no
pH vaginal e na possvel presena de friabilidade
cervical. Normalmente, o pH vaginal >6.0, o corrimento
exacerbado ou branco espumoso e a friabilidade
cervical pontuada (colo do tero com aspecto de
morango) so sugestivos de infeco por T. vaginalis.
Entretanto, a ausncia desses sinais clnicos no
suficiente para eliminar a possibilidade de infeco,
principalmente devido ao fato de esta ser assintomtica
em aproximadamente 50% das mulheres e 70-80%
dos homens (5,6). Consequentemente, os mtodos
laboratoriais so necessrios para aumentar a
sensibilidade e a especificidade do diagnstico.

Tricomonase

83

Tabela 6.1: Manifestaes clnicas da infeco por Trichomonas vaginalis


Infeco genital

Primria

Sequelas

Mulheres

Corrimento exacerbado, purulento ou


espumoso branco a amarelo; disria;
dor plvica; prurido

Desfechos negativos da gravidez,


aumento do risco de transmisso e
infeco por HIV

Homens

Corrimento uretral, disria, dor no


testculo

Possvel epididimite e prostatite

A resposta inflamatria da tricomonase em mulheres


e da uretrite causada por T. vaginalis em homens
significativa e aumenta substancialmente o risco
de transmisso e infeco por HIV, como tambm a
probabilidade de desfechos negativos da gravidez.
Em homens, o tratamento de uretrite causada por
T. vaginalis resulta em uma diminuio de 0,5-2
log da carga viral do HIV no lquido seminal (10, 11).
Resultados similares foram observados em mulheres
que receberam tratamento para o corrimento vaginal
(12, 13). Uma vez que a carga viral no compartimento
genital um dos principais fatores de risco para
a transmisso para um parceiro no infectado, o
diagnstico apropriado e o tratamento das infeces
por T .vaginalis devem ser prioridade na sade pblica
como estratgia de enfrentamento ao HIV. Da mesma
forma, dados disponveis h muitos anos indicam que
a presena de corrimento resultante de DST aumenta
o risco de infeco por HIV. Estudos realizados na
frica subsaariana estimaram que o aumento do risco
de soroconverso em mulheres com tricomonase
de 1,5-3,0 vezes (9). Esses estudos foram conduzidos
em populaes de mulheres em alto risco para HIV
(profissionais do sexo) e em populaes mais gerais
(mulheres atendidas em clnicas de planejamento
familiar). Anlises de sobrevivncia realizadas durante
longos ensaios clnicos estimaram um aumento de
duas vezes quanto ao risco relativo de infeco por
HIV por mulheres com tricomonase durante um
perodo de 30 meses (14). Por outro lado, mulheres
com HIV apresentaram um aumento de 2,1 vezes no
risco de adquirir trichomonas durante os 30 meses
de acompanhamento (14). Isso indica um aumento de
risco de transmisso do HIV a parceiros no infectados.
Dado o maior risco de transmisso do HIV, semelhante
ao observado para gonorreia, e taxas de prevalncia

84

aproximadamente trs vezes maiores em relao a


esta ltima, o diagnstico apropriado e o tratamento da
infeco por T. vaginalis merece maior priorizao.
As infeces por T. vaginalis so as DST no virais
mais comuns, as quais aumentam o risco de
transmisso e infeco por HIV, alm de elevar a
probabilidade de desfechos negativos da gravidez.

6.2 Reviso dos mtodos de diagnstico


disponveis
Existem quatro classes principais de ensaios de
diagnstico laboratorial: microscopia de preparao
a fresco, deteco de antgenos, cultura e testes de
amplificao de cidos nucleicos (NAAT, do ingls
nucleic acid amplification test). A microscopia de
preparao a fresco pode ser realizada em clnicas e
em combinao com testes para vaginose bacteriana.
Esse um mtodo de diagnstico de primeira linha
ideal, isto , quando realizado e interpretado de forma
adequada, fornece um diagnstico definitivo com alta
especificidade. Entretanto, preciso usar de cautela ao
descartar a possibilidade de infeco com base somente
na microscopia negativa, devido a trs razes. Primeiro,
os tricomonaddeos so sensveis a temperaturas altas
e perdem sua mobilidade em at 10 minutos aps a
coleta da amostra. Uma vez que a mobilidade uma
marca caracterstica, sua perda pode resultar em
resultados falso-negativos. Segundo, o tamanho dos
tricomonaddeos similar ao das clulas brancas do
sangue (linfcitos ou pequenos granulcitos neutrfilos),
que esto comumente presentes como resultado do
processo inflamatrio. Assim, os tricomonaddeos podem
ser confundidos com esses tipos de clulas. Finalmente,
em muitas mulheres e na maioria dos homens, a carga
do organismo pode ser inferior ao limite de deteco da

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

microscopia. Alm das amostras vaginais, a microscopia


pode ser realizada em secrees uretrais ou sedimentos
urinrios de homens, mas essa tcnica apresenta baixa
sensibilidade, provavelmente tambm devido baixa
carga de organismos (15).
Os testes point-of-care (POC) de deteco de antgeno
esto atualmente disponveis em muitos lugares. Esses
so aprovados apenas para amostras vaginais. A ltima
gerao desses testes, por exemplo, o Teste Rpido
para Trichomonas OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA),
apresenta uma sensibilidade maior quando comparado
microscopia (16, 17 ) e pode fornecer resultados
em aproximadamente 30 minutos, isto , enquanto o
paciente espera. Assim como em outros ensaios POC,
a oportunidade de tratar as infeces imediatamente
uma vantagem desse teste em relao queles que
necessitam de encaminhamento a um laboratrio
central.
As culturas laboratoriais foram utilizadas por muitos
anos e, na ltima dcada, kits de cultura disponveis
comercialmente, tais como o sistema de cultura InPouch
TV (BioMed Diagnostics, EUA), tornaram-se acessveis.
Amostras vaginais, da uretra e de sedimentos urinrios
de homens so espcimes licenciados para a cultura
(ver Tabela 6.2). Esse mtodo exige at 5-7 dias aps a
coleta e a determinao de resultados positivos requer
a avaliao por microscopia. Entretanto, a cultura
aumenta a sensibilidade para alm daquela observada na
microscopia de preparao a fresco (15, 17 ).
Finalmente, os NAAT esto disponveis para a deteco
do DNA ou RNA especfico de T. vaginalis. Em programas
que empregam os NAAT para clamdia e gonorreia,
a incluso do teste para T. vaginalis pode ser uma
estratgia razovel. At a escrita do presente manual,
a Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica (FDA, do ingls United States of
America Food and Drug Administration) aprovou apenas
um ensaio, mas outros ensaios esto sob avaliao
e j podem estar disponveis em alguns lugares. A
sensibilidade e a especificidade do ensaio aprovado
pela FDA (APTIMA TV, Gen-Probe, EUA) so muito
altas (5, 16, 18). As caractersticas de desempenho de
outros NAAT devem ser avaliadas rigorosamente, de
preferncia em relao ao teste aprovado pela FDA, nos

lugares a ser utilizados e antes da implementao para o


diagnstico de rotina nos laboratrios.
Uma srie de mtodos foram descritos para a deteco
de anticorpos contra T. vaginalis. No entanto, os
testes de anticorpos apresentam baixa sensibilidade
e especificidade inferior ideal para a deteco de
infeces por T. vaginalis, e no devem ser utilizados
para o diagnstico de rotina de tricomonases.
A Tabela 6.3 resume as caractersticas de desempenho
dos testes de diagnstico disponveis para a deteco
de T. vaginalis. Para o desempenho apropriado de
todos os mtodos de diagnstico, essencial seguir
precisamente os procedimentos operacionais-padro
e recomendaes dos fabricantes quanto coleta,
transporte e armazenamento das amostras, assim
como o desempenho do ensaio especfico, incluindo os
controles de qualidade.
Os testes POC apropriados e a cultura apresentam
maior sensibilidade que a microscopia.
Os NAAT apropriados e validados apresentam
sensibilidade superior a outros mtodos de
diagnstico.

6.3 Condies de coleta, transporte e


armazenamento de espcimes (ver
Tabela 6.2)
Mulheres
As amostras vaginais so ideais para a deteco de T.
vaginalis. A coleta de amostra do frnice posterior deve
ser realizada por meio de uma haste de plstico com
extremidades de dacron ou rayon. As hastes de madeira
com extremidades de algodo so aceitveis para
microscopia ou inoculao de culturas, mas no so
recomendadas para POC ou NAAT. Dessa forma, para
evitar confuses, mais prtico evitar o uso de hastes
com extremidades de algodo. Os mdicos devem
coletar as amostras antes da insero do espculo
durante os exames plvicos, ou o prprio paciente pode
obter a amostra. necessrio orientar os pacientes
para que estes entendam como coletar sua prpria
amostra. O fornecimento de instrues adequadas um
fator determinante para a concordncia do paciente em
coletar sua prpria amostra. As amostras residuais

Tricomonase

85

vaginal, cervical ou de urina coletadas para o teste de


clamdia/gonorreia podem ser utilizadas para o NAAT de
T. vaginalis.
Homens
Secrees da uretra podem ser coletadas utilizando-se
uma haste de alumnio com extremidade de dacron

ou rayon. Essas amostras podem ser usadas para a


microscopia de preparao a fresco, para a cultura
ou para o NAAT. O primeiro jato de urina pode ser
centrifugado para a obteno do sedimento apropriado
para a cultura. A urina no centrifugada adequada para
o NAAT.

Tabela 6.2: Coleta, transporte e armazenamento de amostras


Local

Aparato
de coleta

Procedimento de
amostragem

Microscopia

POC

Cultura

NAAT

Vaginal
(coletado
pelo mdico)

Haste/
plsticoa

Colete a amostra
do frnice
posterior antes
da insero do
espculo.

Dilua a
amostra em
0,5mL de
soluo salina
e aplique
uma gota da
soluo na
lmina com
lamnula.

Coloque a
amostra no
tampo de
extrao do
kit e siga as
instrues
do manual.

Coloque a
amostra
diretamente em
meio de cultura
(por exemplo,
meio de Diamond
ou InPouch).b

Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Pode ser

Entregue a
amostra ao
fornecedor
para a diluio
e preparao
da lmina.

Entregue a
amostra ao
fornecedor
para
que seja
processada
como
descrito
acima.

Vaginal
Haste/
(coletado
plsticoa
pelo paciente)

86

Gire a haste 360,


tocando todas as
paredes vaginais.

Incube a 37C.

Entregue a
amostra ao
fornecedor para
a inoculao em
meio de cultura.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

enviada seca
ao laboratrio.
Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.
Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Pode ser
enviada seca
ao laboratrio.
Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.

Tabela 6.2: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)


Local

Aparato
de coleta

Procedimento de
amostragem

Microscopia

Uretra
(apenas em
homens
sintomticos)

Haste/
alumnioc

Colete secrees
da uretra >1 hora
aps a ltima
urina.

Urina

Copo
estril
para
coleta de
urina

O paciente no
deve limpar a rea
genital. Obter a
primeira parte do
jato de urina (em
geral, menos que
25mL), >1 hora
aps a ltima
urina.

POC

Cultura

NAAT

Dilua a
NA
amostra em
0,5mL de
soluo salina
e aplique
uma gota da
soluo na
lmina com
lamnula.

Coloque a
amostra
diretamente em
meio de cultura
(por exemplo,
meio de Diamond
ou InPouch).b
Incube a 37C.

Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.

Centrifugue
NA
a amostra
a 500g por
cinco minutos.
Coloque o
sedimento
em 0,5
de soluo
salina. Aplique
uma gota da
soluo na
lmina com
lamnula.

Centrifugue
a amostra a
500g por cinco
minutos. Coloque
o sedimento
em um meio
de cultura (por
exemplo, meio
de Diamond ou
InPouch).b Incube
a 37C.

Coloque a
amostra no
aparato de
coleta do
fabricante.
Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.

NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: testes point-of-care.
a

Hastes de plstico com extremidades de dacron ou rayon.

Para lugares que no tm acesso a meio de cultura, as hastes podem ser colocadas em tubos contendo meio Amies, sendo armazenadas a 4C e
transportadas ao laboratrio central em at 24 horas.
b

Haste de alumnio com extremidades de dacron ou rayon.

Tricomonase

87

Tabela 6.3: Caractersticas de desempenho dos testes de diagnstico para a deteco de T. vaginalis
Microscopia

POC

Cultura

NAAT

Haste com amostra


endocervical

No

No

No

Sim

Meio lquido para citologia

No

No

No

Sim

Obtida pelo paciente

Sim

Sim

Sim

Sim

Coletada pelo mdico

Sim

Sim

Sim

Sim

Feminina

No

No

No

Sim

Masculina

Sim

No

Sim

Sim

Sim

No

Sim

Sim

Sensibilidade

Baixa

Altaa

Moderada-alta

Muito alta

Especificidade

Muito alta

Muito alta

Muito alta

Muito alta

Custo

Baixo

Moderado

Moderado

Alto

Transporte e
armazenamento

NA

NA

Ambiente

Ambiente

Instrumentao

Microscpio

Nenhuma

Estufa, microscpio

Grande infraestrutura

Rendimento/automatizao Baixo/no

Baixo/no

Baixo/no

Alto/possvel

Complexidade tcnica

Moderada
(experincia em
microscopia)

Baixa

Moderada (experincia
em microscopia)

Alta

Nvel de infraestrutura do
laboratrio

Perifrica

Perifrica

Intermedirio-central

Central

Outros comentrios

Resultados
As infeces
falso-negativos
identificadas
so mais
podem ser
provveis que
tratadas
resultados
antes que
negativos
o paciente
reais. Assim, o
deixe a
contexto clnico
clnica.
essencial.

necessrio
um mximo de
ateno para uma
microscopia precisa.

necessria a
adeso estrita aos
protocolos, devido
possibilidade
de contaminao
laboratorial.

Tipos de espcime

Haste com amostra vaginal

Urina

Haste com amostra uretral


masculina
Desempenho

Outras consideraes

Com a probabilidade
de obter isolados
viveis, til para
Alguns exigem
testes adicionais,
grandes lotes, o
como a determinao
que pode atrasar o
de gentipos e o teste
tempo de entrega
de susceptibilidade
de resultados.
antimicrobiana.

NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care.
a

88

Refere-se ao teste rpido para trichomonas OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA).

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

6.4 Mtodos de diagnstico


6.4.1 Microscopia
Imediatamente aps a coleta, as amostras so diludas
em 0,5mL de soluo salina estril a temperatura
ambiente, e uma lmina deve ser preparada com uma
gota da amostra em soluo salina e uma lamnula. A
lmina deve ser analisada com um aumento de 100x,
em at 10 minutos aps a coleta, para visualizar os
tricomonaddeos mveis. A confirmao da morfologia
em formato de pra, incluindo a visualizao do
flagelo, deve ser realizada utilizando um aumento
de 400x (Figura 6.1). As clulas no mveis no
podem ser diagnosticadas como tricomonaddeos e,
consequentemente, importante que a microscopia
seja realizada imediatamente, uma vez que os
organismos perdem rapidamente sua mobilidade (19). A
sensibilidade da microscopia limitada (apenas 40-65%
para mulheres em alguns lugares, e ainda menos
para amostras de homens) (6, 15, 16) e os resultados
negativos devem ser interpretados com cautela.
Em alguns lugares, a microscopia constitui o diagnstico
e triagem de primeira linha e as amostras negativas so
encaminhadas a um laboratrio central para maiores
avaliaes, principalmente as de indivduos sintomticos.
Entretanto, quando a mobilidade do organismo,
estritamente exigida, e a morfologia so identificadas,
a especificidade da microscopia excelente e todos
os pacientes com microscopia positiva devem ser
considerados infectados.
A microscopia necessita ser realizada e interpretada em
at 10 minutos para obter bons resultados e uma maior
sensibilidade em mulheres sintomticas.

Figura 6.1
Trichomonas vaginalis em microscopia de
preparao a fresco.

A microscopia deve ser realizada e interpretada em


at 10 minutos para obter bons resultados e uma
maior sensibilidade em mulheres sintomticas.

6.4.2 Testes point-of-care (POC) com deteco


de antgenos
Vrios ensaios de deteco de antgenos foram
desenvolvidos para a identificao de T. vaginalis (16,
17, 20). As exigncias de equipamentos e os custos dos
reagentes variam, assim como o desempenho do ensaio.
Vrios desses ensaios so direcionados apenas para o
uso em mulheres sintomticas, tornando-os menos teis
que as outras opes. A ltima gerao desses testes,
como, por exemplo, o Teste Rpido para Trichomonas
OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA) apresenta maior
sensibilidade quando comparado microscopia (16,
17 ). Os procedimentos iro variar de acordo com
o fabricante, e as instrues do manual devem ser
seguidas precisamente para cada ensaio.
Os testes POC apropriados apresentam sensibilidade
substancialmente maior que a microscopia e fornecem
resultados rpidos com um mnimo de experincia
tcnica.
Os testes POC apropriados apresentam
sensibilidade substancialmente maior que a
microscopia e fornecem resultados rpidos com
um mnimo de experincia tcnica.

6.4.3 Cultura
Por muitos anos, a cultura foi fundamental para
o diagnstico de T. vaginalis. O T. vaginalis um
organismo anaerbico, que cresce muito devagar
em condies aerbicas. Atualmente, a cultura
normalmente realizada utilizando-se o meio de Diamond
modificado ou o sistema de cultura InPouch TV (BioMed
Diagnostics, EUA) (Figura 6.2). As culturas devem ser
incubadas por at 5-7 dias. importante ressaltar que o
T. vaginalis deve crescer no fundo do tubo de cultura e,
consequentemente, os tubos necessitam ser incubados
em uma posio vertical. Alm disso, o meio de cultura
deve ser pr-reduzido e os tubos de cultura levemente
abertos antes de serem colocados no recipiente
anaerbico para incubao a 37C.

Tricomonase

89

90

O meio de Diamond original (21, 22) (ver Anexo 4) foi


subsequentemente modificado de acordo com Fouts
e Kraus, isto , com a substituio da estreptomicina
por netilmicina (22, 23). O meio modificado melhora a
sensibilidade em aproximadamente 75% em relao
aos NAAT. No entanto, a cultura de T. vaginalis tambm
apresenta desvantagens. A sensibilidade da cultura
baixa se comparada aos resultados obtidos por NAAT
(principalmente para homens), alm de constituir um
procedimento que demanda muito tempo e requer que
os pacientes voltem para buscar os resultados. Outros
meios de cultura tambm foram descritos (22, 24-26)
(ver Anexo 4). As amostras coletadas por hastes devem
ser diludas, ou os sedimentos de urina inoculados,
diretamente no meio de cultura na clnica. Nos lugares
que no tm acesso a meio de cultura, devido ao prazo
de validade curto ou outras razes, as hastes podem ser
colocadas em tubos contendo meio Amies, armazenadas
a 4C e transportadas ao laboratrio central em at 24
horas. As culturas devem ser misturadas gentilmente,
coletando-se uma gota do fundo do tubo (onde h maior
concentrao de tricomonaddeos) para microscopia de
preparao a fresco, diariamente, por at sete dias. Se
no for possvel realizar o exame todos os dias, o exame
realizado aps 3-4 dias e novamente no stimo dia ir
detectar quase todos os espcimes positivos.

a ponta. importante ressaltar que a espessura da bolsa


requer que todos os planos de foco sejam avaliados;
isso exige a movimentao do topo para o fundo e de
um lado para o outro. As lminas devem ser avaliadas
diariamente at o quinto dia. Se nenhum trichomonas for
identificado at o dia 5, a cultura considerada negativa.

Em meados dos anos 90, um sistema de cultura


tornou-se comercialmente disponvel, ampliando o uso
de cultura para diagnstico (22, 27-30). O sistema para
cultura InPouch TV utiliza uma bolsa com duas cmaras
independentes (Figura 6.2). As amostras coletadas
por hastes so diludas, ou os sedimentos de urina so
inoculados, no meio no primeiro compartimento. O meio
ento forado para o segundo compartimento e a bolsa
selada. As bolsas so transportadas ao laboratrio
para incubao a 37C por at cinco dias. O sistema
de bolsa pode ser concludo mais rapidamente que a
cultura tradicional, j que, a cada vez, todo o volume
avaliado. As bolsas seladas esto prontas para ser
colocadas no microscpio, utilizando um aumento de
100x. Suportes para essas bolsas, que se encaixam nos
grampos que seguram as lminas, j esto disponveis e
devem ser utilizados para auxiliar na movimentao da
bolsa durante a anlise de microscopia. Toda a cultura
avaliada por meio de uma varredura cuidadosa de ponta

6.4.4 Testes de amplificao de cidos


nucleicos (NAAT)

A cultura tem sensibilidade similar dos testes POC


apropriados, mas tambm pode ser utilizada para
realizar exames em homens.

Figura 6.2
Sistema de cultura InPouch TV.

Os NAAT oferecem a maior flexibilidade quanto aos


mtodos de coleta de amostras e apresentam a maior
sensibilidade dentre todos os mtodos de diagnstico
disponveis. Amostras genitais residuais utilizadas para
o diagnstico de clamdia e gonorreia por meio de NAAT
so adequadas para a deteco dos cidos nucleicos de
T. vaginalis. Os laboratrios que realizam rotineiramente
NAAT para clamdia e gonorreia devem considerar testes
para tricomonase. Apesar da diferena na faixa etria
de maior prevalncia, em muitos locais, a prevalncia
da infeco por T. vaginalis na populao suficiente
para que haja uma preocupao em inclu-la no painel
de testes das causas de corrimento. A descrio de
ensaios desenvolvidos em laboratrios que utilizam
muitas das plataformas de NAAT acessveis atualmente
para clamdia e gonorreia esto disponveis (6, 15,
31-42). Todos esses ensaios envolvem o isolamento do

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

cido nucleico, a amplificao das sequncias-alvo e a


deteco do material amplificado. Apesar da excelente
sensibilidade e especificidade, esses ensaios podem
ser afetados pela contaminao ambiental e, dessa
forma, justifica-se a adeso estrita s boas prticas
laboratoriais. tambm altamente recomendado que
a efetividade do NAAT para T. vaginalis proposto para
os estabelecimentos locais, antes de ser utilizado no
diagnstico, seja estritamente validado em relao a,
pelo menos, um NAAT certificado internacionalmente,
de preferncia o aprovado pela FDA, o APTIMA TV
(ver adiante), e, subsequentemente, utilizado com um
sistema adequado de garantia de qualidade (ver Captulo
2 e Anexo 3).

Entretanto, os dados de resistncia so escassos


e estudos adicionais nessa rea so necessrios
para determinar os mecanismos, a prevalncia e a
epidemiologia dessa resistncia. Contudo, uma vez que
a maioria dos organismos so susceptveis, o teste de
susceptibilidade antimicrobiana (47, 48) no realizado
rotineiramente. No entanto, alguns laboratrios de
referncia precisam manter a capacidade de realizar o
teste de susceptibilidade antimicrobiana em isolados
de T. vaginalis, principalmente quando houver falha na
terapia com metronidazol. Os pacientes que retornam
continuamente com sintomas devem ser avaliados
quanto a possveis comportamentos de exposio e a
adeso aos regimes de tratamento.

Como mencionado acima, um ensaio (APTIMA TV,


Gen-Probe, EUA) foi aprovado pela FDA. Esse teste
altamente sensvel e especfico (16, 18, 43, 44) e pode
ser realizado em uma plataforma semiautomtica ou
totalmente automatizada. O ensaio, como todos os NAAT,
exige ateno especial aos procedimentos de manuseio
de lquidos, para minimizar os eventos de contaminao.
A infraestrutura de equipamentos e os requisitos de
energia para o teste so ambos substanciais. Esse
ensaio deve ser restrito aos laboratrios de referncia
com alta capacidade tcnica.

Os mdicos devem estar cientes de que a


resistncia antimicrobiana tem sido descrita e
considerar esse dado em relao a pessoas com
sintomas continuados.

Os NAAT eficientes e validados apresentam


sensibilidade muito alta e so especialmente teis
em locais onde os testes para clamdia/gonorreia
so realizados utilizando NAAT.
O diagnstico por NAAT exige equipamento
especializado, reagentes e experincia tcnica.

6.5 Resistncia antimicrobiana


Foram descritos isolados de T. vaginalis com
susceptibilidade diminuda e resistncia a metronidazol
(em geral, o tratamento de primeira linha) e tinidazol
(geralmente, a terapia de segunda linha), mas
essas ocorrem raramente (45, 46). Entretanto, em
alguns locais, foi identificado um ligeiro nvel de
resistncia em 2-5% dos casos de tricomonase em
mulheres. A origem da resistncia antimicrobiana
no clara, mas muitas das cepas resistentes de T.
vaginalis parecem ser aerotolerantes. Os organismos
facultativos so geralmente resistentes a metronidazol.

6.6 Referncias
1. Global incidence and prevalence of selected curable
sexually transmitted infections2008. Geneva,
World Health Organization, 2012 (http://www.who.
int/reproductivehealth/publications/rtis/2008_STI_
estimates.pdf, accessed 2 April 2013).
2. Wetmore CM, Manhart LE, Golden MR. Idiopathic
urethritis in young men in the United States:
prevalence and comparison to infections with
known sexually transmitted pathogens. Journal of
Adolescent Health, 2009, 45(5):463472.
3. Sea AC et al. Trichomonas vaginalis infection in
male sexual partners: implications for diagnosis,
treatment, and prevention. Clinical Infectious
Diseases, 2007, 44(1):1322.
4. Zhang ZF et al. Trichomonas vaginalis and cervical
cancer. A prospective study in China. Annals of
Epidemiology, 1995, 5(4):325332.
5. Van Der Pol B. Trichomonas vaginalis infections.
In: Kumar B, Gupta S, eds. Sexually transmitted
infections, 2nd ed. New Delhi, Elsevier,
2012:602609.

Tricomonase

91

6. Van Der Pol B, Kraft CS, Williams JA. Use of an


adaptation of a commercially available PCR assay
aimed at diagnosis of chlamydia and gonorrhea
to detect Trichomonas vaginalis in urogenital
specimens. Journal of Clinical Microbiology, 2006,
44(2):366373.
7. Miller WC et al. The prevalence of trichomoniasis
in young adults in the United States. Sexually
Transmitted Diseases, 2005, 32(10):593598.
8. Krieger JN. Trichomoniasis in men: old issues and
new data. Sexually Transmitted Diseases, 1995,
22(2):8396.
9. Shafir SC, Sorvillo FJ, Smith L. Current issues and
considerations regarding trichomoniasis and human
immunodeficiency virus in African-Americans.
Clinical Microbiology Reviews, 2009, 22(1):3745.
10. Price MA et al. Addition of treatment for
trichomoniasis to syndromic management
of urethritis in Malawi: a randomized clinical
trial. Sexually Transmitted Diseases, 2003,
30(6):516522.
11. Hobbs MM et al. Trichomonas vaginalis as a cause
of urethritis in Malawian men. Sexually Transmitted
Diseases, 1999, 26(7):381387.
12. Tanton C et al. Correlates of HIV-1 genital shedding
in Tanzanian women. PloS One, 2011, 6(3):e17480.
13. Wang CC et al. The effect of treatment of vaginal
infections on shedding of human immunodeficiency
virus type 1. Journal of Infectious Diseases, 2001,
183(7):10171022.
14. Mavedzenge SN et al. Epidemiological synergy
of Trichomonas vaginalis and HIV in Zimbabwean
and South African Women. Sexually Transmitted
Diseases, 2010, 37(7):460466.
15. Hobbs MM et al. Methods for detection of
Trichomonas vaginalis in the male partners
of infected women: implications for control of
trichomoniasis. Journal of Clinical Microbiology,
2006, 44(11):39943999.

16. Huppert JS et al. Rapid antigen testing compares


favorably with transcription-mediated amplification
assay for the detection of Trichomonas vaginalis in
young women. Clinical Infectious Diseases, 2007,
45(2):194198.
17. Huppert JS et al. Use of an immunochromatographic
assay for rapid detection of Trichomonas vaginalis in
vaginal specimens. Journal of Clinical Microbiology,
2005, 43(2):684687.
18. Nye MB, Schwebke JR, Body BA. Comparison
of APTIMA Trichomonas vaginalis transcriptionmediated amplification to wet mount microscopy,
culture, and polymerase chain reaction for diagnosis
of trichomoniasis in men and women. American
Journal of Obstetrics and Gynecology, 2009,
200(2):188.e1188.e7.
19. Kingston MA, Bansal D, Carlin EM. Shelf life of
Trichomonas vaginalis. International Journal of STD
and AIDS, 2003, 14(1):2829.
20. AduSarkodi Y et al. Comparison of latex
agglutination, wet preparation, and culture for
the detection of Trichomonas vaginalis. Sexually
Transmitted Infections, 2004, 80(3):201203.
21. Diamond LS. The establishment of various
trichomonads of animals and man in axenic
cultures. Journal of Parasitology, 1957,
43(4):488490.
22. Schmid GP et al. Evaluation of six media for the
growth of Trichomonas vaginalis from vaginal
secretions. Journal of Clinical Microbiology, 1989,
27(6):12301233.
23. Fouts AC, Kraus SJ. Trichomonas vaginalis:
reevaluation of its clinical presentation and
laboratory diagnosis. Journal of Infectious Diseases,
1980, 141(2):137143.
24. Kupferberg AB et al. Nutritional requirements of
Trichomonas vaginalis. Proceedings of the Society
for Experimental Biology and Medicine, 1948,
67(3):304308.
25. Kupferberg AB. Trichomonas vaginalis: nutritional
requirements and diagnostic procedures.

92

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

International Record of Medicine and General


Practice Clinics, 1955, 168(11):709717.
26. Feinberg JG, Whittington MJ. A culture medium
for Trichomonas vaginalis donn and species
of Candida. Journal of Clinical Pathology, 1957,
10(4):327329.
27. Borchardt KA et al. A comparison of the sensitivity
of the InPouch TV, Diamonds and Trichosel media
for detection of Trichomonas vaginalis. Genitourinary
Medicine, 1997, 73(4):297298.
28. Borchardt KA. Trichomoniasis: its clinical
significance and diagnostic challenges. American
Clinical Laboratory, 1994, 13(9):2021.
29. el Naga IF, Khalifa AM, el Azzouni MZ. In-pouch
TV culture system in diagnosis of Trichomonas
vaginalis infection. Journal of the Egyptian Society of
Parasitology, 2001, 31(3):647656.
30. Levi MH et al. Comparison of the InPouch TV
culture system and Diamonds modified medium
for detection of Trichomonas vaginalis. Journal of
Clinical Microbiology, 1997, 35(12):33083310.
31. Smith KS et al. Comparison of conventional testing
to polymerase chain reaction in detection of
Trichomonas vaginalis in indigenous women living in
remote areas. International Journal of STD and AIDS,
2005, 16(12):811815.
32. Wendel KA et al. Use of urine polymerase chain
reaction to define the prevalence and clinical
presentation of Trichomonas vaginalis in men
attending an STD clinic. Sexually Transmitted
Infections, 2003, 79(2):151153.
33. Kaydos-Daniels SC et al. Validation of a urine-based
PCR-enzyme-linked immunosorbent assay for use
in clinical research settings to detect Trichomonas
vaginalis in men. Journal of Clinical Microbiology,
2003, 41(1):318323.
34. Schwebke JR, Lawing LF. Improved detection
by DNA amplification of Trichomonas vaginalis
in males. Journal of Clinical Microbiology, 2002,
40(10):36813683.

35. Kaydos SC et al. Development and validation of a


PCR-based enzyme-linked immunosorbent assay
with urine for use in clinical research settings to
detect Trichomonas vaginalis in women. Journal of
Clinical Microbiology, 2002, 40(1):8995.
36. Jordan JA, Lowery D, Trucco M. TaqMan-based
detection of Trichomonas vaginalis DNA from female
genital specimens. Journal of Clinical Microbiology,
2001, 39(11):38193822.
37. Lawing LF, Hedges SR, Schwebke JR. Detection
of trichomonosis in vaginal and urine specimens
from women by culture and PCR. Journal of Clinical
Microbiology, 2000, 38(10):35853588.
38. Crucitti T et al. Comparison of culture and different
PCR assays for detection of Trichomonas vaginalis
in self collected vaginal swab specimens. Sexually
Transmitted Infections, 2003, 79(5):393398.
39. Pillay A et al. Comparison of a TaqMan-based
real-time polymerase chain reaction with
conventional tests for the detection of Trichomonas
vaginalis. Sexually Transmitted Infections, 2007,
83(2):126129.
40. Schirm J et al. Trichomonas vaginalis detection
using real-time TaqMan PCR. Journal of
Microbiological Methods, 2007, 68(2):243247.
41. Simpson P et al. Real-time PCRs for detection of
Trichomonas vaginalis beta-tubulin and 18S rRNA
genes in female genital specimens. Journal of
Medical Microbiology, 2007, 56(Pt 6):772777.
42. Shipitsyna E et al. Evaluation of polymerase chain
reaction assays for the diagnosis of Trichomonas
vaginalis infection in Russia. Journal of the European
Academy of Dermatology and Venereology, 2013,
27(2):e217223.
43. Hardick A et al. Comparison between the
Gen-Probe transcription-mediated amplification
Trichomonas vaginalis research assay and real-time
PCR for Trichomonas vaginalis detection using a
Roche LightCycler instrument with female selfobtained vaginal swab samples and male urine

Tricomonase

93

samples. Journal of Clinical Microbiology, 2006,


44(11):41974199.
44. Munson E et al. Impact of Trichomonas vaginalis
transcription-mediated amplification-based
analyte-specific reagent testing in a metropolitan
setting of high sexually transmitted disease
prevalence. Journal of Clinical Microbiology, 2008,
46(10):33683374.
45. Sobel JD, Nyirjesy P, Brown W. Tinidazole
therapy for metronidazole-resistant vaginal
trichomoniasis. Clinical Infectious Diseases, 2001,
33(8):13411346.
46. Schmid G et al. Prevalence of metronidazoleresistant Trichomonas vaginalis in a gynecology
clinic. Journal of Reproductive Medicine, 2001,
46(6):545549.
47. Upcroft JA, Upcroft P. Drug susceptibility testing
of anaerobic protozoa. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 2001, 45(6):18101814.
48. Meri T et al. Resistance of Trichomonas vaginalis to
metronidazole: report of the first three cases from
Finland and optimization of in vitro susceptibility
testing under various oxygen concentrations.
Journal of Clinical Microbiology, 2000,
38(2):763767.

94

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 7
Vaginose bacteriana
7.1 Introduo
A vaginose bacteriana (VB) a causa mais comum de
corrimento vaginal entre mulheres na idade reprodutiva.
Embora no seja considerada uma doena sexualmente
transmissvel, a atividade sexual um fator para sua
aquisio (1). Isso foi demonstrado pelo aumento de
sua incidncia em relao ao aumento no nmero de
parceiros recentes e ao longo da vida, e em relao a
ter um novo parceiro sexual. A identificao de vaginose
bacteriana tambm em mulheres virgens se ope
ideia da transmisso sexual exclusiva. A condio
provavelmente muito mais relacionada a alteraes na
microbiota vaginal (devido a mecanismos at o momento
desconhecidos e a fatores do hospedeiro), causando
um aumento no pH local, o que resulta na reduo de
lactobacilos produtores de perxido de hidrognio. Os
lactobacilos ajudam a manter a acidez do pH de vaginas
saudveis e a inibir outros microrganismos anaerbicos.
Normalmente, vaginas saudveis apresentam altas
concentraes de lactobacilos. Na VB, a populao de
lactobacilos muito reduzida, enquanto as populaes
de vrios anaerbios e de Gardnerella vaginalis so
aumentadas. Os anaerbios envolvidos na VB incluem
Mobiluncus spp., Prevotella spp., Bacteroides spp.,
Peptostreptococcus, Fusobacterium, Eubacterium
spp., Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum.
Com as atuais tcnicas independentes de cultura,
um maior nmero de organismos foram identificados
como parte da microbiota encontrada em mulheres
com VB, incluindo Atopobium vaginae (2). Muitas
das bactrias associadas a VB so encontradas em
mulheres saudveis, embora em menor nmero.
Assim, o diagnstico laboratorial de VB repleto de
dificuldades, com vrios mtodos descritos na literatura.
O isolamento e identificao de organismos individuais
como a G. vaginalis frequentemente proposto, mas no
adequado para o diagnstico clnico de VB (3), alm de
poder levar ao excesso de tratamentos. O diagnstico
melhor realizado usando tanto os critrios clnicos de

Amsel (4) ou por meio da avaliao (5) ou pontuao (6)


de bactrias em um esfregao vaginal com colorao de
Gram.
A VB a causa mais comum de corrimento vaginal
e est relacionada a mudanas na microbiota, com
a reduo da populao de lactobacilos da vagina
e um crescimento acentuado de anaerbios e G.
vaginalis.

7.2 Diagnstico
A VB uma manifestao clnica caracterizada pelo
aumento da quantidade de corrimento vaginal ftido. O
diagnstico baseia-se na presena de pelo menos trs
dos quatro critrios seguintes (critrios de Amsel) (4):
Corrimento branco ou cinzento, homogneo e viscoso;
Fluido vaginal com pH >4,5;
Liberao de odor de amina, semelhante a peixe, do
fluido vaginal quando misturado a soluo a 10% de
hidrxido de potssio (KOH);
Clulas indicadoras visveis em anlise no
microscpio.
Corrimento. A avaliao desse sinal clnico subjetiva.
O corrimento em mulheres com VB normalmente no
muito maior do que o observado em mulheres saudveis.
Alm disso, a aplicao de duchas vaginais pode reduzir
a quantidade de corrimento.
pH vaginal. O pH do fluido vaginal deve ser mensurado
utilizando-se tiras de papel indicador de pH no intervalo
adequado (3,8 a 6,0), tais como o papel com intervalo
estreito de Whatman. Um espcime dos frnices laterais
e posterior da vagina coletado com uma haste, a qual
, ento, colocada diretamente sobre a tira de papel.
Alternativamente, o papel de pH pode ser tocado com
a ponta do espculo aps este ser retirado da vagina
(Figura 7.1). O contato com o muco cervical deve ser
evitado, uma vez que este apresenta pH >7,0. Uma
vagina madura normal apresenta um pH cido de 4,0. Na
VB, o pH geralmente elevado a >4,5.

Vaginose bacteriana

95

Figura 7.1
Teste do pH do fluido vaginal, comparado a uma
escala padronizada de cores.
O teste do pH vaginal apresenta a maior sensibilidade
das quatro caractersticas, mas a menor especificidade.
Tambm se observa um pH elevado se o fluido vaginal
estiver contaminado por sangue menstrual, muco
cervical ou smen e em mulheres com infeco por T.
vaginalis.
Odor. Mulheres com VB normalmente reclamam de
um odor desagradvel na vagina. Esse odor devido
liberao de amina, produzida pela descarboxilao dos
aminocidos lisina (para cadaverina) e arginina (para
putrescina) por bactrias anaerbicas. Quando o KOH
adicionado ao fluido vaginal, essas aminas se tornam

A. Clulas indicadoras em preparao a fresco de


amostra vaginal (400x).

imediatamente volteis, produzindo um odor tpico


de peixe. Coloque uma gota de fluido vaginal em uma
lmina de vidro e adicione uma gota de KOH a 10%.
Segure a lmina prximo ao nariz para detectar o cheiro
de amina. Aps uma reao positiva, o espcime se
tornar rapidamente inodoro devido rpida e completa
volatizao das aminas. Em algumas partes do mundo, o
KOH no est disponvel devido sua natureza custica
e, ento, se forem realizados apenas trs dos quatro
critrios, perde-se a sensibilidade destes.
Clulas indicadoras. Misture uma gota do fluido
vaginal com uma gota de soluo salina em uma lmina
de vidro. Coloque uma lamnula sobre a suspenso
e examine microscopicamente a lmina com um
aumento de 400x. As clulas indicadoras so clulas
epiteliais escamosas cobertas com vrios organismos
cocobacilares granulares pequenos, gerando um aspecto
pontilhado, granular. As bordas dessas clulas epiteliais
no so claramente definidas, devido ao grande nmero
de bactrias presentes e aparente desintegrao
celular (Figuras 7.2A e 7.2B). Na maioria dos pacientes
com VB, ser visualizada uma mistura de clulas
epiteliais vaginais normais esfoliadas e 20% ou mais de
clulas indicadoras. As bactrias aderidas s clulas so
G. vaginalis misturadas com anaerbios.

B. Clulas indicadoras em esfregao vaginal com


colorao de Gram.

Figura 7.2
Microscopia de esfregaos vaginais

96

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Grau I (microbiota normal): somente ou


predominantemente morfotipos de lactobacilos (Figura 7.4)

7.3 Critrios de Ison-Hay


Esse mtodo avalia as propores relativas dos
diferentes morfotipos bacterianos e os classifica como
descrito a seguir:

Figura 7.3
Colorao de Gram de esfregao vaginal normal
mostrando os lactobacilos (1000x).
Fonte: Reproduzido com permisso da Associao
Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls
British Association for Sexual Health and HIV).

A VB reconhecida em um esfregao vaginal


com colorao de Gram. As lminas podem ser
examinadas na clnica, quando houver infraestrutura,
ou armazenadas para ser examinadas no laboratrio,
visando verificaes posteriores independentes.
Podem ser observados no esfregao diversos graus de
microbiota vaginal, variando de normal (Figura 7.3) a
morfotipos de VB intermediria. Em um esfregao de
uma mulher com VB, os lactobacilos esto ausentes
ou tm seu nmero muito reduzido, e so substitudos
por uma microbiota misturada. Dois mtodos so
comumente utilizados para a anlise dos esfregaos:
os critrios de Ison-Hay (5), que verificam a microbiota
e so mais adequados para o uso na prtica clnica
de rotina; e a pontuao de Nugent (6), que classifica
as bactrias individualmente e fornece uma anlise
quantitativa particularmente til para propsitos de
pesquisa, mas oferece poucas vantagens no uso clnico.
A variabilidade intrnseca gerada pelos observadores foi
descrita como sendo a mesma para ambos os critrios
de Nugent e Ison-Hay (7 ).

Grau I (microbiota normal): somente ou


predominantemente morfotipos de lactobacilos (Figura
7.4)

Figura 7.4
Grau I

Grau II (microbiota intermediria): reduo dos


morfotipos de lactobacilos, com morfotipos bacterianos
misturados (Figura 7.5).

Figura 7.5
Grau II
Grau III (VB): morfotipos bacterianos misturados com
poucos ou nenhum morfotipo de lactobacilos (Figura 7.6).

7.3 Critrios de Ison-Hay


Esse mtodo avalia as propores relativas dos
diferentes morfotipos bacterianos e os classifica como
descrito a seguir:
Figura 7.6
Grau III
Vaginose bacteriana

97

Dois graus adicionais no sistema Ison-Hay so:


Grau 0: clulas epiteliais sem bactrias visveis (Figura
7.7).

7.4 Pontuao de Nugent


Esse mtodo baseado na pontuao de tipos
individuais de organismos. Uma pontuao de 0 a 10
resulta de uma combinao ponderada de: grandes
bastonetes Gram-positivos (lactobacilos), pequenos
bastonetes Gram-negativos ou variveis (G. vaginales ou
outros anaerbios) e bastonetes curvos Gram-negativos
ou variveis (Mobiluncus spp.). Cada um desses
trs grupos so avaliados quantitativamente em um
esfregao segundo uma pontuao de 0-4, da seguinte
forma:
0 = nenhum morfotipo por campo de viso

Figura 7.7
Grau 0

1+ = menos que um morfotipo por campo de viso


2+ = um a quatro morfotipos por campo de viso

Grau IV: clulas epiteliais cobertas somente com cocos


Gram-positivos (Figura 7.8).

3+ = cinco a 30 morfotipos por campo de viso


4+ = mais que 30 morfotipos por campo de viso
A abundncia de morfotipos de lactobacilos em um
esfregao considerada normal. Assim, as pontuaes
de lactobacilos so inversamente relacionadas aos seus
nmeros. A quantidade 4+ para lactobacilos pontua 0;
3+, pontua 1, e assim por diante. Mobiluncus recebem
menor peso; dessa forma, organismos classificados
como 1+ e 2+ pontuam 1 e organismos 3+ e 4+
pontuam 2.

Figura 7.8
Grau IV
Fonte: Figuras 7.4-7.8 reproduzidas com permisso da
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).
Ambos os graus 0 e IV so encontrados em mulheres
saudveis. O grau 0 ocorre principalmente aps
tratamento antimicrobiano intravaginal e o grau IV
encontrado em menor nmero em mulheres que
so colonizadas longitudinalmente com cocos Grampositivos, normalmente streptococos, com lactobacilos
reduzidos ou ausentes.

98

Um diagnstico de VB severa pontua 10 (4 pela


ausncia de morfotipos de lactobacilos, 4 por morfotipos
de Gardnerella 4+ e 2 por morfotipo de Mobiluncus 4+).
Um esfregao Gram vaginal normal pontua 0 (0 para
morfotipos de lactobacilos 4+, 0 para morfotipos de
Gardnerella 0 e 0 por morfotipo de Mobiluncus 0).
Na pontuao de Nugent, uma pontuao total de 7 a 10
(a soma das pontuaes de classificao dos trs grupos
descritos acima) indicativa de VB; uma pontuao de 4
a 6, de microbiota intermediria; e uma pontuao de 0
a 3, de microbiotas normais.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

7.5 Outros testes para VB

7.6 Referncias

A microscopia de esfregaos vaginais com colorao de


Gram, atualmente, continua sendo o mtodo laboratorial
preferido para o diagnstico de VB. Uma srie de outros
testes foram descritos, que podem ser teis caso no
haja microscpios disponveis. Isso inclui:

1. Bradshaw CS et al. High recurrence rates of


bacterial vaginosis over the course of 12 months
after oral metronidazole therapy and factors
associated with recurrence. Journal of Infectious
Diseases, 2006, 193(11):14781486.

1. Affirm VP III (8) Usa hibridizao de DNA para


detectar nveis altos de Gardnerella.

2. Tabrizi SN et al. Prevalence of Gardnerella vaginalis


and Atopobium vaginae in virginal women. Sexually
Transmitted Diseases, 2006, 33(11):663665.

2. BV Blue (9) Teste point-of-care disponvel


comercialmente. Mede a sialidase, uma enzima que
produz algumas das aminas liberadas durante a VB.
Comparado com os critrios de Nugent e Amsel,
apresenta uma especificidade de 95% e 91%,
respectivamente, e uma sensibilidade de 88%.
3. FemExam (10) Consiste em dois cartes com
indicadores que medem o pH vaginal, aminas e
atividade enzimtica. Os indicadores do carto
do FemExam medem o pH maior ou igual a
4,7 e aminas com concentrao maior que
0,5mmol. O carto 2 mede a atividade da prolina
aminopeptidase. Comparado com a pontuao de
Nugent, o carto 1 do FemExam apresenta uma
sensibilidade e uma especificidade de 71,4% e
72,8%, respectivamente; e o carto 2, sensibilidade
e especificidade de 70% e 81%, respectivamente.
Os mtodos moleculares foram usados recentemente
para detectar bactrias tambm no identificadas
anteriormente na VB e apresentam o potencial de
fornecer um diagnstico para VB sensvel e especfico
(11, 12).
O diagnstico pode ser realizado utilizando-se os
critrios de Amsel por meio da demonstrao da
presena de pelo menos trs dos quatro critrios
seguintes: corrimento vaginal branco a cinzento,
homogneo e viscoso, pH>4,5, odor de amina e
presena de clulas indicadoras.
A cultura de organismos associados a VB no tem
valor para diagnstico.
Onde houver infraestrutura, a colorao de Gram
do corrimento vaginal, mostrando os graus da
microbiota vaginal de normal a VB, pode ter os
morfotipos pontuados de acordo com os critrios
de Ison-Hay e Nugent para o diagnstico de BV.

3. Krohn MA, Hillier SL, Eschenbach DA. Comparison


of methods for diagnosing bacterial vaginosis
among pregnant women. Journal of Clinical
Microbiology, 1989, 27(6):12661271.
4. Amsel R et al. Non specific vaginitis. Diagnostic
criteria and microbial and epidemiologic
associations. American Journal of Medicine, 1983,
74(1):1422.
5. Ison CA, Hay PE. Validation of a simplified grading
of Gram stained vaginal smears for use in
genitourinary medicine clinics. Sexually Transmitted
Infections, 2002, 78(6):413415.
6. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of
diagnosing bacterial vaginosis is improved by a
standardized method of Gram stain interpretation.
Journal of Clinical Microbiology, 1991,
29(2):297301.
7. Forsum U et al. An international study of the
interobserver variation between interpretations of
vaginal smear criteria of bacterial vaginosis. APMIS,
2002, 110(11):811818.
8. Gazi H et al. Use of DNA hybridization test for
diagnosing bacterial vaginosis in women with
symptoms suggestive of infection. APMIS, 2006,
114(11):784787.
9. Bradshaw CS et al. Evaluation of a point-of-care
test, BVBlue, and clinical and laboratory criteria for
diagnosis of bacterial vaginosis. Journal of Clinical
Microbiology, 2005, 43(3):13041308.
10. West B et al. Evaluation of a new rapid diagnostic kit
(FemExam) for bacterial vaginosis in patients with
vaginal discharge syndrome in the Gambia. Sexually
Transmitted Diseases, 2003, 30(6):483489.
Vaginose bacteriana

99

11. Fredricks DN et al. Targeted PCR for detection


of vaginal bacteria associated with bacterial
vaginosis. Journal of Clinical Microbiology, 2007,
45(10):32703276.
12. Shipitsyna E et al. Composition of the vaginal
microbiota in women of reproductive agesensitive
and specific genetic diagnosis of bacterial vaginosis
is possible? PLoS ONE, 2013, 8(4):e60670.

100

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 8
Candidase
8.1 Introduo
A candidase vulvo-vaginal (CVV) causada pelo fungo
Candida albicans (1) em aproximadamente 85% dos
casos, sendo a C. glabrata responsvel pelos 15%
restantes (2). Outras espcies, tais como C. krusei e C.
tropicalis, raramente causam vaginites (3). As Candida
spp. so geralmente de origem endgena e podem ser
isoladas a partir do trato genital de at 25% de mulheres
saudveis assintomticas em idade reprodutiva. Para
as Candida spp. colonizarem a vagina, elas devem
primeiro aderir s clulas epiteliais vaginais, onde
crescem, proliferam-se e germinam antes de finalmente
causarem os sintomas de inflamao. Normalmente,
so necessrias alteraes no ambiente vaginal antes
que o organismo possa induzir os efeitos patolgicos.
Provavelmente, a microbiota natural a defesa mais
importante contra a colonizao e a inflamao. O
mecanismo pelo qual a cndida induz a inflamao
ainda no foi determinado, mas fatores importantes de
predisposio colonizao e inflamao incluem:
Alteraes nos nveis dos hormnios reprodutivos
associados a perodos pr-menstruais, gravidez e
contraceptivos orais;
Uso de antibiticos;
Diabetes mellitus;
Imunossupresso.
A candidase normalmente de origem endgena
e no se transmite sexualmente. A CVV crnica ou
recorrente ocorre em um pequeno nmero de mulheres,
causando sintomas persistentes, e pode estar associada
aos fatores de risco descritos acima (4, 5). Produtos
qumicos, alergias locais e hipersensibilidade tardia
tambm podem contribuir para a induo de vaginite
sintomtica ou vulvite.
Em homens, a importncia de Candida spp. no
clara, embora o agente possa ser transmitido entre

parceiros sexuais, causando balanite ou balanopostite


e, raramente, uretrite. Tipicamente, os homens
desenvolvem uma resposta alrgica ao antgeno
da cndida, embora a infeco repentina possa ser
observada mais frequentemente em pacientes com os
fatores de risco mencionados acima (6).

8.2 Diagnstico
O diagnstico de CVV normalmente estabelecido por
meio da combinao entre as manifestaes clnicas
e anlise microscpica de preparao a fresco. Os
sintomas clssicos e os sinais de CVV incluem prurido
vaginal, corrimento branco e coalhado sem odor (queijo
cottage), sensao de queimao na vulva, disria e
eritema dos lbios e vulva. Entretanto, os sintomas e
sinais so frequentemente mais ambguos. A deteco
do brotamento de clulas de levedura por meio de
microscopia de preparao a fresco ou com hidrxido
de potssio (KOH) pode ser realizada em laboratrios
ou clnicas e apresenta um valor preditivo muito alto
para o diagnstico de CVV. Embora essa combinao
seja geralmente usada, frequentemente razovel
oferecer terapia a mulheres com sinais clssicos de
CVV, com base em um diagnstico clnico presuntivo,
sem uma confirmao adicional por microscopia. O uso
de esfregaos com colorao de Gram e a deteco
do brotamento de clulas de levedura e pseudo-hifas
preferido em alguns centros para a determinao de
candidase.
Em mulheres com corrimento vaginal anormal, e na
ausncia de um microscpio, a deteco de um pH <4,5
um bom indicador de CVV e pode ajudar a diferenci-la
de uma vaginose bacteriana ou tricomonase, as quais
tipicamente produzem um pH >4,5. Um papel de pH
com intervalo estreito (Whatman) um mtodo de baixo
custo, sensvel e simples de usar e est disponvel na
maioria dos lugares.
A cultura atualmente o mtodo mais sensvel para
a deteco de Candida spp., mas deve ser usada
com cautela, uma vez que Candida spp. tambm so
encontradas em mulheres sem CVV. Dessa forma,
a cultura s deve ser considerada em caso de CVV
clinicamente suspeita, mas com microscopia negativa
(embora, nesse caso, o tratamento presuntivo possa
ser aplicado, resultando em menor custo financeiro) ou

Candidase

101

quando o teste de susceptibilidade antimicrobiana for


requisitado.
A deteco molecular de Candida spp. utilizando
a reao em cadeia da polimerase (PCR, do ingls
polymerase chain reaction) foi descrita, mas no oferece
vantagens em relao aos testes disponveis atualmente,
uma vez que a alta sensibilidade demonstrada pela PCR
ir detectar leveduras de Candida spp. em mulheres
sem CVV e resultar em diagnsticos excessivos e
tratamentos desnecessrios.

8.3 Coleta de espcimes


Obtenha uma amostra de secreo da parede lateral
da vagina com uma haste (o tipo de fibra no
importante). Em pacientes com corrimento vaginal leve e
comprometimento excessivo da vulva e lbios, melhor
que seja coletado um espcime da mucosa irritada. A
microscopia direta pode ser realizada imediatamente
na clnica, ou ento o espcime pode ser transportado
para o laboratrio. O uso de um meio de transporte
como o de Amies no necessrio para a finalidade de
identificao de leveduras, mas prefervel manter a
viabilidade e mobilidade no caso dos tricomonaddeos.
Em homens com balanite, use uma haste umedecida
previamente em soluo salina para coletar a amostra da
glande do pnis.

Figura 8.1A
Preparao de hidrxido de potssio (KOH) de
secreo vaginal, mostrando o brotamento de
leveduras e pseudo-hifas (400x).

Figura 8.1B
Preparao a fresco de leveduras sem pseudo-hifas.
Fonte (A e B): reproduzidas com permisso da
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).

8.4 Microscopia direta


Coloque o espcime em uma lmina de vidro e, se
necessrio, dependendo da sua fluidez, misture-o
com uma gota de soluo salina. Cubra a preparao
com uma lamnula e examine ao microscpio com um
aumento de 400x no apenas para detectar leveduras,
mas tambm para verificar a presena de trichomonas
e clulas identificadoras. As leveduras so clulas
arredondadas a ovais, com 4m de dimetro, mostrando
um brotamento tpico (blastocondia) (Figuras 8.1A
e 8.1B). A adio de KOH a 10% para a preparao
aumenta levemente a sensibilidade de deteco de
leveduras, tornando o reconhecimento de miclias
(pseudo-hifas) muito mais fcil. As leveduras podem
ser reconhecidas facilmente em um esfregao com
colorao de Gram, uma vez que so clulas Grampositivas (Figuras 8.2A e 8.2B).

102

Figura 8.2A
Esfregao de secreo vaginal com colorao de
Gram mostrando as leveduras Gram-positivas e
pseudo-hifas (1000x).

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

O diagnstico de candidase estabelecido


pela combinao de caractersticas clnicas e
microscopia de uma amostra de um espcime
apropriado.
A cultura de secreo vaginal deve ser considerada
para casos de microscopia negativa, na presena
de sintomas clnicos.

Figura 8.2B
Brotamento de leveduras sem pseudo-hifas.
Fonte (A e B): reproduzidas com permisso da
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).

8.5 Cultura
O gar dextrose Sabouraud com cloranfenicol um
excelente meio de crescimento para o isolamento de
Candida spp. Aps a inoculao do espcime clnico, as
placas so incubadas a 36C por dois dias. As colnias
de clulas de levedura so opacas e com colorao de
branca a creme. A nica identificao importante para
o diagnstico de rotina a diferenciao de bactrias. A
microscopia pode ser utilizada para confirmar a presena
de clulas de levedura.
No necessria a identificao adicional de levedura
para o diagnstico de rotina de CVV descomplicada.
Entretanto, o teste de tubo de germinao representa
um mtodo simples para a identificao presuntiva de C.
albicans. Uma colnia emulsificada em 0,5mL de soro
bovino ou de cavalo e incubada a 36C por quatro horas.
A C. albicans mostrar filamentos de hifa laterais curtos
sem nenhuma constrio. Uma identificao completa de
levedura em nvel de espcie pode ser obtida por meio
de mtodos auxanogrficos para a assimilao de nitrato
e carboidrato, ou mediante testes de fermentao de
carboidrato. Kits para a identificao de leveduras, em
nvel de espcie, esto disponveis comercialmente.

O teste de susceptibilidade antimicrobiana de


Candida spp. ocasionalmente justificado e deve
ser realizado em centros especializados.

8.6 Referncias
1. Sobel JD. Vulvovaginal candidosis. The Lancet,
2007, 369(9577):19611971.
2. Sobel JD. Vulvovaginitis due to Candida glabrata.
An emerging problem. Mycoses, 1998, 41(Suppl
2):1822.
3. Horowitz BJ, Giaquinta D, Ito S. Evolving pathogens
in vulvovaginal candidiasis: implications for patient
care. Journal of Clinical Pharmacology, 1992,
32(3):248255.
4. Morton RS, Rashid S. Candidal vaginitis: natural
history, predisposing factors and prevention.
Proceedings of the Royal Society of Medicine, 1997,
70(Suppl 4):36.
5. Sobel JD. Pathogenesis and treatment of recurrent
vulvovaginal candidiasis. Clinical Infectious
Diseases, 1992, 14(Suppl 1):S148S153.
6. Marrazzo J, Hillier S, Sobel J. Vaginal infections. In:
Morse SA et al., eds. Atlas of sexually transmitted
diseases and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/
Elsevier, 2010:7693.

Candidase

103

104

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 9

na borda circundante e na camada drmica subjacente.


Entretanto, apenas 10-30% das infeces novas so
sintomticas (Figura 9.1).

Infeces pelo vrus do herpes


simples (HSV)

Aps a recuperao da infeco inicial, o vrus


permanece latente no gnglio sensorial por toda a
vida do hospedeiro. Periodicamente, o vrus pode ser
reativado do seu estado latente e trafegar por meio do
nervo sensorial para a superfcie da pele ou mucosa.
A liberao intermitente de vrus pode ocorrer tanto na
presena de leses (reativao clnica) ou mediante
sintomas muito leves ou ausentes (reativao subclnica).
A liberao de vrus na superfcie da mucosa leva
transmisso para parceiros sexuais.

9.1 Introduo
Os vrus do herpes simples tipo 1 (HSV-1, do ingls
herpes simplex virus type 1) e tipo 2 (HSV-2, do ingls
herpes simplex virus type 2) so vrus de DNA de dupla
fita. O HSV-1 e o HSV-2 compartilham uma estrutura
genmica similar, com 40% de sequncias semelhantes
e 83% de similaridade em suas regies codificantes, o
que explica as numerosas semelhanas biolgicas e a
reao cruzada antignica entre os dois sorotipos.

Os episdios sintomticos recorrentes tendem a ser mais


leves que o episdio primrio, curando-se, normalmente,
em 10 dias; mas tambm podem ser severos,
principalmente em indivduos imunocomprometidos.
A Tabela 9.1 resume os principais sintomas clnicos,
as manifestaes e as complicaes de infeces por
herpes genital. Aproximadamente 70-90% das pessoas
com HSV-2 genital sintomtico e 20-50% com HSV-1
genital sintomtico apresentaro uma recorrncia no
primeiro ano. Pessoas imunocompetentes com herpes
genital podem apresentar leses genitais frequentes,
doloridas e recorrentes, associadas a estresse
psicossocial.

Durante a infeco primria, o HSV penetra em rupturas


na pele ou mucosa, adere s clulas epiteliais e nelas
adentra, comeando seu ciclo replicativo. O vrus, ento,
captado por terminaes nervosas sensoriais livres
e transportado para os gnglios sensoriais localizados
nessa regio da pele. As manifestaes cutneas
incluem leses vesiculares, levando a ulceraes rasas,
que formam crosta e curam-se espontaneamente em
duas ou trs semanas, sem deixar cicatrizes. As leses
acarretam a destruio central da camada epitelial,
desenvolvendo uma infiltrao de clulas inflamatrias

Durao da liberao de vrus


Pstula
vesicular

Contato
sexual

-4

-2

Cura da crosta da
lcera

Sintomas
locais

Sintomas
sistmicos

Sintomas
-6

lcera mida

10

12

14

16

18

Leses
Mdico Formao de Leses Desaparecimento
observadas contactado leso nova comeam dos sintomas,
comum
a curar a menos que as
leses estejam
irritadas

20

Dias

Leses
curadas

Figura 9.1
Evoluo clnica de herpes genital primrio

Infeces pelo vrus do herpes simples (HSV)

105

O padro clssico das infeces por HSV-1 e


HSV-2 associadas a doenas orais ou genitais,
respectivamente, permanece como regra em alguns
lugares do mundo, tais como na frica subsaariana,
onde a infeco por HSV-1 permanece como uma
doena comum na infncia e infeces por HSV-2
so transmitidas sexualmente. Em contrapartida, a
diferenciao entre HSV-1 e HSV-2 baseada no stio
anatmico da infeco est longe de ser absoluta em
pases desenvolvidos, uma vez que o herpes genital
pode ser causado frequentemente pelo HSV-1. O atraso
na aquisio da infeco oral por HSV-1 em pases
desenvolvidos torna uma proporo significativa de
adultos jovens susceptveis infeco genital por
HSV-1, acompanhando a iniciao da atividade sexual
e o contato sexual orogenital, o qual visto como
mais seguro que a relao sexual com penetrao e

como um meio de evitar a gravidez. Em sociedades em


desenvolvimento, as taxas de soropositividade para
HSV-1 frequentemente alcanam 100% entre os adultos,
sendo de apenas 50-70% em pases desenvolvidos, nos
quais, entretanto, vem sendo reportada uma exploso de
infeces genitais por HSV-1 na ltima dcada.
As infeces genitais por HSV-1 representam hoje,
pelo menos, metade de todos os episdios primrios
de herpes genital em adultos jovens nas sociedades
ocidentais. Alm disso, a soropositividade para
HSV-2 aumenta aps a iniciao sexual e se amplia
progressivamente com a idade. A soroprevalncia
de HSV-2 varia de acordo com as regies do mundo,
ocorrendo em aproximadamente 10-40% dos adultos,
podendo alcanar 60-95% em indivduos infectados
por HIV e mulheres profissionais do sexo. O HSV-2

Tabela 9.1: Sintomas, sinais ou complicaes clnicas durante infeco por herpes genital sintomtico
Sintomas clnicos
Homens

Mulheres

Sinais clnicos

Leses papulares ou vesiculares


Leses papulares,
em reas genitais, perigenitais ou
vesiculares e pustulares,
extragenitais (coxa, olhos, ndega,
seguidas de ulceraes
dedo)
no pnis, perneo e coxa
Leses pustulares
Corrimento uretral
Ulcerao genital
Uretrite
Dor perineal
Disria
Desconforto ou dor inguinal
(periadenite)
Infeco na faringe (contato orogenital)

Meningite assptica
Erupo cutnea vesicular
extensiva
Reteno urinria
Radiculopatia com
sensibilidade, devido ao
comprometimento de
nervos sacrais
Mielite transversa
Risco aumentado de
adquirir HIV por exposio
sexual
Leses papulares ou vesiculares
Leses papulares,
em reas genitais, perigenitais ou
vesiculares e pustulares, Risco aumentado de
transmisso de HIV em
extragenitais (coxa, olhos, ndega,
seguidas de ulceraes
indivduos co-infectados
dedo)
na vulva, perneo e coxa
por HIV/HSV
Leses pustulares
Corrimento vaginal e
Herpes neonatal aps
Ulcerao genital
cervical
parto vaginal
Dor perineal
Cervicite
Disria
Hiperemia das
Desconforto ou dor inguinal
membranas mucosas da
(periadenite)
vulva e vagina
Dispareunia
Corrimento uretral
Infeco na faringe (contato orogenital) Uretrite
As infeces primrias em mulheres
so normalmente piores em
intensidade e durao que em homens.

HIV: vrus da imunodeficincia humana; HSV: vrus do herpes simples

106

Complicaes

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

compartilha os fatores de risco de outras doenas


sexualmente transmissveis (DST), isto , nmero
elevado de parceiros sexuais durante a vida, histrico
prvio de DST e iniciao sexual precoce. O perodo
de incubao de ambos os vrus HSV-1 e HSV-2
normalmente de dois a 10 dias (at quatro semanas).
Tanto em homens como em mulheres com herpes
genital primrio, as leses comeam como ppulas
ou vesculas, que do origem a leses pustulosas e
ulcerativas. Essas leses persistem por 4-15 dias at
que formem crosta e finalmente cicatrizem.
A consequncia mais sria da infeco por herpes
genital a possibilidade de transmisso vertical de uma
me infectada para seu neonato durante o parto vaginal.
Isso pode resultar em uma infeco generalizada,
comprometimento do sistema nervoso central e
possibilidade de morte neonatal. Alm disso, nas duas
ltimas dcadas, a infeco por HSV-2 tambm foi
associada a um risco trs vezes maior de infeco por
HIV. A ruptura na mucosa causada por lceras genitais
favorece a infeco por HIV, uma vez que fornece uma
porta de entrada para o vrus. Alm disso, a reativao
do HSV-2 resulta em uma infiltrao da mucosa com
linfcitos CD4, as clulas-alvo para a adeso do HIV.
Esses mesmos fatores facilitam a disseminao da
infeco por HIV de um indivduo coinfectado por HSV/
HIV para um parceiro sexual no infectado.

9.2 Reviso dos procedimentos diagnsticos


A infeco por herpes genital frequentemente
diagnosticada em clnicas como um resultado da
presena de um grupo de leses vesiculares. Entretanto,
uma vez que outras causas de ulcerao genital podem
ter uma apresentao clnica semelhante, principalmente
se forem notadas apenas as ulceraes, pode ser
necessria a confirmao laboratorial do diagnstico.
Os mtodos laboratoriais utilizados para o diagnstico
da infeco por HSV incluem deteco direta do HSV em
materiais provenientes de leses e mtodos sorolgicos
indiretos (Tabelas 9.2 e 9.3). Os testes disponveis
para HSV incluem a deteco de antgeno, cultura viral
e testes de amplificao de cidos nucleicos (NAAT,
do ingls nucleic acid amplification test) para o DNA
viral, assim como o uso de ensaios sorolgicos para
a triagem da exposio ao HSV por meio da deteco

de anticorpos especficos para o HSV. A cultura viral


seguida da determinao do tipo de HSV tem sido a
principal forma de diagnstico do HSV nas duas ltimas
dcadas. Entretanto, a deteco do DNA do HSV em
espcimes clnicos utilizando teste moleculares de
amplificao surgiu como um mtodo alternativo, uma
vez que este at quatro vezes mais sensvel, menos
dependente das condies de coleta e transporte e mais
rpido que a cultura viral. A escolha do teste e a forma
de interpretao dos resultados so consideraes
importantes tanto para os microbiologistas como para os
clnicos.

9.3 Coleta e transporte do espcime


O HSV-1 e o HSV-2 podem ser coletados mediante a
raspagem de material das leses genitais mucocutneas
ou de locais mucocutneos previamente afetados em
pacientes com infeco assintomtica. Para a coleta de
amostras, uma pequena haste com ponta de algodo ou
dacron usada na cultura viral e em biologia molecular.
Hastes com alginato de clcio reduzem a recuperao
viral e inibem os mtodos de deteco baseados
em NAAT. Uma vez que a excreo genital de HSV
intermitente, o teste utilizando o material coletado de
pacientes assintomticos no recomendado para
o diagnstico de rotina, visto que essa abordagem
dificilmente fornecer informaes sobre o estado do
portador.
Para leses recentes, o mtodo escolhido a coleta do
lquido vesicular ou do exsudato de pequenas vesculas.
O fluido oriundo de vesculas grandes, que contm
uma alta concentrao de vrus, pode ser aspirado
com uma seringa de tuberculina. Aps a aspirao, a
superfcie da vescula removida e a base da leso
esfregada vigorosamente para coletar clulas epiteliais
infectadas. Para leses mais antigas, o rendimento
do diagnstico pode ser inaceitavelmente baixo. No
entanto, os indivduos com esse tipo de leso devem ser
aconselhados a retornar ao servio de sade quando
novas erupes aparecerem, para que a amostra seja,
ento, coletada. Ocasionalmente, podem-se coletar
amostras de outras regies anatmicas, como, por
exemplo, a uretra, vagina ou colo do tero.
Deve-se dar cuidadosa ateno s condies de
transporte e armazenamento dos espcimes clnicos.

Infeces pelo vrus do herpes simples (HSV)

107

Aps a coleta da amostra, os espcimes que sero


submetidos deteco viral devem ser acondicionados
imediatamente em recipientes contendo 1mL do meio
de transporte viral apropriado para cultura de clulas,
um meio de transporte universal (para cultura ou NAAT),
ou ento ser enviados como amostra seca (somente
para NAAT). A cultura recomendada nas situaes em
que possvel enviar os espcimes ao laboratrio em
um prazo de quatro horas. Se isso no for possvel, a
amostra deve ser armazenada a 4C ao longo da noite
e enviada no dia seguinte. O tempo de transporte a
partir da coleta do espcime at o laboratrio no deve
ultrapassar 48 horas e, nessas situaes, essencial
que as amostras sejam enviadas em uma caixa trmica

com gelo. importante notar que a recuperao de


vrus substancialmente reduzida aps um ciclo de
congelamento/descongelamento, no sendo aconselhvel
congelar a -20C as amostras pendentes de transporte
para o laboratrio. As regies recomendadas para a
coleta de amostra, os tipos de amostras e os mtodos
a ser utilizados para o diagnstico de infeces por
herpes genital so apresentados nas Tabelas 9.2-9.4. A
Tabela 9.3 apresenta as recomendaes referentes ao
transporte de amostras e seu armazenamento para uso
em microscopia, cultura ou NAAT.

Tabela 9.2: Recomendaes para a coleta de amostra para o diagnstico de infeces por herpes genital,
adaptadas de Domeika et al. (1)

108

Regio de coleta

Equipamentos para a coleta de amostras

Mtodo de coleta

Pele ou membrana
mucosa de leses em
homens (incluindo a
regio perianal)

Agulhas estreis
Haste de madeira, plstico ou alumnio,
com extremidade de algodo, dacron ou
flocos de nylon
Lminas para microscpio

Desencape as vesculas com uma agulha


estril
Colete o contedo das vesculas com
uma haste estril e:
Aplique-o em uma lmina de
microscpio (para colorao
fluorescente), ou
Introduza-o em um meio de transporte
para a cultura viral ou NAAT

Uretra em homens

Haste de madeira, plstico ou alumnio,


com extremidade de algodo, dacron ou
flocos de nylon

Limpe a regio externa da abertura da


uretra com uma haste umedecida em
soluo salina
Retraia o prepcio para evitar
contaminao durante a coleta da
amostra
Insira uma haste estril cuidadosamente
no canal uretral externo (a uma
profundidade de 0,5-2cm) e colete o
exsudato uretral a ser testado

Pele ou membrana
mucosa de leses em
mulheres (incluindo a
regio perianal)

Gaze e hastes
Lminas para microscpio

Similar pele ou membrana mucosa em


homens

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 9.2: Recomendaes para a coleta de amostra para o diagnstico de infeces por herpes genital,
adaptadas de Domeika e colaboradores (1) (continuao)
Regio de coleta

Equipamentos para a coleta de amostras

Mtodo de coleta

Uretra em mulheres

Gaze estril (para remover o excesso de


corrimento)
Haste de madeira, plstico ou alumnio,
com extremidade de algodo, dacron ou
flocos de nylon

Limpe o introito utilizando uma gaze


estril
Introduza gentilmente uma haste
de alumnio estril na uretra (a uma
profundidade de 0,5cm) para coletar o
exsudato a ser testado

Colo do tero

Espculo vaginal
Gaze estril (para remover o excesso de
corrimento)
Haste de madeira, plstico ou alumnio
com extremidade de algodo, dacron ou
flocos de nylon

Insira o espculo vaginal, que pode ser


previamente umedecido em gua morna,
e limpe o canal cervical abrindo-o com
uma gaze estril
Insira uma haste com extremidade de
algodo ou dacron, cuidadosamente, no
canal cervical (a uma profundidade de
2cm) e colete o material das leses

Vagina (de mulheres


pr-pberes)

Haste de madeira, plstico ou alumnio,


com extremidade de algodo, dacron ou
flocos de nylon

Introduza uma haste de alumnio estril


cuidadosamente, atravs do hmen, na
vagina e colete o material da parede da
vagina

NAAT: teste de amplificao de cido nucleico.


Nota: coleta-se material do reto quando o paciente teve contato sexual anal, quando h inflamao anorretal ou se a pele perianal ou pregas anais
estiverem mais espessas.

Tabela 9.3: Mtodos laboratoriais diretos para o diagnstico de HSV


Mtodo

Princpio

Exame
Esfregao
citolgico de Tzanck,
Papanicolau
(Pap) ou
colorao de
Romanovsky
Deteco
de clulas
infectadas
por imunofluorescncia
direta

Amostra

Sensibilidade Especificidade Vantagens

Desvantagens

Leses na
pele/mucosa
Bipsias
Esfregaos da
crnea/conjuntiva

Baixa

Baixo custo

Leses frescas
Sensibilidade
e especificidade abaixo
do timo

Esfregaos,
seces de
tecidos
Esfregao
da base da
vescula

Mdia (lAlta (>95%)


cera genital:
70-90%;
assintomticos: <4050%)

Baixo custo
Rpido
(vivel em
<4 horas)
Possibilidade de determinao
do tipo

Vesculas
frescas
Sensibilidade
abaixo do
timo
Demorado
Trabalhoso
No padronizado

Baixa

Infeces pelo vrus do herpes simples (HSV)

109

Tabela 9.3: Mtodos laboratoriais diretos para o diagnstico de HSV (continuao)

110

Mtodo

Princpio

Amostra

Sensibilidade Especificidade Vantagens

Deteco
de
antgeno
viral

Colorao
de imunoperoxidase

Amostras
Mdia (80%)
coletadas com
haste
Esfregaos de
leses
Esfregaos ou
fluido vesicular do exsudato da base
da vescula

ELISA

Amostras
Alta (lcera
Alta (62-100%)
coletadas com genital: >95%)
haste
Fluido vesicular ou exsudato da base
da vescula

Teste rpido

Amostras
Desconhecida
coletadas com
haste
Fluido vesicular do exsudato da base
da vescula

Alta (90%)

Desconhecida

Desvantagens

Baixo custo Vesculas


do reagente
frescas
Rpido
Sensibilidade
(vivel em
abaixo do
<4 horas)
timo
No requer
a integridade do
espcime
Posibilidade
de determinao do
tipo
Vesculas
frescas
No
possibilita a
determinao
do tipo
Teste point- Ainda no
of-care
avaliado

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 9.3: Mtodos laboratoriais diretos para o diagnstico de HSV (continuao)


Mtodo

Princpio

Cultura viral Isolamento


de HSV
de clulas
susceptveis

Amostra

Sensibilidade Especificidade Vantagens

Amostras
coletadas
com haste
Leses de
pele
Fluido vesicular ou
exsudato
da base da
vescula
Amostras de
mucosa sem
leso
Bipsias
Esfregao
da crnea/
conjuntiva
Recmnascidos

Baixa a alta, Alta (~100%)


dependendo
do contexto
clnico
Contedo
vesicular:
>90%
lcera: 95%
Coletadas
com haste:
70-80%
Mucosa
sem leso:
30%

Desvantagens

Permite vrus
Menos sen Classicamente,
svel que o
mtodo paPCR
dro ouro
As condies
Atualmente, o
de armazeteste preferido
namento e
(2)
transporte
Simplicidade
da amostra
na coleta de
influenciam
amostras
a sensibili Determinao
dade (transdo tipo
porte rpido,
Teste de
refrigerado e
resistncia
em meio de
fenotpicaa
transporte
viral protegido da luz)
Trabalhoso
Caro
Laboratrios
especializados
Resultados
em 2-7 dias
Necessidade
de convnio
com laboratrio

Infeces pelo vrus do herpes simples (HSV)

111

Tabela 9.3: Mtodos laboratoriais diretos para o diagnstico de HSV (continuao)


Mtodo

Princpio

Biologia
Deteco
molecular do DNA de
HSV e/ou
quantificao
por NAAT,
incluindo a
clssica PCR
in-house,
PCR em
tempo real
e ensaios
comerciais

Amostra

Sensibilidade

Especificidade Vantagens

Desvantagens

Amostras
coletadas
com haste
Leses de
pele
Fluido vesicular ou
exsudato
da base da
vescula
Amostras
de mucosa
sem leso
Humor
aquoso/
vtreo
Lquido
crticoespinhal
Sangue

A mais alta
(98%)

Alta (~100%)
O controle
de possveis
contaminaes
cruzadas
importante

Somente em
laboratrios
especializados
No padronizado
No validado para
todos os
tipos de
amostras
Risco de
contaminao (PCR)
Pode ser
relativamente caro
(PCR em
tempo real)
Genotipagem de
resistncia
de rotina no
disponvel

Alta sensibilidade
Atualmente, o
teste preferido
(2)
Permite a deteco viral e a
determinao do
tipo no mesmo
teste
Rpido
Pode ser automatizado
Eficiente em termos de trabalho
Resultados em
24-48 horas,
possivelmente
em <3 horas
Genotipagem de
resistncia
Mtodo de escolha para LCR
PCR em tempo
real:
Amplificao
rpida
Anlise
quantitativa
Risco de
contaminao
reduzido
Mtodo de
escolha para
leses na
pele

LCR: lquido cefalorraquidiano; ELISA: ensaio imunossorvente ligado enzima; HSV: vrus do herpes simples; NAAT: teste de amplificao de cidos
nucleicos; PCR: reao em cadeia da polimerase.
a
A deteco de mutaes de resistncia codificando resistncia a drogas anti-herpes (aciclovir) por meio da genotipagem de resistncia a drogas
do HSV provavelmente substituir o teste fenotpico em poucos anos.

112

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

9.4 Diagnstico direto de HSV a partir de


espcimes clnicos
9.4.1 Exames citolgicos
O exame direto de espcimes e o exame citolgico
utilizando procedimentos de colorao convencionais
(esfregao de Tzanck, Papanicolau ou colorao
de Romanovsky) apresentam baixa sensibilidade e
especificidade e no devem servir de base para o
diagnstico da infeco pelo vrus do herpes. Entretanto,
um diagnstico de cervicite por herpes pode ser
um achado incidental durante o exame de rotina de
esfregaos Pap submetidos a citologia cervical.

9.4.2 Deteco de antgeno viral


Quando h presena de leses mucocutneas, o
antgeno viral no material da leso pode ser detectado
por meio de imunofluorescncia direta (IF), colorao
com imunoperoxidase (IP) ou ensaio imunossorvente
ligado enzima (ELISA, do ingls enzyme-linked
immunosorbent assay).
A IF direta pode ser classificada como um teste
diagnstico rpido, permitindo a diferenciao dos
tipos de herpesvrus genitais, mediante a utilizao
de esfregaos preparados em clnicas ou daqueles
produzidos em laboratrios a partir de amostras
coletadas com hastes recebidas de outros lugares.
Nesse ltimo caso, as clulas devem ser concentradas
antes da preparao dos esfregaos. Os antgenos de
HSV-1 e HSV-2 podem ser detectados por anticorpos
monoclonais especficos, marcados com fluorescena
(Figura 9.2). As principais limitaes das IF diretas so
o fato de serem demoradas, relativamente caras em
termos de reagentes e equipamentos (um microscpio
de fluorescncia) e menos sensveis que os mtodos
moleculares modernos. A IF direta apresenta uma
sensibilidade de 70-90% quando comparada
cultura para casos de doena sintomtica; porm, sua
sensibilidade bem menor para casos assintomticos,
impedindo seu uso nessas situaes.
A colorao de IP indireta apresenta a vantagem da
possibilidade do uso de um microscpio de luz normal, o
que a torna mais conveniente para laboratrios de nvel
intermedirio. Os espcimes so preparados da mesma
forma que para o teste de IF direta e incubados com

anticorpos policlonais de coelho ou rato especficos para


HSV ou monoclonais especficos para HSV-1 ou HSV-2. A
ligao detectada utilizando um anticorpo conjugado
peroxidase de raiz forte direcionado s imunoglobulinas
de coelho ou rato, usando mtodos padres de IP. A
sensibilidade dos mtodos de IF e IP so semelhantes.
As protenas do herpes tambm podem ser detectadas
em amostras clnicas por meio de um ELISA de captura
clssica, empregando anticorpos policlonais ou
monoclonais especficos para HSV. A sensibilidade dos
ELISA de captura disponveis comercialmente, quando
comparada da cultura viral, superior ou igual a 95%,
com especificidade variando entre 62% e 100% em
pacientes sintomticos. A sensibilidade do ELISA de
captura de antgeno pode ser maior que a da cultura viral
para apresentaes tpicas, porm menor para amostras
cervicais e da uretra. A maioria dos ensaios disponveis
comercialmente, entretanto, no diferenciam o HSV-1 do
HSV-2.
Os testes point-of-care (POC) para a deteco do
antgeno de HSV esto disponveis comercialmente,
mas o desempenho desses testes ainda no foi
extensivamente avaliado.

9.4.3 Isolamento de vrus e determinao do


tipo em cultura de clulas
As clulas utilizadas mais frequentemente para o
isolamento de HSV a partir de espcimes clnicos
incluem os fibroblastos humanos diploides primrios e
cepas de clulas, tais como clulas MRC-5 (fibroblastos
humanos), clulas Vero (rim de macaco), clulas Hep-2

Figura 9.2
Imunofluorescncia intracelular de HSV em
espcime clnico (400x).

Infeces pelo vrus do herpes simples (HSV)

113

(carcinoma de clula escamosa da laringe), rim de filhote


de hamster e clulas de rim de coelho.
As clulas cultivadas podem crescer em uma
monocamada aderente em um tubo de cultura de tecido
plano em um dos lados. O meio de cultura removido
e dois tubos de cultura so inoculados com alquotas
de 0,25mL de espcimes e agitados vigorosamente
(em vrtice). Os tubos so colocados em posio
horizontal em uma estufa por uma hora a 36C para
aumentar a adsoro das partculas virais pelas clulas.
Aps a adsoro, so adicionados 2mL de meio de
manuteno para clulas com herpes, incubando-se os
tubos de cultura a 36C em uma atmosfera contendo
5% de CO2 por um perodo de sete dias. Os tubos de
cultura devem ser examinados diariamente utilizando
um microscpio estereoscpico a fim de verificar o
surgimento dos efeitos citopticos caractersticos
de HSV, os quais normalmente se desenvolvem em
24-72 horas aps a inoculao. Os efeitos citopticos
causados por HSV caracterizam-se pela transformao
de clulas alongadas e difusas (Figura 9.3, esquerda)
em clulas expandidas, refrteis, arredondadas,
aumentando em nmero e desenvolvendo uma aparncia
granular (Figura 9.3, direita). Nas culturas de clulas
infectadas por HSV, pode ocorrer uma necrose focal
de clulas, encontrando-se sinccios e clulas gigantes
multinucleadas nos cantos do foco.
Recomenda-se que a presena de HSV em culturas de
clulas apresentando efeitos citopticos seja confirmada,

uma vez que outros vrus podem causar efeitos


citopticos similares aos observados em culturas de
herpes. A confirmao e a determinao do tipo de HSV
podem ser realizadas diretamente na cultura de clulas
infectadas utilizando anticorpos monoclonais especficos,
marcados com isotiocianato de fluorescena (FITC, do
ingls fluorescein isothiocyanate) ou IP diretamente
em um esfregao do material cultivado, ou testando
o sobrenadante das clulas por NAAT. A identificao
e determinao do tipo por IF a abordagem mais
prtica. O meio de cultura removido da monocamada
infectada, adicionando-se 1mL de soro fetal bovino a
5% em soluo salina tamponada com fosfato (PBS, do
ingls phosphate-buffered saline solution). As clulas
no lado plano da monocamada so, ento, raspadas da
lamnula, homogeneizadas e centrifugadas a 500g por
cinco minutos; o precipitado agitado vigorosamente
(em vrtice), e uma gota depositada em cada um
dos dois poos da lmina de vidro coberta com PTFE,
colocada para secar ao ar livre e fixada com acetona
gelada (2-8C) por 10 minutos. Um poo ento
colorido com anticorpo monoclonal especfico para
HSV-1 marcado com fluorescena, e o outro poo, com
anticorpo monoclonal especfico para HSV-2 marcado
com fluorescena. A lmina incubada por 30 minutos
a temperatura ambiente em uma cmara mida e,
ento, lavada com PBS trs vezes por cinco minutos,
usando um agitador mecnico. Em seguida, as lamnulas
so colocadas sobre as lminas com uma soluo de
glicerol-PBS (50%:50%) e as lminas so examinadas

Figura 9.3
Isolamento do vrus do herpes em cultura de clulas (50x). esquerda, monocamada difusa de fibroblastos
humanos diploides MRC-5 no infectados; direita, efeito citoptico tpico de HSV em clulas MRC-5 obtidas
aps 24-48 horas de cultura viral.

114

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

em um microscpio de fluorescncia com um aumento


de 400x. Quando um dos poos mostra partculas verdes
fluorescentes e o outro no, a identificao de HSV
confirmada e o tipo do vrus determinado. Os isolados
de HSV cultivados podem ser armazenados em sacarose
0,2M em PBS 0,02M, pH 7,2 (meio 2SP) a -80C ou em
nitrognio lquido.
O isolamento de vrus em tubos de cultura de tecido
demorado e trabalhoso, mas apresenta a vantagem
de demonstrar a infeco ativa em uma leso clnica
e tambm permite a determinao do tipo do vrus
e a realizao do teste de sensibilidade fenotpica
a antivirais. Culturas mais rpidas de HSV podem
ser obtidas utilizando pequenos frascos ou placas
com vrios poos e centrifugando os espcimes da
monocamada celular em lamnulas, de forma similar
cultura de clamdia.
O diagnstico da infeco por HSV em cultura de
tecido tem sensibilidade baixa, por ser o HSV isolado
a partir de leses em aproximadamente 80% das
infeces primrias, mas em apenas 25-50% das leses
recorrentes e ainda menos em pessoas cujas leses j
comearam a cicatrizar.
Assim, a secreo coletada de bolhas intactas
(vesiculares ou leses postulares) ir produzir isolados
de cultura em mais de 90% dos casos. A partir do
momento em que as leses formarem crosta, apenas
aproximadamente 25% das culturas sero positivas. A
no deteco de HSV por meio de cultura no indica a
ausncia de infeco por HSV.
O isolamento de HSV em cultura de clulas tem
constitudo o principal mtodo diagnstico de HSV, mas
s vivel em laboratrios especializados. As vantagens
da cultura de HSV incluem a alta especificidade
e a recuperao de isolados virais que podem ter
seu tipo determinado ou serem testados quanto
susceptibilidade fenotpica a antivirais. A cultura de HSV
cara, trabalhosa, demorada e apresenta sensibilidade
de diagnstico inferior aos ensaios NAAT. O atraso no
processamento de amostras e a falta de refrigerao
aps a coleta reduzem significativamente o rendimento
do diagnstico.

9.5 Deteco e quantificao do vrus


utilizando tcnicas moleculares
Vrios procedimentos moleculares foram propostos
para detectar e/ou quantificar o genoma do HSV em
amostras clnicas, incluindo reaes em cadeia da
polimerase (PCR, do ingls polymerase chain reaction)
competitivas in-house (3), deteco por PCR seguida
de hibridizao de DNA por imunoensaio enzimtico
(4), ensaio de PCR em tempo real e vrios outros kits
disponveis comercialmente. Os NAAT em tempo real
permitem tanto a deteco como a quantificao do DNA
de HSV em amostras clnicas. Comparada aos NAAT
tradicionais, a PCR em tempo real permite a amplificao
do DNA de HSV em um nico tubo de reao, mais
rpida, oferece condies simplificadas de desempenho
e menores riscos de contaminao. Iniciadores de
sequncias de DNA de HSV comuns ao HSV-1 e ao
HSV-2 (a DNA polimerase do HSV [gene pol F ], a timidina
quinase do HSV ou o domnio da glicoprotena B) so
capazes de identificar o DNA de HSV (6-8). Iniciadores
e sondas especficas para sequncias de DNA de HSV-1
e HSV-2, incluindo os genes gG, gD e gI, permitem a
amplificao de um tipo de herpes. Em cada extrao
de DNA e subsequente anlise, so necessrios um
controle positivo interno, que permite a deteco de
inibidores de amplificao e controlam a qualidade da
preparao da amostra, e um controle negativo. Painis
de referncia certificados e registrados, compreendendo
os espcimes de controle codificados, devem ser usados
como controle de qualidade interno e entre laboratrios
(ver Captulo 2).
Atualmente, os NAAT so os testes mais sensveis
para detectar HSV em amostras genitais. As taxas de
deteco dos ensaios de PCR so 11-71% superiores
cultura viral. Alm disso, os NAAT permitem a deteco
de liberao assintomtica de HSV. Entretanto, a no
deteco de HSV por PCR no indica ausncia de
infeco por HSV, uma vez que a liberao do vrus
intermitente. O uso de NAAT para o diagnstico de
HSV tambm permite o transporte de amostras em
condies menos rigorosas do que as necessrias
para o diagnstico por cultura. As PCR em tempo real
oferecem as vantagens adicionais de rpida deteco,
quantificao e determinao do tipo do DNA de HSV

Infeces pelo vrus do herpes simples (HSV)

115

sem o risco de contaminao, em um procedimento


usando apenas um tubo.
Embora a Administrao de Alimentos e Drogas dos
Estados Unidos da Amrica ainda no tenha aprovado
nenhum NAAT para o uso nos Estados Unidos da
Amrica, o Guia de Tratamento de Doenas Sexualmente
Transmissveis de 2010 dos Centros de Controle e
Preveno de Doenas afirma que o teste de PCR para
diagnosticar herpes pode ser realizado por laboratrios
clnicos que desenvolveram seus prprios testes e que
conduziram um estudo de verificao de alteraes e
melhorias do laboratrio clnico e a cultura de clulas
e a PCR so os testes para HSV preferidos para pessoas
que buscam tratamento mdico para lceras genitais e
outras leses mucocutneas (2). importante proceder
a uma avaliao estrita das PCR in-house e dos NAAT
disponveis comercialmente em cada local.

9.6 Diagnstico sorolgico indireto de


infeces por herpes
O teste sorolgico recomendado como auxiliar no
diagnstico de herpes genital em pacientes com
sintomas genitais recorrentes, leses atpicas ou em
fase de cicatrizao, alm de culturas negativas para
HSV. Na ausncia de leses, ou em caso de testes de
deteco viral negativos, os testes sorolgicos podem
ser teis na gesto de parceiros sexuais de pessoas com
herpes genital ou na identificao de infeces por HSV
em indivduos em maior risco, tais como pacientes com
HIV ou outras DST e indivduos com vrios parceiros
sexuais. No indicada a triagem sorolgica de HSV-1 e
HSV-2 na populao geral.
Embora a preciso dos ensaios sorolgicos para HSV
possa no corresponder dos testes de anticorpos
para HIV, esses testes representam claramente uma
melhoria no diagnstico clnico de herpes genital, o qual
tem uma sensibilidade de no mximo 39% e produz um
diagnstico falso-positivo em aproximadamente 20%
dos pacientes.
Os imunoensaios disponveis comercialmente esto
sendo aprimorados e uma srie de algoritmos foram
recomendados para resolver testes indeterminados.
Quanto a decidir quem ser testado, os mdicos
continuam acreditando que pacientes no diagnosticados

116

causam a maior parte das novas transmisses, e


estudos em diferentes locais mostram que a maioria dos
pacientes so receptivos oportunidade de conhecer
seu estado sorolgico.
Os anticorpos IgG so normalmente negativos no herpes
genital primrio, uma vez que se tornam detectveis
duas semanas a trs meses aps o surgimento
dos sintomas e persistem indefinidamente. Assim,
imediatamente aps a infeco, h um perodo de
janela durante o qual os testes de anticorpos tero
resultados negativos. Consequentemente, as infeces
primrias por HSV podem ser documentadas por
meio de qualquer mtodo sorolgico para mostrar a
soroconverso com soros pareados. Uma vez que o
teste para IgM tambm pode resultar positivo durante
a reativao da doena, ele no pode ser utilizado para
distinguir infeco primria da recorrente e, dessa
forma, de uso limitado para a finalidade de diagnstico
de rotina.
Se houver presena de leses genitais, a sorologia
especfica para cada tipo e o teste viral direto podem
ajudar a definir se o episdio representa uma nova
infeco por HSV ou uma reativao (Tabela 9.4).
Anticorpos especficos para HSV podem levar de duas
semanas a trs meses para serem produzidos. Assim,
em uma pessoa com uma aquisio recente de herpes,
a ausncia inicial de anticorpos contra a glicoprotena
G2 (gG2) e o desenvolvimento subsequente desses
anticorpos aps 12 semanas confirma a infeco
primria por HSV-2. A distino entre aquisies novas e
reativaes de HSV til para estudos epidemiolgicos
e, algumas vezes, pode ajudar na gesto clnica de
questes psicossociais.
Uma vez que praticamente todas as infeces por HSV-2
so adquiridas sexualmente, a presena de anticorpos
especficos para HSV-2 implica infeco anogenital,
devendo-se oferecer informaes e aconselhamento
adequados s pessoas com herpes genital. A
presena de anticorpo para HSV-1 mais difcil de ser
interpretada. A maioria das pessoas com anticorpos
para HSV-1 apresentam infeco oral por HSV adquirida
durante a infncia, a qual pode ser assintomtica.
Entretanto, a aquisio genital de HSV-1 est
aumentando e muitas vezes tambm assintomtica.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

A ausncia de sintomas em uma pessoa soropositiva


para HSV-1 no permite distinguir a infeco anogenital
da orolabial. Pessoas com infeces por HSV-1,
independentemente do local da infeco, continuam em
risco para a aquisio de HSV-2.
O teste sorolgico baseado na glicoprotena G (gG)
especfica pode distinguir entre as infeces por
HSV-1 e por HSV-2, devendo ser sempre solicitado,
principalmente quando da realizao da sorologia.
Os ensaios sorolgicos especficos para HSV podem
ser teis nas seguintes situaes: sintomas genitais
recorrentes ou sintomas atpicos com culturas para
HSV negativas; diagnstico clnico de herpes genital
sem a confirmao laboratorial; parceiros de pacientes
com herpes genital comprovada, para demonstrar
a concordncia ou discordncia sorolgica antes do
aconselhamento. Alm disso, o teste sorolgico para
HSV deve ser includo em uma ampla avaliao de DST
entre pessoas com mltiplos parceiros sexuais e/ou
infeco por HIV, e entre homens que fazem sexo com
homens com risco aumentado de contrair HIV.
Os genomas do HSV-1 e do HSV-2 codificam, cada
um, pelo menos 80 polipeptdeos estruturais e
no estruturais diferentes, incluindo no mnimo 10
protenas glicosiladas, designadas de glicoprotena A
a glicoprotena I (gA gI). A maioria dos anticorpos
para infeco por HSV gerada contra essas
glicoprotenas de superfcie. As glicoprotenas gB, gC,
gD e gE desencadeiam respostas imunes potentes.
Alguns epitopos presentes nessas glicoprotenas so
compartilhados pelo HSV-1 e HSV-2 e, dessa forma,
causam um grau elevado de reao cruzada quando
testados por alguns ensaios comerciais. No entanto,
no foram detectadas reaes cruzadas entre a gG1
em HSV-1 e gG2 em HSV-2 (10). Os ensaios sorolgicos
para HSV especficos e precisos baseiam-se na deteco
de anticorpos especficos para gG1 (HSV-1) e gG2
(HSV-2), utilizando gG1 ou gG2 nativas, purificadas ou
recombinantes.
Os ELISA sorolgicos e especficos para HSV baseados
em gG tornaram-se disponveis comercialmente em
1999; porm, ensaios mais antigos, que no distinguem
os anticorpos para HSV-1 e HSV-2 de forma precisa
(embora garantam o contrrio), continuam no mercado.

Os testes rpidos POC tambm podem fornecer


resultados para anticorpos contra HSV-2 a partir do
sangue capilar ou soro, durante uma consulta clnica.
As sensibilidades desses testes especficos para gG na
deteco de anticorpos contra HSV-2 variam de 80-98%
e resultados falso-negativos podem ser mais frequentes
nos estgios precoces da infeco. As especificidades
desses ensaios so 96%. Os testes aprovados para
uso nos EUA apresentam sensibilidade de 97-100%
e especificidade de 94-98%, respectivamente, em
comparao com o western blot (WB). Resultados falsopositivos podem ocorrer, especialmente em pacientes
com baixa probabilidade de estarem infectados por HSV.
A repetio ou a realizao de um teste confirmatrio
podem ser indicadas em alguns lugares, principalmente
na suspeita de aquisio recente de herpes genital.
Doenas sexualmente transmissveis concorrentes
podem aumentar os resultados de testes falso-positivos
por ELISA para HSV-2 (11). Ademais, a comparao
de testes baseados em ELISA em relao ao WB na
frica subsaariana demonstrou menor especificidade
que a previamente observada, principalmente em
pessoas infectadas por HIV (12). De modo geral, a baixa
especificidade de alguns testes para herpes especficos
baseados em gG tem sido reportada em amostras da
frica subsaariana (12-14). No se compreende muito
bem esse fraco desempenho, mas se entende que pode
resultar de questes laboratoriais/tcnicas ou de reao
cruzada de infeces no identificadas, mais comuns na
frica subsaariana (13, 15-16).
Ensaios sorolgicos rpidos (POC) foram desenvolvidos
para a deteco de anticorpos especficos para HSV-2.
Esses imunoensaios so desenhados para utilizar
sangue capilar de puno digital (ou soro) e empregam,
tipicamente, o fluxo lateral por meio da membrana,
contendo um ponto do antgeno gGq ou gG2. Quando
o soro aplicado no aparelho, desenvolve-se uma
mudana visual de cor (ponto rosa), caso estejam
presente anticorpos para HSV. Apesar de ter sido
reportada uma variabilidade interoperativa de 5-10% na
interpretao dos testes, esses testes POC apresentam
desempenho relativamente bom, com sensibilidades
91% e especificidades 94% (17 ). Em concordncia
com os sistemas baseados em ELISA, o desempenho
dos sistemas POC depende em parte da prevalncia de

Infeces pelo vrus do herpes simples (HSV)

117

HSV na populao. O maior benefcio dos ensaios POC


que estes fornecem um resultado rpido (possivelmente
enquanto o paciente ainda se encontra na clnica),
permitindo a orientao e aconselhamento do paciente
de forma mais oportuna. A maior desvantagem desses
testes o seu alto custo em relao aos sistemas
baseados em ELISA.

Os anticorpos IgG e IgM especficos para HSV podem ser


detectados por diversos mtodos imunolgicos (18-19).
Diversos WB no comerciais foram desenvolvidos
em laboratrios de referncia especializados, mas
continuam inacessveis para o uso diagnstico na
maioria dos lugares (20). A Tabela 9.4 resume os
diagnsticos sorolgicos das infeces por HSV e os
testes de anticorpos especficos para HSV.

Tabela 9.4: Abordagens virolgicas e sorolgicas para o diagnstico de HSV-2 na presena e ausncia de
leses genitais, adaptado de Gupta e colaboradores (9)

Primeira avaliao
das leses
genitais

Sem leses

Leses genitais
recorrentes

Deteco de
IgG especfica
HSV-2 por
para HSV-1
mtodo direto

IgG
especfica
para HSV-2

Interpretao

Positivo

Positivo ou
negativo

Negativo

Infeco aguda por HSV-2


Repetir a sorologia especfica para
HSV-2 em 15-30 dias

Positivo

Positivo ou
negativo

Positivo

Infeco por HSV-2 recorrente, com


infeco por HSV-2 adquirida pelo
menos nas seis semanas anteriores

NA

Negativo

Negativo

Pacientes em risco de adquirir infeco


orolabial ou genital por HSV-1 e/ou
infeces por HSV-2

NA

Positivo

Negativo

Pacientes em risco de adquirir infeco


orolabial ou genital por HSV-2

NA

Positivo

Positivo

Infeces anteriores por HSV-1 e HSV-2

Positivo

Positivo ou
Negativo

Positivo

Infeces por HSV-2 recorrentes

Negativo

Negativo

Positivo

Possvel infeco por HSV-2 recorrente


Outras causas provveis de doena
ulcerativa genital devem ser
consideradas

NA: no se aplica.

Os testes sorolgicos para HSV no so recomendados


rotineiramente em pacientes assintomticos, mas so
indicados nas seguintes situaes:
Histrico de doena genital recorrente ou atpica
quando os mtodos de deteco viral direta
apresentaram resultados negativos. O anticorpo para
HSV-2 favorvel para um diagnstico de herpes
genital; anticorpos para HSV-1 no diferenciam
entre infeces genitais e orofarngeas. Devem-se
aconselhar pacientes com IgG para HSV-2 negativo;
aqueles com IgG para HSV-1 devem considerar que

118

o HSV-1 uma causa relativamente incomum de


doenas genitais recorrentes.
Primeiro episdio de herpes genital, em que a
diferenciao entre infeco primria e estabelecida
direciona o paciente para o aconselhamento e gesto.
Quando h o aparecimento dos sintomas, a ausncia
de IgG para HSV contra o tipo de vrus identificado
na leso genital consistente com uma infeco
primria. A soroconverso deve ser demonstrada
durante o acompanhamento.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Parceiros sexuais de pacientes com herpes genital,


nos quais se verifica maior preocupao sobre
transmisso. Casais sorodiscordantes podem ser
aconselhados quanto a estratgias para reduzir o
risco de infeco e doena.
Sorologia para HSV e gravidez:
O teste de mulheres grvidas assintomticas no
recomendado rotineiramente, mas indicado quando
existe um histrico de herpes genital no parceiro.
As mulheres soronegativas para HSV-1 e/ou HSV-2
devem ser aconselhadas sobre estratgias de
preveno de uma nova infeco por ambos os tipos
de vrus durante a gestao.
Sorologia para HSV no contexto da infeco por HIV:
O teste de pacientes infectados por HIV no
recomendado rotineiramente. Embora a
soropositividade para HSV-2 aumente o risco de
transmisso de HIV e recorrncias frequentes de HSV
aumentem a replicao do HIV, as evidncias ainda
so limitadas quanto informao sobre a gesto da
coinfeco por HSV-2 em pacientes infectados por
HIV sem sintomas de herpes genital.

o que pode favorecer a sobrevivncia das cepas de HSV


resistentes a drogas menos adaptadas. A persistncia
das leses por mais de uma semana aps o incio da
terapia sem uma diminuio significativa do tamanho,
uma aparncia atpica das leses ou a emergncia
de novas leses perifricas apesar da administrao
antiviral so sugestivas de falha teraputica. O
diagnstico laboratorial de resistncia ao aciclovir
necessrio para guiar os mdicos quanto s novas
opes de tratamento em caso de falha teraputica.
A resistncia ao aciclovir pode ser diagnosticada
por meio do teste do vrus contra agentes antivirais
(ensaio fenotpico) ou pela identificao de mutaes
especficas nos genes da timidina quinase (UL23) e
da DNA polimerase (UL30), que conferem resistncia
s drogas antivirais (ensaio genotpico). Para que os
mtodos genotpicos sejam teis na prtica clnica,
essencial poder discriminar entre variaes aleatrias
(polimorfismos) e verdadeiras mutaes de resistncia a
drogas.

9.8 Referncias
1. Domeika M et al. Guidelines for the laboratory
diagnosis of genital herpes in eastern European
countries. Eurosurveillance, 2010, 15(44):pii:19703.

Dados limitados sugerem um aumento no risco


de transmisso perinatal de HIV entre mulheres
infectadas por HIV soropositivas para HSV-2. Uma
vez que as evidncias no so consistentes, o teste
de mulheres HIV-positivas no recomendado
rotineiramente.

2. Centers for Diseases Control, Sexually transmitted


diseases treatment guidelines 2010. Morbidity and
Mortality Weekly Report, 2010, 59(RR12) (http://
www.cdc.gov/std/ treatment/2010/STD-Treatment2010-RR5912.pdf, acessado em 4 de abril de 2013).

Os portadores de HSV-2 com comportamento


sexual de alto risco devem ser aconselhados sobre o
aumento no risco de aquisio de HIV.

3. Hobson A et al. Evaluation of a quantitative


competitive PCR assay for measuring herpes
simplex virus DNA content in genital tract
secretions. Journal of Clinical Microbiology, 1997,
35(3):548552.

9.7 Monitoramento teraputico: teste de


resistncia a drogas
A profilaxia de longo prazo e o tratamento com
drogas anti-herpes, como o aciclovir ou o valaciclovir,
pode resultar no desenvolvimento de resistncia,
principalmente em pacientes imunocomprometidos (21).
A prevalncia relativa de isolados de HSV resistentes
ao aciclovir difere entre indivduos imunocompetentes
e imunocomprometidos, devido replicao viral
prolongada e resposta comprometida do hospedeiro,

4. MbopiKou FX et al. Interactions between herpes


simplex virus type 2 and human immunodeficiency
virus type 1 infection in African women:
opportunities for intervention. Journal of Infectious
Diseases, 2000, 182(4):10901096.
5. Ryncarz AJ et al. Development of a high-throughput
quantitative assay for detecting herpes simplex
virus DNA in clinical samples. Journal of Clinical
Microbiology, 1999, 37(6):19411947.

Infeces pelo vrus do herpes simples (HSV)

119

6. Espy MJ et al. Diagnosis of herpes simplex virus


infections in the clinical laboratory by LightCycler
PCR. Journal of Clinical Microbiology, 2000,
38(2):795799.

14. LeGoff J et al. Performance of HerpeSelect


and Kalon assays in detection of antibodies to
herpes simplex virus type 2. Journal of Clinical
Microbiology, 2008, 46(6):19141918.

7. Burrows J et al. Detection and subtyping of herpes


simplex virus in clinical samples by LightCycler
PCR, enzyme immunoassay and cell culture. BMC
Microbiology, 2002, 2(1):12.

15. Ashley-Morrow R et al. Performance of focus ELISA


tests for herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and
HSV-2 antibodies among women in ten diverse
geographical locations. Clinical Microbiology and
Infection, 2004, 10(6):530536.

8. Legoff J et al. Real-time PCR quantification of


genital shedding of herpes simplex virus (HSV) and
human immunodeficiency virus (HIV) in women
coinfected with HSV and HIV. Journal of Clinical
Microbiology, 2006, 44(2):423432.
9. Gupta R, Warren T, Wald A. Genital herpes. The
Lancet, 2007, 370(9605):21272137.
10. Grander S, Svennerholm B, Liljeqvist JA. Secreted
portion of glycoprotein g of herpes simplex virus
type 2 is a novel antigen for type-discriminating
serology. Journal of Clinical Microbiology, 2003,
41(8):36813686.
11. Summerton J et al. Effect of sexually transmitted
disease (STD) coinfections on performance of three
commercially available immunosorbent assays used
for detection of herpes simplex virus type 2-specific
antibody in men attending Baltimore, Maryland,
STD clinics. Clinical and Vaccine Immunology, 2007,
14(12):15451549.
12. Biraro S et al. Performance of commercial herpes
simplex virus type-2 antibody tests using serum
samples from sub-Saharan Africa: a systematic
review and meta-analysis. Sexually Transmitted
Diseases, 2011, 38(2):140147.
13. van Dyck E et al. Performance of commercially
available enzyme immunoassays for detection of
antibodies against herpes simplex virus type 2 in
African populations. Journal of Clinical Microbiology,
2004, 42(7):29612965.

120

16. Golden MR et al. Herpes simplex virus type 2


(HSV-2) western blot confirmatory testing among
men testing positive for HSV-2 using the focus
enzyme-linked immunosorbent assay in a sexually
transmitted disease clinic. Sexually Transmitted
Diseases, 2005, 32(12):771777.
17. Wald A, AshleyMorrow R. Serological testing for
herpes simplex virus (HSV)-1 and HSV-2 infection.
Clinical Infectious Diseases, 2002, 35(Suppl
2):S173S182.
18. Ashley RL et al. Premarket evaluation of a
commercial glycoprotein G-based enzyme
immunoassay for herpes simplex virus type-specific
antibodies. Journal of Clinical Microbiology, 1998,
36(1):294295.
19. Morrow RA, Friedrich D, Krantz E. Performance of
the Focus and Kalon enzyme-linked immunosorbent
assays for antibodies to herpes simplex virus type
2 glycoprotein G in culture-documented cases of
genital herpes. Journal of Clinical Microbiology,
2003, 41(11):52125214.
20. Ashley RL. Sorting out the new HSV type specific
antibody tests. Sexually Transmitted Infections,
2001, 77(4):232237.
21. Piret J, Boivin G. Resistance of herpes simplex
viruses to nucleoside analogues: mechanisms,
prevalence, and management. Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, 2011, 55(2):459472.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 10
Sfilis
10.1 Introduo
A sfilis uma doena sexualmente transmissvel
crnica, caracterizada por manifestaes pontuais e
longos perodos de quiescncia. Ela causada pelo
Treponema pallidum subsp. pallidum, um organismo
espiralado e delicado, intimamente relacionado com
os organismos causadores das treponematoses no
venreas, denominados T. pallidum subsp. pertenue
(bouba), T. pallidum subsp. endemicum (sfilis endmica)
e T. carateum (pinta). Esses quatro patgenos so
morfolgica e antigenicamente idnticos. Eles s podem
ser diferenciados entre si pelo modo de transmisso,
epidemiologia, manifestaes clnicas e, mais
recentemente, por sequenciamento gentico (1).
A sfilis venrea normalmente transmitida como
resultado do contato sexual com uma leso infecciosa
da membrana mucosa ou pele desgastada ou por meio
da placenta de uma gestante para o feto. A multiplicao
bacteriana ocorre preferencialmente no momento da
inoculao, resultando na formao da ulcerao genital
primria, seguida de um perodo de incubao de 9-90
dias. Entretanto, a sfilis deve ser considerada uma
doena sistmica, uma vez que a bactria causadora
entra na corrente sangunea logo aps a infeco.

A Figura 10.1 mostra o curso de uma sfilis no tratada.


A primeira manifestao da doena em adultos
uma pequena mcula, a qual se transforma em
uma ppula que, por sua vez, se torna uma lcera.
A lcera tpica (cancro primrio) classicamente
uma leso nica e indolor, que apresenta uma base
limpa e relativamente avascular. Em homens, a
leso comumente encontrada no sulco coronal, na
glande e na haste peniana e, nas mulheres, na vulva,
nas paredes vaginais ou no colo do tero. Leses
extragenitais so raras, mas o cancro oral pode
ocorrer como resultado de sexo oral, e leses perianais
ou no reto so frequentemente vistas em homens
que fazem sexo com homens ou em mulheres que
praticaram relao sexual anal receptiva. Por serem
frequentemente indolores, as leses primrias podem
no ser percebidas. Se no forem tratadas, a lcera
ir curar-se espontaneamente em 3-8 semanas sem
deixar cicatriz. Os cancros primrios genitais so
normalmente associados linfadenopatia inguinal
bilateral, a qual classicamente discreta e suave.

Muitos anos at
por toda a vida

Infeco

6 semanas a
6 meses

Primria
(cancro)
Perodo de incubao
9-90 dias

Secundria
(erupes)
(Sfilis meningovascular)

1 ano
Sfilis precoce

Sfilis latente
(sem sinal da doena)

Terciria

Doena gomosa benigna


Sfilis cardiovascular
Neurossfilis tardia
Muitos anos at
por toda a vida
Sfilis tardia

Figura 10.1
Representao esquemtica do curso da sfilis no tratada
Sfilis

121

Em pacientes no tratados, o surgimento do segundo


estgio da doena costuma ocorrer entre seis semanas
e seis meses aps a infeco inicial. O cancro primrio
pode ainda estar presente quando as leses secundrias
clinicamente aparentes ocorrerem. A principal
caracterstica da sfilis secundria uma erupo
na pele, no irritvel e distribuda uniformemente,
que pode ser macular, papular ou papulo-escamosa.
frequentemente observada na palma das mos e
na sola dos ps. A erupo pode ser acompanhada
de linfadenopatia, febre, dor de cabea e mal-estar
generalizado. Em reas quentes e midas, como a
vulva ou regio perianal, a erupo muitas vezes se
torna maior e forma uma estrutura elevada semelhante
a uma verruga, conhecida como condiloma lata, e, em
regies mucosas, forma leses superficiais brancas
acinzentadas serpiginosas, conhecidas como lceras em
rastro de caracol.
Se a sfilis secundria permanecer sem diagnstico
e, portanto, sem tratamento, todas as manifestaes
visveis da doena iro sarar espontaneamente e o
paciente passar por um perodo de latncia que pode
durar muitos anos. A sfilis latente convenientemente
dividida em infeco latente precoce e tardia, com a
linha de diviso ocorrendo um ano aps a aquisio da
doena (Figura 10.1). Entretanto, deve-se ter em mente
que muitas vezes impossvel determinar a durao
exata da infeco no tratada e, por padronizao,
esses casos devem ser classificados como doena
tardia latente. Durante os estgios latentes da doena,
no h leses na pele ou membrana mucosa para
serem coletadas; dessa forma, um diagnstico deve
ser baseado no resultado de testes sorolgicos e na
ausncia de sinais e sintomas de sfilis terciria.
A sfilis terciria , normalmente, considerada o estgio
destrutivo da doena. Em geral, os sinais e sintomas
dessas manifestaes tardias ocorrem, frequentemente,
muitos anos aps a infeco inicial, embora o
processo da doena possa cursar significantemente
mais rpido em pacientes coinfectados com o vrus
da imunodeficincia humana (HIV, do ingls human
immunodeficiency virus). As vrias manifestaes
da sfilis terciria foram classificadas em doena
gomosa benigna, sfilis cardiovascular e neurossfilis.
No entanto, essas manifestaes clnicas podem

122

coexistir. As gomas so leses destrutivas da sfilis


terciria que podem ocorrer em qualquer rgo do
corpo, porm mais frequentemente na pele, cartilagem
e ossos (doena gomosa benigna); nas paredes da
aorta (sfilis cardiovascular); nos vasos cerebrais (sfilis
meningovascular); ou no crebro e na medula espinhal
(neurossfilis).
Essas manifestaes tardias so frequentemente
diagnosticadas em centros clnicos combinadas com
os resultados de raio-x do trax ou outra imagem (para
sfilis cardiovascular); avaliao de raio-x dos ossos
afetados para detectar gomas nos ossos; e testes
sorolgicos, incluindo o exame do lquido cefalorraquidiano
para neurossfilis. Uma descrio mais completa das
manifestaes da doena pode ser encontrada em textos
oficiais (2).

10.2 Mtodos de deteco direta para o


diagnstico de sfilis
Uma vez que o T. pallidum no pode ser cultivado em
meio artificial, os mtodos de deteco direta, tais como
a microscopia de campo escuro, imunofluorescncia
direta (IF) e testes para detectar sequncias de DNA
especficas de T. pallidum em espcimes obtidos
de leses na pele ou tecidos so os mtodos de
escolha para diagnosticar a sfilis precoce. O teste de
infectividade em coelhos (RIT, do ingls rabbit infectivity
test) vem sendo considerado, h muito tempo, o padroouro para a deteco direta de T. pallidum em espcimes
clnicos (3). Esse mtodo tem uma sensibilidade de
aproximadamente um nico organismo, quando so
utilizadas passagens repetidas em coelhos. Entretanto,
esses testes raramente so realizados, exceto em
laboratrios de pesquisa, uma vez que so demorados
(necessitam de aproximadamente 1-2 meses para
serem completados) e requerem o acesso a biotrios
adequados.

10.2.1 Microscopia de campo escuro


A microscopia de campo escuro o nico teste point-ofcare (POC) capaz de determinar um diagnstico direto
de sfilis, em casos de doena primria ou secundria,
em adultos, ou doena congnita precoce. Seu uso ,
portanto, recomendado para clnicas especializadas em
DST e laboratrios hospitalares prximos a clnicas. Uma

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

vez que necessria uma microscopia especializada


adaptada com um condensador de campo escuro,
somada adeso a condies tcnicas estritas para
que se produzam resultados confiveis, o teste deve ser
limitado a laboratrios especializados.
Na microscopia de campo escuro, apenas os raios de
luz que atravessam os organismos ou partculas em
um ngulo oblquo entram na objetiva do microscpio,
dando origem a corpos brilhantes, brancos e
luminescentes contra um fundo preto. A microscopia
de campo escuro deve ser realizada por profissionais
bem treinados e experientes, capazes de ajustar o
microscpio corretamente e de diferenciar o T. pallidum
de treponemas no patognicos e outros organismos
espiralados comumente encontrados nas membranas
genitais ou mucosa anal. Uma vez que a cavidade oral
frequentemente colonizada por outras espiroquetas,
diferentes dos treponemas, no se recomenda o exame
em campo escuro de material de leses orais.
Tanto as leses primrias como secundrias de sfilis
podem ser examinadas por microscopia de campo
escuro. O espcime ideal um exsudato seroso de
leses ativas, livre de clulas sanguneas vermelhas.
A leso ativa deve ser cuidadosamente lavada com
gaze e soluo salina estreis. Deve ser, ento,
raspada gentilmente, com uma haste estril e seca,
e espremida para produzir um exsudato seroso. Se
ocorrer sangramento, as gotas de sangue devem ser
removidas e o lquido seroso transferido para uma
lmina de vidro, utilizando uma esptula fina de ao inox
ou platina ou uma ala bacteriolgica, ou pressionando
a lmina diretamente no fluido. O material deve ser
misturado com uma gota de soluo salina para formar
uma suspenso homognea que pode ser, ento,
coberta por uma lamnula. A lmina deve ser examinada
imediatamente, uma vez que a mobilidade caracterstica
do organismo um fator importante para a identificao.
Qualquer atraso no exame diminui rapidamente essa
mobilidade. A chance de visualizar treponemas tambm
diminui se a leso estiver seca ou em processo de
regenerao.
O alinhamento ptico correto do microscpio de campo
escuro essencial para o sucesso da microscopia de
campo escuro. Algumas gotas de leo de imerso devem

ser colocadas no condensador de um microscpio


previamente alinhado. O condensador deve ser, ento,
ligeiramente rebaixado, de modo que o leo fique abaixo
do nvel da platina. O espcime a ser examinado ento
colocado na platina e o condensador elevado at que
haja um bom contato entre o leo e a parte de baixo
da lmina. importante evitar a formao de bolhas
no leo. O espcime deve ser examinado inicialmente
utilizando uma objetiva de baixo poder de aumento (10x).
Aps focar a objetiva, a luz deve ser centralizada no
meio do campo mediante o ajuste dos parafusos de
centralizao localizados no condensador, e esse ltimo
deve ser focalizado com movimentos de subida e descida
at que seja obtido o menor dimetro de luz possvel. A
luz deve ser, ento, novamente centralizada, caso seja
necessrio. O espcime focalizado utilizando uma
objetiva seca de aumento de 40x, e a lmina examinada
cuidadosamente. A microscopia de campo escuro
melhor conduzida em uma cmara escura.
Os T. pallidum aparecem como corpos espiralados
brilhantes e brancos, iluminados contra um fundo
preto. O organismo identificado por sua morfologia,
tamanho e movimento tpicos. Ele um organismo fino
(0,10-0,18m de largura), com 6-20m de comprimento
e 8-14 espirais profundas e regulares (Figura 10.2).
Exibe movimentos rpidos e bastante abruptos, girando
relativamente devagar ao redor do seu eixo longitudinal.
Essa rotao acompanhada por flexes sincopadas
e tores no meio do organismo. Podem-se notar
movimentos de alongamento e encurtamento (como
uma mola em expanso). Distores podem ocorrer
em circunvolues tortuosas. Outras espiroquetas,
normalmente saprfitas, podem ser observadas.
No entanto, elas so frequentemente enroladas de
forma mais frouxa, ou ento aparecem mais espessas
e grossas, com diferentes movimentos, incluindo
contores com flexo e relaxamento acentuados dos
espirais.
A demonstrao de treponemas com morfologia e
mobilidade caractersticas de T. pallidum constitui um
diagnstico positivo para sfilis primria e secundria
(4). Os pacientes com cancro primrio positivos para
a microscopia de campo escuro podem apresentar
sorologia negativa, mas normalmente espera-se que

Sfilis

123

a soroconverso ocorra em poucos dias. Entretanto,


a no visualizao do organismo no exame de campo
escuro no exclui um diagnstico de sfilis. Os resultados
negativos podem significar que:
O nmero de organismos presentes no espcime no
suficiente (um nico exame de campo escuro tem
uma sensibilidade menor que 50%);
O paciente j recebeu tratamento ou uma preparao
tpica antibacteriana foi aplicada na leso;
A leso est prxima de uma cura natural;
A leso no sfilis.

10.2.2 Teste de anticorpo de fluorescncia


direta (EID)
O mtodo utilizado para coletar material de leso para
o EID idntico ao usado para a microscopia de campo
escuro. Os espcimes devem ser passados em uma
rea de 1cm2 da lmina do microscpio, secos ao ar livre
e fixados com acetona ou metanol, podendo, depois,
ser acondicionados para o transporte ao laboratrio.
Aps adicionar globulina anti-T. pallidum marcada com
fluorescena, obtida comercialmente, incubar e lavar, as
lminas devem ser examinadas com um microscpio
de fluorescncia. Qualquer espiroqueta T. pallidum no
espcime aparece como um organismo colorido verdema, com a morfologia tpica de T. pallidum contra
um fundo preto (Figura 10.3). Tanto a sensibilidade
quanto a especificidade do teste EID so superiores s
da microscopia de campo escuro, principalmente se
forem utilizados anticorpos monoclonais para realizar o
conjugado com a fluorescena, uma vez que a tcnica
de EID elimina a confuso com outros organismos
espiralados; alm disso, um pequeno nmero de
treponemas marcados com fluorescena podem ser mais
facilmente detectados no esfregao corado do que na
preparao no colorida (5). Infelizmente, o conjugado

Figura 10.2
Treponema pallidum, microscopia de campo escuro.
Fonte: cortesia de David Cox, Centros de Controle e
Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Independentemente do resultado do exame de campo


escuro, deve-se sempre coletar sangue para a realizao
do teste sorolgico.

NOTA: pode-se praticar a tcnica de campo escuro


e otimizar a ptica do microscpio por meio do
uso de espcimes obtidos ao longo da margem da
gengiva dentria. As clulas epiteliais da gengiva e
bactrias orais, incluindo organismos espiralados,
podem ser visualizados como corpos brilhantes e
brancos contra um fundo escuro.

124

Figura 10.3
Teste de imunofluorescncia direta positivo para T.
pallidum.
Fonte: cortesia de David Cox, Centros de Controle e
Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

especfico de fluorescena no comercializado em


muitos pases.
NOTA: o conjugado de fluorescena
convenientemente titulado por meio da aplicao
de diluies em duas vezes do conjugado em
lminas comerciais que podem ser compradas para
a realizao do teste de absoro do anticorpo
treponmico fluorescente (FTA-Abs, do ingls
fluorescent treponemal antibody absorption),
incubando, lavando e examinando o espcime como
no procedimento do teste de imunofluorescncia
direta anteriormente descrito. A diluio a ser
utilizada no teste de imunofluorescncia direta a
maior diluio possvel do conjugado, que mostra
uma fluorescncia clara e especfica na ausncia
de colorao no fundo.

10.2.3 Teste de amplificao de cidos


nucleicos para T. pallidum
O teste da reao em cadeia da polimerase (PCR, do
ingls polymerase chain reaction) pode detectar o
DNA equivalente a <10 organismos em um espcime,
por meio da amplificao de segmentos de genes
especficos de DNA genmico de T. pallidum. Esse
teste pode ser utilizado para examinar espcimes de
qualquer exsudato de leso, tecido ou fluido corpreo,
podendo o espcime ser fresco, congelado ou fixado
e embebido em parafina. Uma vez que no h testes
disponveis de PCR comerciais para T. pallidum liberados
pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica, alguns laboratrios implementaram
testes de PCR desenvolvidos internamente.
Vrios ensaios de PCR foram desenvolvidos e vm sendo
usados com sucesso para detectar sequncias-alvo de
DNA especficas para T. pallidum em leses primrias
e secundrias (6-8). A sensibilidade analtica desses
ensaios equivalente a aproximadamente 10 organismos.
O uso de iniciadores marcados com fluorescena e uma
analisador gentico ABI 310 para detectar sequncias
amplificadas melhorou a sensibilidade analtica da PCR
para polA para aproximadamente um organismo por
reao de PCR. Esses mtodos, teoricamente, podem
ser aplicados no diagnstico de sfilis congnita e

neurossfilis, nos quais mais provvel que o nmero


de organismos seja baixo. Entretanto, os testes no
podem ser recomendados para a deteco de rotina
de T. pallidum no sangue, mesmo no caso de doenas
primrias e secundrias, devido presena de inibidores
de PCR. Todavia, um ensaio de PCR em tempo real
semiquantitativo foi utilizado para indicar que o nmero
de espiroquetas no sangue de pacientes muda de acordo
com o estgio de sfilis, variando de 200 a 105 organismos
por mL de sangue (9).
Ensaios de PCR mltipla foram desenvolvidos para
detectar simultaneamente as causas mais comuns de
lcera genital de etiologia sexualmente transmissvel
(UG), T. pallidum, Haemophilus ducreyi e o vrus do
herpes simples (10). O alvo de T. pallidum na PCR
mltipla o gene 47-kDa, e um ensaio imunossorvente
ligado enzima (ELISA, do ingls enzyme-linked
immunosorbent assay) de captura utilizado para
detectar as sequncias amplificadas especficas. Esse
ensaio foi adaptado para um formato mltiplo em tempo
real que vem sendo utilizado para determinar as causas
de ulceraes genitais em diferentes lugares no mundo
e, subsequentemente, para determinar algoritmos
sindrmicos adequados gesto de UG.

10.3 Testes sorolgicos para sfilis


Os testes sorolgicos para sfilis podem ser,
convenientemente, divididos em dois tipos: os testes
no treponmicos ou reaginas, tais como a reao de
Wasserman (WR, do ingls Wasserman reaction), a
reagina plasmtica rpida (RPR), o teste do Laboratrio
de Pesquisa de Doenas Venreas (VDRL, do ingls
Venereal Disease Research Laboratory) e o teste da
toluidina vermelha com soro no aquecido (TRUST,
do ingls toluidine red unheated serum test); e os
testes treponmicos, tais como o FTA-Abs, o ensaio
de hemaglutinao para Treponema pallidum (TPHA,
do ingls Treponema pallidum haemagglutination
assay), o ensaio de aglutinao passiva de partculas
para Treponema pallidum (TPPA, do ingls Treponema
pallidum passive particle agglutination assay), o ELISA,
a quimioluminescncia e a grande maioria dos testes
rpidos ou POC atualmente disponveis comercialmente.

Sfilis

125

10.3.1 Testes sorolgicos no treponmicos


Atualmente, todos os testes sorolgicos no
treponmicos para sfilis detectam a reagina, uma
mistura de anticorpos IgG e IgM no soro de pacientes
com sfilis que capaz de reagir com um antgeno
complexo (uma mistura de cardiolipina, lecitina e
colesterol) nos testes. O primeiro teste sorolgico
no treponmico a usar esse antgeno foi o teste
WR, baseado no princpio da reao de fixao do
complemento. No entanto, os testes utilizados mais
frequentemente baseiam-se nas reaes de floculao,
que podem ou no incluir partculas indicadoras.
Acredita-se que anticorpos IgG e IgM antilipdeos
so formados como parte da resposta do hospedeiro
ao material liberado por suas clulas danificadas no
incio da infeco como, tambm, para os lipdeos da
superfcie celular do organismo causador (11, 12).
Embora sejam muito sensveis e possam ser
quantificados, os testes no treponmicos no
apresentam especificidade adequada para sfilis,
tendo-se estimado que reaes falso-positivas podem
ocorrer em 0,2-0,8% dos testes. Essas reaes esto
associadas a vrias condies mdicas no relacionadas
com sfilis (11, 12). As reaes falso-positivas agudas
(que persistem por perodos inferiores a seis meses)
geralmente esto associadas a outras doenas
infecciosas como a malria, hepatite, catapora ou
sarampo, ou com vacinao recente. Em contrapartida,
reaes falso-positivas crnicas (que persistem por mais
de seis meses) esto associadas a distrbios no tecido
conjuntivo, neoplasias e infeces crnicas, como lepra,
abuso de drogas intravenosas e envelhecimento. Dessa
forma, teoricamente, os soros reativos nos testes no
treponmicos devem ser confirmados com um teste
treponmico mais especfico.
importante ressaltar que, embora a gravidez tenha
sido por muito tempo considerada uma condio
possivelmente associada a testes no treponmicos
falso-positivos, a taxa de testes positivos em mulheres
gestantes no maior do que nas no gestantes e pode
estar associado apenas ao grande nmero de mulheres
grvidas testadas para a doena, principalmente em
lugares com baixa prevalncia (13). Via de regra, a
grande maioria dos soros falso-positivos apresentam
ttulos de anticorpos 1:4. Para excluir os resultados no

126

treponmicos falso-positivos, todos os soros reativos nos


testes no treponmicos devem ser confirmados por um
teste treponmico.
Entretanto, ttulos baixos no excluem a possibilidade de
infeco por sfilis e so frequentemente encontrados na
doena latente tardia ou terciria.
A determinao dos ttulos de soros no treponmicos
utilizando um procedimento quantitativo pode ser til
para uma interpretao mais correta dos resultados e
para avaliar os pacientes aps o tratamento.
Quando utilizados como testes de triagem inicial, os
testes no treponmicos tornam-se positivos por volta
de seis semanas aps a infeco. Dessa forma, at 40%
das leses primrias positivas na microscopia de campo
escuro ou na PCR podem ser inicialmente soronegativas.
Em seguida soroconverso, os ttulos de anticorpos
no treponmicos aumentam at atingirem o pico entre
1-2 anos aps a infeco, se no for administrado
nenhum tratamento efetivo. Aps isso, durante os
estgios latentes tardios e tercirios da doena, os ttulos
diminuiro lentamente, tornando-se frequentemente
soronegativos na doena j bastante tardia. A grande
vantagem dos testes no treponmicos que estes
podem ser utilizados para verificar a eficcia da terapia.
Assim, aps o tratamento efetivo da sfilis precoce (isto
, primria, secundria ou doena latente primria), os
ttulos de anticorpos diminuiro significativamente (ou
seja, uma reduo de pelo menos quatro vezes no ttulo),
tornando-se finalmente negativos. Entretanto, a oferta
de tratamento eficiente durante os estgios tardios da
doena pode resultar em soropositividade persistente,
embora em ttulos baixos (Figura 10.4). importante
ressaltar que qualquer aumento subsequente (de quatro
vezes ou mais) na titulao pode indicar tanto recada
como reinfeco.
10.3.1.1 Teste do Laboratrio de Pesquisa de Doenas
Venreas (VDRL)
No teste VDRL, o antgeno no estabilizado e uma
suspenso fresca deve ser preparada no dia em que for
usada. O teste realizado em um soro aquecido (56C)
e os resultados devem ser lidos com um microscpio
utilizando um aumento de 100x. O VDRL continua
sendo o teste escolhido para a deteco de reagina nos

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

espcimes no lquido cefalorraquidiano (LCR) obtidos de


pacientes com neurossfilis. Uma descrio detalhada
do teste VDRL fornecida a seguir. O teste de reagina
com soro no aquecido um aperfeioamento na verso
do teste do VDRL, utilizando o soro no aquecido e um
antgeno estabilizado.

para VDRL pode ser comprada ou preparada no


laboratrio.
A soluo salina tamponada para VDRL inclui:

Procedimento do teste VDRL (adaptado de Larsen et


al., 1998; 3).
Reagentes e equipamentos necessrios:
1. Antgeno VDRL. Uma soluo sem cor, alcolica,
contendo 0,03% de cardiolipina, 0,9% de colesterol e
0,21%+0,01% de lecitina. O antgeno armazenado
no escuro a temperatura ambiente (23-29C) ou
refrigerado a 2-8C, mas no deve ser congelado.
Nessas temperaturas, os componentes do antgeno
continuam em soluo. Garrafas ou frascos que
contm o precipitado devem ser descartados.

Formaldedo, neutro (ACS)

0,5mL

Na2HPO4, andrico

0,037g

KH2PO4

0,170g

NaCl

10,00g

gua destilada

1000,0mL

O pH da soluo deve ser mensurado e a soluo


armazenada em garrafas com tampa de rosca.
Nota: quando uma mudana inexplicvel ocorre na
reatividade dos controles, o pH da soluo salina deve
ser mensurado para determinar se esta seria a causa da
alterao. A soluo salina tamponada que estiver fora
do intervalo de 6,00,1 deve ser descartada.

2. Soluo salina tamponada para VDRL, pH 6,00,1


(NaCl a 1,0%). A soluo salina tamponada

Sfilis precoce
Primria

Sfilis tardia

Secundria

Latente precoce

Latente tardia

Terciria

Normalmente
positivo

Normalmente
positivo mas
tornando-se
negativo

Permanece
positivo

Resultado sem
alterao

No tratado

Negativo
tornando-se
positivo

Sempre positivo

Normalmente
positivo

Tratado com
sucesso

Tornando-se
negativo

Tornando-se
negativo

Tornando-se
negativo

Teste de anticorpo no treponmico positivo

Teste de anticorpo no treponmico negativo

Figura 10.4
Reatividade dos testes sorolgicos no treponmicos durante o curso da sfilis no tratada (quadrados) e resposta
dos testes acompanhando uma terapia bem sucedida (crculos), por estgio da doena.

Sfilis

127

3. Amostras de soro-controle. Soros reativos (R),


fracamente reativos (F) ou no reativos (N) nas
formas liofilizadas ou lquidas so usados como
controle no teste. Se testes quantitativos forem
realizados, um soro-controle, que pode ser titulado
a uma diluio de pelo menos 1:4, deve ser
utilizado.

9.

10. Recipientes para descarte; desinfetantes.


11. Luvas de ltex descartveis, culos de segurana e
roupa de proteo.

4. Acetona.

12. Proteo para lminas enquanto estiverem no rotor


para manter umidade e evitar o ressecamento.

5. lcool, etanol a 95%.

13. Seringas, 2mL ou 5mL.

6. Parafina.

Procedimentos do teste para espcimes de soro

7. Soluo salina a 0,9%. Adicione 0,9g de cloreto de


sdio seco para cada 100mL de gua destilada.

Preparao da suspenso do antgeno:


1.

Prepare uma suspenso de antgeno VDRL fresca


para cada dia. Enquanto a suspenso est sendo
preparada, mantenha a temperatura da soluo
salina tamponada, do antgeno e dos equipamentos
entre 23-29C.

2.

Dispense 0,4mL de soluo salina tamponada para


VDRL no fundo de uma garrafa com rolha redonda,
de 30mL, com o fundo de superfcie interna plana,
ou em um frasco com rolha de 25mL.

3.

Adicione 0,5mL da suspenso de antgeno VRDL


diretamente na soluo salina, enquanto gira a
garrafa de forma contnua, mas gentil, em uma
superfcie plana. O antgeno deve ser adicionado
gota a gota, num ritmo de aproximadamente seis
segundos para cada 0,5mL de antgeno.
A ltima gota do antgeno deve ser expulsa da
pipeta sem encost-la na soluo salina e a rotao
da garrafa deve continuar por 10 segundos.

8. Soluo salina a 10,0%. Adicione 10g de cloreto de


sdio seco para cada 100mL de gua destilada.
Equipamentos:

128

Microscpio binocular com oculares de 10x,


objetiva de 10x.

1.

Agulhas calibradas no descartveis sem bisel

a. Para teste sorolgico: calibre 18

b. Para teste do LCR: calibre 21 ou 22

2.

Garrafas, 30mL com fundo de superfcie interna


plana.

3.

Dispositivo para pipetagem de segurana com


pontas descartveis que liberem 50mL.

4.

Pipetas de 1,0mL, 5,0mL e 10,0mL.

4.

5.

Lminas para microscpio, medindo 5x7,5cm,


com 12 anis de parafina ou cermica de
aproximadamente 14mm de dimetro. Nota: os
anis devem ser altos o suficiente para prevenir o
derramamento durante a rotao.

5. Adicione 4,1mL de soluo salina tamponada.

6.

Suporte para lmina, para lminas de 5x7,5cm.

7.

Montador de anis, para fazer anis de parafina de


aproximadamente 14mm de dimetro (Cat.# 2600,
Eberback Corp., Ann Arbor, MI, EUA).

8.

Agitador mecnico ajustvel para 1802rpm,


circunscrevendo um crculo de 19mm de dimetro
em um plano horizontal.

6. Tampe a garrafa e agite-a aproximadamente 30


vezes em 10 segundos. A suspenso de antgeno
est, ento, pronta para o uso e pode ser utilizada
durante o dia de trabalho.
7.

Misture a suspenso de antgeno VDRL,


agitando-a gentilmente cada vez que for utiliz-la.
(A suspenso no deve ser misturada com
movimentos de trs para frente por meio de uma
seringa ou agulha, uma vez que isso pode causar a
quebra de partculas e perda da reatividade.)

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Teste qualitativo (soro):

Teste quantitativo (soro):

1.

1.

Prepare uma diluio dupla do soro a ser titulado.


Testes quantitativos para trs espcimes de soro
com diluies de at 1:8 podem ser realizados em
uma lmina.

2.

Realize o teste na diluio de duas vezes do soro


exatamente da mesma forma que para o teste
qualitativo.

3.

Analise os resultados microscopicamente, utilizando


oculares de 10x e uma objetiva de 10x, assim como
no teste qualitativo.

4.

Registre os ttulos da maior diluio que apresenta


resultado reativo (no fracamente reativo).

5.

Aps completar os testes do dia, descarte a


suspenso de antgeno e limpe a agulha e a seringa
lavando-as com gua, lcool e acetona, nessa
ordem. Remova a agulha da seringa aps limp-la.

2.

3.

4.

5.

Os testes de floculao em lmina para sfilis


so afetados pela temperatura ambiente. Para
resultados de teste confiveis e reprodutveis,
a suspenso de antgeno VDRL, controles e os
espcimes a serem testados devem ser mantidos a
temperatura ambiente, 23-29C, quando os testes
forem realizados.
Adicione 50L de soro a ser testado em cada anel
da lmina com anel de parafina ou cermica.
Segurando a agulha ou seringa de distribuio de
suspenso na posio vertical, dispense vrias
gotas do antgeno para descartar bolhas de ar
na agulha. Adicione, ento, uma gota (17L) da
suspenso de antgeno para cada anel contendo o
soro.
Posicione a lmina no rotor mecnico e gire-a
por quatro minutos a 1802rpm, debaixo de uma
proteo para manter a umidade atmosfrica e
evitar a evaporao em excesso.
Imediatamente aps girar, analise a lmina e anote
os resultados do teste.

6. Todos os espcimes de soro que produzirem


resultados reativos, fracamente reativos, ou no
reativos irregulares no teste de lmina qualitativo
VDRL devem ser testados quantitativamente e a
titulao do ponto final deve ser registrada.
Leitura e registro dos resultados:
1.

Analise as lminas microscopicamente, utilizando


oculares de 10x e objetivas de 10x.

2.

Registre os resultados como segue:

Leitura

Registro

Aglomerados mdios
ou grandes

Reativo (R)

Aglomerados
pequenos

Fracamente reativo (F)

Sem aglomerados
ou rugosidade muito
discreta

No reativo (N)

Nota: o teste VDRL o preferido para realizao


em LCR no diagnstico de neurossfilis. O teste
realizado de forma idntica quela utilizada para
soro. Entretanto, o espcime de LCR no deve ser
aquecido a 56C antes da realizao do teste.
10.3.1.2 Teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
As principais vantagens do RPR em relao ao VDRL
que o primeiro inclui o uso de um antgeno estabilizado,
o emprego de cartes no lugar de lminas e a adio
de partculas de carvo no antgeno como um indicador
de floculao. O antgeno no coberto por essas
partculas, mas o carvo preso na estrutura formada
pelo complexo antgeno-anticorpo nas amostras reativas,
tornando a reao visvel a olho nu. O teste pode ser
realizado em soro ou plasma no aquecido e conduzido
em crculos de 18mm em cartes plastificados. O
RPR constitui o teste no treponmico macroscpico
mais amplamente disponvel, sendo utilizado em todo
o mundo. A Figura 10.5 mostra o procedimento para
realizar o teste RPR.
Como uma modificao do RPR, o TRUST usa toluidina
vermelha no lugar de carvo para visualizar a reao
de floculao. Os reagentes do TRUST no precisam de

Sfilis

129

armazenamento refrigerado, ao contrrio dos utilizados


no teste RPR.

10.3.2 Testes sorolgicos treponmicos


Ao contrrio dos testes no treponmicos, os testes
treponmicos so considerados mais especficos.
Entretanto, foram relatados raros resultados
falso-positivos, que podem ser transitrios e de
causa desconhecida ou associados a distrbios
no tecido conjuntivo (11). de pouca importncia
o monitoramento de respostas terapia utilizando
testes treponmicos, uma vez que estes normalmente
permanecero positivos por toda a vida mesmo
aps a oferta de terapia eficaz (ver Figura 10.6).

Dessa forma, no h motivos para realizar ensaios


treponmicos quantitativos como parte dos
algoritmos de diagnstico. Uma vez que alguns testes
treponmicos podem se tornar reativos antes dos no
treponmicos (o teste FTA-Abs pode tornar-se reativo
em aproximadamente trs semanas aps a infeco),
alguns pacientes com infeco primria muito recente
podem resultar soronegativos para o teste no
treponmico e soropositivos para o teste treponmico.
Entretanto, deve-se tomar muito cuidado quanto
interpretao dos resultados desses testes sorolgicos,
uma vez que a identificao de um teste no treponmico
negativo e um treponmico positivo frequentemente
uma indicao de doena recente previamente tratada,

(A)

1.

Use luvas, jaleco e culos de


proteo quando estiver
manipulando espcimes e reagentes.

2.

Coloque o kit e todos os reagentes


necessrios em temperatura
ambiente.

4.

Prepare a folha de trabalho e


etiquete o carto de teste com a
identificao (ID) da amostra.

5.

Aspire 50L de amostra de soro para


o interior de uma ponteira de pipeta
de preciso ou dispensador.

7.

Espalhe as amostras e os controles


gentilmente dentro dos crculos,
utilizando a extremidade plana do
dispensador.

10. Manualmente, agite algumas vezes o


carto, gentilmente.

8.

Fixe a agulha do conta-gotas garrafa de


antgeno para RPR. Assegure-se de que o
antgeno esteja bem misturado. Adicione
uma gota do antgeno a cada crculo.

11. Use uma boa luz para interpretar os


resultados.

3.

Prepare o equipamento. Umedea


uma esponja e coloque-a na tampa
do agitador

6.

Dispense 50L (1 gota) do soro a ser


testado e controles em cada crculo
rotulado no carto de teste.

9.

Coloque o carto no agitador a


100rpm por oito minutos.

12. Registre os resultados em formulrios


apropriados.

Figura 10.5
Procedimentos para a realizao (A) e interpretao (B) do teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

130

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

a menos que existam sinais bvios de infeco primria


atual (ver e comparar Figura 10.4 e 10.6).
Todos os testes treponmicos atuais usam os lisados
completos de clulas de T. pallidum ou antgenos
recombinantes treponmicos, isolados ou misturados,
para detectar anticorpos contra componentes celulares
treponmicos especficos. Existem vrias plataformas
diferentes de testes utilizadas para a testagem sorolgica
treponmica, incluindo a IF indireta; o teste de aglutinao

(B)

Resultados qualitativos:

usando eritrcitos sensibilizados ou partculas de gelatina;


os ELISA, inclusive as variantes que utilizam a tecnologia
de quimioluminescncia e imunocromatografia (fluxo
lateral) ou testes POC. Entretanto, esses testes passveis
de automatizao, ou seja, alguns ELISA e ensaios de
quimioluminescncia, foram licenciados em alguns pases
para utilizao como testes de triagem iniciais e os testes
POC treponmicos so frequentemente utilizados como
o nico indicador de infeco, principalmente em lugares
com limitao de recursos.

Reativo
(Aglomerao/
surgimento de
aglutinao).

As amostras apresentando um grau de


Todas as amostras
reatividade igual ou maior em relao ao
reativas devem ser
controle minimamente reativo (Rm) so reativas
testadas por RPR
(R). Os trs crculos inferiores do lado direito do quantitativa para obter
carto so os controles: reativo R,
um nvel de titulao.
minimamente reativo Rm e no reativo N.

Minimamente reativo
(Leve aglomerao/
aglutinao)

No reativo
(Padro cinza suave)

Todas as amostras
reativas devem ser
testadas por RPR
quantitativa para obter
um nvel de titulao.

Relate como no reativo

Procedimentos do teste RPR quantitativo:

1.
1. Rotule um carto de teste com a
identificao (ID) das amostras e as
diluies em duas vezes seriadas. Cada
amostra ser testada sem estar diluda
(1:1) e diluda (1:2, 1:4, etc.).

2.
2. Adicione 50L de soluo salina a 0,9%
em cada crculo que conter a amostra
diluda ou o controle. NO adicione
soluo salina no primeiro crculo para
cada amostra (poo 1:1).

3.
3. Adicione 50L de amostra no primeiro
(1:1) e segundo (1:2) crculos.

4. Utilizando uma pipeta, misture os


espcimes com a gota de soluo
salina, movimentando o lquido para
cima e para baixo na ponteira da pipeta
5-6 vezes.

5. Transfira 50L dessa mistura (crculo 2)


para o prximo crculo (3) e repita o
passo da mistura at que a ltima
diluio seja realizada. Descarte os
ltimos 50L.

6. Siga os passos 7-12 na pgina 1 (RPR


qualitativo) e anote os resultados de
modo que os nveis de diluio sejam
registrados; isto , a maior diluio
reativa a 1:4 ser registrada como R4.

Resultados quantitativos:

Registre a diluio mais alta reativa. No caso acima, o


espcime 7 (primeira fileira) mostra a reatividade para a
diluio 1:1 e registrada como R1. O espcime 8 (segunda
fileira) um R4. Os trs crculos de baixo do lado direito do
carto so os controles: reativo R, minimamente reativo
Rm e no reativo N.

No caso acima, o espcime reativo at a diluio 1:64 e ser


registrado como R64. Se a diluio mais alta ainda for reativa,
deve-se continuar com a diluio do espcime: prepare um
novo carto de teste e estenda as diluies at que a mistura
em um crculo no seja reativa.

Figura 10.5 (continuao)


Procedimentos para a realizao (A) e interpretao (B) do teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Sfilis

131

Sfilis precoce
Primria

Sfilis tardia

Secundria

Latente precoce

Latente tardia

No tratado

Negativo
tornando-se
positivo

Sempre
positivo

Sempre
positivo

Sempre
positivo

Tratado com
sucesso

Permanece
positivo (se
inicialmente
positivo)

Permanece
positivo

Permanece
positivo

Permanece
positivo

Teste treponmico positivo

Terciria
Normalmente
positivo,
tornando-se
eventualmente
negativo

Resultado sem
alterao

Teste treponmico negativo

Figura 10.6
Reatividade dos testes sorolgicos treponmicos durante o curso da sfilis no tratada (quadrados) e resposta dos
testes acompanhando uma terapia bem-sucedida (crculos), por estgio da doena.

10.3.2.1 Teste de absoro do anticorpo


treponmico fluorescente (FTA-Abs)
O teste FTA-Abs foi considerado por muito tempo o
teste treponmico padro ouro, tendo sido, entretanto,
recentemente substitudo por testes mais sensveis,
com menos demandas tcnicas e subjetividade bem
menor. Tanto o desempenho do teste como a leitura
dos resultados devem ser verificados cuidadosamente.
Um microscpio de fluorescncia de boa qualidade,
experincia na leitura de resultados por parte do
executante, reagentes de qualidade e uma diluio
apropriada do conjugado so todos fatores crticos para
a confiabilidade do teste (Figura 10.7). Infelizmente,
resultados de FTA-Abs tanto falso-positivos como falsonegativos so comuns devido a erros laboratoriais e
leitura subjetiva do teste (14, 15). Veja a seguir o mtodo
detalhado.

132

Figura 10.7
Teste FTA-Abs positivo mostrando espiroquetas T.
pallidum fluorescentes.
Fonte: adaptado de Larsen et al., 1998 (3)

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Reagentes:

Reagentes a serem preparados:

1.

As lminas de antgeno do T. pallidum podem


ser obtidas comercialmente. Alternativamente, o
antgeno pode ser adquirido como uma suspenso
ou preparado a partir de T. pallidum (cepa Nichols)
extrado do tecido testicular de coelho e lavado
com soluo salina tamponada com fosfato (PBS,
do ingls phosphate-buffered saline solution) para
remover a globulina de rato. Guarde os frascos
fechados a 2-8C.

1.

Imunoglobulina anti-humana marcada com


isotiocianato de fluorescena (FITC, do ingls
fluorescein isothiocyanate).

O pH deve ser determinado e ajustado para pH 7,20,1


com NaOH 1N.

2.

2.

Soluo salina tamponada com fosfato (PBS, do


ingls phosphate-buffered saline solution). Deve
ser preparada utilizando a seguinte formulao em
gua destilada e armazenada em grandes volumes:
NaCl

7,65g

Na2HPO4

0,724

KH2PO4

0,21g

H2O destilada

1000mL

Tween 80 a 2,0% em PBS.


Aquea os reagentes a 56C em banho-maria.
Para 49mL de PBS estril, adicione 1mL de Tween
80. Ajuste o pH para 7,2 com NAOH 1N. Descarte
o reagente caso se forme um precipitado ou se
houver mudana no pH.

3.

Prepare o reagente absorvente a partir de


culturas de treponemas Reiter no patognicos,
normalmente sem a adio de conservante. O
reagente geralmente distribudo em volumes de
5mL e liofilizado ou mantido como suspenso.

4.

Soro controle reativo. Obtenha uma mistura


de soros humanos de doadores soropositivos
com reatividade 4+. Distribua a mistura de
soros em alquotas e armazene-os congelados,
preferencialmente a -70C ou menos. O soro
altamente reativo pode ser diludo apropriadamente
com soro no reativo para produzir um controle
minimamente reativo 1+. O controle 1+ exibe o
menor grau de fluorescncia relatado como reativo
e usado como um padro para leitura.

3.

Meio de montagem. Adicione uma parte de PBS, pH


7,2, para nove partes de glicerina (grau reagente).

Equipamentos:
1.

Estufa, 35-37C.

2.

Banho-maria, ajustvel para 56C.

3.

Centrfuga.

4.

Dispositivos para pipetagem de segurana.

Soro controle inespecfico. O soro controle


inespecfico uma mistura de soro obtida de
indivduos sem sfilis. Nenhum conservante
adicionado. Esse controle mostra uma reatividade
no especfica >2+ a uma diluio em PBS de 1:5
e, praticamente, nenhuma colorao quando diludo
no reagente absorvente em 1:5.

5.

Micropipetas de 10L e 200L.

6.

Ala bacteriolgica de platina padro com 2mm de

6.

7.

5.

dimetro, calibre 26.


7.

Papel absorvente.

8.

Placa de lminas com cmera mida e papel toalha.

leo de imerso no secante e de baixa


fluorescncia.

9.

Cubas de colorao de vidro ou plstico, com


porta-lminas removvel.

Acetona.

10. Lminas para microscpio, 1x3 polegadas, com


extremidade fosca, espessura de 1mm, com dois
crculos, dimetro interno de 1cm.
11. Lamnulas, no 1, 22mm2.

Sfilis

133

12. Tubos de teste (12x75mm) e suporte.


13. Recipientes para descarte e desinfetantes.
14. Luvas de ltex descartveis, culos de segurana e
roupa de proteo.

Imunoglobulina anti-humana marcada com


fluorescena (conjugado):
1.

Reidrate o conjugado marcado com FITC de acordo


com as instrues do fabricante. Se for observada
turvao, centrifugue a 500g por 10 minutos. Faa
alquotas de volumes pequenos e armazene-os a
-20C. O conjugado descongelado no deve ser
congelado novamente, mas armazenado a 2-8C.

2.

Prepare diluies seriadas em duplicata do novo


conjugado em PBS pH 7,2, contendo Tween 80 a
2%, de modo que as diluies incluam a titulao
sugerida pelo fabricante.

3.

Teste cada diluio do conjugado com o soro


controle reativo 4+ diludo em PBS em 1:5 e com a
diluio do controle reativo mnimo 1+ apropriado,
utilizando o procedimento de FTA-Abs descrito
adiante.

4.

Inclua um controle de colorao inespecfico em


cada diluio do conjugado.

5.

Prepare um conjugado testado previamente em sua


diluio de trabalho e realize testes com um sorocontrole reativo 4+, um soro controle minimamente
reativo 1+ e um controle de colorao inespecfico
com PBS para atuarem como controles ao testar
pela primeira vez um lote novo do conjugado.

6.

Leia as lminas de acordo com a seguinte ordem:

15. Microscpio de fluorescncia com ocular de 10x e


objetivas de 10x e 40x.
16. Agitador (vrtice).
Se as lminas de antgeno no forem adquiridas
comercialmente, elas podem ser preparadas a partir
de suspenses treponmicas, como descrito a seguir:
1.

Higienize as lminas com gaze limpa e armazene-as


em lcool.

2.

Se necessrio, reidrate o antgeno de acordo com


as instrues do fabricante. Armazene os frascos
abertos a 2-8C. Estes devem permanecer estveis
por uma semana.

3.

Misture vigorosamente as suspenses de antgeno


em um agitador (vrtice) por 10 segundos e
examine as amostras com um microscpio de
campo escuro para garantir que os treponemas
estejam distribudos adequadamente ( melhor
obter organismos nicos que amontoados) antes da
preparao das lminas para o teste FTA-Abs.

4. Prepare esfregaos bem finos do antgeno de T.


pallidum dentro de cada crculo, utilizando uma ala
de arame de 2mm. Coloque uma ala completa de
antgeno dentro dos dois crculos de 1cm e deixe
secar ao ar livre por, pelo menos, 15 minutos.
5.

Fixe as lminas em acetona por 10 minutos e


deixe-as secar ao ar livre. Armazene os esfregaos
fixados com acetona a -20C. Os esfregaos no
devem ser descongelados e congelados novamente.

Soluo absorvente
Reidrate a soluo absorvente com gua destilada estril
ou de acordo com as instrues do fabricante. Armazene
a soluo absorvente reidratada a 2-8C ou a -20C.
Ela pode ser utilizada enquanto apresentar reatividade
aceitvel e o produto no estiver contaminado.

134

a. Examine as trs lminas controle (descritas


acima no item 5) para garantir que os
reagentes e as condies de teste sejam
satisfatrias.
b. Examine as lminas de conjugados novos,
comeando pela de menor diluio do
conjugado, e registre as leituras como 1+, 2+,
3+ ou 4+.
c. A maior diluio o ponto final da titulao,
resultando em uma fluorescncia mxima 4+
com o soro controle reativo e uma leitura 1+
com a diluio 1+. A titulao de trabalho do
novo conjugado uma diluio de duas vezes
abaixo do ponto final e deve ser o ponto final
do controle minimamente reativo.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

d. O novo conjugado no pode colorir


inespecificamente trs diluies de duas vezes
abaixo da titulao de trabalho do conjugado.
e. Armazene o conjugado de acordo com o
fabricante e distribua-o em alquotas no
inferiores a 0,3mL a menos de -20C. Um
conjugado com uma diluio de trabalho de
1:1000 ou maior deve ser diludo em 1:10 com
PBS estril contendo 0,5 de albumina de soro
bovino e 0,1% de azida de sdio antes de ser
congelado.

11. Dilua a IgG anti-humana marcado com FITC sua


titulao de trabalho em PBS contendo Tween 80 a
2% e verta aproximadamente 30L do conjugado
diludo em cada esfregao.

f.

12. Repita os passos 9 e 10.

Verifique a titulao do conjugado aps o


armazenamento por vrios dias no congelador.

Procedimento do teste
1.

lminas na cuba de colorao contendo PBS por


cinco minutos e agite as lminas, colocando-as
dentro e fora do PBS, pelo menos 20 vezes.
Utilizando PBS fresco, repita o procedimento de
enxgue mais uma vez. Finalmente, enxague as
lminas por cinco segundos em gua destilada
corrente e passe levemente o papel absorvente.

Identifique as lminas de antgenos preparadas

13. Monte as lminas imediatamente, colocando uma


pequena gota de meio de montagem em cada
esfregao e sobrepondo uma lamnula.

previamente por meio da numerao da parte


fosca.

14. Coloque as lminas em uma cmara escura e


prossiga com a leitura em at quatro horas.

2.

Enumere cada tubo e lmina para corresponderem


ao soro teste e ao soro controle.

3.

Prepare as diluies dos soros controle reativo (4+),


minimamente reativo (1+) e inespecfico na soluo
absorvente ou em PBS, de acordo com o fabricante.

15. Verifique os esfregaos por microscopia de campo


escuro, utilizando primeiro uma lmpada de
tungstnio para verificar a presena de treponemas
no esfregao e, ento, analise-os em um
microscpio de fluorescncia, utilizando os filtros
apropriados para FITC.

4.

Pipete 200L de soluo absorvente em um tubo


de teste para cada soro-teste.

5.

Adicione 50L de soro-teste aquecido ao tubo


apropriado e misture.

6.

Cubra os esfregaos de antgeno adequados com


30L das diluies dos soros-controle reativo (4+),
minimamente reativo (1+) e inespecfico.

7.

Cubra os esfregaos de antgeno adequados com


30L de PBS e 30L de soluo absorvente para os
controles de colorao inespecficos.

8.

Cubra os esfregaos de antgeno adequados com


30L das diluies do soro teste.

9.

Coloque as lminas em uma cmara mida e


incube-as a 35-37C por 30 minutos, para evitar a
evaporao.

10. Coloque as lminas no suporte e enxague por cinco


segundos em PBS corrente. Ento, coloque as

10.3.2.2 Ensaios de aglutinao treponmicos


Os testes TPHA e TPPA so mais fceis de ser realizados
que o FTA-Abs e apresentam sensibilidade similar do
FTA-Abs. Esses ensaios de aglutinao so tambm
mais prticos que o teste FTA-Abs para o processamento
de lotes com grande nmero de espcimes. O TPHA
e, mais recentemente, o TPPA, surgiram como testes
confirmatrios treponmicos escolhidos por muitos
laboratrios. A Figura 10.8 mostra o procedimento de
execuo do teste TPPA. O mtodo para realizar o TPHA
semelhante.
10.3.2.3 Imunoensaios enzimticos (EIA) e ensaios de
quimioluminescncia (EQI) treponmicos
Os EIA e EQI para a deteco do anticorpo para T.
pallidum foram desenvolvidos ainda mais recentemente.
Suas sensibilidades e especificidades so comparveis
s do FTA-Abs e ensaios de aglutinao.
A maioria dos EIA treponmicos empregam tanto
antgenos de T. pallidum sonicados, um antgeno

Sfilis

135

recombinante treponmico, ou uma mistura de


recombinantes revestidos nos poos de placas de
microtitulao. Uma diluio do soro dos pacientes
adicionada a cada poo. Se anticorpos especficos para
T. pallidum estiverem presentes no soro, eles se ligaro
aos antgenos treponmicos. Aps lavar o excesso de
anticorpos, um conjugado composto por IgG de cabra
biotinilada anti-humana marcado com estreptavidinaperoxidase adicionado para detectar anticorpos
de ligao especfica. Aps um passo seguinte de
lavagem para remover qualquer excesso de conjugado,
um substrato de enzima adicionado para detectar o
complexo antgeno-anticorpo-conjugado. Uma reao
de colorao ocorre caso o paciente tenha anticorpos
para o(s) antgeno(s) de T. pallidum. A intensidade do
aparecimento da cor diretamente proporcional
concentrao de anticorpos presente. A mudana de cor
lida utilizando um leitor de placas.
Em alguns EIA, utiliza-se uma abordagem diferente para
a deteco de anticorpos especficos. Os antgenos
recombinantes treponmicos especficos com 15kD,
17kD, 44,5kD e 47kD so imobilizados nos poos de
microplacas. O soro do paciente ento adicionado
aos poos e, se houver presena de anticorpos
antitreponmicos, eles se ligaro especificamente aos
antgenos imobilizados. Todas as protenas no ligadas
so ento removidas durante a fase de lavagem. Os
mesmos antgenos recombinantes que foram conjugados
peroxidase de rbano so adicionados aos poos
da placa. Aps um passo seguinte de lavagem para
remover os conjugados no ligados, adiciona-se um
substrato cromognico peroxidase. A mudana de cor
resultante medida espectrofotometricamente aps se
adicionar uma soluo de parada. A intensidade da cor
proporcional quantidade de anticorpos presentes
no soro do paciente. Como um resultado dessa
configurao, a especificidade e a sensibilidade do teste
so superiores s dos ELISA treponmicos de primeira
gerao.
Os EQI para detectar os anticorpos treponmicos
so quase que exclusivamente utilizados em grandes
laboratrios clnicos em pases industrializados, onde
o custo de mo de obra alto e se prev uma grande
demanda de espcimes. Esses ensaios ora usam o
princpio de ligao de um anticorpo especfico a prolas

136

revestidas por antgeno e subsequente deteco das


prolas que foram marcadas com ficoeritrina conjugada
a IgG de cabra anti-humana, ora detectam os anticorpos
utilizando um conjugado de isoluminol-antgeno para
gerar emisso de quimioluminescncia, que detectada
por um sistema fotomultiplicador sofisticado (16).
Devido ao grande nmero de EIA e EQI disponveis
comercialmente no mundo, uma descrio detalhada do
procedimento do teste para cada fabricante est alm
do escopo deste captulo. Dessa forma, solicita-se que
o leitor siga as instrues includas no manual fornecido
pelo fabricante em cada kit.
10.3.2.4 Ensaios de western blot treponmicos
O teste WB treponmico tem sido utilizado como um
teste confirmatrio para anticorpos treponmicos no
soro de pacientes com sfilis. Antgenos individuais
de T. pallidum so fracionados por eletroforese de
poliacrilamida de lisados celulares totais. As bandas de
polipeptdeos resolvidas de vrias massas moleculares
so, ento, transferidas para folhas de membrana
de nitrocelulose. Essas folhas so secas e cortadas
em tiras para ser utilizadas em amostras de soro
individuais. O soro de um paciente diludo e incubado
com cada tira. Se houver presena de anticorpos IgM
especficos para T. pallidum na amostra, eles se ligaro
a um ou mais antgenos de peso molecular 15kD, 17kD,
44,5kD e 47kD na tira. Qualquer anticorpo no ligado
removido por lavagem.
Os anticorpos ligados so detectados com fosfatase
alcalina conjugada IgG ou IgM anti-humana. A tira ,
ento, lavada para remover o excesso de conjugados e,
finalmente, reage com um precipitado desenvolvendo
uma soluo que forma bandas de antgeno roxas. A
reatividade nas bandas especficas dos antgenos de
15kD, 17kD e 47kD considerada significativa (Figura
10.9). Em contraste, a reatividade em outras posies
da tira no considerada significativa. Os WB foram
utilizados no passado para estudar a resposta imune
sfilis (17, 18) e, subsequentemente, para selecionar os
antgenos adequados a ser includos nos imunoensaios
em linha.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

(A)

Verifique o kit antes de utiliz-lo. Coloque todos os espcimes e reagentes em temperatura ambiente. Anote o nmero do
lote e a data de validade.
Sempre use as medidas universais de segurana quando estiver manipulando espcimes.
Tempo de execuo: aproximadamente uma hora. O nmero mximo de espcime/placa de 21.

Este guia no tem a inteno de substituir o manual do produto ou seu procedimento operacional padro (POP).

Use luvas, jaleco e culos de


proteo quando estiver
manipulando espcimes e reagentes.

Identifique a folha de trabalho e as


placas de microtitulao com a
identidade das amostras (ID). Divida cada
placa de modo que cada espcime
ocupe um conjunto de quatro poos
consecutivos. O controle positivo
ocupar toda a primeira fileira (oito
poos). O controle negativo ocupar
quatro poos.

Reconstitua os reagentes contendo


partculas sensibilizadas e no
sensibilizadas. Misture gentilmente para
garantir a ressuspenso completa.

Cubra a placa com um protetor e


misture por 30 segundos.

Prepare os materiais necessrios


(kit, agitador de placa, pipetas, placa
de microtitulao em formato de U).

Coloque o kit e todos os reagentes


necessrios em temperatura
ambiente antes de utiliz-los.

Adicione 100L de diluente de amostra


para TPPA no primeiro poo de cada
conjunto de espcime e controle.
Adicione 25L de diluentes de amostra
para TPPA nos poos restantes da
placa.

Inverta a amostra de soro para


mistur-la. Adicione 25L de amostra
no primeiro poo de cada conjunto
de espcime. Misture pipetando para
cima e para baixo 5-6 vezes.
Transfira 25L para o segundo poo
e misture 5-6 vezes. Repita para o
poo 4, descartando 25L do poo 4
de cada espcime.

Adicione uma gota (25L) de partculas


no sensibilizadas (tampa cinza) ao
terceiro poo de cada amostra e
controle.

Incube por duas horas em


temperatura ambiente.

Adicione uma gota (25L) de partculas


sensibilizadas (tampa vermelha) ao
quarto poo de cada amostra e aos
poos 5-8 do controle positivo.

Leia, interprete e registre os


resultados nos formulrios
apropriados.

Figura 10.8
Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) do ensaio de aglutinao passiva de partculas
para Treponema pallidum (TPPA).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

10.3.2.5 Imunoensaios em linha


Os imunoensaios em linha para sfilis so designados
como testes confirmatrios treponmicos. Eles so
planejados para uso como testes suplementares quando
os resultados dos testes treponmicos de rotina so
ambguos. Quatro protenas recombinantes, TpN47,
TpN17, TpN15 e TmpA, so revestidas como linhas em

tiras de membrana de nitrocelulose com um suporte de


plstico rgido. O soro do paciente adicionado s tiras
dos testes. Se anticorpos especficos para T. pallidum
estiverem presentes nas amostras, eles se ligaro s
linhas de antgenos individuais (19). Aps lavar qualquer
excesso de soro, adiciona-se uma IgG ou IgM de cabra
anti-humana, marcada com fosfatase alcalina, a qual

Sfilis

137

(B)
O controle positivo
ocupa toda a
primeira fileira.
O controle
negativo ocupa
quatro poos
consecutivos.
Cada espcime
ocupa quatro
poos
consecutivos.

Adicione
partculas
sensibilizadas.

Adicione
partculas no
sensibilizadas.

Interpretao dos resultados de TPPA


Diluio do
controle
positivo

Interpretao

Clulas-teste

Clulas-controle

Positivo

Padro de organizao
Anel grande definido com uma margem externa
irregular multiforme e aglutinao perifrica, ou
partculas aglutinadas espalhadas, cobrindo
uniformemente o fundo do poo.
As partculas se concentram no formato de um
boto no centro do poo, com uma margem
externa suave e arredondada.

Negativo
As partculas se concentram no formato de um
anel compacto, com uma margem externa suave
e arredondada.

Inespecfico
O uso de nome e recursos comerciais apenas para a identificao e no implica apoio pela OMS.

Figura 10.8 (continuao)


Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) do ensaio de aglutinao passiva de partculas
para Treponema pallidum (TPPA).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
se ligar a qualquer complexo antgeno-anticorpo de
sfilis formado. A adio subsequente de um substrato
para a enzima produz linhas de cor marrom-escura, cuja
densidade proporcional concentrao de anticorpos

138

especficos presentes na amostra. Quando no h


anticorpos para T. pallidum presentes, pode aparecer
apenas uma cor de fundo padro.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

10.3.2.6 Testes POC para sfilis


Mundialmente, existem vrios fabricantes para testes de
diagnstico POC para sfilis. Esses testes so geralmente
formatados seja como testes de fita com fluxo lateral,
seja como dispositivos de escoamento. No formato
de fluxo lateral, um ou mais antgenos recombinantes
so distribudos em uma tira imunocromatogrfica de
nitrocelulose para capturar anticorpos treponmicos
especficos e uma linha colorida produzida ao associar
imunoglobulina anti-humana ligada a uma enzina, ouro
coloidal ou partculas de ltex coloridas.
Uma linha de controle separada incorporada ao teste,
atuando tanto como um controle de procedimento
(em alguns testes) ou indicando a adequao do
espcime (por meio da indicao da presena de
imunoglobulina humana inespecfica no espcime
do paciente) (20-22). Em formato de escoamento,
pontos de antgenos substituem as linhas, e a ligao
do anticorpo especfico ao antgeno ocorre durante a
passagem pela membrana ao invs da passagem lateral
ao longo da tira de membrana. Todos esses testes
fornecem uma identificao rpida de exposio prvia
infeco por treponema e vm sendo convenientemente
utilizados na triagem de mulheres grvidas em pases
em desenvolvimento para prevenir a sfilis congnita.
O uso desses testes para a triagem de sfilis durante
a gravidez mostrou-se extremamente econmico (23)
e surgiu como um componente-chave da Estratgia
Cont

da Organizao Mundial da Sade para a Eliminao


Global da Sfilis Congnita (24). O uso desses testes
simples permite a triagem e o tratamento no mesmo
dia em clnicas perifricas distantes dos laboratrios.
Esses testes podem ser realizados utilizando o sangue
completo (obtido por uma picada no dedo), plasma ou
soro e no necessitam de equipamentos especiais (a
exemplo de refrigerador ou centrfuga). Embora sejam
de fcil execuo, necessria a adeso rigorosa s
instrues do fabricante para garantir sua preciso. A
adoo de testes POC em clnicas requer a superviso
contnua por um laboratrio de referncia, incluindo o
estabelecimento de um programa de avaliao externa
da qualidade.
Alm das aplicaes de triagem, esses testes podem ser
utilizados para confirmar a especificidade dos testes no
treponmicos reativos no lugar de ensaios treponmicos
laboratoriais mais complexos. importante notar que o
uso desses testes treponmicos rpidos sozinhos (isto
, sem a subsequente confirmao no treponmica dos
testes rpidos reativos), inevitavelmente, resultar em
tratamento excessivo, uma vez que, assim como todos
os testes treponmicos, eles provavelmente continuaro
reativos por toda a vida, mesmo aps a realizao
de tratamento bem-sucedido. Idealmente, um teste
quantitativo no treponmico deve ser realizado visando
aumentar a especificidade do diagnstico da infeco
ativa e servir de base para monitorar o tratamento. Pela
mesma razo, esses testes rpidos treponmicos no
+

Cont

Figura 10.9
Deteco de anticorpos para Treponema pallidum por western blot (WB).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Sfilis

139

podem ser utilizados sozinhos para a sorovigilncia


de sfilis, a menos que um teste no treponmico seja
realizado em todos os casos reativos na triagem por
teste rpido; somente aqueles duplamente reativos sero
considerados casos de infeco.
A Figura 10.10 mostra um exemplo de procedimento a
ser seguido e os resultados que podem ser obtidos em
um teste rpido treponmico de fluxo lateral. Para outros
tipos de dispositivo, devem-se seguir precisamente
as instrues do fabricante. Ambos os formatos de
escoamento ou de fluxo lateral permitem a realizao
de ensaios multiplex. Como resultado, testes POC
imunocromatogrfico duplo treponmico/HIV esto
atualmente em desenvolvimento.
importante ressaltar que, atualmente, existe
pelo menos um teste POC duplo no treponmico/
treponmico disponvel comercialmente em algumas
regies do mundo (25, 26). Ao detectar tanto anticorpos
treponmicos como no treponmicos (Figura 10.11),
prev-se que esses testes reduziro fortemente as taxas
de tratamento excessivo inerentes ao teste rpido atual e
permitiro que um nico dispositivo POC seja usado para
a sorovigilncia de sfilis.

10.3.3 Uso apropriado de testes sorolgicos


para sfilis
A Tabela 10.1 mostra a sensibilidade e a especificidade
de testes para sfilis no treponmicos e treponmicos,
para as diferentes fases da doena.
A abordagem convencional para o teste sorolgico de
sfilis envolve a triagem do soros com um teste no
treponmico de baixo custo, sensvel, mas relativamente
menos especfico e trabalhoso e, se este gerar
resultado reativo, realiza-se a confirmao por meio
de um teste treponmico mais especfico, porm mais
caro. Ao longo dos anos, essa abordagem mostrou-se
eficiente, principalmente em lugares nos quais a
doena frequentemente encontrada. A subsequente
titulao do soro reativo confirmado, utilizando um teste
no treponmico quantitativo, tambm fornece uma
interpretao mais precisa desses resultados, com uma
mensurao da linha de base (ttulo) em relao qual
se pode avaliar a eficcia da terapia.

140

O desenvolvimento recente de ELISA e EQI treponmicos


com possibilidade de automao resultou em uma
mudana nessa abordagem, particularmente em
muitos laboratrios com grandes demandas em
pases industrializados, nos quais o custo de mo de
obra alto e a soroprevalncia baixa, tais como em
bancos de sangue. Assim, a triagem de lotes de soros
realizada por meio de um desses testes ELISA ou
EQI mais recentes e, somente se um soro for reativo,
realiza-se um teste no treponmico. Se tanto os testes
treponmicos como no treponmicos forem reativos, tal
como anteriormente descrito, deve-se realizar um teste
no treponmico quantitativo.
Essas duas abordagens devem, teoricamente, produzir
o mesmo resultado. Entretanto, a segunda abordagem
resulta na deteco de testes treponmicos positivos
e testes no treponmicos negativos, que no foram
detectados pela abordagem convencional (27 ). Uma
vez que esse padro de reatividade sorolgica pode
ser encontrado na sfilis primria recente, na doena
primria previamente tratada e raramente na infeco
terciria tardia, deve-se dar considervel ateno aos
resultados do exame fsico de pacientes, histria prvia
da doena e ao risco sexual recente, antes de qualquer
tratamento e notificao do parceiro.
Os laboratrios devem considerar os seguintes fatores
antes de escolher a abordagem mais apropriada
(frequentemente em termos de custo-benefcio) para
fornecer servios sorolgicos de sfilis a uma populao
em particular, a saber: o nmero de soros triados para
sfilis em um determinado lugar; a soroprevalncia de
sfilis (tanto treponmica quanto no treponmica);
o custo da aquisio de equipamentos para ELISA e
EQI; o custo dos kits para testes no treponmicos e
treponmicos; e o custo da mo de obra.
Nos casos em que se detectarem reaes
indeterminadas em qualquer dos testes, estes devem
ser repetidos, se possvel, no espcime de um soro
novo. Se os ensaios iniciais no resultarem reativos e
caso se suspeite de sfilis primria, os testes devem
ser repetidos aps 2-3 semanas em uma nova amostra
de soro. Finalmente, alguns pacientes que receberam
o devido tratamento logo no incio da infeco primria
permanecero negativos para o teste de anticorpo.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

(A)

Verifique o kit antes de utiliz-lo. Use apenas os itens no expirados e no danificados.


Sempre use as medidas universais de segurana quando estiver manipulando espcimes. Mantenha a rea de trabalho limpa e organizada.

Este guia no tem a inteno de substituir o manual do produto ou seu procedimento operacional padro (POP).

Separe os itens do teste e todos os


outros materiais de laboratrio
necessrios.

Abra um envelope laminado do teste.

Realize a puno digital ou venosa.

Colete 20L de sangue total. Para a


puno digital, use duas gotas de sangue
da ponta do dedo. Para a puno venosa,
abra um tubo para a coleta de sangue a
vcuo (Vacutainer) e utilize uma pipeta de
preciso.

Adicione 3 gotas do diluente do


ensaio no espcime sobre a
almofada.

Espere 10 minutos e leia,


imediatamente, os resultados.

Identifique a tira do teste com o


nmero de identificao do paciente.

Aplique o espcime na almofada


absorvente da tira.

Leia e registre os resultados e outras


informaes pertinentes no
questionrio do estudo.

Figura 10.10
Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) de um teste rpido treponmico de fluxo lateral.
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
A sororreverso dos testes no treponmicos em
pacientes devidamente tratados ocorre normalmente
dentro de um perodo de seis meses a alguns anos
e est associada durao da infeco e titulao
de anticorpos no soro no momento da terapia (28).
Entretanto, em alguns indivduos, principalmente
naqueles que receberam tratamento 1-2 anos aps
o incio da infeco, os anticorpos no treponmicos
podem persistir por longos perodos, mesmo aps o uso
de terapia adequada. Esses indivduos so conhecidos
como soro-rpidos. A sororreverso de testes
treponmicos pode ocorrer tambm em uma minoria dos
pacientes em poucos anos.

10.4 Diagnstico laboratorial de sfilis congnita


Qualquer leso na pele ou membrana mucosa presente
em um recm-nascido de me soropositiva deve ser
examinada por microscopia de campo escuro, IF direta
ou PCR para obter evidncias diretas de infeco por
T. pallidum. Treponemas saprfitos no aparecem na
boca do neonato at, aproximadamente, seis semanas
aps o nascimento. Assim, existe pouca chance de obter
resultados falso-positivos a partir de espcimes orais.
A deteco de um teste sorolgico reativo em um
neonato pode ser resultado de transferncia passiva
de anticorpos maternais atravs da placenta durante

Sfilis

141

(B)

Positivo

Aparecem duas linhas de qualquer intensidade em ambas as reas de controle e do paciente.

Negativo

Aparece uma linha na rea do controle e nenhuma linha na rea do paciente.

Invlido

No aparece linha na rea do controle.


No registre resultados invlidos. Repita o teste com um novo dispositivo de teste.

Invlido

Nenhuma linha aparece na rea de controle e aparece uma linha na rea do paciente.
No registre resultados invlidos. Repita o teste com um novo dispositivo de teste.

Figura 10.10 (continuao)


Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) de um teste rpido treponmico de fluxo lateral.
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Tabela 10.1 Caractersticas de desempenho de testes sorolgicos para sfilis selecionados, por estgio da
doena
Sensibilidade (%)
Estgio da infeco por sfilis
Teste

Primria

Secundria

Latente

Terciria

Especificidade (%)

FTA-Abs

98 (93-100)

100

100

96

99

TPHA/PA

82 (69-90)

100

100

94

99

RPR

86 (81-100)

100

80 (53-100)

73 (36-96)

98

VDRL

80 (74-87)

100

80 (71-100)

71 (37-94)

98

FTA-Abs: absoro do anticorpo treponmico fluorescente; TPHA: ensaio de hemaglutinao para Treponema pallidum; TPPA: ensaio de
aglutinao passiva de partculas para Treponema pallidum; RPR: reagina plasmtica rpida; VDRL: Laboratrio de Pesquisa de Doenas Venreas.

a gravidez, o que no pode ser considerado um


diagnstico. Entretanto, a identificao de ttulos por
RPR/VDRL significativamente superiores (isto , 4
vezes maior) no soro de um neonato comparados
titulao materna, ou a deteco de um aumento
significativo dos ttulos por RPR/VDRL durante

142

um perodo de trs meses, foram previamente


considerados indicadores de infeco congnita.
As verses modificadas dos testes FTA-Abs (FTA-IgM),
EIA especficos e imunoensaios em linha que detectam
somente IgM podem ser utilizadas para detectar IgM
antitreponmico especfico, o qual no capaz de

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

atravessar a barreira placentria. A identificao desses


anticorpos IgM na circulao do beb uma indicao de
infeco congnita, mas o IgM especfico no pode ser
detectado em todos os casos da doena congnita (29).
Testes de IF indireta para IgM especficos apresentam
especificidade notoriamente baixa e o teste FTA-IgM,
assim como o teste FTA-Abs, inerentemente subjetivo.
Alm disso, as colunas usadas para separar as fraes
de imunoglobulinas na utilizao do teste 19S-FTA-IgM,
o qual substituiu em grande parte o teste FTA-IgM, no
esto mais disponveis em muitos pases.

Em EIA para IgM especfico, o anticorpo IgM de coelho


anti-humano (cadeia especfica) colocado nos poos
de placas de microtitulao. Uma diluio mensurada
do soro do paciente adicionada aos poos da placa. A
IgM de coelho anti-humana captura qualquer anticorpo
IgM disponvel no soro do paciente. O antgeno de T.
pallidum purificado adicionado aos poos da placa,
e seu excesso lavado. Uma mistura de antissoro
anti-T. pallidum biotinilado humano ou de coelho e
estreptavidina conjugada peroxidase de rbano
adicionada aos poos da placa. Aps lavar os complexos

No reativo
Somente a linha do
controle

Reativo confirmado
3 linhas

Reativo (2 linhas)
Treponmico e controle
(caso antigo ou tratado)

Reativo (2 linhas)
No treponmico e controle
(falso-positivo)

Figura 10.11
Teste point-of-care (POC) duplo, no treponmico/treponmico, indicando os padres de reatividade e as
possveis interpretaes.
no ligados, adiciona-se o substrato enzimtico e os
indicadores cromognicos. Se o soro contm anticorpos
IgM especficos para T. pallidum, ocorrer uma reao
colorida, com a intensidade de cor proporcional
concentrao de anticorpos presentes.

10.5 Neurossfilis
Anormalidades no LCR so comuns em pacientes
com sfilis precoce que no apresentam sintomas
neurolgicos. Enquanto uma grande proporo desses

casos possuem treponemas no sistema nervoso central,


eles no precisam do tratamento reforado necessrio
para a neurossfilis (30). Consequentemente, a puno
lombar de rotina no realizada rotineiramente para
sfilis precoce, a menos que indicado clinicamente.
Entretanto, quando indicado, os espcimes de LCR
devem ser examinados para protena total e contagem
de leuccitos, realizando-se tambm o teste VDRL-LCR.
Esse ltimo apresenta alta especificidade (99-100%),
mas baixa sensibilidade para neurossfilis (31, 32).

Sfilis

143

Assim, enquanto o teste VDRL-LCR reativo um


indicador de neurossfilis, um teste no reativo no pode
ser utilizado como um meio de excluir a possibilidade de
neurossfilis. Por outro lado, o teste FTA-Abs para LCR
apresenta alta sensibilidade, mas baixa especificidade
para neurossfilis, devido transferncia passiva de
anticorpos IgG especficos atravs da barreira hematoenceflica. Assim, quando se obtm um resultado
negativo no teste FTA-Abs para LCR, existe uma alta
probabilidade de excluso de neurossfilis (33).

10.6 Deteco de IgM anti-treponmico no soro


adulto
Como em outras infeces bacterianas e virais, na sfilis,
a sntese de anticorpos IgM especficos a primeira
resposta imune humoral ps-infeco. Entretanto, o
anticorpo treponmico IgM no est apenas presente em
pacientes com sfilis precoce, mas tambm encontrado
durante o perodo latente e em pacientes com doena
tardia. Esse fenmeno limita o valor dos ensaios para
IgM especfico no diagnstico da doena em adultos.

10.7 Referncias
1.

Pillay A et al. Laboratory-confirmed case of yaws


in a 10-year-old boy from the Republic of the
Congo. Journal of Clinical Microbiology, 2011,
49(11):40134015.

2.

Sparling PF et al. Clinical manifestations of syphilis.


In: Holmes KK et al., eds. Sexually transmitted
diseases, 4th ed. New York, McGraw-Hill Medical,
2008:661684.

3.

Larsen S et al. A manual of tests for syphilis,


9th ed. Washington, DC, American Public Health
Association, 1998.

4.

Wheeler HL, Agarwal S, Goh BT. Dark ground


microscopy and treponemal serological tests in the
diagnosis of early syphilis. Sexually Transmitted
Infections, 2004, 80(5):411414.

5.

6.

144

Hook EW III et al. Detection of Treponema


pallidum in lesion exudate with a pathogenspecific monoclonal antibody. Journal of Clinical
Microbiology, 1985, 22(2):241244.
Chen CY et al. Diagnosis of gastric syphilis by
direct immunofluorescence staining and real-time

PCR testing. Journal of Clinical Microbiology, 2006,


44(9):34523456.
7.

GayetAgeron A et al. Assessment of a realtime


PCR test to diagnose syphilis from diverse biological
samples. Sexually Transmitted Infections, 2009,
85(4):264269.

8.

Liu H et al. New tests for syphilis: rational design


of a PCR method for detection of Treponema
pallidum in clinical specimens using unique regions
of the DNA polymerase I gene. Journal of Clinical
Microbiology, 2001, 39(5):19411946.

9.

Marfin AA et al. Amplification of the DNA


polymerase I gene of Treponema pallidum from
whole blood of persons with syphilis. Diagnostic
Microbiology and Infectious Diseases, 2001,
40(4):163166.

10. Orle KA et al. Simultaneous PCR detection of


Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, and
herpes simplex virus types 1 and 2 from genital
ulcers. Journal of Clinical Microbiology, 1996,
34(1):4954.
11. Larsen SA, Steiner BM, Rudolph AH. Laboratory
diagnosis and interpretation of tests for syphilis.
Clinical Microbiology Reviews, 1995, 8(1):121.
12. Ratnam S. The laboratory diagnosis of syphilis.
Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical
Microbiology, 2005, 16(1):4551.
13. Nandwani R, Evans DT. Are you sure its syphilis?
A review of false positive serology. International
Journal of STD and AIDS, 1995, 6(4):241248.
14. Aktas G et al. Evaluation of the fluorescent
treponemal antibody absorption test for detection
of antibodies (immunoglobulins G and M) to
Treponema pallidum in serologic diagnosis of
syphilis. International Journal of STD and AIDS,
2007, 18(4):255260.
15. Egglestone SI, Turner AJ. Serological diagnosis of
syphilis. PHLS Syphilis Serology Working Group.
Communicable Diseases and Public Health, 2000,
3(3):158162.
16. Marangoni A et al. Evaluation of LIAISON Treponema
screen, a novel recombinant antigen-based
chemiluminescence immunoassay for laboratory
diagnosis of syphilis. Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology, 2005, 12(10):12311234.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

17. Baker-Zander SA et al. Antigens of Treponema


pallidum recognized by IgG and IgM antibodies
during syphilis in humans. Journal of Infectious
Diseases, 1985, 151(2):264272.
18. Moskophidis M, Mller F. Molecular analysis of
immunoglobulins M and G immune response
to protein antigens of Treponema pallidum in
human syphilis. Infection and Immunity, 1984,
43(1):127132.
19. Lam TK et al. Comparative evaluation of the
INNO-LIA syphilis score and the MarDx Treponema
pallidum immunoglobulin G Marblot test assays for
the serological diagnosis of syphilis. International
Journal of STD and AIDS, 2010, 21(2):110113.
20. Zarakolu P et al. Preliminary evaluation of an
immunochromatographic strip test for specific
Treponema pallidum antibodies. Journal of Clinical
Microbiology, 2002, 40(8):30643065.
21. Diaz T et al. Evaluation of the Determine Rapid
Syphilis TP assay using sera. Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology, 2004, 11(1):98101.
22. Peeling RW, Ye H. Diagnostic tools for preventing
and managing maternal and congenital syphilis: an
overview. Bulletin of the World Health Organization,
2004, 82(6):439446.
23. Rydzak CE, Goldie SJ. Cost-effectiveness of
rapid point-of-care prenatal syphilis screening in
sub-Saharan Africa. Sexually Transmitted Diseases,
2008, 35(9):775784.

20052006. MMWR Morbidity and Mortality Weekly


Report, 2008, 57(32):872875.
28. Romanowski B et al. Serologic response to
treatment of infectious syphilis. Annals of Internal
Medicine, 1991, 114(12):10051009.
29. Bromberg K, Rawstron S, Tannis G. Diagnosis
of congenital syphilis by combining Treponema
pallidum-specific IgM detection with
immunofluorescent antigen detection for T.
pallidum. Journal of Infectious Diseases, 1993,
168(1):238242.
30. Rolfs RT et al. The Syphilis and HIV Study Group.
A randomized trial of enhanced therapy for early
syphilis in patients with and without human
immunodeficiency virus infection. New England
Journal of Medicine, 1997, 337(5):307314.
31. Davis LE, Schmitt JW. Clinical significance of
cerebrospinal fluid tests for neurosyphilis. Annals of
Neurology, 1989, 25(1):5055.
32. Castro R, Prieto ES, da Luz Martins Pereira
F. Nontreponemal tests in the diagnosis of
neurosyphilis: an evaluation of the Venereal Disease
Research Laboratory (VDRL) and the Rapid Plasma
Reagin (RPR) tests. Journal of Clinical Laboratory
Analysis, 2008, 22(4):257261.
33. Jaffe HW et al. Tests for treponemal antibody
in CSF. Archives of Internal Medicine, 1978,
138(2):252255.

24. Schmid GP et al. The need and plan for global


elimination of congenital syphilis. Sexually
Transmitted Diseases, 2007, 34(7):S5S10.
25. Castro AR et al. Novel point-of-care test for
simultaneous detection of nontreponemal
and treponemal antibodies in patients with
syphilis. Journal of Clinical Microbiology, 2010,
48(12):46154619.
26. Yin YP et al. A dual point-of-care test shows
good performance in simultaneously detecting
nontreponemal and treponemal antibodies in
patients with syphilis: a multisite evaluation study
in China. Clinical Infectious Diseases, 2013,
56(5):659665.
27. Centers for Disease Control and Prevention. Syphilis
testing algorithms using treponemal tests for
initial screeningfour laboratories, New York City,

Sfilis

145

Captulo 11
Linfogranuloma venreo (LGV)
11.1 Introduo
O linfogranuloma venreo (LGV) uma das trs doenas
sexualmente transmissveis tropicais clssicas. Ele
causado pela biovariante tpica L de Chlamydia
trachomatis, a qual apresenta as sorovariantes (L1, L2,
L2a, L2b e L3), mais invasivas do que as responsveis
pela infeco clssica nos olhos por tracoma
(sorovariantes A-C) e por uretrite no gonoccica, e
por infeces associadas ao trato genital (sorotipos
D-K). O LGV apresenta uma distribuio mundial,
sendo, porm, mais prevalente em pases tropicais e
subtropicais; por exemplo, endmico em partes do
Leste e do Oeste da frica, ndia, Sudeste da sia,
Amrica do Sul e Caribe. Na maioria dos casos, essas
observaes epidemiolgicas so relacionadas
apresentao clnica clssica de LGV, que se caracteriza
por uma linfadenopatia inguinal, com ou sem leso
primria associada (1). Esses sintomas so mais
comumente referidos em homens que em mulheres.
Em 2003, foram relatadas infeces retais por LGV,
com comprometimento caracterstico do linfonodo e/ou
proctite ou proctocolite, em homens que fazem sexo com
homens (HSH) na Holanda (2). Relatos subsequentes
foram realizados em muitos outros pases europeus,
alm da Amrica do Norte, Austrlia e outros, nos quais
anteriormente se registraram apenas casos espordicos
e importados de LGV (3-5). O nmero de C. trachomatis
no reto pertencentes ou no s biovariantes do LGV
continua desconhecido, devido carncia de triagem e
ao uso disseminado de um teste discriminatrio.
Classicamente, o LGV apresenta uma leso primria
transitria herpetiforme na genitlia externa; porm,
em muitos casos, a leso pode passar despercebida,
manifestar-se como uma uretrite no gonoccica aguda
em homens ou ser completamente assintomtica em
mulheres, como resultado da infeco primria do colo
do tero. Muitos casos necessitam de ateno mdica
quando ocorre infeco dos gnglios linfticos regionais,
como resultado da disperso linftica do organismo
causador. Em homens, o inchao das glndulas inguinais

ou femurais resulta frequentemente na formao


de nguas supurantes em um ou ambos os lados do
ligamento inguinal (o indcio de sulco, que pode ser
observado em uma minoria dos casos de pacientes
com cancro) (1). Em mulheres, a glndula plvica
profunda e a perirretal podem ser comprometidas se as
leses primrias forem encontradas no colo do tero,
e a paciente pode apresentar sintomas relacionados
doena inflamatria plvica (PID, do ingls pelvic
inflammatory disease).
Os HSH podem apresentar uma proctite ou proctocolite
ulcerativa severa com dor no reto, corrimento
sanguinolento, anuscopia nitidamente anormal, febre e
linfadenopatia (6,7 ). Tal como em mulheres, que tambm
podem apresentar essas leses, a falha no tratamento
da doena nesse estgio pode resultar na formao
de abcessos perirretais, estenoses retais, fstulas e
cicatrizes crnicas. Alm dessas complicaes, que
surgem como resultado de mudanas inflamatrias
agudas, as manifestaes crnicas da doena podem
causar o bloqueio da drenagem linftica da genitlia
ou reto, causando edema. O edema linftico severo
denominado de elefantase.

11.2 Testes laboratoriais


At o incio da dcada de 80, o isolamento de C.
trachomatis na cultura de clulas era o principal mtodo
para o diagnstico de infeces clamidiais (ver Captulo
5). Os isolados de LGV foram identificados por crescerem
mais rapidamente em clulas de cultura de tecidos
que os isolados clamidiais no LGV. A partir de meados
da dcada de 90, os testes de amplificao de cidos
nucleicos (NAAT, do ingls nucleic acid amplification test)
tornaram-se os testes de escolha para o diagnstico
de infeces clamidiais. Esses NAAT, disponveis
comercialmente, so significativamente mais sensveis
que os mtodos de diagnstico anteriores (ver Anexo
3). Entretanto, eles no so capazes de discriminar
as cepas de LGV ou no-LGV. Subsequentemente,
foram desenvolvidos ensaios moleculares que podem
diferenciar as cepas com base em uma deleo que
ocorre no gene pmpH somente em isolados de LGV
(8-10). A coleta, o transporte e o armazenamento
apropriados dos espcimes so fundamentais para a

Linfogranuloma venreo (LGV)

147

alta sensibilidade e especificidade de todos os mtodos


diagnsticos.
Os espcimes escolhidos para cultura e NAAT de LGV
incluem amostras coletadas com hastes diretamente
das leses primrias (quando presentes); amostras da
uretra colhidas com hastes ou o primeiro jato de urina,
em homens; amostras endocervicais em mulheres e
amostras do reto em HSH, tambm coletadas com
hastes. Aspirados obtidos a partir de linfonodos regionais
flutuantes raramente apresentam resultados positivos.
Ao contrrio de outras infeces clamidiais no
invasivas do trato genital, as infeces por LGV tendem
a provocar uma resposta de anticorpos significativa. No
passado, o teste clamidial de fixao de complemento
foi amplamente usado para o diagnstico da infeco
tropical clssica, sendo detectadas titulaes 1:64.
Subsequentemente, o teste de microimunofluorescncia
foi utilizado, sendo detectados ttulos de anticorpos
1:256, com reao cruzada ampla. Deve-se ressaltar
que mulheres com PID e indivduos com infeco
por cepas de LGV no complicada podem apresentar
respostas de anticorpos semelhantes. A importncia da
sorologia no diagnstico de proctite e proctocolite por
LGV continua desconhecida.

11.3 Referncias
1. Mabey D, Peeling RW. Lymphogranuloma venereum.
Sexually Transmitted Diseases, 2002, 78(2):9092.
2. Nieuwenhuis RF et al. Resurgence of
lymphogranuloma venereum in Western Europe:
an outbreak of Chlamydia trachomatis serovar L2
proctitis in The Netherlands among men who have
sex with men. Clinical Infectious Diseases, 2004,
39(7):9961003.

148

3. Rnn MM, Ward H. The association between


lymphogranuloma venereum and HIV among men
who have sex with men: systematic review and
meta-analysis. BMC Infectious Diseases, 2011,
11:7078.
4. Martin-Iguacel R et al. Lymphogranuloma venereum
proctocolitis: a silent endemic disease in men who
have sex with men in industrialised countries.
European Journal of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases, 2010, 29(8):917925.
5. White J, Ison C. Lymphogranuloma venereum: what
does the clinician need to know? Clinical Medicine,
2008, 8(3):327330.
6. Levine JS, Smith PD, Brugge WR. Chronic proctitis
in male homosexuals due to lymphogranuloma
venereum. Gastroenterology, 1980, 79(3):563565.
7. Quinn TC et al. The polymicrobial origin of intestinal
infections in homosexual men. New England Journal
of Medicine, 1983, 309(1):576582.
8. Morr SA et al. Real-time polymerase chain reaction
to diagnose lymphogranuloma venereum. Emerging
Infectious Diseases, 2005, 11(8):13111312.
9. Chen CY et al. The molecular diagnosis of
lymphogranuloma venereum: evaluation of a real
time multiplex polymerase chain reaction test using
rectal and urethral specimens. Sexually Transmitted
Diseases, 2007, 34(7):451455.
10. Alexander S, Martin IM, Ison C. A comparison of
two methods for the diagnosis of lymphogranuloma
venereum. Journal of Medical Microbiology, 2008,
57:962965.

Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 12
Cancro mole
12.1 Introduo
O cancro mole causado pela bactria Haemophilus
ducreyi, sendo transmitido exclusivamente por contato
sexual, com a invaso direta do organismo pela pele
saudvel ou desgastada. A doena , aproximadamente,
sete vezes mais comum em homens que em mulheres
e sua transmisso est associada ao nmero elevado
de parceiros sexuais. O cancro mole produz lceras
na genitlia, tipicamente no sulco coronal peniano,
em homens, e na vulva, em mulheres. O cancro mole
perianal pode ocorrer em homens que fazem sexo com
homens com comportamento receptivo e, tambm, em
mulheres que tiveram relaes sexuais com penetrao
anal. O cancro mole pode estar associado linfadenite
inguinal supurativa, principalmente se houve um atraso
na procura pelo servio de sade ou na realizao de
um diagnstico correto. Raramente, o cancro mole pode
ser adquirido no laboratrio por meio de uma inoculao
acidental de H. ducreyi por via digital.
O tempo de inoculao , normalmente, de 4-10 dias.
A lcera genital comea como uma ppula tenra, que
se torna pustulosa e ulcera em dois dias. A lcera
dolorida, irregular, com extremidades no definidas
e, normalmente, no endurecida. Essas so as
caractersticas clssicas que diferenciam o cancro
mole das lceras sifilticas. Entretanto, importante
destacar que a sensibilidade do diagnstico baseado
simplesmente no surgimento clnico de ulceraes
baixa. A base da lcera encontra-se frequentemente
coberta por uma secreo purulenta e necrtica,
sangrando facilmente quando raspada ou limpada.
comum haver mltiplas leses, que podem se fundir
e formar lceras grandes. Tambm costuma ocorrer
adenite inguinal dolorosa unilateral; caso esta no
seja pronta e adequadamente tratada, pode levar
ruptura espontnea dos linfonodos supurados (nguas).
Apresentaes atpicas de cancro mole so comuns
e a doena pode ser facilmente confundida com
outras lceras genitais (UG) de etiologia sexualmente
transmissvel, principalmente o herpes genital. Algumas

lceras genitais podem estar infectadas por mais de


um patgeno causador de UG, mas, atualmente, isso
menos comum devido reduo da prevalncia relativa
de bactrias causadoras de UG.
O patgeno H. ducreyi um bacilo Gram-negativo,
pequeno e imvel. Trata-se de um organismo delicado
e, devido s suas necessidades nutricionais complexas,
necessrio utilizar meio de cultura enriquecido para
o seu isolamento. O crescimento dos isolados de H.
ducreyi pode ser tanto aerbico quanto anaerbico,
sendo considerado timo a 32-33C, em uma atmosfera
saturada de vapor de gua. A maioria das cepas,
principalmente no isolamento primrio, dependente
de dixido de carbono. O H. ducreyi apresenta poucas
caractersticas bioqumicas distintivas: todas as cepas
reduzem o nitrato a nitrito, so positivas tanto para
oxidase quanto para fosfatase alcalina e necessitam de
hemina (fator X) para seu crescimento.
Embora o cancro mole tenha sido considerado muito
comum em algumas partes do mundo, a prevalncia
dessa doena diminuiu drasticamente desde a dcada de
90, devido, em parte, ampliao do acesso a agentes
antimicrobianos, implantao da gesto sindrmica,
melhoria dos cuidados mdicos para os profissionais do
sexo e mudana no comportamento sexual na era da
infeo por HIV.

12.2 Reviso dos procedimentos de


diagnstico
O diagnstico laboratorial de cancro mole baseia-se
tradicionalmente na recuperao de H. ducreyi a
partir da cultura, o que representa um procedimento
tecnicamente exigente, com baixo rendimento fora dos
laboratrios altamente especializados e acostumados a
trabalhar com o patgeno (1). Embora no exista nenhum
teste de amplificao de cidos nucleicos (NAAT,
do ingls nucleic acid amplification test) disponvel
comercialmente para o diagnstico de cancro mole,
vrios NAAT desenvolvidos in-house foram utilizados
para aumentar a sensibilidade do diagnstico (1). Alm
disso, descreveram-se diversas tcnicas fundamentadas
em pesquisa, incluindo o uso da deteco de antgenos
com base em anticorpo monoclonal e sondas de DNA
(1). A microscopia direta apresenta sensibilidade e
especificidade muito baixas, no sendo, portanto, muito

Cancro mole

149

utilizada como ferramenta de diagnstico para cancro


mole. Os ensaios sorolgicos baseados em pesquisa,
atualmente disponveis, so teis somente para
propsitos soroepidemiolgicos.

12.3 Coleta e transporte de espcimes


Os espcimes para a cultura de H. ducreyi devem ser
obtidos a partir da base da lcera. Limpe a lcera com
uma gaze seca, ou com uma haste, para remover crostas
e detritos superficiais. No necessrio realizar uma
limpeza excessiva, o que pode causar sangramento e
ser doloroso para o paciente. Colete o exsudato da base
com uma haste. O tipo de fibra utilizada na haste no
parece afetar a sensibilidade da cultura. O isolamento
de H. ducreyi a partir do pus da ngua inguinal bem
menos eficiente que a partir do material da lcera genital
e, dessa forma, raramente realizado. Para resultados
ideais, inocule os espcimes imediatamente no meio
para isolamento e os mantenha em um recipiente com
vela, ou em uma estufa com atmosfera mida, a uma
temperatura no superior a 35C, at sua incubao
final. Quando o meio de cultura no estiver disponvel na
clnica mdica, os espcimes podem ser transportados
a 4C em um meio para transporte. Um meio baseado
em tioglicolato com hemina, contendo L-glutamina e
albumina bovina, parece manter a viabilidade de H.
ducreyi por vrios dias a 4C (2).

12.4 Isolamento e identificao de H. ducreyi


A cultura bacteriolgica de H. ducreyi continua sendo
a principal ferramenta para o diagnstico de cancro
mole em clnicas e, por muitos anos, foi o padro ouro
para a avaliao de outros mtodos diagnsticos. Uma
cultura bem-sucedida depende crucialmente do uso
de meio fresco (idealmente, com menos de sete dias)
e da ateno s condies de incubao. Entretanto,
com o surgimento de NAAT mais sensveis, baseados
em pesquisa, sabido que a cultura pode detectar, no
mximo, apenas 75% das infeces por H. ducreyi (3).
As tentativas iniciais de cultura de H. ducreyi utilizaram
sangue de coelho fresco coagulado e aquecido a
55C, sangue humano fresco coagulado e soro
humano inativado por calor; mas esses mtodos
foram alvo frequente de contaminaes recorrentes
por microrganismos (1). O problema da contaminao

150

foi subsequentemente contornado pela adio de


vancomicina ao gar de chocolate semislido
concentrao de 3g/mL (4). Utilizando tal meio seletivo,
Hammond et al. registraram o crescimento de H. ducreyi
em sete (44%) de 16 pacientes com o diagnstico clnico
de cancro mole (4). Deve-se ressaltar que o crescimento
de algumas cepas de H. ducreyi pode ser inibido quando
estas so expostas a essa concentrao de vancomicina,
e que tais cepas necessitariam ser isoladas em um meio
de cultura isento de antibitico.
Vrios meios seletivos artificiais foram desenvolvidos e
revisados com detalhes em outro documento (5). Nsanze
et al. demonstraram que o rendimento das culturas
positivas pode ser aumentado utilizando mais de um
tipo de meio de cultura para isolar H. ducreyi, a partir
de material de lcera genital (6). As diferenas nas
necessidades nutricionais entre as cepas de H. ducreyi
podem contribuir parcialmente para essas observaes.
Um meio contendo gar base GC, 1-2% de hemoglobina,
5% de soro fetal bovino com enriquecimento de 10% de
cofatoresvitaminasaminocidos (CVA) e vancomicina
(3g/mL) parece apresentar a maior sensibilidade para
o isolamento de H. ducreyi de espcimes clnicos, com
registro de culturas positivas em at aproximadamente
80% dos casos de cancro mole definidos clinicamente
(Figura 12.1) (5). Entretanto, notou-se que alguns
isolados de H. ducreyi no crescem nesse meio, mas
podem ser isolados a partir de um meio diferente
contendo gar Mueller-Hinton (MH), 5% de sangue de
cavalo achocolatado com enriquecimento de 1% de CVA
e vancomicina (3g/mL) (5). Para auxiliar na otimizao
da cultura de H. ducreyi em clnicas, dois meios podem
ser incorporados simultaneamente em uma nica placa.
Mais recentemente, foi desenvolvido um meio baseado
em carvo que evita a necessidade de adicionar o
oneroso soro fetal bovino, o qual pode representar uma
ferramenta de diagnstico com melhor custo-benefcio
para lugares com limitaes de recursos (Figura
12.2) (7 ). O Anexo 4 lista os protocolos para os meios
apropriados. Para o estabelecimento de lugares para
a cultura de H. ducreyi, recomenda-se o uso de, pelo
menos, dois dos meios mencionados acima e a definio
de suas sensibilidades durante estudos-piloto.
Aps a inoculao, incube as placas de cultura a
32-34C em uma atmosfera saturada de vapor

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Figura 12.1
Crescimento de H. ducreyi em placa de gar chocolate GC enriquecido.

Figura 12.2
Aglomerados de H. ducreyi em um meio baseado em carvo.
de gua, contendo 5% de dixido de carbono, ou,
preferencialmente, em condies microaeroflicas.
Incube as culturas por 48 horas antes da anlise inicial
e as mantenha por cinco dias antes de defini-las como
negativas. As colnias de H. ducreyi podem variar de
tamanho, dependendo do tempo e da temperatura de
incubao, da atmosfera e do meio de crescimento.
As colnias so no mucoides, elevadas, granulares,
apresentam uma cor amarela acinzentada e so

coletadas intactas em aglomerados na superfcie de gar


com uma ala bacteriolgica. As colnias podem ser
tanto translcidas quanto opacas e essa variabilidade
muitas vezes d a impresso de uma cultura misturada,
impura. A colorao de Gram de esfregaos de colnias
mostra cocobacilos em cadeias curtas, aglomerados
ou espirais. Os organismos so pleomrficos em,
aproximadamente, 50% das culturas. As bactrias
individuais parecem apresentar colorao bipolar. Em

Cancro mole

151

vrios lugares do mundo, quase todos os isolados de


H. ducreyi produzem -lactamase. Essa caracterstica
pode contribuir para uma identificao presuntiva. Para
o trabalho de diagnstico de rotina em reas endmicas,
no existe a necessidade de identificao posterior.
Entretanto, a identificao confirmatria pode ser
necessria para os isolados suspeitos provenientes de
reas no endmicas. Uma combinao de alguns dos
mtodos a seguir pode ser realizada para viabilizar esse
processo: teste de oxidase, reduo de nitrato, teste de
porfirina e deteco de fosfatase alcalina.
Teste de oxidase
A produo de citocromo oxidase pode ser demonstrada
colocando algumas gotas de hidrocloreto de tetrametilp-fenilenodiamina em uma tira de papel filtro e
friccionando, com o auxlio de uma ala bacteriolgica,
as vrias colnias crescidas em uma rea impregnada.
Uma mudana de cor do azul para o roxo em um minuto
indica um resultado positivo.
Reduo de nitrato
Prepare uma suspenso bacteriana densa (padro de
McFarland 3, 109 UFC/mL) e transfira 0,04mL para
um tubo pequeno. Adicione 0,04mL de soluo de
nitrato de sdio a 0,5g/L e 0,04mL de tampo fosfato a
0,025mol/L, pH 6,8, e incube em banho-maria a 37C,
por uma hora. Em seguida, adicione 0,06mL de cido
sulfanlico a 8g/L em cido actico a 5mol/L e 0,06mL
de -naftilamina a 5g/L em cido actico a 5mol/L. O
tubo deve ser agitado e, se a cor rosa for observada, o
teste positivo.
Necessidade de hemina (Fator X) o teste de
porfirina
O teste clssico de crescimento com discos ou tiras
impregnadas por hemina no pode ser utilizado para
detectar H. ducreyi. O teste de porfirina o nico modo
vivel para demonstrar a necessidade de hemina.
Faa uma suspenso densa de bactrias (padro de
McFarland 3, 109 UFC/mL) em 0,5mL de uma soluo de
hidrocloreto de cido -aminolevulnico a 2mmol/L em
tampo fosfato a 0,1mil/L, pH 6,9, contendo soluo de
sulfato de magnsio a 0,08mmol/L. Incube em banhomaria a 37C, por quatro horas. Exponha o substrato

152

luz de Wood (comprimento de onda de 360nm), em uma


cmara escura. Uma fluorescncia vermelha indica a
presena de porfirinas, isto , no h necessidade de
hemina. Assim, o H. ducreyi deve fornecer um resultado
negativo e no exibir fluorescncia vermelha.
Deteco de fosfatase alcalina
Faa uma suspenso densa de bactrias (padro de
McFarland 3, 109 UFC/mL) em um tubo contendo 0,5mL
de fosfato dissdico livre de fenol a 0,3g/L em tampo
de Srensen citrato-hidrxido de sdio a 0,01mol/L, pH
5,6, e incube o tubo em banho-maria a 37C, por quatro
horas. Adicione quatro gotas de 2,6-dibromoquinona4-clorimida a 5g/L em metanol, agite e deixe o tubo
repousar a temperatura ambiente por 15 minutos.
Adicione 0,3mL de n-butanol, agite e deixe repousar por
cinco minutos. Uma cor de azul a roxo nas camadas de
butanol indica um resultado positivo.
Outras caractersticas de H. ducreyi
Os testes de catalase, indol e urease so negativos. O
H. ducreyi no considerado sacaroltico. Entretanto,
foram registradas reaes positivas para diferentes
carboidratos. O H. ducreyi apresenta uma grande gama
de atividades de aminopeptidases e todos os isolados
testados mostraram atividade com -naftilamida
derivada de L-lisina, L-arginina, L-alanina, L-glicina,
glicilglicina, glicil-L-alanina e L-leucina.

12.5 Deteco de H. ducreyi baseada em


cido nucleico
At o momento da escrita deste documento (junho
de 2012), no existe NAAT para a deteco de H.
ducreyi disponvel comercialmente e aprovado pela
Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica. Vrios NAAT baseados em
pesquisas foram descritos na literatura e utilizam uma
gama de alvos moleculares diferentes, incluindo o
gene do RNAr 16S de H. ducreyi, a regio ribossmica
espaadora intergnica rrs (16S)-rrl (23S) e o gene
groEL (1). Foi tambm desenvolvida uma reao em
cadeia da polimerase multiplex robusta para a deteco
de patgenos de UG, incluindo o H. ducreyi, que est
sendo utilizada em uma srie de centros de referncia
internacionais (8).

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

12.6 Tecnologias de sonda de cido nucleico


Foram investigados ensaios de hibridizao DNA-DNA e
DNA-RNA como possveis meios de detectar H. ducreyi
no laboratrio, provando-se que estes apresentam
100% de sensibilidade e 100% de especificidade, mas
sua adequao como ferramenta de diagnstico para
detectar cancro mole ainda deve ser estabelecida (1).

12.7 Microscopia
O exame direto de material clnico em esfregaos com
colorao de Gram pode, ocasionalmente, ser til
para o diagnstico de cancro mole, caso se visualizem
bacilos Gram-negativos pequenos tpicos, agrupados em
correntes dos tipos cardume de peixes, vias frreas
ou impresses digitais. Entretanto, essas aparncias
morfolgicas clssicas so raramente visualizadas
na prtica clnica. Alm disso, a maioria das lceras
genitais abriga uma microbiota polimicrobiana devido
contaminao secundria. A presena de bacilos Gramnegativos em um esfregao, dessa forma, pode ser
mal interpretada e contribuir para o fraco desempenho
da microscopia como uma ferramenta de diagnstico.
Consequentemente, devido sua baixa sensibilidade e
especificidade, os esfregaos com colorao de Gram
no so recomendados para o diagnstico de cancro
mole.

12.8 Deteco de antgeno de H. ducreyi


Vrios anticorpos monoclonais contra os antgenos
proeminentes de H. ducreyi, incluindo a protena da
membrana externa de 29kDa e o lipo-oligosacardeo,
foram utilizados para detectar a infeco por H.
ducreyi em diversos formatos de diagnstico, incluindo
imunofluorescncia e ensaios imunolgicos Limulus (1).
Esses ensaios baseiam-se em pesquisas, no tendo
sido utilizados como uma ferramenta de diagnstico na
prtica clnica.

12.9 Sorologia
Atualmente, os testes sorolgicos para a deteco
de anticorpos contra H. ducreyi no esto disponveis
comercialmente. As respostas sorolgicas de humanos
e coelhos para infeces por H. ducreyi foram
detectadas mediante uma srie de tecnologias, a
exemplo de imunoensaios enzimticos, precipitao,

aglutinao e o ensaio dot immunobiding (1). Durante


o estgio ulcerativo do cancro mole, desenvolve-se
uma resposta humoral infeco por H. ducreyi;
porm, segundo experincias clnicas e estudos de
inoculao experimental em humanos, provavelmente
no h imunidade adquirida para H. ducreyi. Os testes
sorolgicos oferecem muito pouco em termos de
assistncia a diagnstico, mas seriam uma ferramenta
til para os profissionais que realizam pesquisas
soroepidemiolgicas para infeces de cancro mole
presentes nas diversas comunidades.

12.10 Teste de susceptibilidade


antimicrobiana
Foi observada e descrita em isolados de H. ducreyi uma
alta resistncia mediada por plasmdio a sulfonamidas,
penicilinas, canamicina, estreptomicina, tetraciclina,
cloranfenicol e trimetoprina. Os padres da resistncia
cromossmica mediada por plasmdeo pode variar
muito entre as diversas reas geogrficas. Um grande
nmero de isolados de H. ducreyi exibe resistncia a
vrios agentes antimicrobianos. O crescimento contnuo
da resistncia a drogas entre os patgenos de doenas
sexualmente transmissveis (DST) torna necessria a
vigilncia adequada da susceptibilidade de isolados
clnicos de H. ducreyi em reas nas quais o cancro
mole continua representando um problema clnico
significativo. Entretanto, ainda no h um procedimento
padro para o teste de susceptibilidade antimicrobiana a
esse organismo.
A maioria dos estudos publicados utilizou a tcnica
de diluio em gar para determinar a concentrao
inibitria mnima (CIM). Um dos meios mais adequados
o gar MH enriquecido com hemoglobina a 1%, soro fetal
bovino a 5% e o suplemento IsoVitaleX TM a 1% (Anexo 4).
Alternativamente, o meio MH pode ser substitudo por
gar base GC. A determinao da CIM antimicrobiana
para os isolados de H. ducreyi um procedimento
tecnicamente complicado e delicado, sendo realizado
com sucesso somente em laboratrios de referncia
especializados.
A lista de antibiticos a ser testados deve incluir as
drogas localmente recomendadas para o tratamento
de cancro mole, assim como os agentes teraputicos
alternativos, os antibiticos teis para estudos

Cancro mole

153

epidemiolgicos de H. ducreyi e, finalmente, novas


drogas desenvolvidas que necessitam de avaliao
microbiolgica. Os antibiticos comumente testados
incluem sulfametoxazol e trimetoprina (usados
isoladamente ou combinados), tetraciclina, cloranfenicol,
eritromicina, canamicina (ou estreptomicina),
ciprofloxacina (ou fleroxacina) e ceftriaxona (ou
cefotaxima).

de ser menos destrutivo para o bacilo. A centrifugao


a baixa velocidade (500g) pode ajudar a sedimentar os
aglomerados grandes. A densidade do sobrenadante
ento comparada a 0,5 no padro de McFarland
(108UFC/mL). Dilua a suspenso em TSB (1:10) para
obter 107UFC/mL e coloque 0,5mL dessa diluio
no poo correspondente em um bloco repicador de
sementes.

A preparao de solues-estoque antimicrobianas e as


diluies para seu uso no teste da CIM esto descritas
com detalhes no Captulo 4, seo 4.8.4.2.

Aquea as placas do teste de CIM para a temperatura


ambiente e, se necessrio, seque-as em uma estufa, na
posio invertida, com a tampa semiaberta. Transfira
o inculo bacteriano preparado para as placasteste, utilizando um repicador de mltiplos pontos,
a fim de gerar pontos contendo aproximadamente
104UFC. Inocule, primeiro, uma placa-controle sem

Para preparar o meio, dissolva o gar MH desidratado


e a hemoglobina, separadamente, em gua destilada.
O volume de gua utilizado deve ser 16% ou inferior
ao da frmula do meio normal (para permitir o volume
de suplementos e solues antimicrobianas a ser
adicionados posteriormente). Ferva e dispense o MH
e a hemoglobina, separadamente, em recipientes
com volumes apropriados ao nmero de placas a ser
preparadas para cada diluio antimicrobiana, o qual
depender do nmero de cepas a serem testadas.
Autoclave em recipientes bem fechados, deixe esfriar
a uma temperatura de 50-55C em banho-maria e,
ento, misture os dois em um recipiente e adicione soro
fetal bovino a 5%, suplemento para H. ducreyi a 1% e
soluo antimicrobiana a 10%. Misture gentilmente o
meio e verta uma quantidade de aproximadamente 20mL
nas placas, com um dimetro interno de 9cm. Uma
vez que o gar esteja solidificado, as placas devem ser
armazenadas a 4C, por at uma semana, em sacolas
plsticas fechadas.
Para preparar o inculo, ressuspenda em caldo de
triptona de soja (TSB, do ingls trypic soy broth) a cultura
crescida a partir de uma subcultura de 24 horas em gar
MH ou GC enriquecidos (similar ao meio de isolamento,
mas sem a vancomicina), para uma densidade de 108
unidades formadoras de colnias (UFC) por mL. As
colnias de H. ducreyi so normalmente to viscosas
que no possvel obter uma suspenso homognea,
mesmo aps agitar vigorosamente ou mistur-la com
o auxlio de um vrtice. O uso de seringa e uma agulha
25G laranja para quebrar os aglomerados, por meio da
aspirao e liberao da suspenso, pode auxiliar na
obteno de uma suspenso mais homognea, alm

154

antibiticos e, em seguida, as placas contendo os


agentes antimicrobianos, comeando pela de menor
concentrao para cada agente. Finalmente, inocule uma
segunda placa-controle. Deixe secar o inculo, inverta as
placas e incube a 33C, em uma atmosfera saturada em
vapor de gua, contendo dixido de carbono a 5%, por
24 horas.
A CIM a concentrao mais baixa do antibitico, a qual
no permite o crescimento ou o crescimento de apenas
poucas colnias, bem finas e praticamente no visveis.
O crescimento em ambas as placas-controle deve ser
aderente e livre de contaminao. A determinao da
CIM para sulfonamidas um pouco difcil, uma vez
que os seus limites so menos precisos do que para
os outros antibiticos. Uma leitura padro e resultados
reprodutveis so obtidos se a segunda diluio, na
qual se d uma grande reduo no crescimento, for
considerada como a CIM. Pode ser til comparar esse
crescimento com o das placas controle.

12.11 Conservao dos isolados


Para manter a viabilidade dos isolados de H. ducreyi
no laboratrio, estes devem ser subcultivados a cada
quatro dias. As cepas tambm podem ser preservadas
por at quatro semanas, por meio da inoculao em
gar chocolate enriquecido. Para a manuteno durante
perodos de muitos meses, suspenses em leite
desnatado so armazenadas mediante congelamento
a -70C. Para preservao em longo prazo, os isolados
podem ser suspensos em um meio crioprotetor, tais

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

como soro fetal bovino + dimetilsulfoxida a 10% ou


leite desnatado + glicerol a 20%, e armazenados em
nitrognio lquido.

12.12 Questes mdico-legais


O cancro mole sempre deve ser visto como uma DST,
com exceo de episdio raro de infeco adquirida em
laboratrio.

12.13 Referncias
1. Lewis DA. Diagnostic tests for chancroid. Sexually
Transmitted Infections, 2000, 76(2):137141.
2. Dangor Y, Radebe F, Ballard RC. Transport media
for Haemophilus ducreyi. Sexually Transmitted
Diseases, 1993, 20(1):59.
3. Morse SA et al. Comparison of clinical diagnosis
and standard laboratory and molecular methods for
the diagnosis of genital ulcer disease in Lesotho:
association with human immunodeficiency virus
infection. Journal of Infectious Diseases, 1997,
175(3):583589.
4. Hammond GW et al. Comparison of specimen
collection and laboratory techniques for isolation
of Haemophilus ducreyi. Journal of Clinical
Microbiology, 1978, 7(1):3943.
5. Morse SA. Chancroid and Haemophilus ducreyi.
Clinical Microbiology Reviews, 1989, 2(2):137157.
6. Nsanze H et al. Comparison of media for the
primary isolation of Haemophilus ducreyi. Sexually
Transmitted Diseases, 1984, 11(1):69.
7. Lockett AE et al. Serum-free media for isolation
of Haemophilus ducreyi. The Lancet, 1991,
338(8762):326.
8. Orle KA et al. Simultaneous PCR detection of
Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, and
herpes simplex virus types 1 and 2 from genital
ulcers. Journal of Clinical Microbiology, 1996,
34(1):4954.

Cancro mole

155

156

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 13
Donovanose (granuloma
inguinal)
13.1 Introduo
A donovanose, tambm conhecida como granuloma
inguinal, uma infeco crnica envolvendo a pele, as
membranas mucosas e o sistema linftico da genitlia
e rea perianal (1). A ocorrncia de donovanose
geograficamente limitada, por exemplo, ao Brasil,
Caribe, ndia, Papua-Nova Guin e ao sul da frica.
Essa doena, que apresenta baixa infecciosidade,
transmitida entre humanos principalmente por contato
sexual. O tempo de incubao pode ser prolongado,
variando entre 1-12 semanas. A doena comea
como um ndulo subcutneo endurecido, que corri
a pele para formar uma lcera vermelha, hipertrfica
e granulomatosa, com a borda bem definida. A leso
sangra facilmente com o contato. A lcera progride
devagar e pode se tornar dolorosa caso se desenvolva
uma infeco bacteriana secundria. Tal infeco com
outros organismos pode contribuir para a formao de
detritos necrticos na lcera. Novas leses costumam
formar-se por autoinoculao e os linfonodos inguinais
aumentam de tamanho, como resultado de infeco
secundria (pseudonguas). A donovanose pode se
espalhar hematogenicamente para os ossos, juntas e
fgado. Por vezes a disseminao tambm resulta em
leses cutneas em locais extragenitais. Leses genitais
e perianais em vrios estgios podem lembrar leses
formadas por outras condies, como sfilis, cancro
mole, carcinoma e amebase.
A donovanose causada pelas Klebsiella (anteriormente
chamada Calymmatobacterium) granulomatis, bactrias
Gram-negativas (1,5 x 0,7m) que podem ser observadas
no interior de vacolos em grandes clulas histiocticas,
onde so denominadas corpos de Donovan (1,2).

13.2 Reviso do diagnstico laboratorial


O diagnstico laboratorial depende da visualizao dos
corpos de Donovan em esfregaos coloridos obtidos a
partir de leses clnicas ou cortes histolgicos coloridos

de tecidos de bipsia. O organismo somente pode ser


cultivado, com dificuldade, em centros especializados,
utilizando cultura de clula de moncito/Hep2. Ainda no
possvel cultivar o organismo em meio artificial. Foram
descritos na literatura ensaios de amplificao de cido
nucleico in-house, mas, na maioria dos pases, esses
ensaios no esto disponveis para fins de diagnstico
de rotina.

13.3 Coleta de espcime


Antes de preparar o esfregao do material da lcera,
gire gentilmente, por sobre a leso, uma haste com
ponta de algodo, para remover o exsudato resultante
de infeces secundrias e/ou resduos, de forma a
minimizar o sangramento. Uma segunda haste deve
ser utilizada para coletar material da base da lcera,
assegurando uma boa amostragem das bordas da leso,
onde mais provvel que os corpos de Donovan sejam
encontrados. A seguir, role essa haste uniformemente
sobre uma lmina e deixe-a secar ao ar livre antes de
transport-la ao laboratrio. importante ressaltar que
alguns mdicos preferem utilizar uma pina perfuradora
para bipsia e remover um pequeno pedao de tecido, o
qual , ento, esmagado, espalhado em uma lmina e,
em seguida, seco ao ar livre. A preparao de lminas
a partir de material esmagado facilita a interpretao
microscpica e aumenta o valor de diagnstico.

13.4 Microscopia
Foi descrito um mtodo simples e rpido (1 minuto)
de microscopia usando colorao de Giemsa (4). Com
esse mtodo de colorao, a lmina mergulhada
cinco vezes em um fixador, seis vezes em uma soluo
de eosina, seis vezes em uma mistura de corante
tiazdico e, ento, lavada com tampo fosfato, pH 6,8.
Os corantes de Giemsa a 10% ou de Leishman, diludo
de forma semelhante, tambm podem ser empregados
como alternativa, seguidos da fixao do material na
lmina com metanol por 2-3 minutos. Cubra a lmina
com o corante diludo por 10 minutos (corante de
Leishman) ou por at 30 minutos (corante de Giemsa)
e, ento, lave a lmina em um fluxo de gua tamponada
corrente ou de soluo salina de tampo fosfato (pH
7,0-7,2). Em seguida, deixe a lmina secar ao ar livre e,
ento, examine-a em um microscpio de luz, utilizando
leo de imerso (aumento de 1000x). Os corpos de

Donovanose (granuloma inguinal)

157

Donovan aparecem como coco-bacilos dentro de


grandes vacolos (25-90m de dimetro) no citoplasma
de histicitos grandes e, ocasionalmente, em clulas
plasmticas e leuccitos polinucleares. Os organismos
apresentam cores de azul a roxo e, frequentemente,
encontram-se circundados por uma cpsula proeminente
rosa claro a acidfila (Figura 13.1). A bactria tpica
lembra alfinetes de segurana fechados. A contaminao
com outras bactrias frequentemente observada.
Embora a microscopia de esfregaos de lcera seja a
forma convencional de diagnosticar a donovanose, os
corpos de Donovan tambm j foram identificados em
esfregaos de Papanicolau (Pap) utilizados na citologia
cervical de rotina (5).

13.5 Histopatologia
O exame histopatolgico de uma bipsia pode ser til
no diagnstico diferencial entre donovanose e outras
condies. Uma lcera com um infiltrado inflamatrio
mesclado de clulas plasmticas, neutrfilos e
histicitos, com ausncia notvel de linfcitos,
sugestiva de donovanose. Retire um pedao de tecido
(3-5mm de espessura) da borda da leso com uma pina
perfuradora para bipsia e coloque-o em um recipiente
com soluo salina-formaldedo fixadora. O diagnstico
pode ser realizado por meio da identificao de corpos
de Donovan, utilizando o reagente de impregnao de
prata de Warthin-Starry (6). As bipsias parafinadas
devem ser cortadas em seces de 6m. Aps a
desparafinizao e hidratao com gua destilada, fixe
as seces em uma lmina de vidro com glicerol, seque
e trate com soluo cida de nitrato de prata a 43C,
por 30 minutos. Lave com gua quente, enxague em
gua destilada, desidrate em etanol 95% e clarifique em
xileno.

13.6 Cultura
Aps um relatrio descrevendo a cultura de K.
granulomatis a partir de fezes, em 1962, mostrou-se,
subsequentemente, ser muito difcil a cultura do
organismo com base em espcimes clnicos (1, 7 ).
Em 1997, dois grupos reportaram a multiplicao
bem-sucedida de K. granulomatis utilizando diferentes
sistemas de cultura, isto , um sistema de cocultura
de moncitos e uma tcnica modificada de cultura
de clamdia (8, 9). Com exceo dessas publicaes

158

isoladas, no existem outras tcnicas de cultura in


vitro para o isolamento de K. granulomatis. Entretanto,
o organismo pode ser cultivado por inoculao dos
espcimes clnicos no saco vitelino de ovos de galinha
embrionados de cinco dias (10). O organismo
detectvel aps 72 horas de incubao.

Figura 13.1
Esfregao com colorao de Giemsa de material de
lcera, contendo moncitos de corpos de Donovan
(1000x).

13.7 Amplificao de cido nucleico


Foi desenvolvida uma reao em cadeia da polimerase
(PCR, do ingls polymerase chain reaction) para
diagnstico, baseada em pesquisas, a qual tem como
alvo o gene phoE e incorpora, aps a amplificao, a
digesto de amplicons com base na enzima de restrio
HaeIII (3). Esse mtodo foi refinado, em seguida, em um
teste de PCR colorimtrico.

13.8 Testes sorolgicos


Atualmente, no existem testes sorolgicos disponveis
para auxiliar no diagnstico.

13.9 Referncias
1. OFarrell N. Donovanosis. Sexually Transmitted
Infections, 2002, 78(6):452457.
2. Carter JS et al. Phylogenetic evidence for
reclassification of Calymmatobacterium
granulomatis as Klebsiella granulomatis comb nov.
International Journal of Systematic Bacteriology,
1999, 49(Pt4):16951700.
3. Carter JS et al. Diagnostic polymerase chain
reaction for donovanosis. Clinical Infectious
Diseases, 1999, 28(5):11681169.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

4. OFarrell N et al. A rapid stain for the diagnosis of


granuloma inguinale. Genitourinary Medicine, 1990,
66(3):200201.
5. de Boer AL, de Boer F, Van der Merwe JV. Cytologic
identification of Donovan bodies in granuloma
inguinale. Acta Cytologica, 1984, 28(2):126128.
6. Freinkel AL. Histological aspects of sexually
transmitted genital lesions. Histopathology, 1987,
11(8):819831.
7. Goldberg J. Studies on granuloma inguinale. V.
Isolation of a bacterium resembling Donovania
granulomatis from the faeces of a patient with
granuloma inguinale. British Journal of Venereal
Diseases, 1962, 38(2):99102.
8. Kharsany AB et al. Growth and cultural
characteristics of Calymmatobacterium
granulomatisthe aetiological agent of granuloma
inguinale (donovanosis). Journal of Medical
Microbiology, 1997, 46(7):579585.
9. Carter J et al. Culture of the causative organism for
donovanosis (Calymmatobacterium granulomatis) in
HEp-2 cells. Journal of Clinical Microbiology, 1997,
35(11):29152917.
10. Anderson K, Demonbreun WA, Goodpasture EW. An
etiologic consideration of Donovania granulomatis
cultivated from granuloma inguinale (three cases) in
embryonic yolk. Journal of Experimental Medicine,
1945, 81(1):2539.
11. Carter JS, Kemp DJ. A colorimetric detection
system for Calymmatobacterium granulomatis.
Sexually Transmitted Infections, 2000,
76(2):134136.

Donovanose (granuloma inguinal)

159

160

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 14
Infeces pelo papilomavrus
humano (HPV)
14.1 Papilomavrus humano (HPV)
Os HPV so vrus pequenos (~55nm de dimetro),
icosadricos, no envelopados, com um genoma de DNA
de fita dupla circular e enrolado de, aproximadamente,
8kb (Figura 14.1). Esses vrus infectam, tipicamente,
a pele e superfcies mucosas de humanos (1). Ao
contrrio da maioria dos vrus que infectam pessoas,
os papilomavrus no podem se propagar por meio
de cultura in vitro convencional. Dessa forma, no se
pode utilizar uma classificao clssica antignica
e de sorotipo para a determinao do tipo viral. Em
vez disso, utiliza-se uma abordagem de genotipagem
para a identificao e classificao desses vrus. Os
HPV individuais so identificados quanto ao tipo e ao
gentipo, distinguidos de acordo com sua sequncia
genmica e enumerados na ordem em que so
descobertos. O gene L1, que codifica o principal
componente do capsdeo viral (Figura 14.2), a regio
mais conservada entre os tipos individuais, sendo
utilizada pela taxonomia para a construo de rvores
filogenticas (Figura 14.3) (2). Os HPV com divergncia
de 2-10% na sequncia de L1 so conhecidos como
subtipos, e aqueles com menos de 2%, como variantes.

O termo gnero utilizado para os clados de maior


ordem, denominados por meio do alfabeto grego e,
dentro de cada gnero, pequenos clados so designados
como espcies e recebem um nmero. Por exemplo, o
gnero papilomavrus contm as espcies -9 e -7,
as quais representam, respectivamente, as duas causas
mais comuns de cncer cervical, ou seja, os gentipos
16 e 18 do HPV (2). Existem mais de 200 tipos diferentes
do vrus, dos quais, aproximadamente, 100 j tiveram
o genoma completo sequenciado e 40 so conhecidos
por infectar, especificamente, a mucosa anogenital de
humanos (HPV mucosotrfico).
Os tipos de HPV detectados, frequentemente, no trato
anogenital so subdivididos em tipos de baixo risco (LR,
do ingls low-risk) e de alto risco (HR, do ingls highrisk), com base no risco relativo para a complicao rara
de neoplasia (3). Os tipos LR de HPV so encontrados,
tipicamente, em leses intraepiteliais de baixo grau
(leses no pr-cancerosas), assim como em verrugas
anogenitais. Os tipos 6 e 11 do HPV contribuem para,
aproximadamente, 90% das verrugas genitais (4, 5). Os
HPV HR so encontrados em leses de baixo e alto graus,
assim como em cncer de colo do tero e outros locais
anogenitais (vulva, vagina e nus) (6). Coletivamente, os
HPV 16 e 18 so responsveis por, aproximadamente,
70% de todos os cnceres de colo do tero no mundo
(7-11). Com exceo dos cnceres anogenitais, o tipo
16, principalmente, apresenta um papel causal em
alguns cnceres de orofaringe, particularmente aqueles
localizados nas tonsilas (12, 13).
P97
URR

E6

E7

MY09

MY11

E1

L1
HPV

L2

E4

E2

E5

Figura 14.1
Microscopia eletrnica de HPV mostrando as
partculas virais nas clulas selecionadas de um
esfregao de Papanicolau (Pap).
Fonte: cortesia de Colin Laverty, Sydney, NSM,
Australia, 1978.

Figura 14.2
Organizao gentica dos HPVs(48).
URR: regio reguladora proximal (do ingls upstream
regulatory region)
Fonte: reproduzido com permisso da Organizao
Mundial da Sade (OMS).
Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)

161

Figura 14.3
rvore filogentica contendo as sequncias de L1 de 118 tipos de papilomavrus (2).
Fonte: reproduzido com permisso da Virology.

14.2 Histria natural das infeces genitais por


HPV
A maioria das infeces genitais por HPV so adquiridas
sexualmente, transitrias e lentamente curadas pelo
sistema imune do hospedeiro (14). Raramente, em cerca
de 5-10% dos casos, as infeces por HPV podem se
tornar persistentes. O HPV HR persistente um forte
indicador de risco para o desenvolvimento de pr-cncer,
o qual, por sua vez, apresenta o risco de progredir para
cncer ao longo dos anos, caso no seja tratado (15, 16).
Os cofatores determinados para o desenvolvimento de
infeco persistente e cncer cervical so o tabagismo,
uso prolongado de contraceptivo oral, alta paridade, idade
precoce no primeiro parto e estado imunossupressivo,
como na coinfeco por HIV (17 ). Ainda no se tem
conhecimento sobre se h fatores especficos do
hospedeiro e/ou outros fatores ambientais que determinam
os indivduos destinados a pr-cncer ou neoplasia (18).
A transmisso de HPV genital normalmente ocorre via
contato sexual direto (pele genital com pele genital) com
um indivduo infectado, resultando em taxas estimadas

162

de aquisio de HPV ao longo da vida de at 60-80%


(19, 20). A idade mdia da primeira relao sexual em
muitos pases ocidentais, tais como Austrlia, Reino
Unido e Estados Unidos da Amrica, de 16 anos (19,
21). Dessa forma, segue-se que as taxas mais elevadas
de novas infeces por HPV adquiridas so observadas
em mulheres jovens, com o pico etrio logo aps o
incio da atividade sexual e com estimativas de at
75% das infeces por HPV ocorrendo em mulheres
de 15 a 24 anos. Dados recentes sugerem que muitas
novas infeces em mulheres jovens, no infectadas
previamente por HPV, so infeces mltiplas (mltiplos
tipos de HPV detectados) (22).
H menos conhecimento sobre a histria natural da
infeco por HPV em homens. Novamente, as infeces
(peniana, na pele genital e/ou anal) so muito comuns,
ocorrendo logo aps o incio da atividade sexual, com
taxas rpidas de aquisio e cura (23, 24). Alm disso, o
comportamento sexual envolvendo nmeros elevados de
parceiros sexuais aumenta o risco de infeco, enquanto
a circunciso mostra um efeito protetor (24).

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

14.3 Imunologia do HPV


A resposta imune do hospedeiro ao HPV envolve tanto os
compartimentos humorais como aqueles mediados por
clulas. Em seguida infeco natural, a resposta humoral
de anticorpos especfica, sendo detectada, primeiramente,
em 6-18 meses aps a infeco (14). A resposta fraca e,
aproximadamente, apenas 50-60% dos indivduos positivos
para o teste de DNA do HPV desenvolvem uma resposta de
anticorpos mensurvel (14). Aps a infeco natural, um
indivduo pode permanecer positivo para o teste de DNA do
HPV, apesar do desenvolvimento de anticorpos especficos.
Tais indivduos no esto isentos de desenvolver uma doena
subsequente a partir desse tipo de HPV. A eliminao da
infeco por HPV e a resoluo das leses clnicas, como
as verrugas genitais, so caracterizadas por uma resposta
imune celular efetiva (25).
A sorologia do HPV no utilizada para o diagnstico.
A sorovigilncia til para estimar, em uma base
populacional, a idade e prevalncia da exposio em locais
pr-vacina. A sorologia ps-vacinao utilizada como
uma mensurao da efetividade da vacina. A proteo
corresponde deteco de anticorpos neutralizantes,
embora o mecanismo de proteo em si no seja
completamente compreendido. Estudos em animais com
papilomavrus especficos para o hospedeiro descrevem
anticorpos neutralizantes, a partir da infeco primria,
que se mostram protetores, embora sejam, em seguida,
desafiados pelo vrus respectivo. importante ressaltar
que, apesar de a durabilidade dos anticorpos induzidos
por vacinao em triagens humanas ser atualmente
documentada como sendo superior a oito anos, ainda no
se definiu uma correlao imune de proteo (27).

14.4 Manifestaes de doenas


Verrugas anogenitais
As verrugas anogenitais, tambm conhecidas como
condiloma acuminado, so uma massa exoftica benigna,
de crescimento papular ou plano, que podem ocorrer em
qualquer regio da rea anogenital. Elas so extremamente
comuns, principalmente em jovens que iniciam a atividade
sexual, sendo amplamente diagnosticadas nas clnicas.
Raramente, as leses podem causar problemas devido
ao seu tamanho e s obstrues que provocam, mas
acarretam, sobretudo, dificuldades psicossociais ou
relacionadas aparncia. As leses apresentam uma

tendncia a recuar aps o tratamento. Os HPV 6 e 11


causam a maiorias das verrugas anogenitais (85-90%) (5).

Papilomatose respiratria recorrente (PRR)


A PRR uma condio muito rara, caracterizada pelo
crescimento recorrente de estruturas semelhantes a
verrugas (papilomas) no trato respiratrio superior, embora
tambm possa envolver o trato respiratrio inferior,
resultando em morbidade e mortalidade significativas. Os
tipos 6 e 11 do HPV so responsveis, em grande parte,
por essas leses. A laringe a regio mais comumente
afetada, resultando em alteraes na voz. Em crianas
pequenas, pode ocorrer a obstruo de ar. O diagnstico
feito clinicamente por meio da observao de leses
caractersticas semelhantes a verrugas em laringoscopia/
broncoscopia. As leses so benignas, mas podem recorrer
frequentemente aps o tratamento. O surgimento dos
sintomas segue dois padres: a forma juvenil (idade mdia
de dois anos) e a forma tardia, observada em adultos (28).

Leses pr-cancerosas e cnceres


A infeco persistente com HPV oncognicos ou de
gentipos HR est intimamente relacionada a um aumento
de risco de cncer anogenital. Essa tendncia foi melhor
estudada no colo do tero, onde foram primeiramente
definidos os critrios para a identificao citolgica e
histolgica de leses pr-cancerosas de progresso
lenta. A nomenclatura dos tipos mudou ao longo dos anos
e continua a evoluir. Os precursores do cncer foram
denominados de displasias (suave, moderada e severa)
ou neoplasia intraepitelial cervical (NIC 1, 2, 3) e, mais
recentemente, de leses NIC 1-3 de alto grau (HSIL,
do ingls high-grade intraepitelial lesion) ou baixo grau
(LSIL, do ingls low-grade intraepithelial lesion) (29).
A terminologia em outras regies anatmicas segue o
mesmo padro: anal (AIN, do ingls anal intraepithelial
lesion), vulvar (VIN, do ingls vulvar intraepithelial lesion),
vaginal (VaIN, do ingls vaginal intraepithelial lesion) e
peniana (PIN, do ingls penile intraepithelial lesion). Em
cada caso, as leses precursoras (de alto grau ou grau 3)
so assintomticas, de progresso lenta e diagnosticadas
com histologia. A triagem recomendada apenas para as
leses cervicais, embora a abordagem para a triagem anal
esteja sendo avaliada (30). Atualmente, o tratamento s
recomendado para as leses precursoras (de alto grau).

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)

163

Fortes evidncias laboratoriais e epidemiolgicas


associam o HPV ao cncer cervical, sendo a infeco
por HPV HR persistente considerada um fator causal
necessrio, mas no suficiente, para o cncer cervical.
Na ausncia de infeco por HPV, muito improvvel
que o cncer cervical se desenvolva, e essa ntima
relao a razo pela qual as vacinas visam a preveno
das infeces por HPV oncognicos mais frequentes a
fim de prevenir o cncer, motivo pelo qual o teste de HPV

tambm pode auxiliar na triagem de cncer cervical.


Atualmente, as vacinas para HPV tm como alvo os
tipos 16 e 18 do HPV HR, que contribuem para 70% dos
casos de cncer cervical no mundo (7-11). As evidncias
epidemiolgicas so menos estabelecidas para os outros
cnceres associados ao HPV, mas estes envolvem
infeces em outras regies anogenitais, assim como
orofarngeas (base da lngua e tonsila), resultando em
um nus significativo da doena (Tabela 14.1).

Tabela 14.1: Cnceres atribuveis ao HPV em 2002

Local
Colo do tero

Destes, so
positivos
Atribuveis para o HPV 16
ao HPV (%) e/ou 18 (%)

Ambos os sexos
Total de
cnceres

Atribuveis
ao HPV

% de
todos os
cnceres

Atribuveis
ao HPV
16/18

% de
todos os
cnceres

100

70

492.800

492.800

4,54

344.900

3,18

Pnis

40

63

26.300

10.500

0,10

6.600

0,06

Vulva, vagina

40

80

40.000

16.000

0,15

12.800

0,12

nus

90

92

30.400

27.300

0,25

25.100

0,23

Boca

95

274.300

8.200

0,08

7.800

0,07

12

89

52.100

6.200

0,06

5.500

0,05

10.862.500

561.100

5,17

402.900

3,71

Orofaringe
Todos os locais

Fonte: adaptado de Parkin DM. The global burden of infection-associated cancers in the year 2002. International Journal of Cancer, 2006, 118: 3030-3044.

A proporo de cnceres relacionados ao HPV difere


para cada local anatmico e o HPV-16 , principalmente,
proeminente em cnceres no cervicais.

14.5 Procedimentos laboratoriais para a


deteco do HPV
O teste para HPV baseia-se em mtodos moleculares.
Isso ocorre, como mencionado anteriormente, devido
a que os mtodos de cultura convencionais no so
capazes de cultivar o HPV e a sorologia relativamente
insensvel. Os mtodos de teste para a vigilncia
epidemiolgica diferem daqueles aplicados em clnicas.
Os mtodos epidemiolgicos requerem ensaios
especficos, com alta sensibilidade analtica. Uma
vez que os ensaios clnicos utilizam o HPV como um
marcador da doena subjacente, eles so comparveis
aos desfechos da patologia. No h tratamentos para
o HPV em si; os tratamentos so direcionados aos
precursores do cncer associado ao HPV ou outras
leses relacionadas ao vrus. Uma ampla variedade de
ensaios para HPV esto disponveis comercialmente e
tambm so desenvolvidos por laboratrios. O uso em

164

clnicas necessita que os laboratrios utilizem ensaios


validados por agncias reguladoras para obter indicaes
clnicas especficas ou que os laboratrios procedam
validao do desempenho clnico do ensaio. Uma vez
que os precursores de cncer esto apenas associados
aos HPV HR, no h indicaes clnicas para o teste de
HPV LR. Existem algumas variaes nas quais os tipos
de HPV HR so clinicamente relevantes, e a maioria dos
ensaios incluem (ou realizam a reao cruzada com) os
14 tipos de HPV HR seguintes: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45,
51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.

14.6 Aplicaes clnicas dos ensaios de


deteco do HPV
As aplicaes clnicas para os ensaios de deteco do
HPV incluem:
Triagem primria, tanto isolada quanto em
combinao com a citologia cervical (Figura 14.4), em
mulheres 30 anos de idade. Estudos longitudinais
mostram que o teste de DNA para HPV apresenta
maior sensibilidade para predizer a prevalncia ou o

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Normal

ASCUS/limtrofe

LSIL

HSIL

Coilcito

Figura 14.4
Citologia de Papanicolau (Pap) de clulas esfoliadas normais, coilocitose tpica, mas no patognica, da
infeco por HPV, clulas escamosas atpicas de significncia indeterminada, mudanas celulares LSIL e HSIL.

desenvolvimento tardio de displasia; alm disso, o


seu valor preditivo negativo (VPN) extremamente
alto e superior ao da citologia. Dessa forma,
prope-se que os pacientes com resultado negativo
no exame de DNA para HPV em duas ocasies
possam apresentar um intervalo maior de triagem.
Isso torna a combinao de Papanicolau (Pap) e teste
de DNA para HPV custo-efetiva (31-36).
A triagem de mulheres com anormalidades citolgicas
mnimas (inconclusiva, equivocada ou limiar), para
discrimin-las daquelas de fato relacionadas ao HPV
e que requerem acompanhamento (37 ).
Terapia ps-ablao para displasia de alto grau e
monitoramento de mulheres com evidncias de
doena persistente/recorrente, e como um teste de
cura (32, 38).
O uso do HPV como uma triagem primria para cncer
cervical est sendo avaliado (39). Atualmente, enquanto
o teste para HPV um excelente preditor negativo da
doena, ele no apresenta a especificidade necessria
para a indicao direta de tratamento. A citologia
cervical uma opo de segundo teste. Outros testes
moleculares esto sendo avaliados, tais como o fator
do hospedeiro p16INK4a (p16), um inibidor quinase
dependente de ciclina. ndices elevados de p16 indicam
a remoo do controle de realimentao negativa
fornecido pelo gene do retinoblastoma, pRB. Quando
protenas as oncognicas E7 do HPV se ligam ao pRB, o
p16 expresso em demasia e seus ndices so elevados,

WNL, 200x

NIC1, 200x

NIC2, 200x

NIC3, 200x

Figura 14.5
p16 no expressa em tecidos normais (WNL) e
progressivamente expressa com anormalidades
crescentes (NIC1 a NIC3).
Fonte: reproduzido com permisso de Magnus von
Knebel Doeberitz, Departamento de Biologia aplicada a
tumor, Instituto de Patologia, Universidade de Heidelberg,
Heidelberg, Alemanha.
representando a expresso ativa de oncogenes do
HPV (40) (Figura 14.5). Alm disso, em combinao
com a expresso aumentada de outros fatores do
hospedeiro, tais como o Ki67, a expresso em excesso
de p16 est altamente relacionada com infeces virais
transformadoras (Figura 14.6) (41).

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)

165

14.7 Mtodos de deteco do DNA do HPV


Historicamente, os mtodos utilizados para detectar o
DNA do HPV constituam ensaios de hibridizao direta
de sonda, tais como o dot blot e o southern blot. Esses
mtodos eram trabalhosos, demorados e apresentavam
baixa sensibilidade, sendo necessria uma grande
quantidade de DNA em amostras clnicas. Atualmente,
as aplicaes clnicas se baseiam em ensaios altamente
padronizados, que simplificam o manuseio da amostra
e envolvem alguma forma de amplificao para a
realizao do teste. A Tabela 14.2 mostra os testes
atualmente aprovados pela Administrao de Alimentos
e Drogas dos Estados Unidos da Amrica (FDA, do ingls
United States of America Food and Drug Administration).
O teste de captura hbrida (CH2), desenvolvido pela
Digene (Qiagen), foi amplamente utilizado em estudos
anteriores, tendo sido o primeiro ensaio aprovado
pela FDA. O CH2 um ensaio semiquantitativo com

excelentes comparaes interlaboratoriais e alto VPN


para leses NIC2/3 (42). Alm disso, foi desenvolvida
uma verso de baixo custo para realizao em locais
com poucos recursos, necessitando apenas um
mnimo de equipamentos e treinamento, e de execuo
semelhante de um teste rpido (43).
Embora o teste careHPV tenha sido, por longo tempo,
utilizado apenas em pesquisa, atualmente ele est
disponvel para uso clnico. Sua sensibilidade para
NIC2+ em uma ampla triagem na China foi de 90%,
no sendo significativamente diferente do CH2, com o
qual foi comparado. Dessa forma, o teste considerado
promissor como um mtodo de triagem primria para a
preveno de cncer cervical em regies com recursos
limitados (43). Os resultados no diferenciam os tipos de
HR presentes, mas so indicativos da presena de um ou
mais tipos includos no ensaio.

HSIL persistente

HSIL regressivo

Progresso do HSIL
% de ncleos positivos para p53 na
metade profunda do epitlio

Regresso
Persistncia

% de ncleos positivos para protenas


do retinoblastoma na metade profunda
do epitlio

Figura 14.6
Vrios marcadores de fatores de risco viral e do hospedeiro com HSIL. Centro: Grfico de disperso da
deteco da protena do retinoblastoma (pRb) e p53 na metade inferior do epitlio de leses HSIL que
persistem (tringulos vermelhos) ou regridem (crculos azuis abertos) durante o acompanhamento. Esquerda:
HSIL persistente. Direita: HSIL com regresso (41).
Fonte: reproduzido com permisso da American Journal of Surgical Pathology.
166

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 14.2: Testes de HPV aprovados pela FDA


Testes

Fabricante

Mtodo

Tipos (alvo)

Captura hbrida (CH2)

Quiagen (Valencia, CA, EUA)

Amplificao de sinal

HR 13 (DNA genmico)

Cervista HPV HR

Hologic (Bedford, MA, EUA)

Amplificao de sonda (InvaHR 14 (DNA proprietrio)


der Technology)

Cervista HPV 16/18

HPV16/18

APTIMA HPV

Amplificao do alvo (ampliGenProbe (So Diego, CA, EUA) ficao mediada por transcrio)

HR 14 (RNA de E6/E7)

Cobas HPV

Roche (Pleasanton, CA, EUA)

HR 14 (DNA de L1)

Amplificao do alvo (PCR)

FDA: Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica; HPV: papilomavrus humano; HR: tipos de alto risco; PCR: reao em
cadeia da polimerase.

Recentemente, em uma avaliao de vrios ensaios


de reao em cadeia da polimerase (PCR, do ingls
polymerase chain reaction) para a triagem primria e
deteco precoce de leses de alto grau, a sensibilidade
dos ensaios de amplificao do alvo para o diagnstico
de NIC2+ foi registrada como alta, de aproximadamente
96% (34, 44). Por exemplo, o teste para HPV COBAS
4800, aprovado recentemente pela FDA, que utiliza uma
preparao automatizada de amostra combinada com a
tecnologia de PCR em tempo real para detectar o HPV
HR 14 em um nico tubo, foi comparado favoravelmente
CH2, com sensibilidade e especificidade clnicas no
inferiores s desta (44). De forma similar, nos resultados
finais, recentemente publicados, da triagem POpulationBased SCreening study Amsterdam (POBASCAM) uma
triagem controlada, randomizada, de base populacional
um ensaio de PCR para L1 (GP5+/6+) levou a uma
deteco mais precoce de NIC2 clinicamente relevantes
ou piores, corroborando o uso do teste de DNA em
todas as mulheres de 29 anos de idade ou mais (34).
Os ensaios baseados em PCR que apresentam a regio
L1 como alvo so conhecidos como ensaios de PCR
consensos para L1. Os diferentes ensaios utilizam
iniciadores distintos: o MY09/MY11, substitudo
posteriormente pelos iniciadores PGMY09/11, resulta
em um amplicon de 450pb (45). Outros conjuntos de
iniciadores descritos incluem o GP5+/6+, produzindo um
amplicon de, aproximadamente, 160pb (46), enquanto
o SPF10 produz um amplicon pequeno, de 65pb (47 ).
O sistema PGMY09/11 est disponvel comercialmente
como o teste Linear Array HPV Genotyping Test (Qiagen)
ou o Multiplex HPV Genotyping Kit (Multimetrix,
Heidelberg). Para os tecidos embebidos em parafina,

principalmente aqueles arquivados, prefervel o uso


dos ensaios que detectam amplicons pequenos, tais
como os iniciadores SPF, uma vez que o DNA dever
estar degradado.
Para os passos seguintes em cada um desses
ensaios, o leitor deve se reportar ao manual de HPV da
Organizao Mundial da Sade (OMS), o qual detalha
cada etapa, incluindo a descrio dos iniciadores,
controles apropriados, preveno de contaminao,
interpretao de dados, etc. (48).

Ensaios de mRNA de HPV


Alm dos ensaios de DNA, outros testes detectam a
expresso do mRNA dos oncogenes E6/E7 (49, 50).
Os princpios desses ensaios moleculares esto descritos
nos seguintes tpicos (51):

Pr-anlise
So essenciais a utilizao dos espcimes adequados
e o manuseio apropriado de amostras clnicas para
a obteno de resultados precisos. Para a deteco
de HPV, as amostras adequadas incluem aquelas
coletadas por hastes, raspagem e bipsia de tecidos.
O manuseio apropriado das hastes inclui o transporte
seco ou em um meio de transporte para vrus, enquanto
que as raspagens e bipsias so coletadas em meio
de transporte viral. O transporte deve ser realizado
em temperatura ambiente em 24 horas ou em at
quatro dias a 4C. Os ensaios com a aprovao da FDA
especificam os mtodos de coleta e armazenamento, e
os resultados no devem ser considerados vlidos caso
haja irregularidades na coleta e armazenamento.

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)

167

Anlise
Aps a coleta do espcime, deve-se proceder extrao
ou liberao do cido nucleico das amostras. Os
ensaios aprovados pela FDA especificam os mtodos
de processamento ou extrao para cada ensaio. Os
resultados no so considerados vlidos se houver
modificaes na realizao do processamento ou
extrao. O uso de ensaios comerciais no isenta os
laboratrios da necessidade de manter mtodos de
garantia de qualidade (GQ) e controle de qualidade (CQ)
vigentes. A incluso de cepas celulares como controles
negativos e positivos pode ser til para o monitoramento
dos resultados. O processamento de gua em todos
os passos do ensaio particularmente crucial para o
monitoramento de resultados falso-positivos, que podem
ocorrer por meio da contaminao cruzada de amostras.
Alguns ensaios incluem um alvo endgeno da clula
hospedeira, tal como a -globulina, para monitorar a
presena de DNA passvel de amplificao. Amostras
negativas para o alvo endgeno e para o HPV no podem
ser interpretadas. Os ensaios aprovados clinicamente
incluem as diretrizes para o monitoramento e relato
de ensaios. Os ensaios desenvolvidos em laboratrios,
in-house, otimamente verificados, podem tambm ser
utilizados no diagnstico de rotina. Sempre que um ensaio
comercialmente aprovado estiver disponvel, as autoridades
de credenciamento devem recomendar sua utilizao.
Uma das vantagens desse procedimento que os ensaios
comerciais normalmente incluem reagentes com qualidade
controlada, assim como controles apropriados.

Garantia da qualidade laboratorial


Devem ser seguidas as boas prticas microbiolgicas,
incluindo os controles positivo e negativo apropriados.
A participao em painis de proficincia e programas
de GC essencial para determinar o desempenho do
ensaio, devendo-se envidar o mximo esforo para a
realizao de tais programas para cada analito.

Epidemiologia/teste em pesquisa
Vrios ensaios comerciais e in-house so usados
na epidemiologia e pesquisa. Eles variam quanto s
caractersticas de desempenho, como ressaltado por
estudos de proficincia global para a determinao do
tipo de HPV (52). A Tabela 14.3 mostra exemplos de

168

ensaios atualmente disponveis comercialmente que


apresentam o DNA ou mRNA como alvo. Os laboratrios
que buscam providenciar dados para o monitoramento
da resposta vacinao devem ser incentivados a seguir
as diretrizes que constam no Manual de Laboratrio de
HPV da OMS (ver adiante a seo 14.8 sobre a LabNet
de HPV).
Tabela 14.3 Vrios ensaios para HPV disponveis
atualmente, com nome, alvo e iniciado
Tipo de ensaio para HPV

Regio do HPV alvo


(iniciador)

Todos os ensaios

L1/E1/E6/E7

Linear Array (Roche)

L1 (PGMY)

PGMY-RBH

L1 (PGMY)

InnoLiPA (Innogenetics)

L1 (SPF10)

CLART (Genomica)

L1 (PGMY)

DNA chip (Biocore)

L1

Microarray (Genetel)

L1

Ensaios DEIA LiPA

L1 (SPF10)

Microarray (Papillocheck)

E1

PCR tipo especfica (GenolD)

L1

PCR in-house Luminex

L1 (PGMY-GP)

PCR Luminex (Multimetrix)

L1 (GP)

PCR EIA (GenoID)

L1

RealTime para HPV de alto


risco da Abbott

L1

Teste para HPV Amplicor

L1

APTIMA Gen-Probe (TMA)

E6/E7

NucliSENS EasyQ HPV

E6/E7

14.8 Desenvolvimento de uma rede de


laboratrios de HPV da OMS, LabNet
Um grupo de especialistas conveniados OMS se
encontrou em Genebra em 2005 e recomendou o
estabelecimento de uma rede global de laboratrios de
HPV, a LabNet, visando contribuir com a melhoria da
qualidade dos servios laboratoriais para a vigilncia
eficiente e com o monitoramento do impacto da
vacinao para HPV, alm de realizar treinamentos
(53-55). Previu-se que a LabNet de HPV aceleraria
a introduo das vacinas para HPV, pelo auxlio
implementao de procedimentos laboratoriais validados
e padres, pelo desenvolvimento de um sistema de
GQ e de teste de proficincia, pelo treinamento de

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

funcionrios e pela disponibilizao de uma rede de


vigilncia. A LabNet de HPV da OMS foi criada mediante
um financiamento da Fundao Gates e permaneceu em
operao sob a gide da OMS de 2006 a 2010. Durante
esses quatro anos de operao, a LabNet priorizou as
atividades centrais de desenvolvimento dos padres
internacionais para os ensaios de DNA e sorologia para
HPV, padronizao dos ensaios e desenvolvimento de
um manual laboratorial e um programa de treinamento
enfatizando a GQ e o CQ. A LabNet auxiliou o Instituto
Nacional de Padres e Controle Biolgicos (NIBSC, do
ingls National Institute for Biological Standards and
Control) a desenvolver os padres internacionais do DNA
dos tipos 16 e 18 do HPV e anticorpos do tipo 16, os
quais esto disponveis no catlogo do NIBSC. O Manual
de Laboratrio de HPV da OMS foi publicado em 2009
com base no conhecimento e experincia adquiridos
por meio dos estudos de colaborao internacional,
e est disponvel por meio da OMS (55). O manual
visa auxiliar o estabelecimento do apoio laboratorial
necessrio implementao e monitoramento dos
programas de vacinao para HPV, e tem por foco os
ensaios epidemiolgicos, no os clnicos. Os laboratrios
membros da LabNet de HPV continuam a trabalhar em

conjunto no sentido de manter uma rede de especialistas


em testagem otimizada para HPV, e se renem
anualmente durante a Conferncia Internacional de
Papilomavrus.

Marcadores de progresso
Nem todas as mulheres com infeco persistente por
HPV HR, ou com NIC 3, progridem para cncer cervical,
caso no sejam tratadas. Dessa forma, esto sendo
investigados outros marcadores para atuar como
preditores de progresso, tais como o p16. Esses
marcadores de progresso, juntamente com a deteco
de HPV HR, prometem oferecer um diagnstico mais
preciso de displasias de alto grau (40, 41).

14.9 Concluses
Uma enorme quantidade de informaes sobre HPV e
doenas relacionadas tem sido disponibilizada, incluindo
muitas tecnologias novas para a deteco do HPV.
importante que se utilizem testes apropriados, seja para
aplicaes clnicas ou para propsitos epidemiolgicos.
Alm disso, para garantir uma melhor qualidade dos
resultados, os laboratrios que realizam esses ensaios
devem aderir s prticas de GQ e CQ.

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)

169

Pontos principais:
Os HPV oncognicos so causas necessrias da maioria dos cnceres cervicais e de uma alta proporo de
outros cnceres anogenitais, incluindo alguns da orofaringe. Os HPV genitais so extremamente comuns;
aproximadamente 80% das pessoas sexualmente ativa so infectadas em algum momento de suas vidas.
A infeco persistente por HPV oncognico um pr-requisito para o desenvolvimento de leses precursoras e
neoplasia subsequente.
O cncer um desfecho raro dessa infeco genital, embora esta seja muito comum.
Os tipos 16 e 18 do HPV causam regularmente 70% dos cnceres cervicais em todo mundo.
A leso precursora para o cncer cervical a neoplasia intraepitelial cervical de grau 3 (NIC 3); os tipos 16 e
18 causam 50% desses casos.
A deteco do HPV baseia-se em tecnologia molecular, uma vez que o vrus no pode ser prontamente
cultivado pelos mtodos de diagnstico virais tradicionais, e a sorologia no sensvel. A triagem primria
de HPV est sendo incorporada triagem de cncer cervical em vrias combinaes com a citologia cervical
tradicional (teste de esfregao Pap).
Os ensaios utilizados clinicamente para a triagem de NIC3 ou cncer so diferentes daqueles utilizados em
estudos epidemiolgicos, tais como a vigilncia antes e aps a implementao de programas de vacinao.
Atualmente, no h indicaes clnicas para a testagem de HPV LR. Testes clnicos exigem uma padronizao
cuidadosa para a coleta, processamento e teste de amostras, com correlao aos desfechos clnicos (e no
analticos).
importante haver alta GC e CQ para a deteco de HPV. A LabNet de HPV da OMS, em colaborao com a
NIBSC, desenvolveu padres internacionais para o DNA de ambos os HPV 16 e 18 e de anticorpos para o HPV
16.
Para os ensaios de deteco de HPV, o cuidado na coleta de amostras clnicas e no transporte para o
laboratrio, assim como para o subsequente manuseio, imprescindvel para a preveno de contaminao e
ensaios falso-positivos.
A deteco de DNA do HPV um excelente preditor negativo (se o HPV HR no for detectado, improvvel
que a doena se manifeste), mas h muitos resultados falso-positivos na predio de doenas. Uma pesquisa
em andamento est investigando a utilidade de certos marcadores de progresso a fim de melhorar a
especificidade para desfechos clnicos importantes.
Com programas de sade adequados para a vacinao contra o HPV, o valor preditivo positivo da citologia
para detectar displasias em alto grau ir diminuir e, no futuro, ser provvel a utilizao de vrios mtodos
moleculares para a deteco do HPV.

170

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

14.10 Referncias
1. Stoler MH. Human papillomavirus biology and
cervical neoplasia: implications for diagnostic
criteria and testing. Archives of Pathology and
Laboratory Medicine, 2003, 127(8):935939.
2. de Villiers EM et al. Classification of
papillomaviruses. Virology, 2004, 324(1):1727.
3. Schiffman M et al. Classification of weakly
carcinogenic human papillomavirus types: addressing
the limits of epidemiology at the borderline. Infectious
Agents and Cancer, 2009, 4:18.
4. Van Ranst M, Kaplan JB, Burk RD. Phylogenetic
classification of human papillomaviruses:
correlation with clinical manifestations. Journal of
General Virology, 1992, 73(10):26532660.
5. Garland SM et al. Natural history of genital warts:
analysis of the placebo arm of 2 randomized phase
III trials of a quadrivalent human papillomavirus
(types 6, 11, 16, and 18) vaccine. Journal of
Infectious Diseases, 2009, 199(6):805814.
6. Grulich AE et al. Cancers attributable to human
papillomavirus infection. Sexual Health, 2010,
7(3):244252.
7. Bosch FX et al. Prevalence of human papillomavirus
in cervical cancer: a worldwide perspective.
International biological study on cervical cancer
(IBSCC) Study Group. Journal of the National
Cancer Institute, 1995, 87(11):796802.
8. Clifford GM et al. Human papillomavirus types
in invasive cervical cancer worldwide: a metaanalysis. British Journal of Cancer, 2003,
88(1):6373.
9. Muoz N et al. Epidemiologic classification of
human papillomavirus types associated with
cervical cancer. New England Journal of Medicine,
2003, 348(6):518527.
10. Wallboomers JM et al. Human papillomavirus is
a necessary cause of invasive cervical cancer
worldwide. Journal of Pathology, 1999, 189(1):1219.

11. de Sanjose S et al. Human papillomavirus


genotype attribution in invasive cervical cancer:
a retrospective cross-sectional worldwide study.
Lancet Oncology, 2010, 11(11):10481056.
12. DSouza G et al. Case-control study of human
papillomavirus and oropharyngeal cancer.
New England Journal of Medicine, 2007,
356(19):19441956.
13. Hong AM et al. Squamous cell carcinoma of the
oropharynx in Australian males induced by human
papillomavirus vaccine targets. Vaccine, 2010,
28(19):32693272.
14. Carter JJ et al. Comparison of human
papillomavirus types 16, 18, and 6 capsid antibody
responses following incident infection. Journal of
Infectious Diseases, 2000, 181(6):19111919.
15. Wallin KL et al. Type-specific persistence of human
papillomavirus DNA before the development of
invasive cervical cancer. New England Journal of
Medicine, 1999, 341(22):16331638.
16. McCredie MR et al. Natural history of cervical
neoplasia and risk of invasive cancer in women
with cervical intraepithelial neoplasia 3: a
retrospective cohort study. Lancet Oncology, 2008,
9(5):425434.
17. Muoz N et al. Chapter 1: HPV in the etiology of
human cancer. Vaccine, 2006, 24(Suppl 3):S110.
18. Moore EE et al. The roles of genetic and
environmental factors on risk of cervical cancer: a
review of classical twin studies. Twin Research and
Human Genetics, 2012, 15(1):7986.
19. Dunne EF, Markowitz LE. Genital human
papillomavirus infection. Clinical Infectious
Diseases, 2006, 43(5):624629.
20. Garland SM et al. Human papillomavirus prevalence
among indigenous and non-indigenous Australian
women prior to a national HPV vaccination program.
BMC Medicine, 2011, 9:104.
21. Rissel CE et al. Sex in Australia: first experiences
of vaginal intercourse and oral sex among a

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)

171

representative sample of adults. Australian


and New Zealand Journal of Public Health, 2003,
27(2):131137.

men who have sex with men: a systematic review


and meta-analysis. Lancet Oncology, 2012,
13(5):487500.

22. Nielsen A et al. Type-specific HPV infection and


multiple HPV types: prevalence and risk factor
profile in nearly 12,000 younger and older Danish
women. Sexually Transmitted Diseases, 2008,
35(3):276282.

31. Cuzick J et al. Overview of human papillomavirusbased and other novel options for cervical cancer
screening in developed and developing countries.
Vaccine, 2008, 26(Suppl 10):K29K41.

23. Giuliano AR et al. The human papillomavirus


infection in men study: human papillomavirus
prevalence and type distribution among men
residing in Brazil, Mexico, and the United States.
Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention,
2008, 17(8):20362043.
24. Giuliano AR et al. Incidence and clearance
of genital human papillomavirus infection in
men (HIM): a cohort study. The Lancet, 2011,
377(9769):932940.
25. Stanley M. Immunobiology of HPV and HPV
vaccines. Gynecologic Oncology, 2008, 109(2
Suppl):S1521.
26. Shope RE. Immunization of rabbits to infectious
papillomatosis. Journal of Experimental Medicine,
1937, 65(2):219231.
27. Garland SM, Smith JS. Human papillomavirus
vaccines: current status and future prospects.
Drugs, 2010, 70(9):10791098.
28. Somers GR et al. Juvenile laryngeal papillomatosis
in a pediatric population: a clinicopathologic study.
Pediatric Pathology and Laboratory Medicine, 1997,
17(1):5364.
29. Darragh TM et al. The lower anogenital
squamous terminology standardization project
for HPV-associated lesions: background and
consensus recommendations from the College of
American Pathologists and the American Society
for Colposcopy and Cervical Pathology. Archives
of Pathology and Laboratory Medicine, 2012,
136(10):12661297.
30. Machalek DA et al. Anal human papillomavirus
infection and associated neoplastic lesions in

172

32. Garland SM, Tabrizi S. HPV DNA testing: potential


clinical applications. International Journal of Health
Promotion and Education, 2006, 44(3):107112.
33. Kjaer SK et al. Type specific persistence of high
risk human papillomavirus (HPV) as indicator of
high grade cervical squamous intraepithelial lesions
in young women: population based prospective
follow up study. British Medical Journal, 2002,
325(7364):572575.
34. Rijkaart DC et al. Human papillomavirus testing for
the detection of high-grade cervical intraepithelial
neoplasia and cancer: final results of the
POBASCAM randomised controlled trial. Lancet
Oncology, 2012, 13(1):7888.
35. Rijkaart DC et al. Evaluation of 14 triage strategies
for HPV DNA-positive women in population-based
cervical screening. International Journal of Cancer,
2012, 130(3):602610.
36. Ronco G et al. Efficacy of human papillomavirus
testing for the detection of invasive cervical cancers
and cervical intraepithelial neoplasia: a randomised
controlled trial. Lancet Oncology, 2010, 11(3):249257
37. Solomon D et al. Comparison of three management
strategies for patients with atypical squamous cells
of undetermined significance: baseline results from
a randomized trial. Journal of the National Cancer
Institute, 2001, 93(4):293299.
38. Moore EE et al. Clearance of human papillomavirus
in women treated for cervical dysplasia. Obstetrics
and Gynecology, 2011, 117(1):101108.
39. Sankaranarayanan R et al. HPV screening for
cervical cancer in rural India. New England Journal
of Medicine, 2009, 360(14):13851394.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

40. Klaes R et al. p16INK4a immunohistochemistry


improves interobserver agreement in the
diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia.
American Journal of Surgical Pathology, 2002,
26(11):13891399.
41. Baak JP et al. Combined p53 and retinoblastoma
protein detection identifies persistent and
regressive cervical high-grade squamous
intraepthelial lesions. American Journal of Surgical
Pathology, 2005, 29(8):10621066.
42. Snijders PJ, van den Brule AJ, Meijer CJ. The
clinical relevance of human papillomavirus testing:
relationship between analytical and clinical
sensitivity. Journal of Pathology, 2003, 201(1):16.
43. Qiao YL et al. A new HPV-DNA test for cervicalcancer screening in developing regions: a crosssectional study of clinical accuracy in rural China.
Lancet Oncology, 2008, 9(10):929936.
44. Heideman DA et al. Clinical validation of the
Cobas 4800 HPV test for cervical screening
purposes. Journal of Clinical Microbiology, 2011,
49(11):39833985.
45. Gravitt PE et al. Improved amplification of genital
human papillomaviruses. Journal of Clinical
Microbiology, 2000, 38(1):357361.
46. de Roda Husman AM et al. The use of general
primers GP5 and GP6 elongated at their 3 ends
with adjacent highly conserved sequences improves
human papillomavirus detection by PCR. Journal of
General Virology, 1995, 76(4):10571062.
47. Kleter B et al. Novel short-fragment PCR assay
for highly sensitive broad-spectrum detection of
anogenital human papillomaviruses. American
Journal of Pathology, 1998, 153(6):17311739.

cancer. Journal of Clinical Microbiology, 2011,


49(2):557564.
50. Ratnam S et al. Clinical performance of the Pre Tect
HPV-Proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with
that of the Hybrid Capture 2 test for identification of
women at risk of cervical cancer. Journal of Clinical
Microbiology, 2010, 48(8):27792785.
51. Garland SM, Tabrizi SN. Pathogens relevant in
sexually transmitted infections. In: Kessler HH ed.
Molecular diagnostics of molecular diseases. Berlin/
New York, Walter De Gruyter, 2010: 177184.
52. Eklund C et al. The 2010 global proficiency
study of human papillomavirus genotyping in
vaccinology. Journal of Clinical Microbiology, 2012,
50(7):22892298.
53. Pagliusi SR, Garland SM. International standard
reagents for HPV detection. Disease Markers, 2007,
23(4):283296.
54. Brotherton JM, Kaldor JM, Garland SM. Monitoring
the control of human papillomavirus (HPV) infection
and related diseases in Australia: towards a national
HPV surveillance strategy. Sexual Health, 2010,
7(3):310319.
55. Report of a WHO technical workshop on the role
of laboratory detection of human papillomavirus in
global disease prevention and control. Genebra,
Organizao Mundial da Sade, 2006 (http://www.
who.int/biologicals/ areas/human_papillomavirus/
HPV%20technical%20 workshop%2015-17%20
Aug%2005%2006%20845. pdf, acessado em 5 de
abril de 2013).

48. Unger ER, Dillner J, Zhou T, eds. Human


papillomavirus laboratory manual, 1o ed. Genebra,
Organizao Mundial da Sade, 2010.
49. Ratnam S et al. Aptima HPV E6/E7 mRNA test
is as sensitive as Hybrid Capture 2 assay but
more specific at detecting cervical precancer and

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)

173

Captulo 15
Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)
15.1 Introduo
Os primeiros casos da sndrome da imunodeficincia
adquirida (AIDS, do ingls acquired immunodeficiency
syndrome) foram descritos em 1981 e o vrus causador
da doena, o HIV, foi isolado pela primeira vez em 1983.
Desde ento, o vrus se espalhou pelo mundo, com uma
estimativa de 34 milhes de pessoas vivendo com HIV e
2,7 milhes de novas infeces s em 2010 (1). A frica
subsaariana foi a regio mais impactada, com 23,1
milhes de pessoas vivendo com HIV e uma estimativa de
1,9 milhes de novas infeces em 2010. A prevalncia
do HIV alcanou >30% entre adultos em alguns pases.
Apesar do desenvolvimento da terapia antirretroviral e da
expanso da cobertura do tratamento para muitos pases
com recursos limitados, estima-se que para cada pessoa
que inicia o tratamento haja 2-3 novas infeces por
HIV-1. Dessa forma, na ausncia de uma vacina efetiva, o
diagnstico de HIV acessvel, com aconselhamento para
preveno, e o encaminhamento de pessoas infectadas
por HIV para receber cuidados apropriados so estratgias
importantes para desacelerar a propagao da epidemia.
O HIV transmitido principalmente por meio de trocas de
fluidos corporais, que podem ocorrer por via sexual e por
sangue ou produtos sanguneos contaminados. Gestantes
infectadas por HIV tambm podem transmitir o vrus para
a criana durante a gravidez, parto (transmisso perinatal)
ou por meio da amamentao (transmisso ps-natal). A
transmisso do HIV tambm reportada em seguida ao
transplante de rgos, quando se descobre posteriormente
que o doador era HIV positivo. Atualmente, para garantir
a segurana, o sangue, os produtos sanguneos e os
doadores de rgos so testados rotineiramente para a
presena de HIV ou anticorpos para HIV, a fim de eliminar a
possibilidade de transmisso do vrus.
O HIV pertence famlia Retroviridae, subfamlia dos
lentivirus, da qual fazem parte vrus similares tais
como o vrus Maedi-Visna, o vrus da artrite encefalite
caprina, o vrus da anemia infecciosa equina e o vrus
da imunodeficincia em smios. O vrion apresenta,
aproximadamente, 100nm em dimetro, com um capsdeo

cnico que contm duas cpias de RNA genmico (Figura


15.1). A protena do capsdeo, p24, o principal componente
do vrus, sendo coberta por um envelope lipdico contendo
duas glicoprotenas, gp41 e gp120. Essas glicoprotenas de
superfcie so importantes para a ligao s clulas T-CD4,
o primeiro passo para o processo de infeco, assim como
para a gerao de resposta imune do hospedeiro contra
o vrus. O HIV altamente divergente e existem vrios
subtipos ou clados diferentes no mundo. Subtipos distintos
so mais prevalentes nas diferentes regies do planeta.
Alm disso, existem dois tipos principais de HIV, o HIV-1 e
o HIV-2. O HIV-1 subdividido em trs grupos: M (subtipos
A-K), N e O. O HIV-1 o vrus mais comum, dominando a
epidemia, com diversos subtipos e vrus recombinantes.
O HIV-2 ocorre principalmente no Oeste da frica, com
registro de casos isolados em vrios pases no mundo.
Existem algumas diferenas entre os subtipos do HIV-1,
mas, para fins de diagnstico, eles apresentam uma forte
reao cruzada. Assim, os antgenos/protenas derivados
de um nico subtipo so adequados para o diagnstico da
infeco, independentemente dos subtipos prevalentes. Em
virtude da reao cruzada entre HIV-1 e HIV-2, antgenos
especficos adicionais so necessrios para diagnosticar de
forma precisa a infeco por HIV-2.

15.2 Testes de diagnstico


15.2.1 Diagnstico sorolgico da infeco por HIV
O diagnstico sorolgico da infeco por HIV
obtido, rotineiramente, por meio da deteco de
anticorpos para HIV no sangue ou em outros fluidos
corporais. Os anticorpos so induzidos, em mdia, em,
aproximadamente, 4-6 semanas aps a infeco, embora,
em alguns casos, o desenvolvimento de anticorpos
detectveis pode levar at 3-6 meses aps a infeco.
Dessa forma, a infeco por HIV no pode ser excluda
com base em um teste negativo realizado 4-6 semanas
aps a exposio documentada. Durante o perodo inicial
da replicao viral, os anticorpos esto ausentes e o
diagnstico do HIV pode no ser feito de forma precisa,

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)

175

utilizando testes que se baseiam apenas em anticorpos.


O perodo de janela agudo pode ser reduzido por meio do
uso de mtodos que detectam diretamente um ou mais
componentes (antgeno p24 ou RNA) do HIV. A replicao
viral no corpo induz tanto a resposta imune humoral como a
mediada por clulas, que reduz o nvel de vrus a um ponto
definido. A presena de vrus detectveis na maioria dos
indivduos no tratados continua a estimular a resposta de
clulas B e o nvel de anticorpos permanece alto ao longo
do perodo subsequente, a menos que o paciente esteja
altamente imunocomprometido, como nos estgios tardios
da doena. Assim, a deteco de anticorpos especficos
para HIV um marcador bastante confivel para o
diagnstico da infeco pelo vrus (Figura 15.2).
Existem trs usos principais para o teste de HIV: garantir
a segurana de sangue, de produtos sanguneos ou de
rgos transplantados; realizar vigilncia; e efetuar o
diagnstico de indivduos/pacientes. O exame realizado
para a segurana de sangue, normalmente, usa os
procedimentos de teste mais sensveis e sofisticados para
detectar tanto o anticorpo para HIV quanto o antgeno ou o
RNA do HIV-1, a fim de reduzir o perodo de janela.
15.2.1.1 Imunoensaios enzimticos (EIA)
Logo aps a descoberta do HIV, os EIA foram
desenvolvidos para o diagnstico da infeco por HIV.
Esses EIA detectavam anticorpos especficos para HIV,
um indicador de infeco por HIV, e utilizavam lisados
virais como antgenos. Os ensaios de primeira gerao
foram, mais tarde, substitudos pelos de segunda gerao,
que empregam antgenos mais especficos na forma
de peptdeos sintticos ou protenas recombinantes.
Esses ensaios eram mais sensveis e especficos para
detectar anticorpos para HIV. Entretanto, eles ainda
no identificavam respostas precoces de anticorpos na
forma de IgM (imunoglobulina M), devido ao seu formato
e desenho. A terceira gerao de EIA utiliza um formato
sanduche, que inclui antgenos marcados com enzima
e so capazes de detectar respostas de IgM precoce,
reduzindo, assim, o perodo de janela. Nos ltimos anos,
novos EIA de quarta gerao foram desenvolvidos para
reduzir ainda mais o perodo de janela, por meio da
combinao da deteco do antgeno viral (p24), alm dos
anticorpos para HIV (Figura 15.2). Os EIA de combinao
antgeno-anticorpo so muito sensveis para detectar

176

a infeco aguda por HIV antes do desenvolvimento de


anticorpos e, atualmente, so utilizados rotineiramente
para a triagem de sangue e produtos sanguneos em
muitos pases. Embora os ensaios moleculares possam
detectar o cido nucleico viral alguns dias antes que o
antgeno p24 possa ser detectado pelos EIA de quarta
gerao, o custo e a complexidade da deteco de cido
nucleico pode exceder os benefcios, exceto em bancos de
sangue sofisticados.
Embora os EIA sejam ensaios qualitativos, uma reviso
aprofundada dos valores de densidade ptica pode ser de
utilidade. Os ensaios com taxa de sinais/cut-off alta tm
mais probabilidade de resultado positivo para o HIV do que
aqueles com taxa de sinais/cut-off baixa.
gp120

Glicoprotena
de ancoragem

Membrana
lipdica

gp41

Glicoprotena
transmembrana

Capsdeo
Matriz

Transcriptase
reversa

Figura 15.1
Estrutura e organizao da partcula viral do HIV

Anticorpo
para HIV

1 gerao
3 gerao
4 gerao

Infeco
indetectvel

Infeco
Aguda

2 gerao

Dias desde a infeco

Figura 15.2
Dinmica precoce da replicao viral e
desenvolvimento de anticorpos com marcadores da
infeco por HIV. Mostra-se o tempo aproximado
da deteco dos anticorpos pelos imunoensaios
enzimticos de primeira, segunda, terceira e quarta
geraes.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Dessa forma, o valor preditivo positivo (VPP) de um


ou dois resultados de EIA reativos ser muito maior
se os resultados forem interpretados no contexto do
sinal. Os ensaios com sinal baixo, mesmo com dois
EIA reativos, devem ser testados em seguida com um
teste mais especfico ou por meio de uma amostra de
acompanhamento para a confirmao da infeco.
15.2.1.2 Testes rpidos
Nos ltimos anos, houve uma migrao progressiva
do diagnstico do HIV dos laboratrios para locais no
laboratoriais, como um resultado da disponibilidade
de vrios testes rpidos para HIV. No mundo, mais
de 100 milhes de pessoas foram testadas com
testes rpidos para HIV, apenas em 2011. Os testes
rpidos para HIV apresentam, principalmente, dois
formatos diferentes, os quais incluem dispositivos
para imunoconcentrao e cassetes ou tiras de fluido
lateral (Figura 15.3). Uma vez que os testes rpidos
foram desenvolvidos para detectar anticorpos para HIV
em poucos minutos (1-15 min), quando comparados
aos EIA, que podem levar 2-4 horas, os dispositivos
so otimizados para acelerar a interao antgenoanticorpo. Isso requer o uso de altas concentraes de
antgeno e a deteco de complexos antgeno-anticorpo
com reagentes coloridos sensveis, tais como o ouro
coloidal. Os testes rpidos so ideais para fornecer
resultados no mesmo dia em diversas situaes, tais
como a realizao de testes em populaes de difcil
acesso, testagem e aconselhamento em domiclio,
testagem por iniciativa do servio, teste em gestantes
e realizao de testagem mvel. Os testes rpidos
para HIV so, frequentemente, utilizados em locais
com baixa demanda de espcimes, para oferecer uma
alternativa de bom custo-efetividade. Eles podem ser
realizados utilizando soro, plasma ou sangue total, com
a vantagem do uso de amostras coletadas por meio
da puno digital. Os testes rpidos so de realizao
simples e podem ser utilizados em ambientes externos
ao laboratrio por trabalhadores ou consultores leigos
treinados, expandindo assim o acesso testagem
para HIV. A Organizao Mundial da Sade (OMS) e
os Centros de Controle e Preveno de Doenas dos
Estados Unidos da Amrica (CDC, do ingls United
States of America Centers for Disease Control and
Prevention) desenvolveram um amplo mdulo de

treinamento que aborda vrios assuntos, incluindo a


qualidade, preciso e segurana (2). Com a ampliao
da oferta de cuidado e tratamento, observa-se um
aumento nos esforos para fornecer aconselhamento
e testagem a milhes de pessoas no mundo, como um
componente importante de preveno.
Devido alta demanda e a um mercado ampliado,
existem mais de 50 tipos kits de testes disponveis em
todo o mundo, nem todos, porm, com caractersticas
de desempenho desejadas. importante garantir que
os testes rpidos sejam fabricados com o maior nvel
de qualidade possvel, de acordo com as boas prticas
de fabricao, e que apresentem caractersticas de
desempenho equivalentes aos mtodos de diagnstico. A
OMS e os CDC possuem programas de qualificao para
avaliar a qualidade dos novos kits de teste rpido (3, 4).
Recentemente, foram desenvolvidos os testes rpidos
de quarta gerao, capazes de diagnosticar a infeco
aguda por HIV mediante a deteco do antgeno p24,
alm dos anticorpos para HIV. A deteco do antgeno
p24 pode reduzir o perodo de janela para poucos dias
e identificar pessoas que se encontram na fase aguda
da infeco. Entretanto, uma vez que a deteco da
infeco aguda um evento raro mesmo em locais com
alta prevalncia/incidncia, um teste de antgeno positivo
deve ser acompanhado pela realizao de exame em
quatro semanas ou mais para garantir a soroconverso.
Uma avaliao de campo recente desses testes rpidos
demonstrou que a sensibilidade e especificidade da
deteco do Ag ainda no aceitvel (5). Alm disso, uma
vez que essa tecnologia nova e as infeces agudas
so raras, seria importante a realizao de avaliaes de
campo adicionais que incluam a confirmao de todas
as potenciais infeces agudas por meio de teste de
cido nucleico. Assim como em qualquer outro teste, as
medidas da garantia de qualidade (GQ) so essenciais
para assegurar a preciso dos testes rpidos.

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)

177

negativo

positivo
negativo

positivo

(A)

(B)

Figura 15.3
Exemplos de teste rpido para HIV, mostrando (A)
dispositivo de imunoconcentrao por fluxo e (B)
dispositivo de fluxo lateral. So mostrados testes
rpidos com resultados positivo e negativo.
Foram desenvolvidos vrios testes rpidos que utilizam
espcimes de fluido oral (FO) coletados por meio de
uma haste. O FO contm 1/500-1/1.000 vezes menos
IgG que os espcimes sanguneos, mas o suficiente
para diagnosticar a infeco por HIV. A maioria dos
anticorpos no FO transferida passivamente a partir
do sangue e no produzida localmente, e contm um
complemento total de IgG do soro, embora com uma
concentrao mais baixa. Os testes de FO podem
simplificar ainda mais o teste para HIV, tornando-os
mais acessveis, enquanto reduzem os riscos biolgicos
associados aos testes que utilizam amostras de
sangue. Atualmente, pelo menos trs kits de testes
rpidos orais esto disponveis comercialmente.
15.2.1.3 Ensaios confirmatrios
Embora os ensaios individuais listados acima sejam
muito sensveis e especficos, resultados falso-positivos
ou falso-negativos podem ocorrer. Os resultados falsopositivos podem ter consequncias maiores em nvel
individual. Dessa forma, ensaios confirmatrios foram
desenvolvidos para corroborar os resultados positivos
iniciais. Esses ensaios confirmatrios, baseados em
diferentes formatos e princpios, incluem os ensaios de
imunofluorescncia (IFA, do ingls immunofluorescence
assay), western blot (WB) ou imunoensaios em linha
(LIA, do ingls line immunoassay). Os IFA envolvem
o uso de lminas com fixao de clulas infectadas

178

por HIV. Os anticorpos para HIV, se presentes, so


detectados por anticorpos secundrios marcados
com fluorescena e observados em microscpio de
fluorescncia. O IFA no mais usado rotineiramente
e foi substitudo por outros mtodos tais como o
WB ou LIA. Os WB e LIA envolvem o uso de tiras
de membrana com protenas especficas para HIV
ou protenas/peptdeos recombinante separados.
Essas tiras so analisadas por espcimes de soro.
Os anticorpos especficos para HIV so detectados
por anticorpos secundrios que so conjugados com
uma enzima, seguidos por um substrato que gera um
produto colorido. A Figura 15.4 mostra o padro tpico
de bandas no WB, indicando a presena de anticorpos
para protenas virais especficas e incluindo um
controle positivo que mostra todos os anticorpos
especficos para protenas virais passveis de
deteco com seu padro caracterstico (Linha P). Os
indivduos com infeces novas/recentes apresentam
anticorpos mais fracos e para menos protenas,
tipicamente a p24 e gp120/160. Conforme a infeco
progride, desenvolvem-se anticorpos para protenas
virais adicionais e estes se tornam mais fortes ao
longo do tempo, como observado nos indivduos
com infeces crnicas. Os LIA so similares ao
ensaio de WB, mas utilizam protenas ou peptdeos
recombinantes purificados, imunologicamente
importantes para o diagnstico. Os WB e LIA so
caros e requerem interpretao para estabelecer um
diagnstico baseado na combinao de anticorpos
para antgenos especficos (para p24 e uma ou mais
protenas do envelope) presentes no sangue. Esses
ensaios detectam somente IgG especfica para HIV.
Dessa forma, eles no podem ser utilizados para
confirmar a presena de IgM especfica para HIV ou
vrus, que so detectados por EIA mais sensveis de
terceira ou quarta gerao, respectivamente. Um
algoritmo de teste que envolve o uso de dois ou mais
EIA ou testes rpidos em um algoritmo seriado ou
paralelo pode fornecer resultados praticamente to
confiveis quanto os ensaios confirmatrios WB ou
LIA, mas a um custo bem menor.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Recente

Crnica

Figura 15.4
Ensaio de western blot confirmatrio e padro de
bandas de anticorpos que podem ser observados
durante infeces recentes (tiras 3-7) e infeces
crnicas (tiras 8-13). P, controle positivo; N, controle
negativo. Vrias protenas virais especficas so
mostradas prximas ao controle positivo.

15.2.2 Deteco do RNA, DNA ou p24 do HIV


O HIV tambm pode ser diagnosticado por meio da
deteco direta do vrus ou componentes virais (antgeno
p24, RNA ou DNA pr-viral). A deteco do vrus por
meio da cultura ou outros mtodos no realizada
rotineiramente, devido baixa sensibilidade quando
comparada aos mtodos imunolgicos e moleculares
padro e complexidade das tcnicas de cultura de
vrus. A deteco do antgeno p24 ou do RNA ou DNA
do HIV desempenha um papel importante quando no
possvel realizar o diagnstico com base em anticorpos,
tais como em crianas expostas no momento perinatal
ou a deteco de infeco aguda em adultos antes
do desenvolvimento de anticorpos para HIV (6-10). A
deteco molecular de cidos nucleicos alvo mais
sensvel que a deteco de p24.
Dependendo do estgio da infeco, o HIV pode
ser encontrado principalmente como DNA pr-viral
em clulas infectadas ou como RNA no sangue
(como um componente de partculas virais livres e
RNA intracelular). Kits comerciais esto disponveis
para detectar o DNA e/ou RNA qualitativamente ou
quantitativamente. Para fins de diagnstico, os ensaios

qualitativos so suficientes e apresentam aplicaes


para a deteco precoce de infeces por HIV em
adultos e crianas. A deteco da infeco aguda por
testes de amplificao de cido nucleico (NAAT, do
ingls nucleic acid amplification tests) tem aplicao
para o aumento da segurana de sangue ou produtos
sanguneos doados e, possivelmente, para populaes
de alto risco. Muitos bancos de sangue em pases
desenvolvidos ou em desenvolvimento utilizam NAAT
rotineiramente como parte de seus algoritmos de
testagem. Os indivduos com infeco aguda apresentam
carga viral elevada e tm alto risco de transmitir
a infeco a seus parceiros. Assim, a deteco de
indivduos com infeco aguda foi promovida como
parte da estratgia de preveno do HIV. Entretanto,
a deteco de casos agudos na maioria dos lugares
de baixo rendimento e alto custo, considerando o curto
perodo de janela (aproximadamente duas semanas).
Outra aplicao importante para os testes moleculares
o diagnstico precoce da infeco por HIV em
crianas com exposio perinatal. Uma vez que todas
as crianas nascidas de mes soropositivas adquiriram
passivamente anticorpos para HIV, os ensaios de rotina
baseados em anticorpos no podem ser utilizados para
confirmar ou excluir a possibilidade de infeco por
HIV. Anticorpos residuais em crianas no infectadas
persistem e podem ser detectados at os 18 meses de
idade. Assim, a deteco da presena ou ausncia de
RNA ou DNA para HIV em crianas com seis meses ou
mais o meio definitivo para diagnosticar a infeco
por HIV em crianas. Para o diagnstico infantil precoce
(DIP) em locais com limitaes de recursos, o sangue
pingado em papis-filtro e seco (mancha de sangue
seco; DBS, do ingls dried blood spot) como um modo
de facilitar a coleta, processamento, transporte e
armazenamento de espcimes de sangue. Com o
foco principal na preveno da transmisso vertical,
os ensaios moleculares para o diagnstico infantil
precoce foram implementados em um grande nmero
de laboratrios. Existem vrios ensaios comerciais
utilizados para o diagnstico de HIV em crianas.
Esses ensaios incluem a extrao manual de cidos
nucleicos ou as mais recentes plataformas moleculares
que oferecem a automao para a extrao de cidos
nucleicos e a deteco qualitativa do RNA e DNA do

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)

179

HIV-1. A extrao manual de cidos nucleicos requer um


nmero significativo de passos, havendo um potencial de
ocorrncia de erro humano ou contaminao na reao
em cadeia da polimerase (PCR, do ingls polymerase
chain reaction). Com a necessidade de alcanar
maior qualidade, as plataformas foram desenhadas
para minimizar a interveno do usurio e melhorar o
processamento de amostras. A deteco qualitativa
da infeco pelo HIV-1 em crianas foi apontada como
sensvel o suficiente para detectar 500 cpias de DNA/
mL, dependendo da fonte do espcime (plasma, sangue
total ou DBS). O agrupamento de espcimes, o qual
frequentemente realizado para detectar infeces
agudas em adultos, a fim de aumentar a eficincia
e reduzir os custos, no recomendado para DIP.
Infelizmente, os ensaios quantitativos para HIV no
so licenciados em muitos pases para o diagnstico,
mas apenas para o monitoramento da infeco por
HIV. Entretanto, o uso de um ensaio quantitativo de
RNA de HIV em espcimes de plasma antes do incio
do tratamento antirretroviral (ARV) o segundo teste
confirmatrio preferido.
Enquanto a realizao de testes sorolgicos rpidos
de qualidade para HIV se tornaram rotina em locais
perifricos, os testes point-of-care (POC) de PCR,
utilizando DNA, para os quais necessrio apenas
uma infraestrutura laboratorial mnima, est evoluindo
lentamente. Novas modalidades de testes POC, que
podem ser realizadas em locais com recursos limitados,
baseiam-se na amplificao isotrmica, com a deteco
rpida de sequncias-alvo. Alguns ensaios POC utilizam
instrumentos portteis pequenos e, geralmente, realizam
a extrao e amplificao do cido nucleico, amplificao
do sinal e deteco. Um estudo de campo desses testes
ser fundamental para validar a sua solidez e habilidade
de fornecer resultados acurados.

15.2.3 Algoritmos para testagem


Para o diagnstico de HIV, dois ou mais testes so
combinados em um algoritmo para aumentar o VPP
de um teste inicialmente positivo. Na maioria das
situaes, o algoritmo normalmente mais utilizado inclui
o uso de testes em srie ou sequenciais (algoritmo em
srie). Embora um resultado negativo seja geralmente
comunicado ao paciente com base em um nico teste,

180

um resultado positivo confirmado em seguida por um


segundo teste diferente. Baseando-se na especificidade
dos testes, e se a prevalncia do HIV for relativamente
alta (>5%) na populao, dois resultados positivos
so utilizados para diagnosticar a infeco. Em uma
populao de baixa prevalncia, um terceiro teste
recomendado antes que um diagnstico positivo para
HIV seja confirmado. O algoritmo em srie lgico e
custo-efetivo e inclui um teste mais sensvel como o
primeiro teste, seguido por um teste mais especfico,
para eliminar resultados falso-positivos. No entanto,
em algumas situaes, so utilizados algoritmos
paralelos, que incluem o uso simultneo de dois testes,
registrando-se o resultado como negativo ou positivo de
acordo com a concordncia dos resultados. No caso de
resultados discrepantes, ou um terceiro teste realizado
ou o paciente testado posteriormente para confirmar
ou excluir a ocorrncia de soroconverso recente. Os
algoritmos em paralelo podem ser mais custo-efetivos
em uma situao de alta prevalncia, grande volume de
pacientes ou na testagem de gestantes em trabalho de
parto. importante selecionar a combinao correta de
testes para assegurar um diagnstico preciso (11).

15.2.4 Espcimes em mancha de sangue seco


(DBS)
Embora a maioria dos ensaios de diagnstico seja
desenvolvida para utilizar sangue processado (espcimes
de soro ou plasma), a coleta de espcimes necessita
de um flebotomista experiente e equipamentos. Alm
disso, o transporte de espcimes lquidos depende de
refrigerao, a qual relativamente onerosa. O DBS
oferece uma alternativa simples e fcil de amostra para a
sorologia e teste molecular para HIV. Os EIA e WB foram
otimizados para trabalhar com espcimes DBS (12). Os
espcimes DBS podem ser coletados, armazenados e
transportados em temperatura ambiente. Normalmente,
realiza-se uma puno de 6mm para diluir os anticorpos
a fim de realizar o teste. Dependendo do ensaio utilizado,
geralmente, necessrio realizar algumas otimizaes
no ensaio para garantir a sensibilidade e especificidade
ideais (13). Com o sistema de ensaios otimizado, o DBS
o espcime ideal para a vigilncia do HIV.
Como descrito anteriormente, o DBS um espcime
conveniente, utilizado rotineiramente para o DIP em

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

muitos pases. Recentemente, os ensaios foram


otimizados e validados para o monitoramento de carga
viral com espcimes DBS. Aps o tratamento eficiente,
a carga viral plasmtica diminui rapidamente para nveis
abaixo do detectvel, em poucas semanas. Entretanto,
o RNA e o DNA intracelular persistiro e podero ser
detectados em espcimes DBS. Assim, o uso de DBS
para o monitoramento longitudinal de pacientes em
tratamento requer cautela.

15.3 Monitoramento laboratorial clnico da


infeco por HIV
15.3.1 Funo do teste de CD4 no monitoramento
clnico do HIV
A infeco por HIV leva ao desenvolvimento de AIDS,
a qual se caracteriza pela perda de clulas T-CD4,
necessrias ao funcionamento adequado do sistema
imune do indivduo. O teste de CD4 utilizado no
monitoramento clnico de pessoas infectadas por HIV
para determinar, adequadamente, quando iniciar a terapia
antirretroviral (TARV), para monitorar a eficincia do
tratamento com medicamentos antirretrovirais (ARV)
e para determinar quando se deve fornecer profilaxia
para infeces oportunistas. A OMS recomenda a TARV
para adultos e adolescentes infectados por HIV com a
contagem de CD4 <350 clulas/L, independentemente
dos sintomas clnicos (14). Em regies com recursos
limitados, a taxa para o incio da terapia difere de pas
para pas, mas normalmente, varia de 200 para 350
clulas/L. A contagem de CD4 tambm utilizada,
normalmente, como uma ferramenta para monitorar a
progresso da doena e a efetividade da TARV. Quando
um paciente no responde ao tratamento, os dados
de CD4 so utilizados para determinar a mudana

da terapia de primeira linha para a de segunda linha,


principalmente em pases nos quais o teste de carga
viral no est disponvel. A deciso de quando comear
a TARV crtica em pases com menos recursos, em um
contexto de maiores taxas de mortalidade e incidncia
de infeces oportunistas (15, 16). Quando a contagem
de CD4 diminui, os indivduos HIV-positivos apresentam
maior probabilidade de se infectarem por patgenos
oportunistas. A TARV utilizada quando a contagem
de clulas CD4 atinge um certo limiar para evitar o
desenvolvimento dessas infeces. A contagem de CD4
normal em crianas menores de cinco anos de idade
maior que em adultos e declina ao longo do tempo.
Isso torna difcil o acesso elegibilidade para TARV em
crianas com base na contagem absoluta de CD4. As
porcentagens de CD4 tm sido utilizadas para determinar
quando iniciar a TARV em crianas infectadas por HIV.
15.3.1.1 Princpios do ensaio de CD4
Em geral, a contagem de CD4 se refere determinao
do nmero de clulas T-CD4, tambm chamadas de
linfcitos CD4 ou clulas T auxiliares. Os ensaios de CD4
so utilizados para determinar a concentrao absoluta
de clulas CD4 no sangue total e/ou a porcentagem de
clulas CD4 na populao de linfcitos. A contagem de
CD4 normal situa-se entre 400-1.600 clulas/dL e a
porcentagem normal de CD4, entre 35-55% (17 ).
Os mtodos-padro para a contagem de CD4 utilizam
anticorpos monoclonais marcados para identificar as
molculas de superfcie de clulas sanguneas, tais
como CD4, CD3, CD8 e CD45. As principais clulas
brancas com anticorpos anti-CD4 e CD3 marcados esto
representadas na Figura 15.5.

Anti-CD4
Anti-CD3
com
com
marcao em marcao em
ouro
vermelho
Moncito

Clula B

Figura 15.5
Clulas sanguneas brancas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD3 marcados.

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)

181

10 0 101 10 2 10 3 10 4

CD45 PerCP

CD4 Cy5

R2
R1

10 0 101 10 2 10 3 10 4

800
0 200 400 600

Disperso lateral

1000

As clulas sanguneas que expressam as molculas de


superfcie de interesse so identificadas por citmetros
de fluxo, os quais detectam a marcao especfica de
cada anticorpo monoclonal. Os citmetros de fluxo
tambm diferenciam as clulas sanguneas por meio
da propriedade de difuso da luz pelas clulas. Como
um exemplo de teste de CD4, a Figura 15.6 mostra
uma anlise citomtrica de fluxo com grficos de
disperso de dois parmetros. O primeiro grfico de
disperso identifica a populao de clulas brancas
por meio da propriedade de disperso da luz e das
molculas de superfcie CD45. O quadro representado
por R1 identifica a populao de linfcitos, e o R2, a
populao de moncitos. O segundo grfico de disperso
verifica apenas as clulas dentro das caixas R1 e R2
do primeiro grfico de disperso. As clulas CD4 so
o grupo de clulas na direita superior, verificando-se
tanto a expresso de CD4 quanto de CD3. As clulas T
CD8 esto logo abaixo do grupo de CD4, expressando
CD3, mas no CD4. As clulas B so o grupo no canto
esquerdo inferior, no expressando CD4 ou CD3. Os
moncitos so o grupo verde de clulas acima das
clulas B, com baixa expresso de CD4 e ausncia
de CD3. O citmetro de fluxo pode contar o nmero
de clulas em cada grupo para ajudar a determinar a
contagem de CD4.

Moncito
Clulas T CD4

Clula B

Clulas T CD8

10 0 101 10 2 10 3 10 4

CD3 FITC

Figura 15.6
Exemplo de grficos de disperso de citmetro de
fluxo de um ensaio de CD4.
15.3.1.2 Plataformas de CD4 e estratgias
A contagem de CD4 era tradicionalmente determinada
utilizando uma tcnica de plataforma dupla com
um citmetro de fluxo, fornecendo a porcentagem
de clulas CD4 em uma populao de clulas
sanguneas brancas ou de linfcitos, e um analisador
de hematologia, fornecendo a contagem absoluta de

182

clulas sanguneas brancas ou linfcitos. Atualmente,


os mtodos de plataforma simples so os preferidos,
tendo-se mostrado que estes melhoram a preciso
dos ensaios de CD4 (15). O mtodo de plataforma
simples determina a contagem de CD4 em citmetros
de fluxo a partir de amostras de sangue total, com o
volume determinado precisamente. Os mtodos de
plataforma simples baseiam-se tanto em um princpio
volumtrico pela contagem de clulas CD4 em uma
unidade de volume das amostras processadas quanto na
comparao da contagem de um nmero conhecido de
microesferas adicionadas amostra processada com a
contagem de clulas CD4.
A estratgia recomendada para a marcao da rea a ser
estudada para a contagem de CD4 identifica a populao
de linfcitos por meio de marcadores CD45 e propriedades
de disperso lateral. Tambm existem vrios ensaios
de CD4 que utilizam estratgias de marcao de uma
rea fixa e especfica a ser estudada, que so exclusivas
desses ensaios. Exemplos destes ensaios incluem o
FACSCount CD4 e o Guava Auto CD4/CD4%.
15.3.1.3 Ensaios de CD4
A Tabela 15.1 mostra a variedade de tecnologias
comercialmente disponveis para o teste de CD4. A
tabela inclui os mtodos manuais para a contagem de
clulas CD4, que se baseiam na contagem direta por
microscpio, assim como o novo ensaio de CD4 POC, o
Pima CD4. Antes da implementao dos ensaios de CD4,
devem-se considerar as polticas internas de cada pas e
da OMS quanto ao uso desses testes, no que diz respeito
infraestrutura e aos profissionais necessrios para sua
implementao apropriada, assim como ao fornecimento
de servios de logstica e avaliao e monitoramento
da qualidade dos testes (16).

15.3.2 Garantia da qualidade para os testes de CD4


O desenvolvimento de diretrizes para a GQ do teste de
CD4 orientou-se pelo avano e experincia tanto nos
locais desenvolvidos quanto naqueles com escassez de
recursos (17-19). importante que os espcimes para
a contagem de CD4 sejam devidamente identificados;
coletados em tubos adequados para sangue; mantidos
em temperatura ambiente, mas no expostos ao calor
extremo; e analisados no perodo de tempo recomendado

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

para o ensaio. Estabilizadores de sangue, tais como o


Cyto-chex e o Transfix, foram utilizados para estender o
perodo durante o qual um espcime pode ser analisado,
principalmente quando necessrio um espcime de
referncia. O espcime deve ser processado seguindo
um procedimento-padro escrito. Pipetas calibradas e
reagentes devidamente estocados e dentro do prazo de
validade so importantes para a obteno de resultados
confiveis. Os ensaios de CD4 devem ser realizados por
profissionais de laboratrio treinados e qualificados.
Todos os resultados obtidos, incluindo os grficos de
disperso, devem ser revisados quanto preciso,
completude e identificadores corretos. necessrio
que realizar a manuteno diria de equipamentos
e instrumentos, de acordo com um cronograma. O
contrato de servios em citmetros de fluxo pode
estender a vida til do instrumento e ajuda a garantir
seu funcionamento apropriado. So necessrios um

inventrio de reagentes e uma cadeia de suprimento


confivel para garantir que no haja atrasos no teste
como resultado da falta de reagentes.
O controle de qualidade (CQ) deve ser realizado
diariamente, sempre que o teste de CD4 for realizado.
Suprimentos de sangue estabilizado podem ser
utilizados como material para o CQ e esto disponveis
comercialmente (19). Dois nveis de materiais de CQ,
normal e baixo, devem ser testados como um espcime de
paciente. Os resultados de CQ necessitam ser revisados
diariamente. Alternativamente, controles de esferas
podem ser utilizados para garantir a preciso da funo de
contagem dos instrumentos de CD4. Os laboratrios que
realizam o teste CD4 tambm devem ser registrados em
um programa de avaliao/GQ externa.

Tabela 15.1: Instrumentos e ensaios para CD4


Tipo

Instrumentos/
companhias

Ensaio

Princpios do ensaio

Sistemas de
rendimento alto

Epic XL-MCL &


FC500/ Beckman
Coulter Brea, CA, EUA

PLG CD4

Citometria de fluxo, baseada em


esfera

FACSCalibur & Canto/


BD Bioscience San
Jose, CA, EUA

Tritest & MultiTest

Citometria de fluxo, baseada em


esfera

FACSCount/BD
Bioscience

Reagentes para FACSCount


& reagentes para CD4

Citometria de fluxo, baseada em


esfera

Guava PCA/
Millipore
Billerica, MA, EUA

Easy CD4,
Easy CD4%
Auto CD4/CD4%

Citometria de fluxo, volumtrica

CyFlow SL_3 &


Counter/ Partec
Gorlitz, Alemanha

Partec Easy CD4 & CD4%

Citometria de fluxo, volumtrica

Beckman Coulter
Invitrogen
Oslo, Noruega

Cyto-Spheres

Observao direta de clulas com


esfera

Kit T4 Quant

Observao direta de clulas


imunocapturadas

Pima Analyzer/
Alere Technologies
Jena, Alemanha

Pima CD4

Imagem digital de clulas duplamente


marcadas, volumtrica

Sistemas de
rendimento mdio
a baixo

Sistemas manuais

POC

POC: teste point-of-care.


Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)

183

15.3.3 Teste de carga viral


Embora o CD4 seja um parmetro importante para a
compreenso do estado clnico do paciente e para iniciar
a TARV, a carga viral uma medida quantitativa de HIV
no sangue, sendo tambm um parmetro importante
utilizado para monitorar a eficcia do tratamento ao
longo do tempo. Existem muitos ensaios de carga
viral (CV) comercialmente disponveis e utilizados,
principalmente, para o manejo da infeco pelo HIV,
em conjunto com a apresentao clnica e outros
testes laboratoriais. A tecnologia de amplificao de
cido nucleico in vitro usada para quantificar as
partculas de HIV no plasma. Os mtodos de PCR
para a transcriptase reversa (RT, do ingls reverse
transcriptase), amplificao baseada nas sequncias de
cido nucleico (NASBA, do ingls nucleic acid sequencebased amplification) e DNA em cadeia ramificada (bDNA,
do ingls branched DNA) so utilizados para quantificar
o RNA do HIV por PCR, amplificao isotrmica de cido
nucleico e amplificao de sinal, respectivamente. As
tecnologias no fundamentadas em cido nucleico
baseiam-se na deteco de enzimas virais (RT) e
protenas (antgeno p24) como uma medida substituta de
carga viral para HIV. Os ensaios de CV diferem quanto
sensibilidade, amplitude dinmica e capacidade de
detectar e quantificar os diferentes subtipos de HIV.
O plasma humano o tipo de espcime padro para
tecnologia de CV e as restries quanto ao processamento
de plasma, manuteno da refrigerao e armazenamento
de espcime so preocupaes genunas. Entretanto,
o uso de DBS como fonte de espcime promissor
e os locais de cuidado primrio podem coletar DBS e
transport-los aos laboratrios centrais para a realizao
do teste de CV. Atualmente, a testagem centralizada lei
em pases com limitaes, mas o teste POC pode alterar
o cenrio desses locais, para que, no futuro, o teste de CV
seja realizado rotineiramente.

15.3.4 Teste de resistncia a drogas


A resistncia do HIV s drogas da terapia antirretroviral
(HIVDR, do ingls HIV drug resistance) se refere
habilidade do HIV de continuar a se replicar na
presena de medicamentos antirretrovirais (ARV) que,
normalmente, suprimem sua replicao. A HIVDR
causada por mutaes ou mudanas nas regies
importantes do genoma viral de RNA que so alvo dos

184

ARV, as quais, por fim, podem levar a mudanas nas


protenas enzimticas essenciais para a replicao viral
e permitir que o HIV se replique na presena de ARV
importantes. Em locais com poucos recursos, os ARV
prescritos mais comumente agem contra as regies
da RT e protease (PR). A evoluo de subpopulaes
de HIV resistentes a drogas pode comprometer
significativamente a habilidade dos ARV de suprimirem a
replicao viral. Uma vez que as cepas virais resistentes
surgem, elas podem persistir indefinidamente, tanto
como vrus circulantes ou integradas ao genoma de
linfcitos T de memria como DNA pr-viral. Essas
linhagens virais resistentes podem no s causar HIVDR
em pacientes que as adquirem, como tambm podem
ser transmitidas a novos indivduos infectados por HIV,
levando ao comprometimento da eficcia da TARV
nesses pacientes. Dois mtodos estabelecidos para o
teste de HIVDR esto disponveis: os testes genotpico
e fenotpico. Ambos so complexos e onerosos. Em
pases ricos, o monitoramento de pacientes em TARV
para a aquisio de HIVDR e deteco da transmisso
de HIVDR em indivduos infectados recentemente por
HIV tornou-se o cuidado padro (17 ). Demonstrou-se
que o teste de HIVDR melhora a sobrevivncia e a resposta
imune, quando utilizado para orientar a tomada de deciso
clnica para pacientes que no responderam a um ou mais
esquemas prvios. Devido limitao e/ou ausncia de
infraestrutura e profissionais treinados e ao seu alto custo,
o teste individual de HIVDR no realizado rotineiramente
em locais com escassez de recursos. A OMS recomenda o
monitoramento e vigilncia da HIVDR em nvel populacional
para prevenir o desenvolvimento e transmisso de HIVDR
em pases com programas de TARV, alm de garantir que
os regimes de TARV selecionados para incluso em guias
nacionais, e os programas que os administram, continuem
eficientes (18-20).
15.3.4.1 Teste de HIVDR genotpico
O teste de HIVDR genotpico avalia as sequncias de
nucleotdeos das quais so deduzidos os aminocidos
das enzimas PR e RT do HIV. As sequncias de
aminocidos das regies da PR e RT do gene pol do HIV
so comparadas quelas da linhagem viral de referncia
do tipo selvagem ou sequncia de referncia consenso
especfica de um subtipo, e qualquer mudana de
aminocido em um cdon especfico registrada. As

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

mutaes so descritas em um formato-padro baseado


na posio numrica de um cdon mutante em uma
sequncia de aminocido da PR ou RT. Por exemplo, uma
mudana de metionina (M) para valina (V) na posio
184 da RT descrita como M184V. A letra esquerda
do nmero representa o aminocido naquela posio na
RT de referncia e a letra direita mostra o aminocido
comparvel associado mutao na linhagem de
HIV sendo testada. O teste genotpico demonstrou-se
altamente reprodutvel e sensvel, e fornece a sequncia
gentica completa e precisa do domnio de interesse.
Estudos indicaram que o teste genotpico pode identificar
mutaes de HIVDR presentes em cerca de 20% das
quasispcies circulantes.
Os testes genotpicos aprovados pela Administrao
de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica
(FDA, do ingls United States of America Food and Drug
Administration) disponveis comercialmente, os sistemas
de genotipagem TRUGENE e Viroseq, so desenhados
e aprovados para a genotipagem do subtipo B do
HIV-1, que so as linhagens dominantes que circulam
na Europa e Amrica do Norte. Embora esses testes
sejam utilizados para o teste genotpico em subtipos
no-B do HIV-1, suas caractersticas de desempenho
no foram completamente avaliadas e os resultados
dos testes podem variar. Laboratrios por todo o mundo
desenvolveram e validaram testes genotpicos que foram
desenhados para a genotipagem dos diversos subtipos
do grupo M do HIV-1 e formas recombinantes circulantes
(CRF, do ingls circulating recombinant forms) (21, 22).
15.3.4.2 Teste de HIVDR fenotpico
Os testes fenotpicos in vitro utilizam as regies da RT
e PR do gene pol do HIV-1 derivados de um indivduo
infectado por HIV e incorporam essas regies genmicas
para gerar um vrus recombinante. A susceptibilidade
do vrus recombinante , ento, determinada por meio
do teste de susceptibilidade na presena de vrias
concentraes de uma droga relevante. Os resultados
so expressos como mudanas na susceptibilidade
na concentrao inibitria de 50% (IC50) quando
comparada aos valores de cut-off gerados pelo vrus
selvagem de referncia. Existem vrias limitaes no
teste fenotpico. Notavelmente, o teste fenotpico pode
no predizer o desfecho clnico adequadamente se
houver uma mistura de populaes de linhagens virais

selvagens e mutantes presentes em uma quasispecie


viral. Alm disso, o teste fenotpico s est disponvel em
um nmero limitado de laboratrios, que usam diferentes
mtodos e podem gerar resultados discordantes.
Ainda mais importante, atualmente, o custo do teste
fenotpico , pelo menos, trs vezes maior que o do teste
genotpico. Devido a essas limitaes, o teste fenotpico
no recomendado para o propsito de vigilncia de
rotina da HIVDR na populao.
15.3.4.3 Tipos de espcimes para o teste de HIVDR
O plasma o tipo de espcime utilizado rotineiramente
para o teste genotpico e considerado o padro
ouro. Os dois testes genotpicos aprovados pela FDA
requerem plasma para a realizao do teste. A OMS
tambm recomenda que o plasma seja utilizado para
as pesquisas de monitoramento da HIVDR adquirida em
pacientes tratados com os ARV de primeira linha por
12-15 meses (23). Alm disso, muitos estudos avaliaram
o uso de DBS para o teste de HIVDR em locais com
recursos limitados, o qual foi utilizado com sucesso
no teste genotpico, em populaes recentemente
diagnosticadas com HIV e que no foram submetidas a
tratamento antirretroviral, para verificar a transmisso
do HIV nos ltimos anos. A OMS tambm recomenda
que o DBS seja utilizado para a pesquisa de HIVDR
transmitidas em populaes virgens de tratamento
e para o monitoramento de HIVDR adquiridas em
pacientes iniciando a TARV (23-25). Embora haja
vantagens importantes em utilizar o DBS para o teste de
HIVDR, incluindo a facilidade para a coleta de amostra,
transporte e armazenamento sem a necessidade de
refrigerao (21, 22, 26-28), existem limitaes para o
seu uso na coleta de amostras de pacientes tratados
com ARV de primeira linha, participando de pesquisas
sobre a aquisio de HIVDR nos 12 meses aps o incio
de TARV (23, 29). Isso se deve principalmente menor
quantidade de amostra aplicada para a extrao, menor
carga viral na maioria dos pacientes em tratamento e
menor sensibilidade do teste de genotipagem na maioria
dos ensaios de genotipagem in-house. Entretanto,
resultados recentes de estudos conduzidos em locais
com limitaes de recursos, utilizando testes de carga
viral baseados em PCR em tempo real de segunda
gerao, revelaram que a quantificao da carga viral
com DBS em pacientes tratados com ARV de primeira

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)

185

linha pode ser uma alternativa vivel para a mensurao


da carga viral (30-34). Por meio da combinao de
teste de carga viral baseado em PCR em tempo real de
segunda gerao com ensaios genotpicos in vitro de
menor sensibilidade, o monitoramento de HIVDR em
pacientes em tratamento utilizando DBS, finalmente,
pode se tornar vivel em locais com recursos escassos.
15.3.4.4 Resultados de genotipagem com qualidade
garantida
Assim como em qualquer tcnica molecular, o teste de
HIVDR genotpico passvel de contaminao cruzada,
se o teste no for realizado conforme os procedimentos
e as condies laboratoriais para os quais o mesmo
foi desenvolvido. A fim de padronizar o teste de
HIVDR genotpico e garantir a qualidade dos dados de
genotipagem em locais com limitaes de recursos, a
OMS/ResNet desenvolveu uma estratgia laboratorial
para verificar a resistncia do HIV aos medicamentos
(35). As estratgias do laboratrio de genotipagem,
incluindo os programas de avaliao externa da
qualidade, foram desenvolvidas e implementadas em
todos os laboratrios de resistncia a medicamentos
autorizados pela OMS, e somente estes realizam
testes de genotipagem e geram dados para fins de
monitoramento e vigilncia de HIVDR. A equipe de
resistncia do HIV a medicamentos do Departamento de
HIV/AIDS da OMS, em colaborao com o Laboratrio
de Resistncia a Drogas na Filial Internacional de
Laboratrio, Diviso de HIV/AIDS global, CGH, CDC,
tambm desenvolveu um pacote de treinamento para
laboratrios de HIVDR. Todas essas medidas garantiram
a qualidade de dados de genotipagem.

15.4 Referncias
1. UNAIDS world AIDS day report 2011. Genebra, Joint
United Nations Programme on HIV/AIDS, 2011.

186

4. USAID. HIV/AIDS rapid test kits: process


for USAID approval and technical guidance.
Washington, DC, Agncia dos Estados Unidos para
o Desenvolvimento Internacional, 2010 (http://
transition.usaid.gov/our_work/global_ health/aids/
TechAreas/treatment/testkit_explain.pdf, acessado
em 5 de abril de 2013).
5. Bhowan K et al. Identifying HIV infection in South
African women: how does a fourth generation HIV
rapid test perform? African Journal of Laboratory
Medicine, 2011, 1(1). http:// dx.doi.org/10.4102/
ajlm.v1i1.4.
6. Leelawiwat W et al. Dried blood spots for the
diagnosis and quantitation of HIV-1: stability
studies and evaluation of sensitivity and specificity
for the diagnosis of infant HIV-1 infection in
Thailand. Journal of Virological Methods, 2009,
155(2):109117.
7. Ou CY et al. Early diagnosis of HIV infection in
the breastfed infant. Advances in Experimental
Medicine and Biology, 2012, 743:5165.
8. Ou CY et al. Identification of HIV-1 infected
infants and young children using real-time RT
PCR and dried blood spots from Uganda and
Cameroon. Journal of Virological Methods, 2007,
144(12):109114.
9. Facente SN et al. Performance of risk-based criteria
for targeting acute HIV screening in San Francisco.
PLoS One, 2011, 6(7):e21813.
10. Pilcher CD et al. Approaching HIV elimination:
interventions for acute HIV infection. Current HIV/
AIDS Report, 2006, 3(4):160168.

2. WHO, UNAIDS, CDC. HIV rapid testing: training


package. Atlanta, GA, USA, Centros de Controle e
Prevenao de Doenas, 2006.

11. UNAIDS/WHO Working Group on Global HIV/AIDS/


STI Surveillance. Guidelines for using HIV testing
technologies in surveillance: selection, evaluation
and implementation, 2009 update. Genebra,
Organizao Mundial da Sade, 2009.

3. WHO, UNAIDS. HIV assays: operational


characteristics (phase 1). Report 14, simple/rapid
tests. Genebra, Organizao Mundial da Sade,
2004.

12. Granade TC et al. Factors influencing HIV-1 banding


patterns in miniaturized western blot testing of dried
blood spot specimens. Journal of Immunological
Methods, 1992, 154(2):225233.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

13. Guide to implementation of services for early


diagnosis of HIV in infants in resource-limited
settings. Atlanta, GA, USA, Centros de Controle
e Preveno de Doenas, 2009 (http://www.
womenchildrenhiv.org/wchiv?page=ch-09- 00-eid,
acessado em 5 de abril de 2013).

22. Buckton AJ et al. Development and optimization


of an internally controlled dried blood spot assay
for surveillance of human immunodeficiency virus
type-1 drug resistance. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, 2008, 62(6):11911198.

14. Antiretroviral therapy for HIV infection in adults and


adolescents: recommendations for a public health
approach2010 revision. Genebra, Organizao
Mundial da Sade.

23. WHO manual for HIV drug resistance testing using


dried blood spot specimens.Genebra, Organizao
Mundial da Sade, 2010 (http://www.who.int/hiv/
topics/drugresistance/dbs_ protocol.pdf, acessado
em 5 de abril de 2013).

15. Westerman LE et al. A quality management systems


approach for CD4 testing in resource-poor settings.
American Journal of Clinical Pathology, 2010,
134(4):556567.

24. Somi GR et al. Surveillance of transmitted HIV drug


resistance among women attending antenatal
clinics in Dar es Salaam, Tanzania. Antiviral
Therapy, 2008, 13(Suppl 2):7782.

16. Laboratory guidelines for enumerating CD4 T


lympho-cytes in the context of HIV/AIDS. New
Delhi, Escritrio Regional da Organizao
Mundial da Sade para o Sudeste da
sia, 2007 (http://www.who.int/hiv/amds/
LaboratoryGuideEnumeratingCD4TLymphocytes.
pdf, acessado em 5 de abril de 2013).

25. Kamoto K, Aberle-Grasse J, Malawi HIV Drug


Resistance Task Force. Surveillance of transmitted
HIV drug resistance with the World Health
Organization threshold survey method in Lilongwe,
Malawi. Antiviral Therapy, 2008, 13(Suppl 2):8387.

17. Hammer SM et al. Antiretroviral treatment of


adult HIV infection: 2008 recommendations of the
International AIDS Society-USA panel. JAMA, 2008,
300(5):555570.
18. Bennett DE et al. The World Health Organizations
global strategy for prevention and assessment
of HIV drug resistance. Antiviral Therapy, 2008,
13(Suppl 2):113.
19. Bennett DE et al. Recommendations for surveillance
of transmitted HIV drug resistance in countries
scaling up antiretroviral treatment. Antiviral
Therapy, 2008, 13(Suppl 2):2536.

26. Ziemniak C et al. A sensitive genotyping assay


for detection of drug resistance mutations in
reverse transcriptase of HIV-1 subtypes B and C in
samples stored as dried blood spots or frozen RNA
extracts. Journal of Virological Methods, 2006,
136(12):238247.
27. Bertagnolio S et al. HIV-1 drug resistance
surveillance using dried whole blood spots. Antiviral
Therapy, 2007, 12(1):107113.
28. McNulty A et al. Evaluation of dried blood spots
for human immunodeficiency virus type 1 drug
resistance testing. Journal of Clinical Microbiology,
2007, 45(2):517521.

20. Jordan MR et al. World Health Organization surveys


to monitor HIV drug resistance prevention and
associated factors in sentinel antiretroviral treatment
sites. Antiviral Therapy, 2008, 13(Suppl 2):1523.

29. Bertagnolio S et al. Dried blood spots for HIV-1


drug resistance and viral load testing: a review of
current knowledge and WHO efforts for global HIV
drug resistance surveillance. AIDS Reviews, 2010,
12(4):195208.

21. Yang C et al. Development and application of


a broadly sensitive dried-blood-spot-based

30. Johannessen A et al. Dried blood spots perform


well in viral load monitoring of patients who receive

genotyping assay for global surveillance of HIV-1


drug resistance. Journal of Clinical Microbiology,
2010, 48(9):31583164.

antiretroviral treatment in rural Tanzania. Clinical


Infectious Diseases, 2009, 49(6):976981.

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)

187

31. Mbida AD et al. Measure of viral load by using


the Abbott Real-Time HIV-1 assay on dried blood
and plasma spot specimens collected in 2 rural
dispensaries in Cameroon. Journal of Acquired
Immune Deficiency Syndromes, 2009, 52(1):916.
32. Brambilla D et al. Multicenter evaluation of use
of dried blood and plasma spot specimens in
quantitative assays for human immunodeficiency
virus RNA: measurement, precision, and RNA
stability. Journal of Clinical Microbiology, 2003,
41(5):18881893.

34. Lofgren SM et al. Evaluation of a dried blood spot


HIV-1 RNA program for early infant diagnosis and
viral load monitoring at rural and remote healthcare
facilities. AIDS, 2009, 23(18):24592466.
35. WHO/HIVResNet HIV drug resistance laboratory
strategy. Genebra, Organizao Mundial da Sade,
2010 (http://www. who.int/hiv/pub/drugresistance/
hiv_reslab_strategy. pdf, acessado em 5 de abril de
2013).

33. Garrido C et al. Correlation between human


immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA
measurements obtained with dried blood spots
and those obtained with plasma by use of
Nuclisens EasyQ HIV-1 and Abbott RealTime HIV
load tests. Journal of Clinical Microbiology, 2009,
47(4):10311036.

188

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Anexo 1
Microscopia e princpios de colorao
A1.1 Introduo
A microscopia para doenas sexualmente transmissveis
(DST) fornece um teste simples, rpido e de baixo custo,
que pode ser utilizado prximo ao paciente (1). Ela pode
ser sensvel e especfica, ideal para triagens e,
frequentemente, pode fornecer um diagnstico
presuntivo que orienta o tratamento, quebrando, dessa
forma, a cadeia de transmisso. A interpretao de
imagens microscpicas uma habilidade que requer
treinamento, incluindo um bom conhecimento
profissional do microscpio (1).

A1.2 Preparao de esfregaos para


microscopia
Um espcime de boa qualidade, coletado a partir do local
apropriado com o auxlio de uma haste adequada ou
ala, um requisito essencial para uma boa tcnica de
microscopia. importante que a lmina esteja limpa e
que o espcime seja colocado do lado correto, caso a
lmina seja fosca em um dos lados. Para preparaes
frescas, uma quantidade suficiente de amostra
depositada sobre a lmina com uma gota de soluo
salina, se necessrio, devendo ser examinada
imediatamente sob baixo aumento, sem leo de imerso.
Para esfregaos para colorao de Gram, o espcime
deve ser espalhado uniformemente sobre a lmina e
fixado por calor ou lcool, adequadamente corado e
examinado com leo de imerso.

A1.3 Microscopia de transmisso de luz


A orientao principal para uma boa microscopia
montar o microscpio corretamente e sentar
confortavelmente na bancada, com as costas apoiadas,
e com as oculares na altura dos olhos. O microscopista
deve ter um bom conhecimento dos componentes
individuais do microscpio (Figura A1.1). O microscpio
deve ser mantido limpo e coberto, quando no estiver
em uso, e precisa ser revisado regularmente. uma boa

prtica manter a platina longe das lentes e usar o menor


aumento capaz de fornecer uma boa imagem.
Procedimentos para montar o microscpio de luz:
1.
2.
3.
4.

Ligue o microscpio
Abaixe a platina, coloque a lmina
Selecione a objetiva de 10x
Olhando para a platina, eleve-a (pensando na
distncia a ser trabalhada)
5. Ajuste a distncia intraocular e focalize o espcime
6. Feche o diafragma de campo e abra totalmente o
condensador
7. Mova o condensador para cima e para baixo at que
o canto fique ntido
8. Utilizando o charriot, centralize a imagem
9. Abra o diafragma de campo (tenha cuidado com a
intensidade da luz)
10. Reajuste a intensidade da luz para uma viso
confortvel
11. Feche lentamente o condensador at que a imagem
fique ntida e o brilho intenso desaparea
12. Reajuste a intensidade da luz, caso seja necessrio.

Definies-chave
Aumento - o nmero de vezes que o comprimento, a
largura ou o dimetro, mas no a rea, de um objeto so
multiplicados.
a. Aumento til quando a imagem ntida e os
pequenos detalhes so revelados, normalmente a um
mximo de 1.000x.
b. Aumento vazio quando a a nitidez da imagem se
perde e mais nenhum detalhe revelado.
Aumento = poder da ocular x poder da objetiva x poder
do canho. Normalmente, melhor utilizar um aumento
menor para ver claramente os detalhes do objeto e obter
um maior campo de viso.

Anexo 1. Microscopia e princpios de colorao

189

Resoluo a capacidade de revelar detalhes


estruturais adjacentes como separados e distintos.
Definio a capacidade de uma lente de tornar claras
e distintas as margens da imagem de um objeto.
Diafragma de campo protege o objeto do excesso de
calor e luz que no necessrio para a formao da
imagem.

Condensador focaliza a luz no objeto. Os instrumentos


modernos possuem lentes auxiliares para o uso de
objetivas de 20x ou mais para evitar o reajuste contnuo
da ptica.
Problemas que podem ocorrer com a microscopia de luz:

Objeto desfocado e incapacidade de obter foco claro


- leo nas lentes, que pode ser limpo com um
solvente recomendado

Condensador ou diafragma de abertura contribui


para a resoluo e contraste da imagem. No o utilize
para o controle do brilho.

- O leo pode estar atrs das lentes, sendo


necessrio contatar o fabricante

Ajuste interpupilar
Ocular (lentes oculares)

Corpo
Revlver

Brao

Lentes objetivas (4)


Platina ou mesa

Parafuso macromtrico

Condensador
Controle da abertura do diafragma
Base com fonte de luz
Nivelador do diafragma de campo

Parafuso micromtrico
Charriot

Controlador da intensidade de luz

Figura A1.1
Componentes de um microscpio de transmisso de luz.
Fonte: reproduzido com permisso da Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls British
Association for Sexual Health and HIV).
- As lentes condensadoras podem estar sujas de
leo
- A lmina podia estar molhada antes de se
aplicar o leo
- leos de diferentes lotes podem ter se
misturado
- A lamnula pode ser muito espessa
- O material no est suficientemente espalhado
na lmina ou esta muito espessa
- No se utilizou o lado correto da lmina

190

- A lamnula pode estar suja com leo ou marcas


de impresso digital
- leo seco na lmina
Bolhas se movendo pela lmina
- leos de diferentes lotes podem ter se
misturado
- A lmina podia estar molhada antes de se
aplicar o leo
- As bolhas de ar podem ter se formado ao se
aplicar o leo

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana.

Iluminao desigual

Os seguintes problemas podem ocorrer com a

- O microscpio no foi montado de forma


correta; o condensador no est centralizado

microscopia de fluorescncia:

As lentes do revlver no esto alinhadas


corretamente

esperado: o microscpio pode ter sido montado de


forma incorreta ou o obturador pode estar fechado;

Aparecimento de partculas estranhas


- Pode haver presena de poeira nas oculares,
lentes, lmina ou lamnula, a qual deve ser
cuidadosamente removida.

Ausncia de imagem ou imagem mais escura que o

O espcime est emitindo fluorescncia secundria


ou autofluorescncia causada por colorao
inespecfica do espcime ou devido a lentes
objetivas sujas;

A1.4 Microscopia de fluorescncia

componentes do microscpio podem no estar

A microscopia de fluorescncia pode ser utilizada para

devidamente alinhados;

permitir a visualizao de algumas bactrias e vrus


que no so facilmente visualizados por microscopia

imunofluorescncia. Esse mtodo pode ser til para a


deteco de agentes microbianos tais como

Brilho em excesso nas lentes oculares: os filtros


corretos podem no estar presentes;

de luz, mediante a colorao por um anticorpo


especfico ligado a um fluorocromo, produzindo a

Imagem iluminada de forma desigual: os

Rpido branqueamento do espcime ao ser


visualizado.

Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis e o vrus

A1.5 Microscopia de campo escuro

da herpes simples, ou para auxiliar na identificao de

A microscopia de campo escuro difere da microscopia

organismos utilizando anticorpos espcie-especficos,


tais como para Neisseria gonorrhoeae. A microscopia
de fluorescncia necessita de treinamento para
conferir experincia interpretao, principalmente
para distinguir uma base fluorescente artificial de
uma fluorescncia especfica. O microscpio melhor
mantido e utilizado em uma sala que possa
permanecer escura.
Na microscopia de fluorescncia, a amostra corada
utilizando um fluorocromo, e ento, iluminada por
meio de um feixe de luz com comprimento de onda
que excite o fluorocromo na amostra, o que
capturado pelas lentes objetivas. Para fins gerais de
DST, tal pode ser obtido mediante um acoplamento a
um microscpio de transmisso de luz que possua
uma lmpada (vapor de mercrio ou tungstniohalognio) e apresente dois filtros: um filtro de
iluminao (ou excitao), que garanta que a
iluminao seja prxima monocromtica e no
comprimento de onda correto; e um filtro de segunda
emisso (ou de barreira), que garanta que nenhuma
fonte de luz excitatria alcance o detector.

de transmisso de luz pelo fato de que somente os


raios de luz que atingem os organismos ou partculas
em um ngulo oblquo entram na objetiva do
microscpio, dando origem a corpos luminescentes
brancos e brilhantes contra um fundo preto (Figura
A1.2). A microscopia de campo escuro para a deteco
de T. pallidum, no diagnstico de sfilis, necessita ser
realizada por profissionais bem treinados e experientes,
capazes de ajustar o microscpio corretamente e de
diferenciar o T. pallidum de treponemas no
patognicos e outros organismos espiralados,
encontrados comumente nas membranas mucosas
genital e anal. Uma vez que a cavidade oral
frequentemente colonizada por espiroquetas diferentes
dos treponemas, a anlise de material de leses orais
por campo escuro no recomendada.
Procedimento para o uso do microscpio de campo
escuro:
1. Faa uma preparao fina (Captulo 10) utilizando
lmina e lamnula bem limpas. O material em
excesso pode anular o efeito.

Anexo 1. Microscopia e princpios de colorao

191

transmitida

campo escuro

Figura A1.2
Comparao do caminho de luz entre um microscpio de
transmisso de luz e um microscpio de campo escuro.
Fonte: Reproduzido com permisso da Associao
Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls
British Association for Sexual Health and HIV).
2. Abaixe o condensador e coloque uma gota de leo
no topo das lentes. Tome cuidado para evitar a
formao de bolhas.
3. Coloque a lmina na platina e suba o condensador
lentamente at que o leo toque a lmina. Um breve
feixe de luz ser visualizado. Tome cuidado para no
permitir a formao de bolhas.
4. Focalize o objeto com uma objetiva de menor poder
(10x). Se o condensador estiver focalizado de forma
correta, um pequeno ponto de luz iluminar o objeto
contra o fundo escuro. Se for visualizado um anel de
luz, o condensador precisa ser ajustado.
5. Com o auxlio do charriot, ajuste o condensador at
que o ponto de luz fique no meio do campo.
6. Coloque uma gota de leo na lamnula e focalize o
objeto com as lentes para leo de imerso. Caso se
utilize uma objetiva com diafragma de ris, pode ser
necessrio um pequeno ajuste. Se as objetivas no
estiverem centralizadas, talvez seja preciso
centralizar o condensador.
7. A microscopia de campo escuro melhor conduzida
em uma sala escura.
Os seguintes problemas podem ocorrer na microscopia
de campo escuro:

192

As lminas ou lamnulas podem ser muito espessas

Pode haver muitas bolhas de ar na preparao.

O condensador pode no estar focado ou


centralizado corretamente.

Pouca intensidade da iluminao.

O campo de vista muito pequeno (diafragma de


campo aberto).

O centro do campo de vista escuro (a lmina


muito espessa ou o condensador est em uma
posio errada).

A1.6 Microscopia de contraste de fase


A microscopia de contraste de fase raramente est
disponvel ou utilizada, mas apresenta algumas
vantagens para a anlise de espcimes vivos, no
corados, uma vez que estes apresentam o mesmo ndice
de refrao que o fluido de montagem, e os detalhes
internos podem ser de difcil visualizao. Pode-se
considerar que os objetos no corados apresentam
propriedades de uma grade de difrao. A luz que passa
atravs de diferentes partes do objeto afetada e sua
fase muda levemente, mas isso no discernvel aos
olhos. Entretanto, por meios pticos, essa mudana de
fase pode tornar-se visvel como reas claras e escuras.
So necessrios para a microscopia de contraste de fase:
1. Um condensador especial apresentando uma srie
de diafragmas anelares, com o tamanho anelar
variando de acordo com a abertura numrica da
objetiva utilizada;
2. Objetivas de fase especiais, contendo uma placa de
fase. Essa placa consiste em um disco de vidro
contendo um vale circular, de tal profundidade que a
luz que passa por essa poro apresenta uma
diferena de fase de um quarto de um comprimento
de onda quando comparada com o resto da placa.
Procedimentos para o uso do microscpio de contraste
de fase:
1. Prepare uma lmina de espcime fina, no muito
carregada, e a posicione para ser observada pela
objetiva (as objetivas so marcadas como Ph, Phaco
ou similar).

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana.

2. Gire o anel apropriado para a objetiva na posio do


condensador.
3. Verifique se o anel e a placa de fase esto na
posio correta, utilizando o telescpio fornecido
com o sistema.
4. Remova uma ocular e insira o telescpio. As
imagens do anel e da placa de fase devem coincidir.
Caso contrrio, ajuste com o charriot.
5. Recoloque a ocular e examine o espcime.
6. As objetivas de todos os aumentos podem ser
utilizadas, desde que estejam ajustadas a uma
placa de fase e que haja um anel adequado no
condensador.
Os seguintes problemas podem ocorrer na microscopia
de contraste de fase:

O condensador e a objetiva podem no ser


compatveis, de acordo com o cdigo Ph;

A placa de fase no est alinhada, sendo necessria


a verificao por meio de um telescpio;

O diafragma de campo no est focalizado na


superfcie do espcime, o que pode ser resolvido
movendo-o para cima e para baixo.

A1.7 Colorao de Gram


Essa colorao foi descrita primeiramente em 1984 por
Gram e demonstra a morfologia de bactrias e fungos.
Ela divide as bactrias em dois grupos: aquelas que
aparecem positivas e aquelas que aparecem negativas.
Por sua vez, estas podem ser divididas em cocos
(esferas) ou bacilos (bastonetes), resultando em quatro
grupos. Muitas bactrias que aparecem bastante
distintas, tais como a N. gonorrhoeae, so diplococos
Gram-negativos, mas importante lembrar que a reao
da colorao de Gram fornece apenas uma identificao
presuntiva. Outros mtodos de identificao so
necessrios para classificar qualquer bactria. Os fungos
aparecem como Gram-positivos.

A1.7.1 Princpios da colorao de Gram


A colorao de Gram reflete as diferenas na estrutura
da parede celular bacteriana, de modo que as bactrias

Gram-positivas apresentam uma grande quantidade de


peptidoglicano na parede celular, o que retm a
colorao violeta (Figura A1.3a), enquanto que as
bactrias Gram-negativas apresentam uma parede
celular complexa, com menos peptidoglicano, no
retendo a colorao violeta, mas assumindo o
contrastante rosa (Figura A1.3b).

A1.7.2 Mtodo de uso


O esfregao fixado inundado com cristal de violeta
por 30 segundos, durante os quais todas as bactrias
adquirem a colorao (Figura A1.4). O esfregao ,
ento, lavado gentilmente em gua corrente e
inundado com Lugol por mais 30 segundos, o qual
atua como um mordente e fixa a colorao violeta na
parede celular.
Aps a lavagem com gua, um descolorante utilizado
para remover o excesso de colorao. nesse estgio
que o complexo cristal violeta/Lugol lavado da parede
celular das bactrias Gram-negativas, uma vez que no
h peptidoglicano suficiente para ret-lo. Vrios
descolorantes so utilizados, desde o lcool, que de
ao lenta e suave, at a acetona, que mais forte e
rpida. O tempo durante o qual descolorante deixado
no esfregao varia de alguns minutos, para o lcool, a
apenas poucos segundos, para acetona. aconselhvel
segurar o esfregao sobre a pia e deixar que o
descolorante corra sobre ele. O complexo violeta ir se
desprender do esfregao e, assim que parar de escorrer,
deve-se lavar o esfregao com gua. Nessa etapa,
possvel que o esfregao descolore demais,
principalmente se for utilizada acetona; muitos
consideram a mistura acetona e lcool (1:1) uma boa
combinao, uma vez que a velocidade da acetona
levemente moderada pelo lcool.
Aps a descolorao, o esfregao inundado com um
contrastante por, aproximadamente, um minuto; nesse
estgio que as bactrias Gram-negativas retm a
colorao rosa. Novamente, vrios contrastantes podem
ser utilizados: safranina, vermelho neutro e
carbolfucsina. A safranina e o vermelho neutro so bons
corantes para esfregaos que contm polimorfos, uma
vez que eles fornecem uma boa definio para a
estrutura celular, enquanto que a carbolfucsina
prefervel para bactrias.

Anexo 1. Microscopia e princpios de colorao

193

Peptideoglicano

Exterior

Espao
periplasmtico

Interior

Membrana celular
Figura A1.3A
Estrutura de uma parede celular Gram-positiva.

Fonte: reproduzido com permisso da Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls British
.
Association for Sexual Health and HIV).
Exterior

Lipdeo A
Porina

Lipoprotena

Espao periplasmtico

Fosfolipdeo

Peptideoglicano

Membrana celular

Interior

Figura A1.3B
Estrutura de uma parede celular Gram-negativa.
Fonte: reproduzido com permisso da Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls British Association
for Sexual Health and HIV).
194

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana.

Os tempos individuais utilizados para cada um dos


corantes podem variar, mas os tempos absolutos
utilizados so cruciais. Entretanto, importante lembrar
que enquanto o corante primrio (cristal de violeta) atua
quase que instantaneamente, a colorao de contraste
um processo lento e requer mais tempo. aconselhvel
deixar o contrastante atuando o dobro do tempo utilizado
para a colorao primria.

A1.7.3 Problemas e solues


Para produzir esfregaos bem corados, essencial o uso de
corantes adequadamente preparados e armazenados. Os
corantes individuais esto disponveis comercialmente e,
hoje em dia, a preparao a partir do p relativamente
incomum. Entretanto, mesmo quando os corantes so
adquiridos prontos para utilizao, ou como concentrados
para diluio e uso, importante armazen-los
corretamente. Os corantes devem ser colocados em
garrafas limpas e, se estas forem reutilizadas, deve-se
eliminar qualquer resduo de corante e ento enxaguar com
gua antes de ench-las novamente. O armazenamento
inadequado pode resultar no depsito de corante sobre todo
o esfregao ou causar a aderncia das clulas epiteliais, as
quais podem ser confundidas com clulas indicadoras.
O esfregao precisa apresentar espessura apropriada. Um
esfregao muito espesso ir reter o corante e impedir a
diferenciao entre os organismos Gram-negativos e
positivos; j um esfregao muito fino, com material
insuficiente, pode no fornecer uma representao
verdadeira da amostra.

Gram-negativa

Gram-positiva
Fixao
Cristal violeta

Tratamento com iodo


Descolorao
Mancha contrastante
de safranina
Figura A1.4
Reao de bactrias Gram-positivas e Gramnegativas aos diferentes estgios da colorao de
Gram
Fonte: reproduzido com permisso da Associao
Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls
British Association for Sexual Health and HIV).

de gonorreia e fornece uma imagem distintiva com alto


valor preditivo em pacientes de alto risco.

A1.9 Colorao de Giemsa


A colorao de Giemsa uma colorao diferencial
utilizada para o diagnstico de donovanose. Consiste em
uma mistura de azul de metileno, eosina e azure B e est
disponvel comercialmente. Um esfregao preparado,
fixado em metanol por 30 segundos, imerso em corante
de Giemsa 5% fresco por 20-30 minutos, lavado e
deixado a secar.

A1.10 Imunofluorescncia
O passo de descolorao o mais crucial na colorao
Gram e, quando feito em excesso ou insuficiente,
resultar na categorizao incorreta da bactria como
Gram-negativa ou Gram-positiva, respectivamente.

A1.8 Colorao de azul de metileno


O uso do azul de metileno como corante nico muito
til em lugares com infraestrutura ou recursos
inadequados para a colorao de Gram. Ele mostra a
morfologia tanto das clulas bacterianas como
hospedeiras, mas no permite a diferenciao obtida
com a colorao de Gram. utilizado, principalmente, na
colorao de esfregaos para o diagnstico presuntivo

A imunofluorescncia uma tcnica que utiliza a ligao


altamente especfica de um anticorpo ao seu antgeno
para marcar protenas especficas ou outras molculas
na clula. Uma amostra tratada com um anticorpo
primrio especfico para a molcula de interesse. Um
fluorforo pode ser conjugado diretamente ao anticorpo
primrio. Alternativamente, pode-se utilizar um anticorpo
secundrio conjugado a um fluorforo, que se liga
especificamente ao primeiro anticorpo.

A1.11 Sade e segurana


Deve-se nomear uma pessoa responsvel pela sade e
segurana em cada local de trabalho, tanto em clnicas

Anexo 1. Microscopia e princpios de colorao

195

quanto laboratrios. Os mtodos de colorao devem


estar descritos em procedimentos operacionais padro
revisados regularmente, os quais devem ser lidos e
compreendidos por todos os funcionrios.
necessrio haver uma srie de regras bsicas:

No comer, fumar ou beber na rea de laboratrio.

Providenciar uma boa ventilao nas reas


utilizadas para a realizao de colorao, a fim de
evitar a inalao de gases e o risco de incndio.

196

Utilizar luvas e jalecos adequados para laboratrio


ao manusear os reagentes individuais utilizados
para a colorao, pois se sabe que estes so
txicos; algumas coloraes de Gram so
cancergenas.

Armazenar os corantes cuidadosamente para evitar


que derramem.

Tomar cuidado ao descartar lminas e lamnulas de


pacientes infectados.

Armazenar os materiais inflamveis em um armrio


especfico e longe de fontes de calor.

A1.12 Referncia
British Association for Sexual Health and HIV (BASHH).
Microscopy for Sexually Transmitted Infections (http://
www.bsig-resources.org.uk/).

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana.

Anexo 2
Princpios dos testes point-of-care rpidos
A2.1 Introduo
O Relatrio Mundial da Sade de 2004 menciona a
indisponibilidade e a inacessibilidade como os dois
principais motivos pelos quais os servios de sade
falham (1). Em pases com altos ndices de doenas
sexualmente transmissveis (DST), os servios
de laboratrio para DST ou no esto disponveis
ou, quando alguns servios esto disponveis, os
pacientes no conseguem acess-los fisicamente ou
pagar por eles. A OMS recomenda o uso da gesto
sindrmica, segundo a qual os pacientes so tratados
para todas as principais causas de uma sndrome em
particular (2). A gesto sindrmica de DST funciona
melhor para corrimento uretral, dor plvica e lcera
genital, mas as avaliaes dos fluxogramas da OMS
mostraram que o algoritmo para corrimento vaginal
carece tanto de sensibilidade como de especificidade
para a identificao de mulheres com infeces de
Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae.
Testes rpidos simples e acessveis podem ser
realizados no local de atendimento e permitem o
tratamento e o manejo de casos urgentes dessas
infeces. Os testes point-of-care (POC) simples
e rpidos so necessrios no s para aumentar
a especificidade da gesto sindrmica e reduzir
o tratamento em excesso para infeces genitais
gonoccicas e clamidiais, como tambm para realizar
a triagem de DST assintomticas (3, 4, 5 ). Um modelo
matemtico estimou que um teste para sfilis que
no requer infraestrutura laboratorial pode salvar
mais de 201.000 vidas e evitar 210.000 natimortos
por ano no mundo. Semelhante teste poderia poupar,
aproximadamente, 4 milhes de anos de vida por
incapacidade (AVAI), evitar mais de 16,5 milhes de
gonorreia incidente e infeces clamidiais e prevenir
mais de 212.000 infeces por HIV a cada ano (6).

A2.2 Caractersticas dos teste point-of-care (POC)


rpidos
Se o diagnstico for realizado no local de atendimento,
o tratamento e o aconselhamento do paciente e a
notificao do parceiro podem ser realizados sem
atrasos. A sigla ASSURED (ver Quadro 1) foi criada,
em 2003, em um encontro do Programa Especial para
Pesquisa e Treinamento em Doenas Tropicais da OMS
(TDR/OMS, do ingls WHO Special Programme for
Research and Training in Tropical Diseases) para definir
as caractersticas ideais de um teste rpido que pode ser
utilizado no local de atendimento, em todos os nveis de
um sistema de cuidado sade (7 ).
Quadro 1. O teste rpido ideal critrio ASSURED
A = Acessvel (do ingls Affordable)
S = Sensvel (do ingls Sensitive)
S = Especfico (do ingls Specific)
U = Fcil de ser utilizado (do ingls User-friendly):
simples de ser realizado, em poucos passos, com um
mnimo de treinamento)
R = Robusto e rpido (do ingls Robust and rapid):
pode ser armazenado em temperatura ambiente e os
resultados esto disponveis em <30 minutos
E = Sem equipamentos (do ingls Equipment-free),
ou com o mnimo de equipamento que pode ser
carregado por bateria ou por energia solar.
Testes rpidos versus testes point-of-care (POC)
Os testes rpidos so normalmente definidos como
testes que geram resultados em <30 minutos. Os
testes POC podem ser descritos como testes simples
e que podem ser realizados em todos os locais de
cuidados sade, principalmente nos servios de
ateno primria, com o mnimo de treinamento e sem
equipamentos (ou com equipamentos pequenos que
podem ser carregados por energia solar ou bateria).
Historicamente, a microscopia com colorao de Gram,

Anexo 2: Princpios dos testes point-of-care rpidos

197

a preparao a fresco, o pH, o teste de amina ou de


Whiff, a reagina plasmtica rpida (RPR) e o teste do
Laboratrio de Pesquisa de Doenas Venreas (VDRL,
do ingls Venereal Disease Research Laboratory) so
considerados testes rpidos e, em princpio, podem
fornecer resultados imediatos para guiar o tratamento.
Entretanto, alguns desses testes dependem de uma
fonte de eletricidade para o manuseio do equipamento,
tais como uma centrfuga ou um microscpio, o que
significa que no podem ser utilizados em locais de
atendimento sem uma fonte de eletricidade. O teste
RPR para sfilis um bom exemplo disso. Ele necessita
de apenas 8-10 minutos para ser realizado, mas o teste
frequentemente realizado em grupos (lotes) e, dessa
forma, no pode ser utilizado para facilitar o teste e
tratamento imediatos. Alm disso, os reagentes para
RPR necessitam de refrigerao, uma centrfuga
nescessria para separar o soro do sangue total e um
agitador para misturar a reao. Consequentemente,
o RPR, apesar do nome, no nem utilizado como um
teste rpido e nem pode ser considerado um teste POC,
uma vez que no pode ser realizado em locais onde no
h eletricidade.
Testes POC treponmicos rpidos simples, desenvolvidos
como testes imunocromatogrficos (ICT, do ingls
immunochromatographic test), no formato de fluxo
lateral ou vareta de medio (dipstick test), apresentam
desempenho aceitvel (8). Esses testes so utilizados
com sangue total obtido por meio de uma puno digital,
podendo ser armazenados em temperatura ambiente
por at 18 meses; tambm requerem um mnimo de
treinamento e fornecem um resultado em 15-20 minutos.
A Tabela A2.1 resume as diferenas entre os dois tipos
de testes rpidos para o diagnstico sorolgico de sfilis.
Existem vrios testes rpidos disponveis
comercialmente para o diagnstico de DST (Tabela
A2.2). As infeces vaginais tais como a candidase,
a vaginose bacteriana ou a tricomonase podem ser
diagnosticadas com um microscpio utilizando a
colorao de Gram em esfregaos ou preparaes a
fresco de secrees vaginais. Entretanto, o tratamento
presuntivo com metronidazol , normalmente, aplicado
aos pacientes com corrimento vaginal, uma vez que
o resultado da microscopia para vaginose bacteriana,
candidase ou tricomonase raramente est disponvel

198

durante a visita do paciente a uma clnica. Os testes


rpidos que podem auxiliar no diagnstico de vaginose
bacteriana so baseados na deteco do pH cido,
utilizando um pedao de papel para medio de pH, ou
do odor caracterstico de amina, quando adicionado o
hidrxido de potssio na secreo vaginal.
Uma vez que a maioria dos kits para teste rpido
no apresentam controle interno de qualidade e so
normalmente utilizados fora das estruturas laboratoriais,
importante que programas de controle desenvolvam
sistemas de garantia de qualidade para assegurar o bom
desempenho dos testes e das testagens. Consideraes
especiais para o uso dos kits de teste rpidos esto
listadas abaixo, no Quadro 2.
Quadro 2. Cuidados no uso de testes rpidos
Antes do uso
- Observe a data de expirao dos kits de
teste rpido; no os utilize alm da data de
expirao
- Verifique se todos os itens esto fornecidos de
acordo com a bula do produto
- Verifique a aparncia da caixa, para garantir
a integridade do produto e garantir que os
kits do teste no foram danificados durante o
transporte
Durante o uso de kits para o teste
- Siga as instrues da bula do produto
- No misture reagentes de caixas diferentes
Aps o uso
- Garanta o descarte adequado de materiais
cortantes e outros dejetos

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana.

Tabela A2.1: Diferenas entre dois tipos de testes rpidos, utilizando testes no treponmicos e testes
treponmicos rpidos como exemplos
Teste rpido
Exemplo: teste no treponmico de reagina
plasmtica rpida (RPR)

Teste POC rpido


Exemplo: teste treponmico

Usa soro ou plasma (requer centrifugao)

Usa sangue total, soro ou plasma

Os reagentes requerem refrigerao

Os kits do teste podem ser transportados e armazenados


em temperatura ambiente

Necessita de equipamento (refrigerador, centrfuga e


agitador) e profissionais treinados

No necessita de equipamentos e requer treinamento


mnimo

Resultado do teste disponvel em 8-10 minutos

Resultado do teste disponvel em 15-20 minutos

Anticorpos relacionados com a infeco recente podem


ser utilizados para distinguir a infeco ativa daquela
previamente tratada e para o teste de cura

Anticorpos treponmicos persistem por anos; a medida


de exposio no pode ser utilizada para distinguir a
infeco ativa daquela tratada previamente

Tabela A2.2: Testes rpidos para o diagnstico de DST


Testes

DST

Equipamento

Custo aproximado
em dlares (US$)

Microscopia:
Colorao de Gram

Neisseria gonorrhoeae

Microscpio
Eletricidade

$ 0,50

Campo escuro (direto Treponema pallidum


ou com anticorpo de
fluorescncia)
Preparao a fresco

Vaginose bacteriana

pH
Amina (KOH)

Vaginose bacteriana
Vaginose bacteriana

Nenhum
Nenhum

Floculao:
RPR
VDRL

Sfilis

Testes rpidos (tiras


imunocromatogrficas)

Eletricidade
para utilizar
centrfuga e
agitador
Microscpio
Nenhum

Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Trichomonas vaginalis
Sfilis
HIV
Vrus da herpes simples
Vaginose bacteriana
Nenhum
(Gardnerella spp.)
Neisseria gonorrhoeae Ensaios de PCR
Chlamydia trachomatis
em tempo real
ou ensaios de
amplificao
isotrmica

NAAT

Sensibilidade
de 95% para
infeces da
uretra em homens
sintomticos, mas
<50% em mulheres

Trichomonas vaginalis
Candidase
Vaginose bacteriana

Clulas de indicao
Pontuao Nugent

Deteco enzimtica

Comentrios

$ 3,00-6,00
$ 0,20

Resultado nem
sempre liberado no
mesmo dia, devido
ao processamento
em lote

$ 6,00-$20,00
$ 6,00-$20,00
$ 3,00-5,00
$ 0,50-3,00
$ 5,00-10,00
$ 35,00
$ 3,00-6,00
$ 15,00-35,00

Esses novos
ensaios moleculares
necessitam de muito
pouca interveno
do usurio e podem
fornecer resultados
em 15-100 minutos

VDRLHIV: vrus da imunodeficincia adquirida; KOH: hidrxido de potssio; NAAT: amplificao de cido nucleico; PCR: reao em cadeia da
polimerase; RPR: reagina plasmtica rpida; DST: doena sexualmente transmissvel; VDRL: teste do Laboratrio de Pesquisa de Doenas Venreas.

Anexo 2: Princpios dos testes point-of-care rpidos

199

A2.3 Princpios das tecnologias do teste


point-of-care (POC) rpido
A2.3.1 Reaes de aglutinao para detectar
antgeno ou anticorpo
A2.3.1.1 Floculao
No teste RPR, os anticorpos para antgenos no
treponmicos, tais como a cardiolipina, podem ser
detectados em amostras de soro, utilizando uma reao
antgeno-anticorpo conhecida como floculao. Uma
pequena quantidade de soro adicionada dentro de
um crculo no carto de teste. Adiciona-se na amostra
de soro uma gota do reagente do teste, que contm
a cardiolipina e partculas de carbono. A mistura
agitada, gentilmente, por oito minutos. Uma reao
positiva antgeno-anticorpo resulta na formao de uma
malha na qual as partculas de carbono se prendem,
como mostra a Figura A2.1. As partculas de carbono
ajudam na visualizao da reao positiva. Um padro
homogneo indica um resultado negativo. Um excesso
de anticorpos em uma amostra de soro pode resultar em
um resultado falso-negativo, uma vez que a estrutura
antgeno-anticorpo tpica de rede pode no ser formada.
Esse resultado falso-negativo conhecido como um
fenmeno de prozona.
Ao invs de partculas de carbono, alguns testes
utilizam o corante vermelho toluidina para melhorar
a visualizao dos resultados do teste. Uma vez que
a leitura do resultado do teste subjetiva, torna-se
importante que o profissional seja devidamente treinado
para realizar e interpretar os resultados do teste.

Figura A2.1
Teste de reagina plasmtica rpida (RPR).
Fonte: Van Dyck E, Meheus AZ, Piot P. Laboratory
diagnosis of sexually transmitted diseases. Genebra,
Organizao Mundial da Sade, 1999.

200

A2.3.1.2 Reaes de aglutinao utilizando partculas


de ltex
Partculas de ltex cobertas com antgenos, tais como os
antgenos treponmicos, oferecem um teste que pode ser
mais fcil de ser interpretado quando comparado ao uso
de partculas de carbono no teste RPR. Uma amostra de
soro e partculas de ltex cobertas misturada por oito
minutos dentro de um crculo em um carto. Se anticorpos
no treponmicos estiverem presentes no soro, eles
formaro um padro de aglutinao com as partculas de
ltex cobertas, o qual pode ser visualizado a olho nu. Um
padro regular indica um resultado negativo. Esse teste
est sujeito a resultados falso-negativos devido ao efeito
de prozona, similar ao RPR.

A2.3.2 Testes imunocromatogrficos (ICT)


A2.3.2.1 Formato de fluxo lateral
No desenho do ICT para a deteco de anticorpo, os
anticorpos marcados (Ac) com corantes, especficos para
o antgeno (Ag) alvo do teste, esto presentes na poro
inferior da tira (membrana) de nitrocelulose, ou em um poo
fornecido por um invlucro que cobre a tira. O Ac, especfico
para outro epitopo no antgeno alvo, est ligado tira em
uma fina linha de teste, e o Ac especfico ao Ac marcado est
ligado linha de controle. A Figura A2.2A um esquema que
representa quatro estgios da progresso de um espcime
(seja sangue total, soro ou plasma) contendo os anticorpos
treponmicos por meio de uma tira imunocromatogrfica de
fluxo lateral. No estgio 1, a amostra colocada no poo da
amostra. Os anticorpos treponmicos, representados por
um diamante amarelo, migram do poo da amostra para
a membrana. No estgio 2, os anticorpos migram atravs
da membrana impregnada com conjugado e combinam-se
com o antgeno marcado com ouro coloidal, formando
um complexo antgeno-anticorpo dourado. No estgio 3,
conforme o complexo cruza a linha de teste, ele se combina
com o antgeno imobilizado na linha teste e, quando
suficientes antgenos marcados se acumulam, os marcadores
com corantes tornam-se visveis a olho nu como uma linha
fina vermelha (a linha de teste). No estgio 4, os conjugados
livres se combinam com os anticorpos imobilizados na linha
controle, tornando-a vermelha.
Se uma amostra no contm nenhum anticorpo
treponmico, ela ir migrar atravs da membrana
impregnada com conjugado e da linha de teste sem torn-la
vermelha. O conjugado livre que migra com a amostra e
tornar vermelha apenas a linha de controle. Se a amostra

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana.

Amostra
Tira (membrana) absorvente
Linha controle
Linha teste

Membrana
Membrana impregnada
com conjugado

Figura A2.2A
Esquema para um teste de sfilis positivo em um formato imunocromatogrfico de fluxo lateral.

Leitura dos resultados do teste:


C T

Um resultado negativo do teste mostrando apenas o


surgimento da linha controle (C) na janela.

Um resultado positivo do teste mostrando o surgimento


de ambas as linhas controle e teste (T) na janela.

Um resultado invlido no mostrando linhas. Ou o


espcime (S) no migrou atravs da tira (membrana) do
teste ou o teste no est mais funcionando.

negativo
C T

positivo
C T

indeterminado
Figura A2.2B
Interpretao de um ensaio de fluxo lateral para a deteco de anticorpos treponmicos de um paciente com sfilis.

Anexo 2: Princpios dos testes point-of-care rpidos

201

no migrar do poo da amostra, as linhas de teste e


controle no aparecero, indicando um ensaio invlido
(Figura A2.2B).

de apenas 50-70% quando comparados aos testes de


amplificao de cido nucleico.

A2.4.1 Ensaios microfludicos


A2.3.2.2 ICT Multiplex
Atualmente, esto disponveis comercialmente ICT
de fluxo lateral desenhados para dois (HIV e sfilis) ou
mltiplos testes (HIV, sfilis e hepatite B ou C) utilizando
uma nica amostra de sangue coletada por puno
digital. Vrios desses testes j esto sendo utilizados
em triagens clnicas. Um teste rpido que pode
detectar tanto os anticorpos no treponmicos como
os treponmicos, utilizando tecnologia patenteada de
caminho duplo, foi avaliado recentemente e mostrou
possuir desempenho aceitvel (9). Vrias companhias
esto desenvolvendo testes de fluido oral nicos para
sfilis ou duplos para sfilis e HIV (10).

A2.3.2.3 Formato de imunoconcentrao


(flow-through)
Ao invs de um formato com tiras de fluxo lateral,
alguns ICT so configurados como um aparelho de
imunoconcentrao (flow-through) no qual os antgenos
so adsorvidos em um disco de nitrocelulose. Em
seguida, faz-se com que o soro ou plasma migrem
atravs dos discos e sejam lavados antes que o
conjugado para os marcadores com corantes sejam
adicionados, a fim de mostrar os resultados.

A2.3.2.4 Leitores de teste rpido


Atualmente, vrios leitores pticos simples e de baixo
custo ou scanners esto disponveis comercialmente
para o uso com ICT. O uso desses leitores elimina o
vis de observao, melhora a sensibilidade e permite
a quantificao, assim como para a titulao no
treponmica.

A2.4 Tecnologias emergentes


Enquanto os ICT podem detectar anticorpos com uma
sensibilidade razovel, devido grande quantidade
de anticorpos no sangue, eles tendem a ser menos
sensveis para a deteco de antgenos. A maioria dos
testes rpidos para a deteco de infeces genitais por
clamdia ou gonoccicas apresentam uma sensibilidade

202

Foram desenvolvidos e aplicados para HIV e sfilis


ensaios microfludicos que podem detectar mltiplos
analitos a partir de um nico espcime, ou que podem
reproduzir todas as caractersticas de desempenho de
um imunoensaio (11, 12). O ensaio apresenta poucas
partes mveis e as fichas custam centavos em vez de
dlares, tornando-o adequado para locais com poucos
recursos. Os resultados podem ser lidos com um aparato
pequeno movido a bateria. Alguns desses ensaios esto
atualmente em experimentao na frica.
Geralmente, esses ensaios funcionam melhor para a
deteco de anticorpos a partir do sangue, devido
abundncia de molculas-alvo. Para outros espcimes,
tais como a urina ou amostras coletadas com haste,
ser necessrio um processamento prvio do espcime,
antes de injet-lo no dispositivo do teste. No que diz
respeito deteco de antgeno, um desafio conseguir
molculas-alvo suficientes na zona de deteco.

A2.4.2 Ensaios moleculares rpidos


Desenvolvimentos recentes em plataformas integradas
de amplificao de cidos nucleicos deram origem a
ferramentas de diagnstico de doenas infecciosas
sensveis, especficas e fceis de serem utilizadas,
necessitando apenas inserir a amostra para receber o
resultado (13). Essas tecnologias so promissoras para a
deteco mltipla de patgenos associados s principais
DST. O ensaio GeneXpert, para a deteco dupla de
clamdia e gonorreia a partir de uma nica amostra,
apresenta um desempenho razovel quando comparado
cultura e PCR como padres de referncia. Ele pode
fornecer um resultado em menos de duas horas. A
mquina permite o acesso randmico, o que torna esse
ensaio mais custo-efetivo se o equipamento puder ser
utilizado para diferentes doenas infecciosas.
Existem algumas tecnologias promissoras de
amplificao isotrmica de cido nucleico, rpidas
e simples de serem realizadas. Elas esto sendo
desenvolvidas para a deteco de doenas infecciosas,
incluindo a clamdia e a gonorreia.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana.

Amplificao da polimerase da recombinase (RPA,


do ingls recombinase polymerase amplification):
um ensaio de 15 minutos que pode alcanar a mesma
sensibilidade e especificidade dos principais ensaios
moleculares atuais, por meio do acoplamento de um
iniciador dirigido por recombinase isotrmico com a
sntese de DNA por deslocamento de fitas. Esse ensaio
usa as recombinases capazes de parear iniciadores
oligonucleotdicos com sequncias homlogas em um
DNA de fita dupla (14). Esse ensaio pode alcanar a
amplificao exponencial a partir de poucas cpiasalvo, sem a necessidade de separar a fita dupla de DNA
antes da amplificao. Todos os reagentes necessrios
para esse ensaio so estabilizados como frmulas
secas e podem ser transportados com segurana sem
refrigerao. Os resultados so lidos em um fluormetro
ou a olho nu, por meio de uma fita de fluxo lateral.
Amplificao dependente de helicase (HDA, do
ingls helicase dependent amplification): um
procedimento de amplificao isotrmica em um
tubo nico que pode detectar sequncias curtas de
DNA (80-120pb). Os resultados so disponibilizados
em 1,8 horas. Entretanto, os reagentes precisam ser
armazenados a -20C.
Amplificao cruzada de iniciadores (CPA, do
ingls cross priming amplification): uma classe de
reaes de amplificao de cido nucleico isotrmica
que utiliza vrios iniciadores e sondas, dos quais um
ou mais so iniciadores cruzados. A reao implica o
deslocamento de uma fita pela DNA polimerase sem a
necessidade de uma etapa inicial de desnaturao ou a
adio de uma enzima de corte (15). A uma temperatura
de ensaio de 63C, a formao de um hbrido iniciadorfita molde em bolhas de desnaturao transitrias e
espontneas na fita-molde de DNA favorecida em
relao ao reanelamento das fitas-molde, devido alta
concentrao de iniciadores em relao ao DNA-molde.
O deslocamento de fitas estimulado pelo anelamento
dos iniciadores cruzados com as terminaes 5 que no
so complementares fita-molde e pela ligao de um
iniciador de deslocamento acima do iniciador cruzado.
A amplificao exponencial resultante do DNA-alvo
altamente especfica e sensvel, produzindo amplicons
de apenas quatro clulas bacterianas.

Amplificao por crculo rolante (RCA, do ingls


rolling circle amplification) e amplificao crculo a
crculo (C2CA, do ingls circle-to-circle amplification)
so plataformas de amplificao isotrmicas integradas
e de subsequente deteco eletrofortica de um gene
especfico em um microchip de poli (metacrilato de
metila) (16). A RCA e a C2CA so realizadas a 37C no
poo para amostra do microchip, e fornecem um mtodo
para amplificao de sinal sensvel, rpido, reprodutvel e
de alto rendimento.
Avanos rpidos nas tecnologias de sequenciamento,
tais como a tecnologia nanoporo, tornaram possvel
conduzir rapidamente amplas varreduras de genomas a
um custo relativamente baixo. Essas tecnologias podem
ser aplicadas para a deteco de genes que conferem
resistncia gonoccica.

A2.5 Referncias
1. Devarajan S, Reinikka-Soininen R, World Bank.
Making services work for poor people: world
development report 2004. New York, Oxford
University Press for the World Bank, 2003.
2. Guidelines for the management of sexually
transmitted infections. Genebra, Organizao
Mundial da Sade, 2003.
3. Peeling RW et al. Why do we need qualityassured diagnostic tests for sexually transmitted
infections? Nature Reviews. Microbiology, 2006,
4(12):909921.
4. Peeling RW et al. Rapid tests for sexually transmitted
infections (STIs): the way forward. Sexually
Transmitted Infections, 2006, 82(Suppl 5):v16.
5. Peeling RW. Applying new technologies for
diagnosing sexually transmitted infections in
resource-poor settings. Sexually Transmitted
Infections, 2011, 87(Suppl 2):ii2830.
6. Aledort JE et al. Reducing the burden of sexually
transmitted infections in resource-limited settings:
the role of improved diagnostics. Nature, 2006,
444(Suppl 1):5972.
7. Kettler H, White K, Hawkes S. Mapping the
landscape of diagnostics for sexually transmitted

Anexo 2: Princpios dos testes point-of-care rpidos

203

infections. Publicao da OMS/TDR. Organizao


Mundial da Sade represetando o Programa
Especial de Pesquisa e Treinamento em Doenas
Tropicais, 2004.
8. Mabey D et al. Prospective, multi-centre clinicbased evaluation of four rapid diagnostic tests for
syphilis. Sexually Transmitted Infections, 2006,
82(Suppl 5):v1316.
9. Castro AR et al. Novel point-of-care test for
simultaneous detection of nontreponemal
and treponemal antibodies in patients with
syphilis. Journal of Clinical Microbiology, 2010,
48(12):46154619.
10. Tucker JD, Bien CH, Peeling RW. Point-of-care
testing for sexually transmitted infections: recent
advances and implication for disease control.
Current Opinion in Infectious Diseases, 2013,
26(1):7379.

11. Sorger PK. Microfluidics closes in on pointof-care assays. Nature Biotechnology, 2008,
26(12):13451346.
12. Chin CD et al. Microfluidics-based diagnostics of
infectious diseases in the developing world. Nature
Medicine, 2011, 17(8):10151019.
13. Niemz A, Ferguson TM, Boyle DS. Point-of-care
nucleic acid testing for infectious diseases. Trends
in Biotechnology, 2011, 29(5):240-250.
14. Piepenburg O et al. DNA detection using
recombination proteins. PLoS Biology, 2006,
4(7):e204.
15. Xu G et al. Cross priming amplification: mechanism
and optimization for isothermal DNA amplification.
Scientific Report, 2012, 2:246.
16. Mahmoudian L et al. Rolling circle amplification
and circle-to-circle amplification of a specific gene
integrated with electrophoretic analysis on a single
chip. Analytical Chemistry, 2008, 80(7):2483-249.

Anexo 3
Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de
doenas sexualmente transmissveis
A3.1 Introduo
As doenas sexualmente transmissveis (DST) podem ser
causadas por vrus, bactrias ou parasitas, no sendo
raras as coinfeces. Os espcimes clnicos para a
testagem de DST tambm so colhidos a partir de
diferentes regies anatmicas, utilizando vrias tcnicas
e aparatos de coleta, e em vrios locais, havendo
grandes variaes no transporte e armazenamento de
espcimes, assim como recursos diferenciados para o
diagnstico de DST. Consequentemente, existem muitos
mtodos diferentes para realizar o diagnstico
laboratorial de DST efetivo em todo o mundo, e esses
mtodos podem variar significativamente quanto
sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade tanto
para testar uma nica infeco quanto para uma grande
gama de DST. Os mtodos laboratoriais histricos para a
deteco de agentes etiolgicos das DST incluem a
cultura bacteriolgica ou de tecido, vrios testes
sorolgicos para detectar a presena de anticorpos
especficos, imunohistoqumica, deteco de antgenos e
microscopia. De forma similar ao diagnstico de muitas
outras doenas infecciosas, a deteco direta de cidos
nucleicos especficos de patgenos que causam DST,
utilizando diferentes testes de amplificao de cido
nucleico (NAAT, do ingls nucleic acid amplification
tests), tornou-se o novo padro ouro para o
diagnstico de muitas DST, devido sua sensibilidade e
especificidade superiores. Muitos NAAT foram aprovados
pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica (FDA, do ingls United States of
America Food and Drug Administration), ou outros
organismos regulatrios internacionais, nacionais ou
regionais, e esto disponveis comercialmente.
Entretanto, diversos ensaios para o diagnstico de DST
desenvolvidos por laboratrio (EDL), utilizando mtodos
baseados na reao em cadeia da polimerase (PCR, do
ingls polymerase chain reaction) convencional ou em
tempo real, tambm so populares, principalmente para
fins epidemiolgicos e de pesquisa. Atualmente, muitos

NAAT singleplex ou multiplex disponveis comercialmente


ou mesmo EDL esto em uso para o diagnstico de DST.
Se algum NAAT no aprovado pela FDA for utilizado,
processos regulatrios internacionais, tais como os da
Unio Europeia (UE), e/ou outros nacionais devem atestar
a segurana quanto qualidade e desempenho do NAAT.
Para o diagnstico de DST, recomendado apenas o uso
de NAAT aprovados internacionalmente. Se isso no for
possvel, essencial que o NAAT sugerido seja
estritamente validado antes do seu uso, de acordo com
os requerimentos locais. A avaliao deve ser realizada
mediante a comparao com pelo menos um NAAT
aprovado internacionalmente, e o ensaio deve ser, ento,
utilizado com controles positivo, negativo e de inibio
apropriados. Alm disso, altamente recomendada a
participao em um sistema de avaliao externa da
qualidade (AEQ).
Em muitos casos, os NAAT so preferidos em relao
aos mtodos diagnsticos convencionais devido sua
sensibilidade e especificidade superiores, menor tempo
para entrega de resultados, alto rendimento e
convenincia da automao, realizao de ensaios
multiplex e quantificao. Devido sua alta sensibilidade,
os NAAT tambm so efetivos para detectar organismos
de infeces assintomticas ou na fase precoce da
infeco (antes da soroconverso), e podem ser
aplicados para espcimes coletados pelo prprio
paciente, de modo no invasivo, tais como amostras de
secreo vaginal ou do primeiro jato de urina.
O diagnstico molecular de DST utilizando testes
baseados em cido nucleico bastante potente, mas
apresenta limitaes. Um dos pontos positivos dos NAAT
a capacidade de detectar patgenos sem a
necessidade de que os organismos estejam vivos, o que
torna o transporte e armazenamento do espcime menos
problemtico. Entretanto, isso tambm constitui um dos
pontos negativos do NAAT; por exemplo, os isolados no
esto disponveis para um teste subsequente de

Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis

205

susceptibilidade antimicrobiana do organismo-alvo ou


outra caracterizao fenotpica. Consequentemente, os
NAAT detectam o cido nucleico tanto de organismos
vivos quanto mortos e, dessa forma, no so adequados
para o teste de cura (TOC, do ingls test-of-cure), a
menos que haja tempo suficiente para que os
organismos residuais e cidos nucleicos sejam
eliminados pelo hospedeiro infectado antes da coleta da
amostra para o TOC. Alm disso, a relao gentica
prxima entre organismos-alvo e espcimes intimamente
relacionados, como, por exemplo, Neisseria gonorrhoeae
e Neisseria spp. comensal, pode gerar resultados
falso-positivos (1, 2). Tambm podem ocorrer resultados
falso-negativos devido variao ou deleo de
sequncias-alvo especficas no organismo a ser
detectado, a exemplo da nova variante sueca de
Chlamydia trachomatis (nvCT) (3, 4). O futuro prximo do
diagnstico molecular de DST deve priorizar a validao
e licenciamento do uso de diferentes ensaios para
espcimes do reto e faringe, alm da expanso da atual
microfludica e nanotecnologia para permitir a integrao
da coleta, estabilizao e manuseio do espcime,
incluindo o desenvolvimento do processo de testagem
em sistemas acessveis, totalmente automatizados, de
alto rendimento e fceis de serem utilizados. Em pases
desenvolvidos, a aplicao de testes point-of-care deve
ser um foco na expanso do portflio para a deteco de
patgenos relacionados DST, a incorporao da
deteco quantitativa e o estabelecimento da deteco
de marcadores moleculares para a tipagem molecular ou
de resistncia antimicrobiana em um nico ensaio
multiplex. Em pases com limitaes de recursos, os
processos de testagem simples e acessveis, que
envolvam instrumentao sustentvel, menor tempo de
manipulao, sistemas fechados para reduzir os riscos
de contaminao, boa capacidade de rendimento e
reagentes de menor custo so as necessidades mais
importantes.
Um NAAT desenhado de forma apropriada ,
teoricamente, capaz de detectar um nico alvo em uma
amostra, com especificidade bastante alta. Entretanto,
atingir esse nvel de limite de deteco requer uma srie
de processos demorados para a otimizao do NAAT.
Alm disso, a sensibilidade analtica dos NAAT tambm
pode ser influenciada por uma variedade de fatores,

206

como, por exemplo, fatores individuais inerentes aos


espcimes clnicos, tais como inibidores; o tipo de
espcime; o nmero de cpias da sequncia-alvo; a
extrao do cido nucleico; a amplificao e a tecnologia
de deteco utilizada. Existem cinco estgios crticos
nos testes baseados em cido nucleico: coleta de
amostra, estabilizao/armazenamento/ transporte de
amostra, extrao/purificao do cido nucleico,
amplificao e deteco. Todos os estgios apresentam
influncia primordial na qualidade e segurana dos
resultados dos testes laboratoriais. Para que um NAAT
diagnostique com xito uma DST, o espcime clnico
precisa ser devidamente coletado a partir da regio
anatmica apropriada e o cido nucleico-alvo
estabilizado no meio de transporte para o
armazenamento e transferncia. No laboratrio, a
extrao/purificao eficiente de cido nucleico crucial
para a preparao da amostra visando a produo de um
molde puro para PCR, sem contaminao com nucleases
e inibidores. Subsequentemente, um NAAT bem
desenhado e otimizado essencial a uma amplificao
eficiente para produzir amplicons de PCR suficientes. Por
ltimo, mas no menos importante, uma estratgia de
deteco adequada necessria a fim de produzir sinais
fortes e claros para positividade e sinais negativos
evidentes para negatividade. O processo de testagem do
NAAT considerado de complexidade mdia a alta e,
geralmente, requer profissionais bem treinados e
infraestrutura laboratorial sofisticada.
A alta sensibilidade dos NAAT pode ser problemtica,
uma vez que at um nvel muito baixo de contaminao
pode levar a resultados falso-positivos. A possibilidade
de contaminao, que a maior preocupao em muitos
laboratrios de diagnstico molecular, pode acontecer
em, praticamente, todos os estgios dos processos
baseados em cido nucleico. Em alguns mtodos, a
adio de enzimas tais como a uracil N-glicosilase na
preparao da reao de PCR ajuda a reduzir a
contaminao por amplicons por meio da degradao
destes, mas isso no previne a contaminao por DNA
genmico diretamente de um espcime para o outro.
Assim, para um NAAT bem sucedido, so pr-requisitos
a adoo de boas prticas para laboratrios moleculares,
um fluxo de trabalho unidirecional e salas separadas

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

para a extrao do cido nucleico, preparao da reao


de PCR e testagem. Outra alternativa para reduzir a
possibilidade de contaminao o emprego de um
sistema robtico fechado, como se observa em muitas
plataformas comerciais para o teste de DST, nas quais,
com exceo da coleta de amostra no meio de
transporte apropriado, os estgios remanescentes do
NAAT so totalmente automatizados, eliminando as
etapas trabalhosas de processamento de amostra.
Entretanto, a complexidade do teste molecular; a
necessidade de equipamentos sofisticados e, muitas
vezes, caros; os kits para NAAT de alto custo e a
necessidade de tcnicos experientes podem representar
desafios para laboratrios com escassez de recursos.
At o momento da escrita deste anexo (junho de 2012),
existem duas principais categorias de tecnologias de
diagnstico para a identificao de DST utilizando
mtodos moleculares. Uma delas (tecnologia de
amplificao de cido nucleico, isto , NAAT), que a
mais utilizada, baseia-se na amplificao de cido
nucleico (DNA ou RNA) especfico do organismo-alvo a
fim de gerar produtos amplificados suficientes para

serem convertidos, por diferentes tecnologias, em sinais


para deteco.
A segunda categoria (tecnologia no baseada na
amplificao de cido nucleico) utiliza sondas de cido
nucleico no amplificadas (por exemplo, marcadas com
enzimas) que hibridizam diretamente a fita-molde alvo;
subsequentemente, como em reaes enzima-substrato,
os sinais so amplificados e detectados. As tecnologias
no baseadas na amplificao de cido nucleico
normalmente so de menor custo e a sua sensibilidade
analtica excede a dos mtodos de diagnstico
convencionais, tais como a cultura ou os imunoensaios
enzimticos (EIA, do ingls enzyme immunoassays);
porm, sua sensibilidade substancialmente menor que
a das tecnologias baseadas em amplificao. A Tabela
A3.1 lista alguns dos ensaios com base em cido
nucleico disponveis comercialmente para o diagnstico
molecular das DST, na poca em que o presente anexo
foi escrito.

Tabela A3.1: Exemplos de ensaios para DST baseados em cido nucleico disponveis comercialmente (junho de 2012)

Organismos-alvo

Tecnologia

Companhia

Chlamydia trachomatis (CT),


Neisseria gonorrhoeae (NG), ou
combo CT/NG

PCR
TMA-HPA
CH (sonda de DNA)
PCR em tempo real
SDA
CH (sonda de RNA)
RT-PCR

Roche, Cepheid
Gen-Probe
Gen-Probe
Abbott, Roche, Siemens
Becton, Dickinson
Qiagen
Roche

HIV

PCR em tempo real


PCR em tempo real

Abbott

NASBA

bioMrieux

PCR em tempo real


RT-PCR
Genotipagem do HIV
HPV

Genotipagem do HPV

bDNA
Sequenciamento
Sequenciamento
PCR em tempo real
TMA-HPA
HC
PCR
PCR
PCR hibridizao em linha

National Genetics Institute


Siemens
Siemens
Abbott
Abbott
Gen-Probe
Qiagen
Roche
Roche
Innogenetics

Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis

207

Tabela A3.1: Exemplos de ensaios para DST baseados em cido nucleico disponveis comercialmente (junho de 2012)
(continuao)

Organismos-alvo

Tecnologia

Companhia

HBV

PCR em tempo real


PCR em tempo real
bDNA
CH
Sequenciamento
PCR em tempo real
RT-PCR
PCR em tempo real
RT-PCR
bDNA
PCR em tempo real
PCR em tempo real
PCR em tempo real
PCR em tempo real
PCR em tempo real
SDA
Amplificao isotrmica dependente
de helicase
TMA-HPA
PCR

Roche
Abbott
Siemens
Qiagen

Hibridizao do DNA por sonda

Becton, Dickinson

Genotipagem do HBV
HCV

Genotipagem do HCV
HSV

Trichomonas vaginalis
C. trachomatis, N. gonorrhoeae e
Mycoplasma genitalium
Gardnerella vaginalis, T. vaginalis
e Candida spp.

Roche
Abbott
National Genetics Institute
Siemens
Abbott
Abbott
Roche
Qiagen
EraGen Biosciences
Becton, Dickinson
BioHelix
Gen-Probe
Bio-Rad Laboratories

bDNA: ensaio de hibridizao de DNA em cadeia ramificada; HBV: vrus da hepatite B; CH: captura hbrida; HCV: vrus da hepatite C; HIV: vrus da
imunodeficincia humana; HPA: ensaio de proteo da hibridizao; HPV: papilomavrus humano; HSV: vrus da herpes simples; NASBA:
amplificao baseada na sequncia de cido nucleico; PCR: reao em cadeia da polimerase; RT-PCR: reao da transcriptase reversa seguida de
PCR; SDA: amplificao por deslocamento de cadeia; TMA: amplificao mediada por transcrio.

A3.2 Tecnologias de amplificao de cido


nucleico

triagens de alta escala. Os sistemas de diagnstico

Os NAAT so os testes de diagnstico molecular mais


sensveis, ainda que complexos, e, geralmente,
apresentam desempenho superior quanto
sensibilidade, em relao aos testes diretos baseados
em sondas (sem amplificao) assim como todas as
outras classes de testes de diagnstico. Alguns NAAT
comerciais de primeira gerao para o diagnstico de
DST foram parcialmente automatizados para reduzir os
requisitos laboratoriais, mas ainda apresentam risco de
problemas de contaminao. Atualmente, as plataformas
dos testes comerciais de segunda gerao so
equipadas com mdulos aperfeioados de

principalmente os ensaios para a deteco de N.

processamento de espcime, totalmente automatizados,


o que permite obter diagnsticos moleculares altamente
eficientes e livres de contaminao, inclusive para

208

molecular baseados na amplificao tm enfocado


gonorrhoeae, C. trachomatis, o vrus da herpes simples
(HSV, do ingls herpes simplex virus), o vrus da
imunodeficincia humana (HIV, do ingls human
immunodeficiency virus), o vrus da hepatite B (HBV, do
ingls hepatitis B virus), o vrus da hepatite C (HCV, do
ingls hepatitis C virus) e o papilomavrus humano (HPV,
do ingls human papillomavirus). Alm da deteco
qualitativa de vrus, a quantificao da carga viral em
espcimes clnicos de grande importncia e est
disponvel para o diagnstico, prognstico e
monitoramento teraputico do HIV, HBV e HCV. A Tabela
A3.2 lista algumas tecnologias de amplificao de cido
nucleico existentes, mostrando as companhias que
comercializam esses testes, se o teste ou no

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela A3.2: Testes de amplificao de cido nucleico (NAAT), junho de 2012

Tecnologia

Companhia

Isotrmica

Alvo

Enzima

PCR

Roche

No

DNA

DNA polimerase

PCR em tempo real

Abbott, Roche

No

DNA

DNA polimerase

TMA

Gen-Probe

Sim

RNA

Transcriptase reversa e
RNA polimerase

SDA

Becton, Dickinson

Sim

DNA

DNA polimerase e
endonuclease de
restrio

NASBA

bioMrieux

Sim

RNA

Transcriptase reversa,
RNase H, RNA
polimerase

NAAT, teste de amplificao de cido nucleico; NASBA: amplificao baseada na sequncia de cido nucleico; PCR: reao em cadeia da
polimerase; SDA: amplificao por deslocamento de cadeia; TMA: amplificao mediada por transcrio.

isotrmico, o tipo de alvo e as enzimas respectivamente

A3.2.1 Reao em cadeia da polimerase (PCR)

utilizadas. Como mencionado acima, uma das principais

A PCR foi desenvolvida em 1983 (5, 6) e


frequentemente referida como um dos avanos
cientficos mais importantes na biologia e medicina.
Atualmente, representa uma tecnologia fundamental e,
frequentemente, indispensvel, amplamente utilizada na
biologia molecular, microbiologia, diagnstico clnico e
em muitas outras reas. O nome PCR vem da DNA
polimerase utilizada para amplificar uma sequncia
especfica de DNA por meio da replicao enzimtica in
vitro. A etapa inicial de aquecimento (normalmente a
94-95C) desnatura o DNA de fita dupla (dsDNA, do
ingls double-stranded DNA) alvo em duas fitas simples
de DNA complementares, permitindo que dois iniciadores
se anelem a uma temperatura mais baixa (dependendo
do iniciador) s suas sequncias complementares,
flanqueando a sequncia especfica a ser amplificada.
Em seguida, a extenso (normalmente a 72C) dos
iniciadores catalisada por uma DNA polimerase estvel
no calor (tais como a Taq DNA polimerase), a qual
sintetiza duas fitas novas de DNA, utilizando
desoxirribonucleosdeo trifosfatos (dNTP) e as fitas
originais como molde. Esse processo (Figura A3.1)
resulta na duplicao da sequncia original de DNA-alvo,
com cada uma das molculas novas contendo uma fita
antiga e uma nova de DNA. Subsequentemente, cada
uma dessas fitas pode ser utilizada para criar duas
cpias novas e assim por diante. Numerosos ciclos
repetitivos de desnaturao, anelamento e extenso
resultam em um acmulo exponencial de um fragmento

vantagens desses ensaios de amplificao altamente


sensveis a sua capacidade de testar amostras no
invasivas, tais como o primeiro jato de urina e secrees
vaginais, que podem ser obtidos pelo prprio paciente. O
sucesso do uso de ensaios de amplificao multiplex e
de amostras no invasivas facilitou enormemente o
processo de triagem, o qual particularmente
importante, uma vez que a maioria das DST so
assintomticas e sua deteco depende da triagem em
populaes, que, a princpio, no seriam testadas por
abordagens tradicionais. Atualmente, possvel utilizar
meios alternativos, incluindo a coleta de espcime em
domiclio para os programas de triagem de DST ou em
clnicas de planejamento familiar, em que no h
necessidade de coleta do espcime pelo mdico. O
primeiro jato de urina de homens e as amostras de
secrees vaginais, coletadas pela prpria paciente com
o auxlio de uma haste, so altamente aceitveis para os
programas de triagem de C. trachomatis e N.
gonorrhoeae, na utilizao de tecnologias de
amplificao de cido nucleico. Os meios no invasivos
de obteno de espcimes para diagnstico podem
constituir um modo de alcanar indivduos sexualmente
ativos que deveriam ser testados para DST mas no
possuem acesso a um centro de cuidado sade ou tm
medo de realizar um exame plvico. Eles tambm podem
poupar gastos, uma vez que dispensam os exames
plvicos de alto custo realizados por mdicos.

Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis

209

especfico de DNA. Os ciclos de PCR de trs etapas

desnaturao do DNA, o anelamento dos iniciadores e a


extenso. importante notar que a manuteno
apropriada, a verificao das temperaturas e o tempo de
rampa (aquecimento/resfriamento) dos termocicladores
so elementos-chave para garantir resultados
reprodutveis e de alta qualidade.

podem ser repetidos at 30 ou 40 vezes, levando a


bilhes de cpias da sequncia-alvo do DNA original. O
processo completo de ciclagem da PCR automtico,
programvel e pode ser completado em apenas poucas
horas. Ele realizado em uma mquina denominada

A tecnologia de PCR revolucionou a deteco e


caracterizao dos organismos de doenas infecciosas,
incluindo os agentes etiolgicos das DST.
Tradicionalmente, os amplicons especficos gerados por

termociclador, a qual equipada com elementos e/ou


ventiladores para aquecimento e resfriamento que
alteram rapidamente a temperatura, permitindo a

Iniciadores de DNA

DNA parental
Etapa 1:
desnaturao
(95C)

Fita molde de DNA

Taq

3'

5'

Nucleotdeos
(dTTP, dCTP, dATP, dGTP)

DNA polimerase

3'

5'
Etapa 2:
anelamento

Duas fitas de DNA

(55C)

5'

5'

3'

5'

3'

5'

3'

3'

5'

5'
Taq

Repetir o ciclo
(20-40 vezes)

3'

3'
P

5'

5'

Etapa 3: sntese (72C);

3'

Regio do DNA a ser


amplificada

Novas fitas de DNA


5'

5'

3'
5'

3'

3'

5'
Taq

Quatro fitas de DNA

Figura A3.1
Reao em cadeia da polimerase (PCR): processo de trs etapas.
Fonte: cortesia da Encyclopdia Britannica, Inc. (http://www.britannica.com/EBchecked/media/18071/The-three-stepprocess-of-the-polymerase-chain-reaction, acessado em 23 de junho de 2013).

amplicon incluem o uso de sondas de captura ou de

(para alvos de RNA), PCR assimtrica, PCR digital, PCR


multiplex, PCR semiquantitativa e PCR quantitativa em
tempo real.

deteco (marcadas, por exemplo, com enzimas ou

A3.2.2 PCR em tempo real

molculas fluorescentes) no formato de micropoos e a

O princpio da PCR em tempo real idntico ao da PCR


convencional, exceto pelo fato de que os processos de
amplificao e deteco so combinados para permitir o
monitoramento do processo de amplificao, uma vez
que este ocorre em tempo real. A PCR convencional s
capaz de realizar medies aps seu trmino (isto ,
detectar e visualizar os produtos de PCR aps o trmino
da amplificao). O avano mais significativo do desenho

PCR eram detectados por gel de eletroforese corado com


brometo de etdeo. Outros mtodos de deteco de

determinao do tamanho dos produtos de PCR


utilizando um Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ou
um Bioanalyzer (Agilent). Muitas modificaes e
adaptaes foram feitas na tcnica original de PCR para
expandir seu uso e benefcios, as quais incluem, dentre
outras, as seguintes: nested PCR, touchdown PCR,
hot-start PCR, PCR com transcrio reversa (RT-PCR)

210

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

da PCR em tempo real a incorporao da tecnologia de


deteco baseada na fluorescncia, utilizando tanto
marcadores que se ligam ao dsDNA quanto sondas
especficas marcadas por molculas fluorescentes
(como, por exemplo, sondas de hidrlise, de hibridizao
ou conformacionais e sinalizadores moleculares) para
permitir no somente a deteco de um cido nucleicoalvo especfico, mas tambm a quantificao do alvo
(Q-PCR). Alm disso, a PCR em tempo real integra e
automatiza tanto a amplificao como a deteco em um
instrumento, o que, frequentemente, requer menos
tempo e trabalho para a obteno dos resultados em
comparao com a realizao de uma PCR convencional.
Outras vantagens da PCR em tempo real incluem o uso
de sequncias-alvo menores (<150bp), a necessidade de
menor volume de espcime, um alcance dinmico mais
amplo para deteco, sensibilidade e especificidade
analticas maiores, capacidade de anlises multiplex e de
curva de fuso; alm disso, no necessria a
manipulao aps a realizao da PCR.
Para monitorar a amplificao durante a PCR em tempo
real, molculas reprteres fluorescentes so utilizadas
para a gerao de sinal fluorescente. A maioria dos
sistemas de PCR em tempo real usa uma faixa fixa do
aparato de emisso de luz para a excitao da
fluorescncia e uma cmera, com dispositivo de carga
acoplado ou um tubo fotomultiplicador com filtros
apropriados para a deteco da fluorescncia. O
aumento no sinal de fluorescncia diretamente
proporcional ao nmero de amplicons gerados na fase
exponencial da reao. A linha de base da PCR em
tempo real se refere quantidade de sinal nos 5-15
ciclos iniciais, durante os quais h pouca mudana no
sinal fluorescente, enquanto que a linha de incio a
quantidade de sinal que reflete um aumento significativo
em relao ao sinal calculado para a linha de base. A
linha de incio pode ser definida, automaticamente, pelo
software do instrumento ou, manualmente, pelo usurio.
O ciclo de incio (Ct, do ingls cycle threshold) o
nmero do ciclo da PCR cujo sinal de fluorescncia da
reao cruza o incio. Consequentemente, a presena de
um Ct reflete o acmulo de um nmero suficiente de
amplicons para ser considerado como uma reao
positiva e o Ct inversamente relacionado quantidade
inicial de fita-molde. Os dados da PCR em tempo real

so normalmente plotados em um grfico de nmero do


ciclo da PCR versus a intensidade de fluorescncia, a
qual relacionada ao nmero inicial da fita-molde. A
Figura A3.2 mostra uma curva de amplificao tpica de
uma PCR em tempo real.
Dois mtodos comuns para a deteco dos produtos de
amplificao da PCR em tempo real so: a deteco no
especfica, utilizando marcadores fluorescentes que se
intercalam com qualquer dsDNA, tais como o SYBR
Rn
2,000,000

Plat

Amostra
1,000,000
Incio

Fase
exponencial

CT

Sem fita molde

Linha de base
0

20

40
Nmero do ciclo da PCR

Figura A3.2
Curva de amplificao tpica de uma PCR em tempo real.
Fonte: cortesia do Centro Nacional para Informao em
Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/
genome/ probe/doc/TechQPCR.shtml, acessado em 23
de junho de 2013).
Green; e a deteco especfica, utilizando sondas
fluorescentes especficas para o alvo, tais como a sonda
TaqMan (sonda de hidrlise), sinalizadores moleculares
ou sondas de hibridizao dupla. O SYBR Green ,
provavelmente, o marcador de ligao a dsDNA para PCR
em tempo real mais amplamente utilizado. Na soluo,
as molculas marcadoras no ligadas exibem muito
pouca fluorescncia, mas a fluorescncia aumenta
significativamente quando se liga ao dsDNA. Conforme o
dsDNA se acumula, o SYBR Green gera sinais que so
proporcionais concentrao de DNA-alvo (Figura
A3.3A). Considera-se que essa tecnologia no apresenta
uma especificidade muito alta, uma vez que o marcador
se liga indiscriminadamente a todos os dsDNA formados
durante a PCR e, consequentemente, qualquer produto
falso de amplificao tambm pode contribuir, de modo
geral, para o sinal de fluorescncia. Entretanto, a

Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis

211

amplificao utilizando marcadores que se ligam a

e no especficos, utilizando os picos de fuso (Figura

dsDNA podem ser submetidos anlise de curva de

A3.3B)

fuso para diferenciar entre produtos de PCR especficos

Fluorencncia normal

(A)

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1 Incio
0.0

10

15

20

25

30

35

40

45

Ciclo
Ciclagem de A.Green (Pgina
1);
R=0.99716
R^2=0.99433
M=-3.283
B=38.737
Eficincia =1.02

35

CT

30
25
20
102

101

103

104
Concentrao

105

106

Fluorescncia

(B)
15
10
5
45

50

50
55

60

65

70

75

80

85

90

70

75

80

85

90

C
0.8

dF/dT

0.6
0.4
0.2
0.0
45

50

50
55

60

65
C

Figura A3.3
(A) Curva de amplificao tpica de uma PCR em tempo real, mostrando os espcimes com uma diluio em
srie do DNA-alvo e a curva padro; (B) anlise da curva de fuso utilizando as temperaturas de fuso (Tm)
para aumentar a especificidade da PCR em tempo real baseada em SYBR Green.
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

212

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

A sonda TaqMan (sonda de hidrlise; Figura A3.4) a

gera uma fluorescncia que aumenta a cada ciclo de


PCR. Os ensaios baseados na sonda TaqMan tm sido
amplamente utilizados na PCR em tempo real para
expresso gnica, determinao de carga viral,
genotipagem por polimorfismo de nucleotdeo simples
(SNP, do ingls single nucleotide polymorphism),
identificao bacteriana, discriminao allica e
verificao de resultados de microarranjos (microarray).

sonda especfica para alvo mais comumente usada na


deteco por PCR em tempo real. A PCR baseada na
sonda TaqMan requer um par de iniciadores de PCR
especficos e uma sonda TaqMan de oligonucleotdeo
complementar sequncia especfica de DNA da
fita-molde entre os iniciadores de sentido direto e
inverso. A sonda normalmente desenhada com um
marcador de alta energia denominado Reprter
(fluorforo) na terminao 5 e uma molcula de baixa
energia denominada Supressor na terminao 3 (que
suprime a fluorescncia do Reprter). Essa sonda
fluorescente duplamente marcada emite pouca
fluorescncia quando livre em soluo, devido
proximidade do Supressor ao Reprter. Durante a
amplificao por PCR em tempo real, a sonda anelada
fita molde clivada pela atividade de nuclease 5 da Taq
DNA polimerase para liber-la (separ-la do Supressor).
Uma vez excitado pela fonte de luz, o marcador reprter
1. Polimerizao: Um marcador reprter fluorescente (R) e um
supressor (S) so ligados s terminaes 5 e 3 de uma sonda
TaqMan, respectivamente.
5'
3'
5'

Iniciador senso

Sonda

3'

Iniciador anti-senso

5'
3'
5'

2. Deslocamento da fita: Quando a sonda est intacta, a emisso


do marcador reprter suprimida..
R

5'
3'
5'

3'

5'
3'
5'

3. Clivagem: Durante o ciclo de extenso, a DNA polimerase cliva o


marcador reprter da sonda.
R

5'
3'
5'

3'

5'
3'
5'

4. Polimerizao completa: Uma vez separado do supressor, o


marcador reprter emite sua fluorescncia caracterstica.
R

3'

5'
3'
5'

5'
3'
5'

Os sinalizadores moleculares (sondas do tipo grampo)


so sondas de hibridizao de oligonucleotdeos de fita
simples que formam uma estrutura de haste e ala
(stem-and-loop) (Figura A3.5). A ala contm uma
sequncia de sonda complementar sequncia-alvo; a
haste formada pelo anelamento das sequncias
complementares dos braos, que esto localizadas em
ambos os lados da sequncia da sonda. Um fluorforo
ligado covalentemente extremidade 5 de um brao; do
mesmo modo, um supressor ligado covalentemente
extremidade 3 do outro brao. A haste mantm essas
duas molculas prximas uma da outra, causando a
supresso da fluorescncia do fluorforo por meio da
transferncia de energia. Dessa forma, os sinalizadores
moleculares no liberam fluorescncia quando esto
livres em soluo. Entretanto, quando se hibridizam s
fitas de cido nucleico contendo sua sequncia-alvo
complementar, eles sofrem uma mudana
conformacional que lhes permite emitir fluorescncia.
Logo, quando a sonda hibridiza-se a uma molcula-alvo,
forma-se um hbrido sonda-alvo mais longo e estvel
que o hbrido da haste. A rigidez e comprimento do
hbrido sonda-alvo impede a existncia simultnea do
hbrido da haste. Consequentemente, os sinalizadores
moleculares sofrem uma reorganizao conformacional
espontnea que fora a separao da haste e causa o
afastamento entre o fluorforo e o supressor, levando
restaurao da fluorescncia. Os sinalizadores
moleculares podem ser utilizados no ensaio de PCR em
tempo real para a deteco de SNP e mutaes.

Figura A3.4
PCR em tempo real baseada na sonda TaqMan
(sonda de hidrlise).
Fonte: cortesia da Life Technologies Corporation (http://
www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/
applications-technologies/real-time-pcr/taqman-andsybr-green-chemistries.html, acessado em 23 de junho
de 2013).
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis

213

Sequncia da sonda

Grampo
Fluorforo

Sinalizador
molecular

Supressor

+
Alvo de DNA ou
RNA

Hbrido

Figura A3.5
Sinalizador molecular (sonda do tipo grampo).
Fonte: cortesia de Horspool D. Wikipedia, 2009 (http://
en.wikipedia.org/wiki/Molecular_beacon, acessado em
11 de abril de 2013); Introduction to molecular beacons.
Nova Jersey, EUA, Public Health Research Institute, 2013
(http://molecular-beacons.org/MB_introduction.html,
acessado em 23 de junho de 2013).

O sistema de sonda de hibridizao dupla ou de


transferncia de energia de ressonncia por
fluorescncia (FRET, do ingls fluorescence resonance
energy transfer) (Figura A3.6) consiste em duas sondas
em par que se hibridizam na sequncia-alvo prximas
uma da outra (normalmente, de um a, no mximo, quatro
nucleotdeos de distncia). A sonda doadora (ncora)
marcada com um fluorforo na terminao 3 e a sonda
receptora (reprter) com outro fluorforo na terminao
5. Os fluorforos so desenhados para permitir que o
espectro de emisso de um se sobreponha
significativamente ao espectro de excitao do outro.
Durante a PCR, o fluorforo doador excitado por uma
fonte luminosa externa e a energia transferida para o
fluorforo receptor, se posicionado adjacente ao
primeiro. O fluorforo receptor excitado emite, ento,
uma luz em um comprimento de onda diferente, a qual
pode ser detectada e medida. As sondas FRET so
utilizadas frequentemente em PCR em tempo real; por
exemplo, em ensaios de discriminao allica.

A3.2.3 Amplificao mediada por transcrio (TMA)


A tecnologia patenteada TMA (do ingls transcriptionmediated amplification) (7,8) pode ser utilizada para

214

amplificar tanto DNA quanto RNA e produz amplicon de


RNA, ao contrrio da maioria dos outros NAAT, que s
produzem DNA. Em sistemas TMA disponveis
comercialmente, um processo de captura de alvo (TC, do
ingls capture target) realizado antes do TMA, isto ,
para reduzir a inibio da amplificao e contaminao.
Nesse mtodo de TC, oligmeros poli-T associados a
partculas magnticas so utilizados para ligar uma
sonda de captura contendo a cauda poli-A a uma
sequncia-alvo especfica, a qual pode se hibridizar
especificamente sequncia complementar do
RNA-alvo. O processo de TMA subsequente (Fig A3.7), o
qual amplifica a sequncia alvo capturada, utiliza dois
iniciadores especficos para o alvo e duas enzimas
diferentes (RT e RNA polimerase) para a amplificao.
Um dos iniciadores especficos contm uma sequncia
promotora para a RNA polimerase e, quando esse
iniciador se hibridiza ao RNA-alvo, a transcrio reversa
iniciada, criando uma cpia de DNA complementar
(cDNA). O RNA no heteroduplex RNA:DNA resultante
degradado pela atividade RNase H da RT. Isso permite
que o segundo iniciador se ligue cpia de DNA e
sintetize uma nova fita de DNA pela RT, criando uma
molcula de dsDNA. Ambas as fitas da molcula de
dsDNA criadas contm agora uma sequncia promotora
para a RNA polimerase e, dessa forma, podem ser
utilizadas como fita-molde para iniciar a transcrio.
Consequentemente, cada um dos novos amplicons de
RNA sintetizados entra novamente no processo de TMA
e serve como uma fita-molde para um novo ciclo de
replicao, levando a uma expanso exponencial da
sequncia de RNA-alvo. A TMA pode produzir 100-1.000
cpias por ciclo de amplificao, em contraste com a
PCR, que s produz duas cpias por ciclo. A TMA
isotrmica; a reao inteira realizada na mesma
temperatura em um banho-maria ou um bloco de
aquecimento no lugar do termociclador.
Os amplicons de RNA produzidos na reao de TMA
podem ser combinados com um marcador molecular,
para deteco em tempo real, ou com uma sonda para
um gene especfico no ensaio de proteo da
hibridizao (HPA, do ingls hybridization protection
assay), para a deteco do ponto final de
quimioluminescncia. A tcnica de HPA est descrita em
tecnologias no baseadas na amplificao de cido
nucleico (ver seo A3.3.2).

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Fluorforo doador 3 (FD),

Sonda oligo 1

Fluorforo receptor 5
(FR),
DNA alvo amplificado
Sonda oligo 2

1. Sondas em soluo emitem fluorescncia baixa

2. Emisso por transferncia de energia de


ressonncia por fluorescncia

Figura A3.6
Sistema de sonda de hibridizao dupla ou de transferncia de energia de ressonncia por fluorescncia (FRET).
Fonte: cortesia de SIGMA-ALDRICH, St Louis, MO, EUA (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/dnaprobes/product-lines/fluorescent-probes/lightcycler-probes.html, acessado em 23 de junho de 2013).

1
rRNA alvo
2

RT

3
Atividades da
RNAse H

DNA
RNA

DNA
5
RT

Iniciador 2

6
Fita molde de DNA
Iniciador-promotor
RT

RNA pol

12
100-1000 cpias

Amplicon de RNA

11
Atividades da
RNAse H
9

10
RT

Iniciador 2

Figura A3.7
Amplificao mediada por transcrio (TMA).
Fonte: Hill CS. Gen-Probe transcription-mediated amplification: system principles. Cortesia de Gen-Probe Inc., San
Diego, CA, EUA (http://www.gen-probe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf, acessado em 23 de junho de 2013).

Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis

215

A3.2.4 Amplificao baseada na sequncia de


cido nucleico (NASBA)

eletroquimioluminescncia (ECL, do ingls


electrochemiluminescently labelled probes), ou pelo
sistema de deteco em tempo real, utilizando
sinalizadores moleculares.

A NASBA (8,9) outra tecnologia de amplificao


isotrmica para sequncias-alvo de RNA ou DNA. A
tecnologia semelhante TMA, exceto pelo fato de a
NASBA utilizar trs (em vez de duas) enzimas: RT do
vrus da mieloblastose aviria (AMV-RT, do ingls Avian
Myoblastosis Virus-RT ), RNAse H e RNA polimerase T7.
Essas enzimas, junto com iniciadores especficos,
possibilitam a amplificao da sequncia-alvo de cido
nucleico (Figura A3.8). Os produtos amplificados de RNA
podem ser detectados por hibridizao ps-amplificao,
utilizando sondas marcadas por

A3.2.5 Amplificao por deslocamento de


cadeia (SDA)
A SDA um processo enzimtico in vitro isotrmico
adicional que permite a amplificao de molculas-alvo
de uma nica fita-molde de DNA ou RNA (8, 10). A
tecnologia patenteada baseia-se na ao combinada de
uma enzima de restrio, DNA polimerase e dois pares
de iniciadores (iniciadores para amplificao SDA e
iniciadores Bumper [adaptadores]). Os iniciadores

Sinalizador
molecular
RNA senso

Fluorforo
P2

Oligo P1

Transcriptase
reversa

RNase H
Iniciador P2

Supressor
RNA polimerase T7

P1
41C

Transcriptase
reversa

RNase H
Oligo P1

Processo de
amplificao

Transcriptase reversa
Transcriptase reversa
Iniciador P2

T7 RNA Polymerase
Luz

RNA anti-senso

Figura A3.8
Amplificao baseada na sequncia de cido nucleico (NASBA)
Fonte: NASBA technology. Cortesia de PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, EUA (http://www.premierbiosoft.com/tech_
notes/NASBA.html, acessado em 23 de junho de 2013).

Bumper contm apenas sequncias de DNA especficas


do alvo, enquanto o par de iniciadores para SDA contm
a sequncia de reconhecimento da endonuclease de
restrio na sua terminao 5, alm de uma sequncia
complementar ao segmento-alvo. A SDA consiste em
duas fases. A Figura A3.9 mostra o processo de SDA. A
primeira fase a gerao de um dsDNA da fita-molde de

216

interesse, contendo o stio de reconhecimento da


endonuclease de restrio que leva segunda fase de
amplificao exponencial, em que a endonuclease de
restrio cliva uma das duas fitas do dsDNA recm
formado, permitindo que a DNA polimerase crie uma
nova sequncia de dsDNA a partir da fita deslocada.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

A. Gerao de alvo
BP

AP

TS
DNA polimerase

Extenso e
deslocamento

O iniciador para amplificao SDA (AP) e o


iniciador Bumper (BP) hibridizam fita
alvo de DNA (TS).
O iniciador para amplificao SDA (AP) e
o iniciador Bumper (BP) so extendidos
pela DNA polimerase ao longo da fita
alvo.
A extenso do iniciador Bumper desloca
o produto da extenso do iniciador para
amplificao.

Hibridizao do iniciador SDA


complementar e amplificao
exponencial.
B. Amplificao exponencial
B. amplificao Exponencial
Hibridizao do iniciador para amplificao SDA (AP1) e
sonda detectora (DP) sequncia alvo de DNA (TS2).

5'
AP1

5' TS1
TS2

5'

AP2

5'

TS1
TS2

A extenso do iniciador de amplificao desloca o produto


da extenso da sonda detectora (converso da sonda
detectora mostrada abaixo) formando uma dupla com o
stio da enzima de restrio (BsoBI).
A enzima de restrio cliva no stio de restrio; a DNA
polimerase se liga para clivar e extender a fita deslocada.
As fitas de DNA que so liberadas na soluo so
capturadas pelos iniciadores complementares que
seguem o mesmo processo de extenso seguido de
clivagem e deslocamento, resultando, dessa forma, em
uma amplificao exponencial, como representado.

Figura A3.9
Amplificao por deslocamento de cadeia (SDA).
Fonte: cortesia de Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA.

Esse processo, que se assemelha replicao em


rolamento circular de bacterifagos de fita simples e
pequenos plasmdeos, repetido continuamente at que
se produza uma quantidade suficientemente grande da
fita de DNA de interesse para que possa ser detectada
por um detector de sonda.
Atualmente, em uma plataforma comercial de segunda
gerao, a deteco em tempo real dos produtos de SDA

ocorre simultaneamente amplificao, utilizando uma


sonda detectora de fluorescncia e transferncia de
energia fluorescente (Figura A3.10). A sonda detectora
consiste em uma regio de hibridizao especfica para o
alvo na terminao 3 e uma estrutura em grampo na
terminao 5. A ala do grampo contm a sequncia de
reconhecimento da endonuclease de restrio e a base
5 conjugada molcula doadora, enquanto a base 3
da haste do grampo conjugada molcula receptora.

Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis

217

Em seu estado nativo, o grampo mantm prximas as


molculas doadora e receptora, e pouca fluorescncia
observada. Conforme a sonda detectora anela-se ao
alvo, o grampo se torna linearizado e estendido pela
polimerase. Essa extenso cria uma sonda detectora de
fita dupla com um stio de restrio clivvel, o qual
imediatamente clivado pela enzima de restrio. A
clivagem causa uma separao fsica do doador em
relao aos efeitos de supresso do receptor e permite a
deteco em tempo real da fluorescncia.

A3.3 Tecnologias no baseadas na


amplificao de cido nucleico
Esto tambm disponveis para algumas DST, tais como
gonorreia, clamdia, hepatite e HIV, testes no baseados
na amplificao de cido nucleico. Normalmente, eles
so rpidos, podem ser automatizados para triagem em
larga escala, possuem custo relativamente baixo e
precisam apenas de conhecimento tcnico moderado.
Entretanto, sua sensibilidade considerada inferior dos

Converso da sonda detector


AP1
5'

DP
TS2

Hibridizao do iniciador para amplificao SDA (AP1) e sonda detectora


(DP) sequncia alvo de DNA (TS2).

5'

A extenso do iniciador de amplificao desloca o produto da extenso da


sonda detectora.

5'

AP2

O produto da extenso da sonda detectora se torna alvo para o iniciador


para amplificao SDA (AP2).

O iniciador de amplificao e o produto de extenso da sonda detectora so


ambos extendidos na direo 3, formando um duplex.
O stio de restrio na sonda detectora diferente daquele incorporado nas
sequncias do iniciador de amplificao e continua susceptvel clivagem
pela BsoBl. Assim, os marcadores fuorforo e suppressor se separam,
resultando no aumento da fluorescncia. Na ausncia de DNA alvo, as
sondas detectoras continuam intactas e a fluorescncia permanece
suprimida.
Figura A3.10
Amplificao por deslocamento de cadeia (SDA) de segunda gerao, na qual os produtos amplificados so
detectados em tempo real, utilizando sonda detectora de fluorescncia e transferncia de energia.
Fonte: cortesia de Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA.
mtodos baseados na amplificao do alvo (NAAT). A

pelo menos, 104 cpias de cido nucleico-alvo por

maioria das hibridizaes diretas por sonda e ensaios de

microlitro. Entretanto, a amplificao de sinal aps a


hibridizao de sonda melhora a deteco para,
aproximadamente, 500 molculas-alvo por microlitro e
fornece capacidades quantitativas.

deteco tem mais probabilidade de ser utilizada quando


se espera haver grande quantidade de DNA ou RNA-alvo,
por exemplo, em uma amostra uretral ou uma cultura
bacteriana. Uma deteco do alvo confivel sem o uso
de amplificao de sinal, normalmente, necessitaria de,

218

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

A3.3.1 Captura hbrida (CH)

slida, utilizando anticorpos universais especficos para

A tecnologia de CH um ensaio de hibridizao de cido


nucleico in vitro com amplificao de sinal utilizando
quimioluminescncia em microplaca para a deteco
qualitativa do cido nucleico-alvo (11). Os passos bsicos
no ensaio de CH envolvem a lise do vrus ou bactria
para a liberao do DNA ou RNA-alvo; a hibridizao de
sondas de RNA ou DNA especficas para criar hbridos
RNA:DNA; a captura de hbridos RNA:DNA em uma fase

os hbridos; a amplificao de sinal com anticorpos

1.

Hibridizao de sonda de
RNA com DNA alvo. O DNA
alvo combina com sondas
especficas de RNA, criando
hbridos RNA:DNA.

2.

conjugados a uma enzima (por exemplo, fosfatase


alcalina); a deteco de sinal quando o substrato (por
exemplo, dioxetano quimioluminescente) clivado pela
enzima; e, finalmente, a mensurao da
quimioluminescncia produzida em unidades relativas de
luz (RLU, relative light units), usando um luminmetro
(Figura A3.11).

Captura hbrida. Os hbridos


RNA:DNA so capturados
em uma fase slida coberta
por anticorpos de captura
universais especficos para
hbridos RNA:DNA.

Figura A3.11
Tecnologia de captura hbrida (CH).

3.

Amplificao de sinais. As
capturas de hbridos RNA:DNA
so detectadas com vrios
anticorpos conjugados
fosfatase alcalina. O sinal
resultante da reao de
quimioluminescncia
lido e os resultados so
interpretados.

Fonte: cortesia de Qiagen Inc., Germantown, MD, EUA (http://www.qiagen.com/hpv/hc2technology.aspx).

A3.3.2 Ensaio de proteo da hibridizao (HPA)

que o DNA ou RNA-alvo est presente. No h emisso

A tecnologia HPA um mtodo patenteado que envolve a


deteco de alvos de RNA ou de DNA de fita simples por
meio de uma sonda de DNA quimioluminescente (12, 13).
No processo do HPA, sondas de DNA para sequncias
especficas marcadas com ster de acridnio (EA)
hibridizam-se com os produtos de amplificao. A
separao (seleo) de sondas hibridizadas a partir
daquelas no hibridizadas realizada por meio da adio
do reagente de seleo (alcalino), o qual hidrolisa o
marcador EA nas sondas no hibridizadas. Quando a
sonda se liga sua sequncia-alvo especfica, o
marcador EA na sonda hibridizada protegido pela dupla

de quimioluminescncia a partir das sondas no

hlice e no hidrolisado. Dada a adio do reagente de


deteco, somente o marcador EA ligado sonda
hibridizada deixado para produzir um sinal, indicando

hibridizadas (Figura A3.12). O HPA no requer as etapas


de lavagens vigorosas, necessrias aos testes de sonda
convencionais e imunoensaios. Alm disso, somente
uma molcula de sonda marcada com EA pode se ligar a
cada amplicon de RNA. Assim, o sinal de
quimioluminescncia obtido diretamente proporcional
ao nmero de molculas-alvo na amostra inicial. A
tecnologia do ensaio de cintica dupla (DKA, do ingls
dual kinetic assay), que uma modificao da tecnologia
HPA, utiliza dois tipos de sonda marcados com dois EA
diferentes, apresentando cinticas de emisso de luz
diferentes em um nico ensaio que permite a deteco
simultnea de dois alvos diferentes. A tecnologia HPA ou
DKA normalmente utilizada para a deteco de
amplicons de RNA produzidos por TMA.

Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis

219

Amplicon de RNA

Sonda
AE

A.

60C

AE

AE

AE

15 min
Hibridizar
Sonda no hibridizada
B.

Selecionar

AE

AE

Detectar

Ausncia
de luz

Sonda hibridizada
C.

AE

AE

Selecionar
AE

AE

Detectar

Luz

Figura A3.12
Ensaio de proteo da hibridizao.
Fonte: Hill CS. Gen-Probe transcription-mediated amplification: system principles. Cortesia de Gen-Probe Inc., San
Diego, CA, EUA (http://www.gen-probe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf, acessado em 23 de junho de 2013).

A3.3.3 Hibridizao de DNA em cadeia


ramificada (bDNA)
Ao contrrio da tecnologia de PCR, que se baseia na
amplificao in vitro da sequncia-alvo, a bDNA envolve
o uso de uma srie de oligonucleotdeos em um mtodo
de hibridizao de cido nucleico do tipo sanduche para
detectar e quantificar o alvo por meio de amplificao de
sinal (14). O processo de bDNA envolve a lise de
organismos-alvo, captura-alvo, amplificao e deteco
de sinal, como mostrado na Figura A3.13. A etapa inicial
de um ensaio de bDNA a ruptura de organismos

220

utilizando detergente ou proteinase K, para liberar os


cidos nucleicos (A). O primeiro grupo de
oligonucleotdeos especficos para o alvo (extensor de
captura) , ento, hibridizado com alta estringncia tanto
para os cidos nucleicos-alvo como para as sondas de
captura, que so ligadas a uma placa de micropoos (B).
O segundo grupo de oligonucleotdeos (extensores do
marcador) desenhado para hibridizar regies contguas
do alvo e fornece sequncias para a hibridizao de um
oligonucleotdeo pr-amplificado. Este ltimo s forma um
hbrido estvel caso se hibridize a dois extensores de
marcador adjacentes (C). Vrias molculas amplificadoras

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

B
Release RNA
Libera
o RNA

Label extender
Extensor
do marcador

Extensor
Capture
extender
de
captura
Hibridiza
sondas
Hybridize
probes
to ou
para
o RNA
RNA or DNA
DNA
and eto para
solid a
fase
slida
phase

Libera
e
Release and
denature RNA

desnatura o RNA
C

Capture probe
Sonda
de captura

Micropoo
Microwell

Molculas
Amplifieramplificadoras
molecules

Pr
amplificador
Preamplifier

RNA alvo

Target RNA

Extensor
do marcador
Label extender

Extensor
Capture
de extender
captura

Sonda
de captura
Capture probe
Microwell
Micropoo

Amplifier
with hybridized
Amplificadores com
sondas
marcadas hibridizadas
label probes

Pr amplificador
RNA alvo

Extensor do marcador

Extensor
de captura

Sonda de captura
Microwell
Micropoo

Figura A3.13
Ensaio de amplificao de sinal de DNA em cadeia ramificada (bDNA)
Fonte: Tsongalis, GJ. Branched DNA technology in molecular diagnostics. American Journal of Clinical Pathology, 2006,
126:448453.

Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente transmissveis

221

de bDNA so, ento, hibridizadas ao pr-amplificador para


criar uma estrutura ramificada (D). Finalmente, os
oligonucleotdeos marcados por fosfatase alcalina,
complementares s sequncias amplificadoras de bDNA,
ligam-se molcula de bDNA por hibridizao. O sinal de
bDNA um produto quimioluminescente da fosfatase
alcalina e seu substrato especfico. Dessa forma, o sinal
amplificado sem copiar a sequncia-alvo de cido nucleico
e a quantidade de sinal detectada diretamente
proporcional quantidade de cido nucleico ligado.
A tecnologia bDNA progrediu dos ensaios de primeira
gerao, que eram precisos e reprodutveis, mas
relativamente insensveis, para testes de terceira
gerao, que so precisos, reprodutveis, altamente
sensveis e passveis de automao completa. Alm
disso, os ensaios bDNA no requerem a amplificao de
uma sequncia-alvo. Assim, menos provvel que
ocorra contaminao cruzada entre amostras replicadas
ou por transferncia.

A3.4 Referncias
1. Palmer HM et al. Evaluation of the specificities of
five DNA amplification methods for the detection of
Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical
Microbiology, 2003, 41(2):835837.
2. Tabrizi SN et al. Evaluation of six commercial nucleic
acid amplification tests for the detection of Neisseria
gonorrhoeae and other Neisseria species. Journal of
Clinical Microbiology, 2011, 49(10):36103615.
3. Ripa T, Nilsson P. A variant of Chlamydia trachomatis
with deletion in cryptic plasmid: implications for use
of PCR diagnostic tests. Eurosurveillance, 2006,
11(11):E061109.2.
4. Unemo M, Clarke IN. The Swedish new variant of
Chlamydia trachomatis. Current Opinion in Infectious
Diseases, 2011, 24(1):6269.

6. Saiki RK et al. Primer-directed enzymatic


amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science, 1988, 239(4839):487491.
7. La Rocco MT et al. Evaluation of a commercial rRNA
amplification assay for direct detection of
Mycobacterium tuberculosis in processed sputum.
European Journal of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases, 1994, 13(9):726731.
8. Gill P, Ghaemi A. Nucleic acid isothermal
amplification technologies: a review. Nucleosides,
Nucleotides and Nucleic Acids, 2008,
27(3):224243.
9. Compton J. Nucleic acid sequence-based
amplification. Nature, 1991, 350(6313):9192.
10. Little MC et al. Strand displacement amplification
and homogeneous real-time detection incorporated
in a second-generation DNA probe system,
BDProbeTecET. Clinical Chemistry, 1999,
45(6):777784.
11. Vernick JP, Steigman CK. The HPV DNA virus hybrid
capture assay: what is itand where do we go
from here? Medical Laboratory Observer, 2003,
35(3):813.
12. Nelson NC. Rapid detection of genetic mutations
using the chemiluminescent hybridization protection
assay (HPA): overview and comparison with other
methods. Critical Reviews in Clinical Laboratory
Sciences, 1998, 35(5):369414.
13. Dhingra K et al. Hybridization protection assay: a
rapid, sensitive, and specific method for detection of
Philadelphia chromosome-positive leukemias.
Blood, 1991, 77(2):238242.Tsongalis GJ. Branched
DNA technology in molecular diagnostics. American
Journal of Clinical Pathology, 2006,
126(3):448453.

5. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in


vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.
Methods in Enzymology, 1987, 155:335350.

222

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Anexo 4
Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)
NOTA: Os reagentes para a preparao de meios e corantes esto listados em ordem alfabtica por categoria*. Alguns
protocolos aparecem nos captulos e no esto repetidos neste anexo.

A4.1 Transporte, armazenamento e meio de cultura


Meio de transporte de Amies (os ingredientes se referem ao produto disponvel comercialmente; Van Dyck et al.,
1999)
Carvo, farmaceuticamente neutro

10g

Cloreto de sdio

3,0g

Hidrogenofosfato dissdico

1,15g

Dihidrogenofosfato de potssio

0,2g

Cloreto de potssio

0,2g

Tioglicolato de sdio

1,0g

Cloreto de clcio

0,1g

Cloreto de magnsio

0,1g

gar

4,0g

gua destilada

1L

1. Suspenda todos os ingredientes em 1L de gua destilada.


2. Ferva a preparao para que o gar seja totalmente dissolvido.
3. Distribua o contedo em tubos ou garrafas pequenas, com tampa de rosca, sempre agitando, para que o carvo se
mantenha suspenso de modo uniforme. Esterilize, autoclavando a 120C por 15 minutos.
4. Armazene o meio a 2-8C por at seis meses.
Meio de armazenamento de infuso de crebro-corao (BHI, do ingls Brain-heart infusion) + 20% de glicerol
(disponvel comercialmente)
BHI

3,7g

Glicerol

20mL

gua destilada

80mL

1. Misture os ingredientes em uma garrafa com tampa de rosca de 150mL, autoclave e resfrie em temperatura
ambiente.
2. Utilizando uma pipeta estril, dispense assepticamente 1,0mL da soluo em criotubos de polipropileno com
tampa de rosca de 1,5mL ( essencial a utilizao adequada dos tubos para evitar quebra).
3. Armazene o meio a 4C at que este seja utilizado.

*NT: correspondente ao original em ingls.

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

223

Chocolate gar ver meio gar-base CG (CG) com hemoglobina (em meio Thayer-Martin)
gar sangue Columbia
gar base sangue Columbia

39g

Sangue de cavalo (desfibrinado)

90mL

gua destilada

1L

1. Suspenda 39g de gar-base sangue Columbia em 1L de gua destilada, mantendo a mistura sob agitao.
Subsequentemente, mantenha sob vapor ou ferva, gentilmente, at que o gar esteja completamente dissolvido.
2. Autoclave a 121C por 15 minutos.
3. Deixe o meio de gar esfriar a 70C em banho-maria.
4. Adicione, assepticamente, 90mL de sangue desfibrinado de cavalo ao gar. Misture com movimentos circulares e
mantenha a 70C por 30 minutos, continuando a mexer, gentilmente, at que o sangue assuma uma cor marrom
chocolate.
5. Transfira o frasco para um banho-maria a 50C para que resfrie, antes de dispens-lo em volumes de 20mL em
placas de Petri de 9cm.
6. Espere que as placas se solidifiquem em temperatura ambiente e armazene-as invertidas a 2-8C em sacolas de
plstico seladas por at quatro semanas.
Agar Columbia + 1% de hemoglobina + carvo ativado + 5% de soro fetal bovino + 1% de enriquecimento com
IsoVitalex + vancomicina (3L/mL)
Esse meio recomendado para a cultura de Haemophilus ducreyi.
gar-base Columbia

40g

Hemoglobina bovina

10g

Carvo ativado

2g

Soro fetal bovino

50mL

Enriquecimento IsoVitaleX

10mL

Soluo de vancomicina

3mg em 5-10mL do fluido

gua destilada

1L

1. Pese a hemoglobina bovina em um frasco (A) e adicione 400mL de gua destilada. Deixe a soluo na geladeira, a
4C, durante toda a noite. Na manh seguinte, agite o frasco e suspenda o p. Coloque em temperatura ambiente.
2. Em um segundo frasco (B), adicione o gar Columbia, o carvo ativado e 600mL de gua destilada.
3. Autoclave os frascos A e B, separadamente, a 121C, por 15 minutos.
4. Esfrie os frascos em um banho-maria a 56C.
5. Com uma tcnica assptica, em capela com fluxo laminar, derrame vagarosamente a soluo de hemoglobina
bovina esterilizada (frasco A), com cuidado, no frasco B, contendo o gar base Columbia e o carvo, deixando
escorrer a soluo pelo lado interno do frasco para evitar a formao de bolhas.
6. Assepticamente, adicione 50mL (5%) de soro fecal bovino, 10mL (1%) de enriquecimento IsoVitaleX e um volume
estril do fluido contendo 3mg de vancomicina (esterilizada por filtrao, caso necessrio).

224

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

7. Uma vez que tudo estiver adicionado, misture o meio, cuidadosamente, com movimentos circulares. Derrame o
contedo, assepticamente, em placas de Petri de 20mL e deixe-o assentar antes de coloc-lo em sacolas plsticas e armazen-lo na geladeira, a 4C, at que seja utilizado. As placas de gar devem ser usadas em at 1-2
semanas aps a preparao.
Meio de Diamond (os ingredientes se referem ao produto disponvel comercialmente; Van Dyck et al., 1999)
O meio de Diamond utilizado para a cultura de Trichomonas vaginalis. Outro sistema de cultura comercial o InPouch
TV (Anexo 5).
Peptona de tripticase

20g

Extrato de levedura

10g

Maltose

5,0g

Cloridrato de L-cistena

1,0g

cido L-ascrbico

0,2g

Hidrogenofosfato dipotssico

0,8g

Dihidrogenofosfato de potssio

0,5g

gar

0,5g

1. Suspenda e dissolva 38g do p de meio de Diamond (todos os ingredientes acima) em 900mL de gua destilada.
2. Autoclave e esfrie o meio a 50C.
3. Adicione 100mL de soro bovino ou de ovelha e 0,1g/L de clorafenicol.
4. Armazene a 4C e utilize em trs meses.
Meio gar-base GC (GC) suplementado com 1% de suplemento de crescimento definido (suplemento definido de
Kellogg ou IsoVitaleX/Vitox)
O meio GC com suplemento recomendado para os mtodos de diluio em gar, disco de difuso e Etest (bioMrieux
Frana) para o teste de susceptibilidade antimicrobiana de N. gonorrhoeae.
GC
IsoVitaleX/Vitox/suplemento definido de Kellogg
gua destilada

36g
10mL
1L

1. Dissolva 36g de GC em 1L de gua destilada e autoclave a 121C, por 15 minutos.


2. Deixe o meio de gar esfriar em um banho-maria a 50C, adicione 10mL de IsoVitaleX/Vitox/suplemento definido
de Kellogg e misture bem.
3. Dispense 20-25mL em placas de Petri de 9cm e 60mL em placas de Petri de 14cm.
4. Espere que as placas se solidifiquem em temperatura ambiente e armazene-as invertidas a 2-8C em sacolas
plsticas fechadas, por at quatro semanas.
5. O IsoVitaleX e o Vitox podem ser adquiridos comercialmente, enquanto o suplemento definido de Kellogg
preparado in-house (ver abaixo).

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

225

Suplemento definido de Kellogg (1,2)


Glicose

40g

Glutamina

1,0g

0,5% de soluo de nitrato frrico

10mL

gua destilada

90mL

1. Misture bem todos os ingredientes em um frasco de 150mL.


2. Esterilize em autoclave.
3. Esfrie em um banho-maria a 50C.
4. Adicione 1mL de soluo cocarboxilase estril a 20% (filtrada, no autoclavada).
5. Dispense, assepticamente, a soluo em garrafas de 100mL com tampa de rosca e armazene a 4C (permanece
estvel por vrios meses).
GC + 2% de hemoglobina + 5% de soro fetal bovino + 1% de enriquecimento IsoVitaleX + vancomicina (3g/mL)
Esse meio recomendado para cultura de H. ducreyi.
GC

36g

Hemoglobina bovina

20g

Soro fetal bovino

50mL

Enriquecimento IsoVitaleX

10mL

Soluo de vancomicina

3mg em 5-10mL de fluido

gua destilada

1L

1. Em um frasco de dois litros (A), adicione a hemoglobina bovina a 500mL de gua destilada e misture bem.
2. Em outro frasco de dois litros (B), adicione GC aos 500mL restantes de gua destilada e aquea em um agitador
at que ferva.
3. Autoclave os frascos a 121C por 30 minutos e, ento, resfrie a 56C.
4. Com uma tcnica assptica, em uma capela com fluxo laminar, dispense vagarosamente a soluo de
hemoglobina bovina esterilizada (frasco A), com cuidado, no frasco B contendo GC, deixando a soluo escorrer
pelo lado interno do frasco para evitar a formao de bolhas.
5. Adicione 50mL (5%) de soro fecal bovino estril, 10mL (1%) de enriquecimento IsoVitaleX e um volume estril do
fluido contendo 3mg de vancomicina (esterilizada por filtrao, caso necessrio).
6. Misture bem o meio com movimentos circulares cuidadosos.
7. Dispense o meio, assepticamente, em placas de Petri de 20mL e deixe-o meio assentar antes de coloc-lo em
sacolas plsticas. Armazene em geladeira, a 4C, enquanto for necessrio.
8. As placas de gar devem ser utilizadas em at 1-2 semanas aps a preparao.

226

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM-VGA) (disponvel comercialmente, Sigma-Aldrich, Life
Technologies, EUA).
Meio Kupferberg (os ingredientes se referem aos produtos disponveis comercialmente; Van Dyck et al., 1999)
Triptose (ou tripticase)

20g

Maltose

1,0g

Cloridrato de L-cistena

1,5g

gar

1,0g

Azul de metileno

0,003g

Cloranfenicol

0,1g

Extrato de levedura

0,1g

1. Suspenda 23,7g do p do meio Kupferberg em 950mL de gua destilada, autoclave e esfrie a 50-55C.
2. Adicione 50mL de soro (bovino, humano, de ovelha, rato ou cavalo), 1.000.000UI de penicilina e 150g de
estreptomicina.
Meio lquido para citologia (disponvel comercialmente, BD Diagnostics)
Meio de Eagle modificado (MEM-VG) (disponvel comercialmente, Sigma-Aldrich, GibconLife Technologies, EUA)
Meio de Thayer-Martin modificado
Prepare o meio GC com hemoglobina e suplementos (ver meio Thayer-Martin). Adicione misturas antimicrobianas
seletivas, as quais esto disponveis comercialmente: VCAT (vancomicina, colistina, nistatina, lactato de trimetropima)
ou LCAT (lincomicina, colistina, anfotericina B ou anisomicina, lactato de trimetropima). Esses suplementos devem ser
hidratados como recomendado pelo fabricante e, ento, adicionados ao meio (3, 4). O meio tambm est disponvel
comercialmente.
Caldo Mueller-Hinton (disponvel comercialmente)
Ingredientes em preparaes comerciais:
Extrato de carne
Digesto cida de casena
Amido solvel

2,0g
17,5g
1,5g

1. Suspenda 21g de meio desidratado em 1L de gua destilada.


2. Misture, dispense em pequenas alquotas (1,5 ou 2mL) e autoclave.

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

227

gar Mueller-Hinton + 5% de sangue de cavalo achocolatado + 1% de enriquecimento IsoVitaleX +


vancomicina (3g/mL)
Esse meio recomendado para a cultura de H. ducreyi.
gar-base Mueller-Hinton

36g

Sangue de cavalo

50mL

Soro fetal bovino

50mL

Enriquecimento IsoVitaleX

10mL

Soluo de vancomicina

3mg em 5-10mL de fluido

gua destilada

1L

1. Pese 38g de gar-base Mueller-Hinton, prepare 1L de soluo com gua destilada, autoclave e resfrie a 56C.
2. Adicione 50mL (5%) de sangue de cavalo estril quando o gar-base dissolvido atingir 56C, e misture.
3. Para achocolatar o sangue de cavalo, aquea a suspenso a 70C, colocando o frasco em banho-maria por,
aproximadamente, 15 minutos.
4. Resfrie a 56C e, ento, adicione 50mL (5%) de soro fetal bovino, adicione 10mL (1%) de enriquecimento
IsoVitaleX e um volume estril do fluido contendo 3mg de vancomicina (esterilizado por filtro, se necessrio).
5. Misture o meio, mexendo cuidadosamente.
6. Derrame o meio, assepticamente, em placas de Petri de 20mL e deixe-o assentar, antes de coloc-lo em sacolas
plsticas. Armazene em geladeira, a 4C, enquanto for necessrio.
7. As placas de gar devem ser utilizadas em at 1-2 semanas aps a preparao.
Base do caldo de micoplasma (5) (o meio est disponvel comercialmente)
Infuso de corao bovino

50g

Peptona

10g

NaCl

5,0g

gua destilada

1L

1. Misture todos os ingredientes.


2. Autoclave a 121C por 15 minutos e armazene a 4C.
gar New York City (disponvel comercialmente, Van Dyck et al., 1999)
Prepare o meio GC com suplementos e adicione sangue de cavalo lisado, mistura de autolisado de levedura e inibidor VCAT.
A mistura de autolisado de levedura contm:
Autolisado de levedura

5,0g

Glicose

0,5g

Bicarbonato de sdio

0,075g

Sangue de cavalo lisado: lisar por meio de congelamento e descongelamento ou por meio da adio de 5mL/L de
saponina ao meio GC.

228

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

1. Suspenda 18g de GC em 430mL de gua destilada, misture e ferva.


2. Autoclave e resfrie a 50-55C.
3. Adicione 50mL de sangue de cavalo lisado, mistura de autolisado de levedura e inibidor VCAT (de acordo com as
instrues do fabricante).
4. Misture e despeje em placas de Petri.
gar-dextrose Sabouraud (5)
Glicose

40g

Neopeptona ou polipeptona (disponvel comercialmente)

10g

gar

15-20g
1L

gua desmineralizada
1. Aquea a mistura at a completa dissoluo; pH final de 5,6.

2. Despeje em tubos (18-25mm em dimetro) e autoclave a 121C, por 15 minutos.


Se o cloranfenicol for adicionado ao meio, adicione volume e concentrao apropriados.
Meio de leite desnatado (Van Dyck et al., 1999)
Leite em p

100g

gua destilada

1L

1. Suspenda 100g de leite em p em 1L de gua destilada.


2. Autoclave por 15 minutos a 112-115C.
3. Armazene a 4-8C.
Nota: importante evitar o aquecimento excessivo para que no ocorra caramelizao.

Meio de transporte Stuart (tambm disponvel comercialmente)


Tioglicolato de sdio
Glicerofosfato de sdio

1,0g
10,0g

Cloreto de clcio

0,1g

Azul de metileno

0,002g

Cloridrato de cistena
gar

0,5g
3-5, 0g

gua destilada

1L

1. Misture os ingredientes em gua destilada e ferva.


2. Distribua em garrafas pequenas com tampa de rosca, aps ajustar o pH para 7,3-7,4.
3. Autoclave a 121C, por 15 minutos, e feche a tampa imediatamente.
4. Quando esfriar, o meio deve estar sem cor.
5. Armazene em geladeira, a 4-8C.

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

229

6. Se a cor mudar para azul, quando armazenado, o meio est gaseificado e, portanto, imprprio para o uso.
7. Afrouxe a tampa de rosca e aquea o meio para remover o ar.
Meio de transporte sacarose fosfato (2SP) com antibiticos (os ingredientes se referem ao produto disponvel
comercialmente; Van Dyck et al., 1999)
Hidrogenofosfato dipotssico

2,1g

Dihidrogenofosfato de potssio

1,1g

Sacarose

68,5g

gua destilada

1L

1. Combine os ingredientes, ajuste o pH para 7,2 e esterilize por meio de filtrao.


2. Assepticamente, adicione os suplementos (veja abaixo) para alquotas de 90mL.
Suplementos:
Soro fetal bovino

10mL

Gentamicina

10mg

Vancomicina

10mg

Anfotericina B

0,5mg

Meio de armazenamento sacarose-fosfato-glutamato (SPG)


Sacarose

75g

KH2PO4

0,6g

K2HPO4

2,83g

Completar com gua para

1L

1. Ajuste o pH para 7,4 com 2N NaOH, se necessrio.


2. Aliquote em garrafas de 100mL e autoclave por 20 minutos.
3. Armazene, por at um ano, a 4C.
Meio Thayer-Martin
GC (ingredientes em preparaes comerciais) gar chocolate
Peptona
Amido de milho

1,0g

Hidrogenofosfato dipotssico

4,0g

Dihidrogenofosfato de potssio

1,0g

Cloreto de sdio

5,0g

gar

10,0g

Hemoglobina: um p de hemoglobina bovina

10,0g

IsoVitalX, Vitox ou enriquecimento de suplemento de


Kellogg
gua destilada

230

15,0g

10,0mL
1L

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

1. Dissolva 36g de GC (Difco, BD) em 500mL de gua destilada. Deixe essa mistura descansar at que o p esteja
completamente dissolvido. Se necessrio, utilize uma barra magntica para misturar.
2. Suspenda 10g de hemoglobina em 500mL de gua destilada, faa uma pasta antes de adicionar a gua, misture
vigorosamente para dissolver e ferva.
3. Esterilize ambas as solues, autoclavando-as a 121C, por 15 minutos. Resfrie, colocando os frascos em um
banho-maria a 50C.
4. Remova cada frasco do banho-maria e, assepticamente, adicione a soluo de hemoglobina ao frasco de GC.
5. Tambm assepticamente, adicione 10mL de suplemento definido dissolvido (por exemplo, suplemento definido de
Kellogg, IsoVitaleX ou Vitox).
6. Misture os contedos completamente, agitando gentilmente com movimentos circulares.
7. Despeje imediatamente 20-25mL da mistura em placas de Petri (9cm).
8. Deixe que o meio se solidifique em temperatura ambiente.
9. Armazene as placas invertidas a 2-8C, em sacolas de plstico fechadas, por at trs semanas.
O IsoVitaleX e o Vitox podem ser adquiridos comercialmente, enquanto o suplemento definido de Kellogg preparado in
house (ver GC).
Adicione vancomicina, colistina e inibidor de nitatina (VCN) ao gar chocolate.
Frmula VCN:
Vancomicina

300g/mL

Colistina

750g/mL

Nistatina

1250 unidades/mL

O meio de Thayer-Martin modificado obtido pela adio de lactato de trimetoprima a uma concentrao de 5g/mL.
Caldo triptona de soja (Van Dyck et al., 1999)
Digesto cida de casena (triptona)

17g

Peptona de soja

3g

Cloreto de sdio

5g

Hidrogenofosfato dipotssico

2,5g

Glicose

2,5g

gua destilada

1L

1. Suspenda 36g do p comercial em 1L de gua destilada; pH 7,3.


2. Misture bem e despeje alquotas de 2mL em pequenos tubos.

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

231

Meio de transporte para vrus (Van Dyck et al., 1999)


O meio consiste na soluo salina balanceada de Hank (HBSS, do ingls Hanks balanced salt solution, disponvel
comercialmente), suplementado com anfotericina B, albumina de soro bovino e gentamicina.
HBSS (disponvel comercialmente)

10,3g

Anfotericina B

5,0mg

Albumina de soro bovino a 10%

100mL

Gentamicina
gua destilada

50mg
1L

1. Dissolva 10,3g de p de HBSS em 1L de gua destilada.


2. Adicione anfotericina B, albumina de soro bovino (dissolvido em gua destilada) e gentamicina.
3. Misture e ajuste o pH para 7,3 com bicarbonato de sdio; soluo a 7,5%.

A4.2 Reagentes e testes de diagnstico


API NH Neisseria gonorrhoeae
Uma vez que os procedimentos para API NH necessitam de um inculo equivalente a 4,0 no padro de McFarland,
normalmente necessrio realizar a subcultura do isolado antes de test-lo, a fim de se obter um inculo adequado.
O meio a seguir pode ser usado para a cultura de N. gonorrhoeae antes de utilizar a fita API NH: gar chocolate com
2% de IsoVitaleX ou seus derivados (isto , Thayer-Martin), com ou sem antibitico; tambm pode ser utilizado o GC
suplementado. Pode-se utilizar meio gar com base de sangue (gar-base de sangue Columbia, tripticase de soja, meio
New York City), embora a fora de algumas reaes bioqumicas seja modificada (isso deve ser levado em considerao
ao se ler a reao; verificar as instrues do fabricante). O RapID NH (Remel) uma alternativa para o API NH.
1. Anote o nmero do isolado na fita.
2. Coloque a fita em uma caixa de incubao.
3. Utilizando uma haste, selecione algumas colnias bem isoladas e prepare uma suspenso (no NaCl fornecido pelo
kit) com turvao equivalente a 4,0 no padro de McFarland; garanta a boa mistura da suspenso por meio de um
agitador (vrtice). Utilize uma cultura de 18-24 horas. A suspenso deve ser usada assim que for preparada.
4. Distribua a suspenso bacteriana preparada (aproximadamente 150L), evitando a formao de um menisco
convexo.
5. Cubra os primeiros sete microtubos (PEN at URE, inclusive) com leo mineral (fornecido pelo kit).
6. Incube, por duas horas, a 36C, sob condies aerbicas.
7. Aps o perodo de incubao, leia as reaes, utilizando como referncia a tabela includa no kit (bioMrieux,
disponvel em www.biomerieux.com).
Cepas de referncia:
Ver as recomendaes do fabricante (bioMrieux, Frana) para o controle de qualidade. Use a cepa N. gonorrhoeae
ATCC31426 ou uma cepa de N. gonorrhoeae da OMS de 2008.

232

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tampes

Tipo de
soluo

Concentrao
(mol/L)

Peso por litro das


solues-estoque
A

Tampofosfato

Tampo
citratohidrxido
de sdio de
Srensen

pH

Volumes usados para


preparar 100mL da
soluo de trabalho (mL)

0,025

3,41g de KH2PO4

4,46g de
Na2HPO4 x
2H2O

6,8

50,8

49,2

0,1

13,62g de KH2PO4 17,82g de


Na2HPO4 x
2H2O

6,9

43,9

56,1

0,01

Dissolva 2,1g
de cido ctrico
monoidratado
em 20mL de
NaOH a 1mol/L
e adicione gua
destilada para 1L
(=0,01mol/L de
citrato dissdico)

5,6

69,3

30,7

HCL a
0,01mol/L

Testes de -lactamase

Vrios testes podem ser utilizados para determinar se um isolado produz -lactamase (por exemplo, iodomtrico,
vermelho de fenol) (3). O mais fcil o teste de cefalosporina cromognica (nitrocefina). Ver Captulo 4 para detalhes.
Testes de utilizao de carboidratos
Ingredientes para gar cistena tripticase (ACT) (Difco, BD, EUA):
Triptona

20g

L-cistena

0,5g

Cloreto de sdio

5,0g

Sulfato de sdio

0,5g

gar

2,5g

Vermelho de fenol

17mg

1. Suspenda 28,5g de CTA em p em 1L de gua destilada. Misture bem.


2. Aquea, agitando sempre, e ferva por um minuto para dissolver completamente o p.
3. Autoclave a uma temperatura no superior a 118C, por 15 minutos.
4. Adicione 5-10g de carboidrato (isto , glicose, maltose, sacarose ou lactose) antes de autoclavar, ou dissolva o
meio em 900mL de gua, autoclave e adicione, assepticamente, 100mL de soluo de carboidrato a 5-10% estril.
5. Misture o contedo no frasco com movimentos circulares suaves e distribua-o, assepticamente, em tubos de
10mL com tampa de rosca pr- esterilizados.

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

233

6. Esfrie os tubos em posio inclinada para criar uma rampa e permitir que o meio se solidifique em temperatura
ambiente.
7. Armazene os tubos a 4C.
8. Teste o meio preparado quanto ao desempenho utilizando culturas de controle tpicas e estveis, como
especificado pelo fabricante (Difco, BD, EUA).
Teste de utilizao rpida de carboidrato (RCUT)
Os reagentes a seguir esto disponveis comercialmente:
Meio de gar sangue lisado (LBA, do ingls lysed blood agar) com 0,5% de glicose
Soluo indicadora de sal balanceada tamponada (BSS, do ingls buffered balanced salt indicator solution)
Solues de carboidrato:
Glicose 10% (G)
Lactose 10% (L)
Sacarose 10% (S)
Maltose 10% (M)
Soluo de ampicilina (200mg/mL) para teste de produo de -lactamase.

Uma cultura pura para a identificao de N. gonorrhoeae suspeita obtida por meio da subcultura de uma nica colnia
em um meio LBA, contendo 0,5% de glicose.
1. Emulsifique duas alas completas de 10L do isolado de uma cultura pura crescida ao longo da noite em um tubo
contendo 1,5mL de BSS e misture bem, com uma pipeta Pasteur, para obter 109 organismos por mL.
2. Marque seis poos de uma placa de microtitulao com C (controle), G, L, M, S e Pase (penicilinase).
3. Adicione 25mL de soluo de carboidrato estril 10% nos poos G, L, M e S e 25mL de soluo de ampicilina no
poo Pase. O primeiro poo sem acar servir de controle.
4. Adicione 100mL (quatro gotas) da suspenso bacteriana em cada um dos seis poos.
5. Leia aps 2-4 horas de incubao a 35-37C em ar (no em CO2). Recomenda-se que a reao de -lactamase

seja examinada novamente aps 24 horas, j que, em algumas cepas, pode ocorrer uma reao de -lactamase
lenta.

Interpretao:
Uma vez que a N. gonorrhoeae utiliza glicose (no maltose, sacarose e lactose), somente o tubo contendo glicose deve
mostrar alterao de cor.
Os resultados da utilizao de carboidrato e produo de -lactamase so registrados da seguinte maneira:

234

Tubo/poo controle

= Vermelho

Cor amarela

= Reao positiva

Cor vermelho-alaranjada

= Reao negativa

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Nota: caso se suspeite de N. gonorrhoeae e se obtenha um resultado indefinido no teste de utilizao rpida de carboidrato, verifique a pureza da cultura e confirme a identidade utilizando outros testes, tais como testes sorolgicos.
Soluo glicose-potssio-sdio-fosfato (GKNP)
Essa soluo corresponde HBSS sem Ca++ e Mg++ (disponvel comercialmente)
Estoque 10X
NaCl

80,0g

Glicose

10,0g

KCl

4,0g

KH2PO4

0,60g

Na2HPO4

0,48g

Vermelho de fenol (opcional)

100mL

H2O

900mL

1. Misture os ingredientes.
2. Autoclave e armazene o estoque 10X a 4C at que seja utilizado; a soluo-estoque expira aps seis meses.
3. A soluo de trabalho obtida por meio da diluio 1:10 da soluo-estoque 10X com H2O.
Gonochek-II
O Gonochek-II (TCS Biosciences, Ltd.) um teste de crescimento independente, utilizado para distinguir espcies
de Neisseria em funo da sua capacidade de hidrolisar trs enzimas produzidas especificamente por uma espcie:
prolina iminopeptidase/prolilaminopeptidase (PIP, do ingls prolyliminopeptidase), para N. gonorrhoeae; -glutamilaminopeptidase, para N. meningitidis; e -galactosidase, para N. lactamica.

O kit Gonochek-II compreende um nico tubo contendo trs substncias cromognicas. A hidrlise dessas substncias produz uma cor distinta. A cor especfica produzida est relacionada enzima presente e, dessa forma, indica a
presena de N. gonorrhoeae, N. meningitidis e N. lactamica, respectivamente.

Outras espcies comensais de Neisseria podem produzir PIP. Assim, testes enzimticos devem ser realizados em cepas
crescidas em meios seletivos. Tambm foram relatadas cepas de N. gonorrhoeae negativas para PIP (6, 8). Dessa
forma, os espcimes devem ser confirmados utilizando um mtodo alternativo (3).
GonoGen-II
O GonoGen-II (New Horizons Diagnostics Corporation) um teste colorimtrico baseado em anticorpo monoclonal, no
qual anticorpos monoclonais contra protena PorB (PorB IA e PorB IB) de N. gonorrhoeae foram agrupados e adsorvidos
em molculas sol-metlicas suspensas. O GonoGen II utiliza um tampo de solubilizao para remover a parede celular
do organismo a ser testado, permitindo, assim, a exposio da protena PorB. Um agrupamento de anticorpos monoclonais ligados a um carreador sol-metlico utilizado para detectar os antgenos especficos de N. gonorrhoeae. O
complexo antgeno-anticorpo subsequente detectado por meio de um aparato de filtrao, dando origem a um ponto
vermelho bem definido (3).
1. Etiquete um tubo de teste separado para cada isolado e cepas-controle.

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

235

2. Dispense 0,5mL de tampo de solubilizao e ajuste a turvao de McFarland para 1,0, por meio da coleta de
colnias em gar seletivo ou enriquecido.
3. Misture vigorosamente ou agite com movimentos circulares (vrtice) o reagente do GonoGen-II.
4. Adicione uma gota do reagente do GonoGen-II em cada um dos tubos a serem testados. Misture bem.
5. Deixe os tubos descansarem por, pelo menos, 5-15 minutos (tempos maiores aumentam a nitidez da reao).
Interpretao:
Positivo: indica N. gonorrhoeae (ponto rosa a vermelho no poo).
Negativo: no h N. gonorrhoeae (ponto branco a rosa claro no poo).
Padres de turvao de McFarland (9)
Os padres de turvao de McFarland so preparados por meio da mistura das solues seguintes em razes
diferentes, para obter a escala de turvao de McFarland desejada (por exemplo, 0,5, 1, 2 etc).

Escala de turvao de McFarland

0,5

Soluo de cloreto de brio anidro


1% (w/v)

0,05mL

0,1mL

0,2mL

0,3mL

0,4mL

Soluo de cido sulfrico 1% (v/v)

9,95mL

9,9mL

9,8mL

9,7mL

9,6mL

Feche os tubos apertando bem e armazene-os em temperatura ambiente no escuro (permanecero estveis por seis meses).
Antes de us-los, inverta os tubos vrias vezes para suspender os precipitados de brio.
Para comparao, utilize um fundo com faixas pretas e brancas.
Teste de oxidase (para a confirmao da identificao de N. gonorrhoeae aps a cultura)
Preparao in-house (Morse, et al., 1996 e 2010):

Dicloridrato de tetra-metil-fenilenodiamina

0,5g

gua destilada

50mL

1. Dissolva o substrato em 50mL de gua destilada.


2. Coloque um papel-filtro em uma placa de Petri e sature com o reagente.
3. Pegue uma poro da colnia a ser testada, utilizando um arame de platina, e esfregue-a no papel-filtro.
Interpretao:
Um resultado positivo obtido pelo aparecimento de uma cor roxa escura em 10 segundos.
Os reagentes de oxidase podem ser adquiridos comercialmente.

236

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Mtodo do papel-filtro:
1. Quebre a ampola de vidro contendo o reagente em seu interior, apertando as laterais do tubo.
2. Etiquete o papel-filtro com o nmero do organismo a ser testado e umedea o papel-filtro com o reagente.
3. Colete uma colnia de uma cultura crescida durante a noite, com uma ala estril ou um aplicador.
4. Esfregue o inculo em um papel-filtro saturado de reagente.
5. Examine o surgimento da colorao roxa escura (reao positiva) em 10-30 segundos.
Mtodo direto na placa de gar:
1. Adicione 2-3 gotas do reagente oxidase diretamente nas placas de gar contendo a cultura crescida durante a noite.
2. Examine a mudana rpida de cor de rosa para marrom e, em seguida, para roxo escuro em 10-30 segundos.
Interpretao:
Organismos positivos para oxidase produzem uma cor roxa em 30 segundos.
Organismos negativos para oxidase produzem uma cor rosa claro ou permanecem incolores.
Teste GC monoclonal Phadebact
No teste GC monoclonal Phadebact, dois agrupamentos de anticorpos monoclonais murinos so misturados
separadamente com a protena A de Staphylococcus no viveis, o que permite o subagrupamento dos isolados
gonoccicos nos grupos WI (PorB IA) e WII/WIII (PorB IB).
1. Remova colnias frescas de N. gonorrhoeae presuntivamente identificadas e as suspenda em 0,5mL de soluo
salina tamponada com fosfato (PBS, do ingls phosphate-buffered saline solution; ver abaixo) a 0,9%, para uma
turvao de McFarland de 0,5. Utilize um tubo de teste com tampa.
2. Coloque o tubo fechado em banho-maria fervente por, pelo menos, cinco minutos e, ento, resfrie em temperatura
ambiente.
3. Antes de utilizar o reagente gonoccico, agite-o vigorosamente. Coloque uma gota do reagente WI e uma gota do
WII/WIII, respectivamente, em uma lmina.
4. Adicione uma gota de suspenso gonoccica fervida ao reagente WI e uma gota ao WII/WIII. Certifique-se de
incluir um controle negativo, no qual se adiciona apenas PBS.
5. Misture as gotas vigorosa mas gentilmente, com uma ala descartvel. Utilize uma ala para cada reagente.
6. Agite a lmina e leia o resultado em um minuto.
Interpretao:
Um precipitado com qualquer um dos reagentes gonoccicos WI ou WII/WIII constitui um resultado positivo. Uma
reao positiva com ambos os reagentes um resultado equivocado que necessitar ser re-testado. Se no ocorrer
reao em nenhum dos reagentes gonoccicos WI ou WII/WIII, o resultado do teste negativo (um resultado negativo
sugere que o isolado testado no N. gonorrhoeae).

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

237

Tampo fosfato (ver Tampes)


Soluo salina tamponada com fosfato (PBS)
O PBS pode ser preparado in-house (veja abaixo) e tambm est disponvel comercialmente em p pr-preparado ou
pastilhas.
Para preparar 1 litro de soluo PBS 1X, misture:
Cloreto de sdio

8,0g

Cloreto de potssio

0,2g

Hidrogenofosfato dissdico

1,78g

Dihidrogenofosfato de potssio

0,27g

gua destilada

1L

1. Dissolva os ingredientes em 80mL de gua destilada.


2. Ajuste o pH como requisitado (7,4; 6,8; etc).
3. Ajuste o volume para 1L com gua destilada adicional.
4. Esterilize em autoclave.
Tampo de Srensen citrato-hidrxido de sdio (ver Tampes)

A4.3 Corantes
Corante de Giemsa (10%) (10) Klebsiella granulomatis (corpos de Donovan)
Soluo estoque:
Giemsa em p

0,5g

Glicerol

33mL

Metanol absoluto, livre de acetona

33mL

1. Dissolva o Giemsa em p em glicerol, colocando a mistura em banho-maria, a 55C, por 90 minutos.


2. Quando os cristais estiverem dissolvidos, adicione o metanol absoluto.
3. Armazene em temperatura ambiente.
Soluo de trabalho (precisa ser preparada na hora em que for usada):
Soluo estoque

1mL

Tampo fosfato

23mL

Tampo fosfato:
Soluo 1
Na2HPO4

Soluo 2
9,47g KH2PO4

Complete para 1L com gua destilada

9,08g

Complete para 1L com gua destilada

1. Misture 72mL da soluo 1 com 28mL da soluo 2.

238

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

2. Adicione 900mL de gua destilada.


Procedimento de colorao:
1. Seque o esfregao ao ar livre, fixe com metanol absoluto por, pelo menos, cinco minutos, e deixe secar novamente.
2. Cubra com soluo de trabalho de Giemsa, por uma hora.
3. Lave rapidamente com lcool etil 95%, para remover o excesso de corante.
Colorao de Gram
O procedimento da colorao de Gram est descrito no Captulo 4 e tambm est relatado neste anexo, uma vez
que o procedimento dessa colorao tambm utilizado para outros patgenos. Os reagentes podem ser adquiridos
comercialmente ou preparados in-house (Van Dyck et al., 1999).
Kits prontos para serem utilizados tambm esto disponveis.
Soluo de cristal de violeta (corante primrio)
Soluo de iodo (corante mordente)
Acetona-etanol (agente de descolorao)
Soluo de safranina (corante de contraste)
1. Cubra o esfregao fixado com cristal de violeta, por 30 segundos. Lave, delicadamente, com gua fria da torneira.
2. Inunde a lmina com soluo de iodo, por 30 segundos. Lave gentilmente com gua fria da torneira.
3. Descolore com acetona, acetona-etanol ou apenas etanol 95%, at que a cor roxa pare de ser liberada do
esfregao. melhor segurar a lmina utilizando uma luva, prximo gua corrente. O tempo para descolorao
depender do agente qumico utilizado e da espessura do esfregao, sendo menor (tipicamente alguns segundos)
para acetona e maior (at um minuto) para o lcool. A descolorao excessiva deve ser evitada; caso contrrio, a
bactria Gram-positiva aparecer como Gram-negativa. Desconsidere as pores mais espessas de um esfregao
no uniforme, as quais ainda podem soltar a cor azul.
4. Lave rapidamente em gua corrente para interromper a descolorao e seque o excesso de gua.
5. Contraste com safranina ou fucsina, por um minuto.
6. Lave com gua corrente e seque, suavemente, com um papel absorvente.
Soluo de cristal de violeta:
Soluo A (10%)
Cristal de violeta em p
Etanol 95%

Soluo B (10%)
2g Oxalato de amnia
20mL gua destilada

0,8g
80mL

Misture as solues A e B para preparar o reagente de colorao cristal de violeta. Armazene por 24 horas e filtre
utilizando papel.

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

239

Acetona-etanol (razo 1:1):


Acetona

50mL

Etanol 95%

50mL

Soluo de iodo:
Iodeto de potssio

2g

Cristais de iodo

1g

gua destilada

300mL

A maioria das referncias sugere triturar o iodo e o iodeto de potssio em um almofariz.


Adicione gua, lentamente, uma vez que os qumicos esto em gros, at que o iodo se dissolva.
Soluo de safranina:
Soluo estoque

Soluo de trabalho

Safranina

5g

Soluo estoque

10mL

Etanol 95%

100mL

gua destilada

90mL

Colorao de Leishman
A colorao de Leishman pode ser utilizada como uma alternativa colorao de Giemsa para Klebsiella granulomatis
(donovanose, Captulo 13), aps fixar o material na lmina com metanol.
Soluo estoque:
Leishman em p
Metanol

1,5g
1L

1. Adicione Leishman em p ao metanol e misture bem, utilizando algumas prolas de vidro.


2. Permita que a soluo-estoque permanea em temperatura ambiente por 24 horas.
Soluo de trabalho:
Soluo-estoque

1 parte

gua tamponada

2 partes

1. Prepare uma soluo fresca para o dia de trabalho, diluindo uma parte da soluo-estoque em duas partes de
gua destilada (gua tamponada com 3,76g/L de hidrogenofosfato dissdico e 2,10g/L de dihidrogenofosfato de
potssio, pH 7,0-7,2).
2. Armazene em uma garrafa bem vedada, para evitar que entre umidade na soluo-estoque.

240

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Mtodo:
1. Prepare um esfregao das laterais da lcera (onde, normalmente, mais provvel encontrar os corpos de
Donovan) em uma lmina de vidro.
2. Cubra a lmina com soluo de trabalho do corante de Leishman, por 10 minutos, ou por at 30 minutos (corante
de Giemsa).
3. Lave a lmina com gua tamponada ou com soluo salina tamponada com fosfato (pH 7,0-7,2).
4. Deixe a lmina secar ao ar livre e, ento, examine em microscpio de luz, utilizando leo de imerso (aumento de
1.000x).
Interpretao:
Os corpos de Donovan aparecem como coco-bacilos com vacolos grandes no citoplasma de grandes histicitos e,
ocasionalmente, em clulas plasmticas e leuccitos polimorfonucleares. Os organismos aparecero azul-violeta,
normalmente, circundados por uma cpsula clara a rosa acidoflico.
Corante azul de metileno - N. gonorrhoeae (5)
Azul de metileno
Etanol
gua destilada

0,3g
30mL
100mL

1. Dissolva o corante em etanol.


2. Adicione gua destilada.
3. Prepare e fixe um esfregao em uma lmina de vidro.
4. Mergulhe a lmina em azul de metileno por um minuto.
5. Lave a colorao da lmina utilizando gua corrente de torneira.
6. Enxague, deixe secar ao ar livre e examine microscopicamente.
Colorao azul de metileno/violeta de genciana N. gonorrhoeae (11)
Azul de metileno
Violeta de genciana
A colorao de azul de metileno (AM)/violeta de genciana (VG) preparada por meio da adio de quatro partes de AM
para uma parte de VG (frmula Huker).
1. Prepare um esfregao fino de uma amostra gonoccica clnica e a cultura controle adequada, em lminas de vidro
separadas e identificadas.
2. Fixe a lmina por aquecimento, passando-a em uma chama.
3. Adicione azul de metileno, por 30-60 segundos.
4. Lave, deixe secar ao ar livre e examine microscopicamente.
5. A N. gonorrhoeae aparecer como cocos ou diplococos roxo-escuro.

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

241

Colorao por impregnao de prata Warthin-Starry


cido ctrico 1%:
cido ctrico
gua destilada ou deionizada

1g
100mL

Van Dyck E, Meheus AZ, Piot P. Laboratory diagnosis of


sexually transmitted diseases. Genebra, Organizao
Mundial da Sade, 1999.

500mL

A4.5 Referncias

gua acidulada:
gua destilada ou deionizada

Adicione a quantidade suficiente de cido ctrico a 1%


para atingir o pH 4,0.
Soluo de nitrato de prata a 2%, para revelao:
Nitrato de prata

5g

gua acidulada

250mL

Soluo de nitrato de prata a 1%, para impregnao:


Soluo de nitrato de prata a 2%

25mL

gua acidulada, pH 4,0

25mL

Soluo de gelatina a 5%
Gelatina, alto grau
gua acidulada

2,5g
50mL

Soluo de hidroquinona a 0,15%


Gelatina, alto grau
gua acidulada

2,5g
50mL

Soluo de revelao:
Soluo de nitrato de prata a 2%

12mL

Soluo de gelatina a 5%

30mL

Soluo de hidroquinona a 0,15%

16mL

A4.4 Agradecimentos
Os autores agradecem a contribuio de Rajinder Parti e
Aura Helena Corredor na preparao deste anexo.
Tambm devemos imensamente aos textos a seguir
como fontes para uma srie de protocolos:
Morse SA, Moreland AA, Holmes KK, eds. Atlas of sexually transmitted diseases and AIDS, 2nd ed. Baltimore,
Mosby-Wolfe, 1996.

242

Morse SA, et al., eds. Atlas of sexually transmitted


diseases and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/ Elsevier, 2010.

1. Kellogg DS Jr et al. Neisseria gonorrhoeae: virulence


genetically linked to clonal variation. Journal of
Bacteriology, 1963, 85:12741279.
2. Dillon JA, Tostowaryk W, Pauz M. Effects
of different media and methods of inoculum
preparation on results of antimicrobial susceptibility
testing of Neisseria gonorrhoeae by agar dilution.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1987,
31(11):17441749.
3. Dillon JR, Starnino S. Laboratory manual: identification
and antimicrobial susceptibility testing of Neisseria
gonorrhoeae, 2nd ed. Co-ordinating Centre for the
Gonococcal Antimicrobial Susceptibility Surveillance
Program in Latin America and the Caribbean, 2002
(http://www.gasp-lac.net/wp-content/uploads2/
EnglishFull_FINAL-VERSION-1_Mar-27-2012.pdf,
acessado em 5 de abril de 2013).
4. Young H, Moyes A. An evaluation of pre-poured
selective media for the isolation of Neisseria
gonorrhoeae. Journal of Medical Microbiology, 1996,
44(4):253260.
5. Sarafian SK. Media, reagents, test procedures and
stains. In: Morse SA, Moreland AA, Holmes KK, eds.
Atlas of sexually transmitted diseases and AIDS, 2nd
ed. Baltimore, Mosby-Wolfe, 1996:326332.
6. Brown S et al. Absence of prolyminopeptidasenegative Neisseria gonorrhoeae strains in Ontario,
Canada. Canada Communicable Disease Report,
2008, 34:2023.
7. Martin IE et al. Identification of
prolyliminopeptidase-negative Neisseria
gonorrhoeae strains in Canada. Sexually Transmitted
Diseases, 2011, 38(1):4042.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

8. Unemo M et al. Global transmission of


prolyliminopeptidase-negative Neisseria
gonorrhoeae strains: implication for changes
in diagnostic strategies. Sexually Transmitted
Infections, 2007, 83(1):4751.
9. Benson HJ. Microbiological applications. A
laboratory manual in general microbiology, 6th ed.
Dubuque, Wm C Brown Company, 1994.

10. Pillay A et al. Media, stains, reagents and test


procedures. In: Morse SA et al., eds. Atlas of
sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010:355365.
11. Taylor SN, DiCarlo RP, Martin DH. Comparison of
methylene blue/gentian violet stain to Grams stain
for the rapid diagnosis of gonococcal urethritis
in men. Sexually Transmitted Diseases, 2011,
38(11):995996.

Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)

243

Anexo 5
Materiais de laboratrio
NOTA: Os materiais de laboratrio esto listados cronologicamente, conforme aparecem em cada captulo. Indica-se
apenas o produto ou reagente e o nome do fabricante. Esta lista no tem a inteno de citar de forma abrangente todos
os fabricantes. Distribuidores locais no esto identificados.

Captulo 3. Micoplasmas genitais


Equipamentos
-

Centrfuga

Freezer (-70C)

Instrumento para reao em cadeia da polimerase (PCR, do ingls polymerase chain reaction)

Aparelho de eletroforese

Geladeira (4C)

Instrumento para PCR em tempo real

Reagentes
- Agarose em p

- Brometo de etdeo

- Reagentes para PCR


- Reagente para a reao de PCR em tempo real


Materiais de consumo

- Ponteiras com filtro para pipetas (1L, 10L, 100L, 1.000L)


- Pipetas (10L, 200L, 1.000L)
- Hastes (dacron ou rayon)

- Tubos para testes (2mL, 200L)

Testes (kits disponveis comercialmente)


- Testes de amplificao de cido nucleico (NAAT, do ingls nucleic acid amplification tests), uma
amplificao mediada por transcrio (TMA, do ingls transcription-mediated amplification); ensaio
somente para o uso em pesquisa (Gen-Probe).

Captulo 4. Gonorreia

Equipamentos
- Balana (para pesar)
- Centrfuga
- Criotubos

- Jarros de anaerobiose (com envelopes ou velas geradoras de CO2)


- Freezer (-80C)

Anexo 5. Materiais de laboratrio

245

- Geladeira (4C)

- Queimadores (bicos) de gs

- Incubadoras (a 37C, CO2 a 51%)

- Padro nefelomtrico de McFarland (PRO-LAB Diagnostics)

- Microscpio (microscpio de luz e microscpio fluorescente)


- Pipetas (10L, 200L, 1.000L)
- Medidores de pH

- Rgua de plstico (mm) ou compassos de calibre

- Replicador de Steer (inoculadores multiponto ou alas calibradas) (CMI-Promex Inc., NJ, EUA)
- Agitador (vrtice)

- Banho-maria
Reagentes

- Discos antimicrobianos (Oxoid)

- Ps antimicrobianos (Sigma-Aldrich ou do fabricante farmacutico, se disponvel)


- Caldo de infuso de crebro-corao (BHI, do ingls brain-heart infusion) (Oxoid)
- Rampas de gar chocolate

- gar-base Columbia (Oxoid)

- gar cistena tripticase (ACT) (contendo glicose, maltose e sacarose, com concentrao final de 1-2%
(Difco, Becton, Dickinson)

- Discos (antibiticos) (Oxoid)

- Fitas de Etest (bioMrieux, Frana)


- Meio-base GC (Difco)

- Glicerol (15-20%) (Sigma-Aldrich)

- Colorao de Gram (cristal de violeta, soluo de iodo, [acetona, acetona-etanol ou etanol], safranina)
(PRO-LAB Diagnostics)

- Isovitalex/Vitox (Oxoid)

- Azul de metileno (PRO-LAB Diganostics)


- Caldo Mueller-Hinton (Oxoid)
- Nitrocefina (Oxoid)
- Reagente oxidase

- Meio seletivo (Thayer-Martin, Thayer-Martin modificado e New York city)

- Esses meios podem ser obtidos comercialmente por distribuidores locais ou preparados in-house

- Meio de transporte no nutritivo (Amies ou Stuart) (Sigma-Alderich)


Materiais de consumo
- Criotubos

- Lminas de vidro

- Pipetas graduadas

- Microbanco de fluidos com crioesferas


246

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

- Placas de microtitulao
- Pipetas Pasteur

- Placas de Petri (90mm)

- Ponteiras para pipetas (1L, 10L, 200L, 1.000L)


- Tubos de plstico transparentes
- Ala de plstico (1L, 10L)

- Garrafas Bijou de policarbonato com tampa de rosca

- Estantes para tubos (15mL ou 50mL) e para criotubos (2mL)


- Hastes (dacron ou rayon)

Testes (kits disponveis comercialmente)


- Abbott RealTime CT/NG (Abbott Molecular)
- API NH (bioMrieux)

- APTIMA Combo 2 (Gen-Probe)

- Teste de cefalosporina cromognica (discos de nitrocefina)


- Cobas Amplicor CT/NG (Roche Diagnostics)
- Gonochek-II (E-Y Laboratories)

- GonoGen II (New Horizons Diagnostics Corporation)

- Captura hbrida 2 (HC2) CT/NG (Digene Corporation)


- MicroTrak (Trinity Biotech PLC Co)
- Caldo Mueller-Hinton (Oxoid)

- Teste de oxidase (BACTIDROP oxidase)


- PACE 2 (Gen-Probe)

- Teste GC monoclonal Phadebact (Boule Diagnostics)


- ProbeTec ET (Becton, Dickinson)

- ProbeTec GC Q (Becton, Dickinson)

- RapID NH (Remel-Thermo Fisher Scientific)

- Meio seletivo (Thayer-Martin, Thayer-Martin modificado e New York City) (Oxoid).

Captulo 5. Infeces por Clamdia


Equipamentos
- Balana (para pesar)

- Capela de conteno de risco biolgico


- Centrfuga
- Criotubos

- Microscpio de fluorescncia
- Freezer (-80C)

- Queimadores (bicos) de gs
- Hemocitmetro

Anexo 5. Materiais de laboratrio

247

- Incubadoras (uma a 37C e uma a 35C)


- Pipeta multicanal

- Pipetas (10L, 200L, 1.000L)


- Sonicador

- Frasco a vcuo

- Agitador (vrtice)

- Banho-maria
Reagentes

- Acetona

- Anfotericina B

- Anticorpos monoclonais marcados com fluorescncia para C. trachomatis


- Soluo glicose-potssio-sdio-fosfato (GKNP)

- Meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM-VGA) (Invitrogen, Sigma-Aldrich)


- Meio de transporte sacarose-fosfato com soro e antibiticos

- Meio de armazenamento sacarose-fosfato-glutamato


Materiais de consumo

- Ponteiras para pipetas de 200 L


- Pipetas calibradas
- Criotubos

- Lamnulas de vidro
- Lminas de vidro

- Linhagens de clulas McCoy (McCoy B; ATCC CRL-1696)


- Pipetas Pasteur

- Filme para vedao

- Frascos para cultura de tecidos

- Placas para cultura de tecidos (96 poos)

- Frascos para cultura de tecidos (5mL) contendo lamnula de vidro de 13mm

Captulo 6. Tricomonase

Equipamentos
- Geladeira (4C)

- Incubadora (37C)

- Microscpio de luz
Reagentes

- Meio de Diamond
- Meio Kupferberg
248

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Materiais de consumo
- Lamnulas

- Hastes de alumnio com extremidades de dacron ou rayon


- Hastes de plstico com extremidades de dacron ou rayon

- Lminas de vidro

Testes (kits disponveis comercialmente)


- Teste point-of-care (POC): teste rpido para Trichomonas OSOM (Genzyme Diagnostics) (aprovado somente
para amostras vaginais coletadas com haste)

- Culture kit: Sistema de cultura InPouch TV (BioMed Diagnostics)


- NAAT: APTIMA TV (Gen-Probe)

Captulo 7. Vaginose bacteriana


Equipamentos
- Microscpio de luz

- Espculo
Reagentes

- Hidrxido de potssio (KOH)

- Colorao de Gram (cristal de violeta, soluo de iodo, safranina) (PRO-LAB Diagnostics)

- Soluo salina ou soluo salina tamponada com fosfato (PBS, do ingls phosphate-buffered saline
solution)

Materiais de consumo
- Hastes com extremidades de algodo
- Lminas de vidro

- Tiras de papel indicadoras de pH (intervalo de pH 3,8-6,0)


Testes (kits disponveis comercialmente)
- Affirm VP III (Becton, Dickinson)
- BV blue (OSOM)

- FemExam Card Test (New Rapid Diagnostic Kit) (Litmus Concepts).

Captulo 8. Candidase

Equipamentos
- Incubadora (36C)

- Microscpio de luz
Reagentes

- Soluo KOH 10%

- Soro bovino (ou de cavalo)

- Colorao de Gram (cristal de violeta, soluo de iodo, safranina) (PRO-LAB Diagnostics)


- Soluo salina ou soluo salina tamponada com fosfato (PBS)

Anexo 5. Materiais de laboratrio

249

- gar seletivo dextrose Sabouraud com/sem cloranfenicol


- Meio de transporte (Amies)


Materiais de consumo

- Hastes com extremidades de algodo


- Lamnulas

- Lminas de vidro

- Tiras de papel para medir pH


- Tubos para testes

Testes (kits disponveis comercialmente)


- API 20C (bioMrieux)

- API ID3 2C (bioMrieux)

- Vitek Yeast Biochemical Card (bioMrieux).

Captulo 9. Infeces pelo vrus da herpes simples (HSV)


Equipamentos
- Centrfuga

- Freezer (-20C e -80C)

- Incubadora (36C, CO2 5%)

- Microscpio (de fluorescncia e estereoscpico)


- Agitador (vrtice)
Reagentes

- Acetona

- Isotiocianato de fluorescena (FITC, do ingls fluorescein isothiocyanate) (sondas moleculares)


- cido N-(2- hidroxietil)piperazina-N-2-etanossulfnico (HEPES)
- Soluo PBS

- Sacarose

Materiais de consumo
- Hastes com as pontas em algodo, dacron ou com flocos de nylon
- Tubos de cultura

- Anticorpos monoclonais tipo-especficos, marcados com FITC ou imunoperoxidase (para ser utilizado
diretamente nas clulas infectadas)

- Lminas para microscpio

- Frascos pequenos ou placas com mltiplos poos

- Hastes de madeira/plstico/alumnio com extremidades de dacron, algodo ou flocos de nylon, estreis


- Agulhas estreis

- Espculo vaginal

- Frascos para meio de transporte

250

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Testes
- NAAT (disponvel comercialmente, mas no aprovado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos
Estados Unidos da Amrica).

- Testes POC rpidos para a deteco de antgeno de HSV esto disponveis comercialmente, mas no foram
amplamente avaliados.

Captulo 10. Sfilis


Equipamentos
- Analisador gentico ABI 310 (Applied Biosystems)

- Microscpio binocular com condensador de fundo escuro


- Aparelho de quimioluminescncia
- Aparelho de eletroforese

- Leitor de ensaio imunossorvente ligado enzima (ELISA, do ingls enzyme-linked immunosorbent assay)
- Microscpio de fluorescncia
- Freezer (-70C)
- Geladeira

- Sonicador

- Banho-maria
Reagentes

- Acetona

- Anti-IgG ou IgM de cabra marcada com fosfatase alcalina

- IgG biotinilada de cabra anti-humana com estreptavidina-peroxidase


- Carvo

- Fluorescena

- Fluorescena conjugada

- Antiglobulina de Treponema pallidum marcada com fluorescena


- Peroxidase de raiz forte
- leo de imerso
- Parafina

- Soluo PBS

- Protenas recombinantes para imunoensaios em linha (TpN47, TpN17, TpN15 e TmpA)


- Vermelho tolueno

Materiais de consumo
- Alas bacteriolgicas ou esptula de ao inoxidvel
- Hastes com extremidades de algodo
- Lminas para microscpio

- Placas para microtitulao

- Tiras imunocromatogrficas de nitrocelulose


- Pipetas

Anexo 5. Materiais de laboratrio

251

- Tiras de membrana de nitrocelulose


- Seringas (2mL e 5mL)

- Testes (kit disponvel comercialmente e preparao de teste in-house)


Testes

- Testes sorolgicos (no treponmicos ou testes de reagina)


Teste de reagina plasmtica rpida (RPR) (Becton, Dickinson)

Teste da toluidina vermelha com soro no aquecido (TRUST, do ingls toluidine red unheated serum
test; New Horizon Diagnostics)
Teste do Laboratrio de Pesquisa de Doenas Venreas (VDRL, do ingls Venereal Disease Research
Laboratory)

Teste de reao de Wassermann (WR, do ingls Wasserman reaction)

- Testes sorolgicos (treponmicos)

Absoro do anticorpo treponmico fluorescente (FTA-Abs, do ingls fluorescent treponemal


antibody absorption)
Ensaio de hemaglutinao para Treponema pallidum (TPHA, do ingls Treponema pallidum
haemagglutination assay)
Ensaio de aglutinao passiva de partculas para Treponema pallidum (TPPA, do ingls Treponema
pallidum passive particle agglutination assay) (Fujirebio)
Imunoensaio enzimtico (EIA, do ingls enzyme immunoassay) e ensaios de quimioluminescncia
(EQI) treponmicos
Ensaios de western blot (WB) treponmicos

- Testes POC rpidos para sfilis

Esses testes esto disponveis nos formatos seguintes:


1) Testes de tiras de fluxo lateral (ver Captulo 10 para procedimento)
2) Aparelho de imunoconcentrao (flow-through) (Span Diagnostics, Ltd.)

- Testes duplos rpidos treponmicos/no treponmicos (Chembio Diagnostic Systems, Inc.)

Captulo 11. Linfogranuloma venreo (LGV)


Teste
- O ensaio molecular para distinguir linhagens LGV e no-LGV baseado na deteco do gene pmpH, o qual
est presente apenas nos isolados LGV.

Captulo 12. Cancro mole


Equipamentos
- Centrfuga

- Freezer (-70C)

- Incubadora (32-34C, atmosfera saturada de vapor de gua ou CO2 a 5%)


- Microscpio de luz

- Padro nefolomtrico de McFarland (PRO-LAB Diagnostics)


- Banho-maria

252

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Reagentes
- Deteco de fosfatase alcalina (n-butanol, tampo citrato-hidrxido de sdio de Srensen [0,01mol/L],
2,6-dibromoquinona-4-clorimida em metanol [5g/L], fosfato dissdico sem fenol)

- Reagentes para colorao de Gram (ver Anexo 4)

- Teste de reduo de nitrato (soluo de nitrato de sdio [0,5g/L]; tampo fosfato, pH 6,8 [0,025 mol/L];
cido actico [5mol/L]; -naftilamina [5g/L])

- Teste de oxidase (cloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamina)

- Teste de porfirina (soluo de sulfato de magnsio; tampo fosfato, pH 6,9 [0,1mol/L]; cloridrato de cido
-aminolevulnico [2mol/L])

- Meio de crescimento (ver Anexo 4).


Materiais de consumo

- Alas bacteriolgicas

- Hastes com pontas de algodo


- Tiras de papel-filtroTestes (identificao de alvos moleculares)


Testes (identificao de alvos moleculares)
- NAAT baseados em pesquisa

Captulo 13. Donovanose (granuloma inguinal)


Equipamentos
- Microscpio de luz

- Pina perfuradora para bipsia


Reagentes

- Etanol a 95%

- Reagentes para colorao de Giemsa (ver Anexo 4)

- Reagentes para colorao de Leishman (ver Anexo 4)

- Colorao por impregnao de prata de Warthin-Starry (ver Anexo 4)


- Parafina

- Lminas de vidro

Materiais de consumo

Testes (identificao de alvos moleculares)


- NAAT baseados em pesquisa, gene alvo phoE

Captulo 14. Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)


Equipamentos
- Balana (para pesar)
- Centrfuga

- Aparelho de eletroforese

- Microscpio de fluorescncia
- Freezer (-70C)

Anexo 5. Materiais de laboratrio

253

- Geladeira

- Incubadora (37C)

- Forno de microondas
- Pipetador (Pipet-aid)

- Transiluminador ultravioleta
- Agitador (vrtice)

- Banho-maria
Reagentes

- cido actico

- P de agarose ou poliacrilamida

- Sonda de DNA especficas para HPV


- leo de imerso
- Mercaptoetanol

- Marcadores sorolgicos
Materiais de consumo
- Lminas de vidro

- Microplaca ou tubos pequenos para reao de PCR


- Pipetas (2mL, 5mL e 10mL)

- Ponteiras com filtro (10L, 100L, 1.000L)

Testes (ver tambm as Tabelas 14.2 e 14.3, Captulo 14)


- Mtodos de deteco do DNA de HPV

PCR utilizando captura hbrida II (CH2), teste para HPV (Qiagen)

Teste Care HPV

Teste para HPV COBAS 4800 (Roche)

Teste de genotipagem para HPV por arranjo linear (Roche)

Teste RUO HPV genotyping LQ (Qiagen)


Kit de genotipagem para HPV multiplex (Multimetric)
- Ensaio de mRNA para HPV

Teste para HPV APTIMA (Gen-Probe)

PreTect HPV proofer (Norchip)

Captulo 15. Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)


Equipamentos
- Centrfuga

- Aparelho de eletroforese

- Leitor e lavadora para ELISA


- Citmetro de fluxo
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Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

- Microscpio de fluorescncia
- Freezer (-25C)
- Geladeira

- Incubadora (37C)

- Pipetador (Pipet-aid)

- Banho-maria
Reagentes

- P de acrilamida
- leo de imerso

- Anticorpos monoclonais marcados para citmetro de fluxo (anti-CD4, -CD3, -CD8 e -CD45)
Materiais de consumo

- Estabilizadores de sangue (tubos Cyto-Chex e TransFix)


- Tubos para sangue

- Calibradores de pipetas

- Reagente colorido (ouro coloidal)


- Hastes com ponta de algodo
- Papel-filtro

- Anticorpos secundrios marcados com fluorescncia

- Tiras de membranas (com protenas ou protenas recombinantes ou peptdeos especficos para HIV,
separados)

- Lmina (para clulas infectadas por HIV fixadas)


Testes (kits disponveis comercialmente)
- Testes sorolgicos

EIA (primeira, segunda, terceira e quarta gerao)

Testes rpidos

- Ensaios confirmatrios (sorolgico)

Ensaios de imunofluorescncia

Ensaios de WB

Imunoensaios em linha

- Testes moleculares

Deteco do RNA, DNA e p24 do HIV (kits comerciais, NAAT)

PCR de DNA POC

Teste genotpico de resistncia a drogas do HIV (HIVDR) (TRUGENE e Viroseq)

Teste fenotpico (de alto custo, no recomendado para o diagnstico de rotina)

Agradecimentos
Os autores agradecem as contribuies de Rajinder Parti e Aura Helena Corredor na preparao deste anexo.

Anexo 5. Materiais de laboratrio

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