LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR I

Grupo N 1
Ao 2016

Teora de la extraccin de ADN en un laboratorio

S. Amaya; shalyaaa8@hotmail.com
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Resumen:
El cido desoxirribonucleico (ADN), es el material gentico de todos los
organismos vivos y de casi todos los virus; es el que lleva la informacin necesaria para
dirigir la sntesis de protenas y la duplicacin de la misma molcula.
Para poder estudiar esta molcula con detalle se precisa generalmente su aislamiento de la
clula, y para ello es necesario un conjunto de material e instrumentos de laboratorio
complejos.
La manipulacin del ADN es uno de los ejemplos del avance de la aplicacin de una serie
de herramientas, y que en la actualidad, se usan de manera rutinaria para desarrollar una
amplia variedad de estudios genticos.
El objetivo de esta prctica es detallar la tcnica que se utiliza para la extraccin del ADN.
Palabras claves: cido desoxirribonucleico; material; estudios genticos; extraccin.
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Introduccin:
En la actualidad, el estudio de la variacin gentica entre individuos, poblaciones y
especies para explicar patrones y procesos evolutivos se aborda mediante marcadores
moleculares, segmentos de ADN que proporcionan informacin.
Los datos moleculares han permitido estudiar con mayor precisin los patrones de
diversidad gentica y su distribucin; el comportamiento; la seleccin natural; las

interacciones biolgicas; la composicin, funcionamiento y dinmica de comunidades

microbianas entre otros.
La aplicacin de tcnicas moleculares inicia con la extraccin de ADN y la obtencin
exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la extraccin de
ADN ntegro y puro. La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de molculas
de ADN y se basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula.
La extraccin de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras
que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificacin, que
implica la retirada de la solucin final de la mayora de elementos; la extraccin de ADN es
quizs el ms desconocido y sobre el que ms control podemos ejercer. La extraccin del
ADN de las clulas o virus donde se halla confinado es un paso previo en muchos
procedimientos analticos y diagnsticos.
A lo largo del tiempo se han diseado distintos protocolos con la finalidad de obtener una
cantidad y calidad de ADN adecuados, as como garantizar la eliminacin de inhibidores
potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molcula.
A partir de los aos 90 se introdujeron al mercado combos o kits de extraccin que utilizan
matrices inorgnicas compactas cargadas positivamente capaces de retener varios
microgramos de ADN y separarlos del resto de las biomolculas, permitiendo obtener un
extracto libre de inhibidores.
Los kits comerciales utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, garantizan una
extraccin de alta pureza ya que tanto la recuperacin del ADN como la eliminacin de
contaminantes son muy eficientes.
La seleccin del mtodo de extraccin es un paso fundamental en las tcnicas moleculares
y depende del organismo bajo estudio, el tejido disponible y su estado de conservacin, la
tcnica que se aplicar posteriormente, as como la infraestructura de los laboratorios, los
recursos econmicos y tiempo para obtener resultados.
Con la finalidad de que el usuario conozca las diferentes opciones y elija la ms apropiada,
de acuerdo con sus objetivos y recursos, en los siguientes prrafos se describen de manera
general las etapas de los protocolos, se explican los mtodos de anlisis y almacenamiento
del extracto.

Materiales y Mtodos:
Para la extraccin del ADN se debe evitar contaminacin con agentes externos, es
por ello que se debe utilizar guantes y mascarillas estriles, este procedimiento se lo va a
realizar en una cabina de flujo laminar provista de luz ultra violeta. Vamos a utilizar un
juego de micro pipeta nica para la extraccin, con puntas estriles
Toma de la muestra
Una colecta y manejo apropiado de la muestra permite obtener ADN integro y sin
contaminantes, los cuales afectan la accin de las enzimas. Cada tejido tiene sus
consideraciones propias y siempre ser necesario conocerlas o preguntar a los especialistas
de cada grupo para llevar a cabo una colecta y extraccin exitosas.
Romper las clulas por accin mecnica o con detergentes
La homogenizacin, mecnica o qumica, consiste en romper las uniones entre las clulas
para facilitar la interaccin con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material
gentico.
En la homogenizacin mediante agentes qumicos, la muestra se mantiene en solucin a
altas temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes caotrpicos que rompen
las uniones entre las clulas o que incluso pueden perforar la membrana celular. La
disgregacin qumica es recomendable para bacterias, muestras pequeas de tejidos frescos
o sangre. En tejidos fibrosos es recomendable cortar en fragmentos pequeos para
favorecer su disgregacin. Antes de iniciar la homogeneizacin es necesario contar con
informacin sobre la cantidad apropiada de tejido que debe utilizarse pues una disgregacin
rpida y completa es esencial para asegurar la obtencin de ADN y evitar su degradacin.
Si se excede la cantidad recomendada se puede sobresaturar el sistema, con lo que se afecta
el rendimiento y aumentan las impurezas del extracto, de manera que es aconsejable
realizar experimentos preliminares con distintas cantidades de material inicial para
determinar cul es la cantidad apropiada, en particular en los sistemas de extraccin
tradicionales.

Digestin enzimtica de protenas u otros componentes celulares

Se colocaran enzimas catalizadoras como la proteinasa K que van a degradar las protenas y
componentes celulares.
Lisis celular
Durante el proceso de lisis las interacciones entre las molculas que conforman la pared, la
membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los cidos nucleicos
se liberen. Se utilizan soluciones bsicas, detergentes o agentes caotrpicos que permiten
disolver la membrana celular, as como inhibidores para inactivar las enzimas que degradan
el ADN. Muchas soluciones de lisis contienen tambin EDTA, que forma un complejo con
los iones de Mg2+ e impide el funcionamiento de las DNasas. Los componentes celulares
no solubles como el material fibroso y protenas que permanecen en solucin se separan del
ADN por centrifugacin.
Extraccin propiamente dicha con solventes orgnicos
Se va a colocar un buffer que contiene solventes orgnicos como el alcohol o etanol al 75%
los cuales mantendrn el Ph de forma neutra y suspendern todo el material que no sea
ADN.
En los kits es necesario liberar al ADN de la matriz,. La membrana y el ADN se deshidratan
con soluciones de lavado y ciclos de centrifugacin, despus se recomienda centrifugar
nuevamente la columna para evaporar el etanol y eliminar el exceso de las soluciones.
Posteriormente, se adiciona agua o solucin amortiguadora al centro de la membrana, se
espera a que el ADN se hidrate, se centrifuga para recuperarlo de la matriz y resuspenderlo.
Es necesario saber que la mayora de los kits tienden a ser generales a la hora de su
aplicacin, pero se disean con un propsito especfico. Por ejemplo, un kit para extraer
ADN de sangre total, considera la presencia de hemoglobina y eritrocitos durante el
proceso. Este mtodo ser ms agresivo en comparacin con un kit diseado para extraer
ADN de clulas o tejidos animales. En los manuales proporcionados por el fabricante se
detallan, adems de los pasos a seguir en cada caso, la cantidad de muestra recomendada y
el rendimiento esperado de acuerdo al tipo de tejido

Purificacin por precipitacin con Etanol

La purificacin del ADN de inters de las protenas solubles y otros cidos nucleicos se
hizo mediante la extraccin orgnica (por ejemplo, el fenol y cloroformo), seguida por la
precipitacin de etanol.
El etanol que se utilizara debe ser al 100% este debe mantenerse en refrigeracin de 2-3C,
la separacin de material soluble e insoluble se realiza mediante un mtodo de
compensacin (por ejemplo, filtracin o centrifugacin) aqu el material ser centrifugado y
se esperara que el etanol se evapore.
Para facilidad de uso, en la actualidad se ofrece una gama de productos de purificacin
ADN convenientemente envasados que permiten aislar el ADN en poco tiempo usando
mtodos mucho ms seguros.
El ADN purificado de alta calidad est listo para usar en una amplia variedad de
aplicaciones exigentes, tales como PCR, transcripcin in vitro / sistemas de traduccin,
transfeccin y reacciones de secuenciacin. El EDTA es un quelante que se une al magnesio
presente en el ADN purificado y puede ayudar a inhibir la actividad nucleasa de posibles
contaminante.
Resultados:

Tabla 1:
Tipo de tejido, cantidad de muestra y rendimiento esperado de ADN,
usando combo de extraccin comercial
Material
Cantidad
Rendimiento de ADN
(g)
Clulas de E. coli
2 x 109
10-30
Sangre de humano
200 ul
3-10

Tabla2:
Recomendaciones sobre la colecta y manejo de muestras
Muestra
Colecta en campo/
Almacenamiento de la
Transporte de la
muestra previo a la
muestra
extraccin
Sangre
Utilizar agujas de calibre Las muestras pueden
apropiado, respetar la
mantenerse por unos
relacin muestra/
das a 4 C despus de
anticoagulante y
su colecta. Si se congela
homogeneizar
la muestra a -20 C,
correctamente la
debe descongelarse a
muestra para evitar la
temperatura ambiente y
hemlisis* y/o
procesarse en su
coagulacin**, y la
totalidad pues una vez
contaminacin
descongelada, inicia la
bacteriana. Una vez
hemlisis, por ello es
obtenida la muestra es
aconsejable hacer
importante evitar
alcuotas
movimientos bruscos
durante el transporte.

Conclusiones:
La incorporacin de controles internos de amplificacin en los kits permite conocer el nivel
de inhibicin de las reacciones. Las bacterias no suelen contener substancias inhibidoras,
por lo que en la mayora de casos una extraccin primaria (lisis y liberacin del ADN) es
suficiente para tener resultados satisfactorios.

Referencias y Bibliografa:
Alejos Velzquez, agosto 2010. Extraccin y purificacin de ADN. Recuperado de:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf

Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Octubre 2009. ACTIVIDAD

PRACTICA No. 8 BIOLOGIA CELULAR EXTRACCIN DE ADN. Recuperado de:
http://bibmed.ucla.edu.ve/edocs_bmucla/MaterialDidactico/Micro/BioCelular/Practica/extr
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Dvila Castillo, 2003. Extraccion de ADN Biolaboratorio. Recuperado de:
http://siladin.cchoriente.unam.mx/coord_area_cienc_exp/biologia/GuiaBioI/Extraccion_de_ADN.pdf
Gutirrez Garca, 2008. LA REACCION EN CADENA LA REACCION EN CADENA DE
LA POLIMERASA. Recuperado de: http://www.paho.org/hq/dmdocuments/2010/C
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