INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE CIENCIA Y TECNOLOGA FARMACUTICA

INGENIERA DE PRODUCTOS BIOLGICOS

LABORATORIO

Elaboraron:
I.B.T. Vernica Chvez Infante
I.B.T. Hctor Molina Jimnez

Diciembre de 2011

PRLOGO
La unidad de aprendizaje naci como respuesta a las necesidades encontradas en la industria
farmacutica nacional y para que los egresados de la carrera de Ingeniera Farmacutica puedan
competir ms eficientemente al incorporarse a sas fuentes de trabajo.
Podemos definir a un Producto Biolgico como cualquier virus, suero teraputico, toxina, antitoxina o
producto anlogo; aplicable a la prevencin o tratamiento de enfermedades humanas.
El presente Manual de Prcticas del Laboratorio de Ingeniera de Productos Biolgicos.
Consta de seis prcticas:
1. Prueba de efectividad de antibiticos en diferentes microorganismos.
2. Determinacin de la capacidad del medio de cultivo para permitir el crecimiento de los
microorganismos.
3. Produccin de anticuerpos en conejos.
4. Diseo terico por bioinformtica de una vacuna.
5. Anlisis del proceso de produccin de interfern humano por tecnologa recombinante.
6. Aislamiento de insulina a partir de pncreas bovino.
Abarca las seis unidades temticas que comprende el programa.

EVALUACIN DEL LABORATORIO DE INGENIERA DE PRODUCTOS

BIOLGICOS 8 DE AGOSTO 2013
La evaluacin del Laboratorio corresponde al 40% de la calificacin que se asienta en las actas.
La evaluacin del curso se realizar en tres evaluaciones departamentales.
El alumno debe obtener una calificacin mnima de seis (6.0) para aprobar.
En caso de presentar examen extraordinario se deber presentar un examen prctico terico de todos
los conocimientos adquiridos en el semestre.
Los aspectos a evaluar son:
El desempeo y trabajo en el laboratorio (10%),
La bitcora (10%), y
La entrega del reporte escrito correspondiente a la prctica realizada (80%).
El reporte escrito debe contener al menos los siguientes apartados:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Introduccin
Objetivos
Diagrama de flujo del trabajo realizado
Resultados
Discusin de resultados
Conclusiones
Sugerencias (opcional)
Bibliografa consultada.
FIRMA DE CONFORMIDAD Y ENTERADO

0PRCTICA No. 1

Prueba de efectividad de antibiticos en diferentes microorganismos.

OBJETIVO GENERAL:
Determinar la eficacia de diferentes antibiticos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Conocer los mtodos que existen para determinar la eficacia teraputica de un antibitico.
Realizar la curva patrn de penicilina, estreptomicina y tetraciclina de acuerdo a la farmacopea.
INTRODUCCIN
Las infecciones bacterianas son un problema de salud a nivel mundial: esto es particularmente cierto para los
pases subdesarrollados, donde estas enfermedades tambin causan una prdida econmica importante.
Para una quimioterapia sistmica, un agente antibacteriano ideal debe ser seguro en dosis teraputicas altas
dosis, fcil de administrar, incapaz de inducir resistencia y de bajo costo; para determinar la factibilidad y los
regmenes ptimos de dosificacin se deben de efectuar cuidadosos estudios farmacolgicos y farmacocinticos.
Los antibiticos son compuestos solubles derivados de ciertos microorganismos y que inhiben el crecimiento de
otros.
La eficacia teraputica de los antibiticos es demostrada por el efecto inhibitorio del crecimiento de un
microorganismo sobre un medio de cultivo especfico para cada antibitico.
Existen dos mtodos generales para demostrar esta inhibicin; el mtodo de cilindro-placa y el ensayo
turbidimtrico, el primero depende de la difusin a travs de un cilindro y sobre una placa solidificada de agar en
una caja petri de tal manera que se adiciona un microorganismo de prueba dependiendo del antibitico a ensayar
y la inhibicin se determina en un rea circular alrededor del cilindro que contiene el antibitico. El mtodo
turbidimtrico depende del crecimiento microbiano en un medio de cultivo lquido que es favorable para el
crecimiento en la ausencia del antibitico.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS:
Antibiticos:
Penicilina
Estreptomicina
Tetraciciclina
Microorganismos:
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Medios de cultivo:
Medio para antibiticos No. 1 (agar y medio lquido)
Medio para antibiticos No. 2
Medio para antibiticos No. 32 (es el medio No. 1 + 300 mg de MnSO 4.H20 por litro)
Diluyentes:

Acido clorhdrico 0.1 N

Solucin amortiguadora No. 1 (Disolver 2.0 g de fosfato dibsico de potasio y 8.0 g de fosfato monobsico de
potasio en 1000 ml de agua. Ajustar el pH con cido fosfrico 18 N Hidrxido de potasio 10 N a pH 6.0 +/-0.05)
PROCEDIMIENTO:
Preparacin del estndar
Estndar de penicilina.
Pesar la cantidad necesaria para obtener una solucin de 100 U/ml y realizar las diluciones necesarias para
obtener por lo menos 5 puntos de la curva de manera que el punto medio sea 1.0 U/ml
Estndar de tetraciclina.
Pesar la cantidad necesaria para obtener una solucin de 1 mg/ml y realizar las diluciones necesarias para
obtener 5 puntos de la curva de manera que el punto medio sea 0.24 g/ml
Estndar de estreptomicina.
Pesar la cantidad necesaria para obtener una solucin de 1 mg/ml y realizar las diluciones necesarias para
obtener 5 puntos de la curva de manera que el punto medio sea 30 g/ml.
Preparacin del inculo.
En un tubo de agar nutritivo sembrar el microorganismo de prueba e incubarlo 24 h. Aadir solucin salina estril
suficiente para obtener una solucin ajustada al 25% de transmitancia a 580 nm.
Mtodo del cilindro-placa.
1. Aadir 20 ml del medio No. 2 en cada caja de petri, una por cada dilucin y dejar solidificar.
2. Aadir al medio No. 1, 0.1 ml de S. aureus o B. subtilis de la suspensin del inculo (ajustada al 25%) por cada
100 ml.
3. Aadir 10 ml del medio inoculado sobre la placa gelificada de agar No. 2 y dejar solidificar nuevamente.
4. Colocar 2 cilindros sobre las placas gelificadas y aadir 50 l de cada una de las diluciones, incubar a 37 C por
24 h, medir el halo de inhibicin.
Mtodo turbidimtrico
1. Preparar las diluciones necesarias para el estndar y realizar por triplicado el ensayo.
2. Colocar 9.0 ml del medio para antibiticos lquido y aadir 0.01 ml de inculo.
3. Incluir 1 2 tubos control, conteniendo l ml de diluyente sin antibitico y 9 ml de medio.
4. De la solucin de referencia aadir 1 ml de cada dilucin a cada uno de los tres tubos preparados y colocar los
tubos en una gradilla.
5. Colocar la gradilla en un bao de agua a 37 C. Despus de la incubacin aadir 0.5 ml de formaldehdo al 12%
en cada tubo.
6. Leer la absorbancia de los tubos de cada gradilla a 530 nm ajustando previamente con los tubos control.

PRCTICA 2
Determinacin de la capacidad del medio de cultivo para
permitir el crecimiento de los microorganismos (USP XX)
sta prueba se lleva a cabo para comprobar que los medios Medio fluido de tioglicolato y Medio digerido de
soya tripticasa tienen las propiedades necesarias para permitir el crecimiento de microorganismos.
Material:
Asa bacteriolgica
Cajas de Petri
Celdas para el espectrofotmetro
Matraces
Perlas de vidrio estriles
Pipetas estriles
Tubos de vidrio con rosca y tapas
Tubos para centrfuga (Falcon )
Varilla de vidrio para la extensin del microorganismo
Recipiente con agua para desechas las pipetas usadas
Cinta para rotular
Marcador indeleble
Mecheros
Franela
Esponjas
Cerillos o encendedor
Equipos:
Parrilla elctrica con agitacin magntica
Incubadora
Espectrofotmetro
Campana de flujo laminar
Agitador vrtex
Soluciones:
Agua destilada estril
Solucin salina al 0.85%
Solucin de fenol al 5%
Cepas a utilizar:

Bacteroides vulgatus ATCC 8482, Clostridium sporogenes ATCC 7955 o Aspergillus

niger ATCC 16404 para el Medio fluido de tioglicolato (MFT)

Bacillus subtilis ATCC 6633 o Candida albicans ATCC 10231 para el Medio digerido
trptico de casena y soya (MDST)
Medios de cultivo:
Caldo carne para los microorganismos B. vulgatus, C. sporogenes y A. niger.
Agar infusin de cerebro y corazn (BHI) para los microorganismos B. subtilis y C.
albicans.
Agar gelosa sangre
MEDIO FLUIDO DE TIOGLICOLATO (MFT)

Digerido pancretico de casena

Extracto de levaduras (soluble en agua)
Cloruro de sodio
Dextrosa monohidratada
Agar granulado (con menos del 15% de
humedad)
Cistina HCl
Tioglicolato de sodio
Resarzurina (solucin al 0.1% recientemente
preparada)
Agua

15.00
5.00
2.50
2.50
0.75

g
g
g
g
g

0.50 g
0.50 g
1.00 mL

aforar a 1000
mL
pH despus de la esterilizacin
7.0 0.2
ste medio puede sustituirse por Caldo tripticasa soya de BBL o DIFCO.

MEDIO DIGERIDO TRPTICO DE CASENA Y SOYA (MDST)

Digerido pancretico de casena
Cloruro de sodio
Digerido pancretico de harina de
soya
Dextrosa monohidratada
Fosfato de potasio dibsico
Agua purificada

17.0 g
5.0 g
3.0 g

2.5 g
2.5 g
Aforar a 1000
mL
pH despus de la esterilizacin
7.3 0.2
ste medio puede sustituirse por el Caldo soya tripticasa de BBL o DIFCO.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
PARA EL MEDIO FLUIDO DE TIOGLICOLATO (MFT):
Preparacin del inculo para la determinacin de la sensibilidad del medio de
cultivo:

A partir de un cultivo de caldo carne o bien, de un vial liofilizado, efectuar una resiembra o caldo
tioglicolato, incubar a 37 C durante 48 horas.
Obtencin del paquete celular:
Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos, lavar con solucin salina al 0.85% dos veces. Resuspender
el paquete celular en 15 mL de solucin salina al 0.85%.
Ajustar esta suspensin a 60% de transmitancia utilizando un filtro verde (580 nm). Una vez ajustada,
preparar diluciones decimales de 10-1 a 10-8. Por duplicado colocar en placas de gelosa sangre 0.5 mL
de las diluciones 10-5, 10-6, 10-7 y 10-8, extender la alcuota ayudndose de una varilla doblada en ngulo
recto estril.
Incubar a 37 C durante 48 horas en atmsfera de anaerobiosis (sistema de Gas-Pack).
Transcurrido el periodo de incubacin, proceder a contar las Unidades formadoras de colonias (UFC)
en cada una de las placas seleccionando aquellas placas que muestren no menos de 30 ni ms de 300
UFC. Calcular el nmero total considerando la dilucin y el volumen del inculo. Utilizar la dilucin
que muestre un nmero de UFC menor de 100.
Desarrollo de la prueba.
De cada lote de medio que se prepare, separar 9 tubos; 4 se usan para probar la sensibilidad del medio
de cultivo; 3 tubos para una segunda prueba, si sta fuera necesaria y 2 tubos se utilizan como control
de esterilidad del medio de cultivo.

De la suspensin ajustada como se indic anteriormente tomar 1 mL e inocularla a cada tubo de prueba.
Incubar a 30-35 C durante 7 das. Revisar los tubos diariamente y anotar el da en el que aparezca el
crecimiento (generalmente aparece al tercer da).
NOTA: Es conveniente que al momento de la prueba se efecte una cuenta en placa, para comprobar que el
nmero de microorganismos del inculo es el indicado en la USP (United States Pharmacopeia).
PARA EL MEDIO DIGERIDO DE SOYA TRIPTICASA (MDST):
Preparacin de los inculos para la determinacin de la sensibilidad del medio
de cultivo:

a. Obtencin de esporas de Bacillus subtilis.

Sembrar el B. subtilis en tubo conteniendo agar BHI (inclinado), incubar por a 37 C 48 horas.
Transcurrido el perodo de incubacin, cosechar el cultivo y resuspender en solucin salina en un tubo
provisto de perlas de vidrio estriles (para la homogenizacin del cultivo), agitndolo en el vrtex.
Calentar el cultivo a 70 C durante 30 minutos. Lavar tres veces centrifugando a 300 rpm durante 15
minutos con solucin salina estril al 0.85% y resuspender finalmente en 50 mL de agua destilada
estril. Calentar nuevamente a 70 C por 30 minutos. Sembrar una placa de BHI para observar
viabilidad de las esporas.
Ajustar la suspensin a 60% de transmitancia utilizando un filtro verde (580 nm). Una vez ajustada la
suspensin, preparar diluciones decimales 10-1 a 10-7 y sembrar por duplicado en cajas de Petri 1 mL de
cada una de las 3 ltimas diluciones, colocar sobre el inculo aproximadamente 25 mL de agar BHI
previamente fundido y enfriado a 45 C (tcnica de vaciado en placa), homogenizar y dejar solidificar
el agar, incubara 37 C por 24 horas. Transcurrido el periodo de incubacin, proceder a contar las UFC
en cada una de las placas, se deben seleccionar aquellas que presenten no menos de 30 ni ms de 300
UFC. Calcular el nmero total considerando la dilucin del inculo. Utilizar la dilucin que muestre un
nmero de UFC cercano a 100 (no ms de 100).
b. Obtencin de la suspensin de Candida albicans.
Sembrar el microorganismo en tubos de agar BHI inclinado e incubar a 37 C por 48 horas.
Transcurrido el periodo de incubacin cosechar el cultivo, resuspender en 15 mL de solucin salina y
homogenizar.
Ajustar la suspensin a 40% de transmitancia utilizando un filtro verde (580 nm). Una vez ajustada,
preparar diluciones decimales de 10-1 a 10-8. Hacer cuenta viable de las cuatro ltimas diluciones
siguiendo el mtodo de vaciado en placa (como en el inciso a.).
Utilizar la dilucin que muestre un nmero cercano a 100 UFC, no ms de 100.
Desarrollo de la prueba:
De cada lote de medio de agar soya tripticasa que se prepare, separar 16 tubos, de los cuales 8 se
utilizarn para probar la sensibilidad del medio, 6 tubos para una segunda prueba, si esta fuera
necesaria y 2 tubos se utilizan como control de esterilidad del medio de cultivo.
De las suspensiones preparadas se inoculan 1 mL de cada una en cuatro tubos de medio y la segunda en
los cuatro complementarios.
Incubar a 20 25 C durante 7 das. Observando diariamente y anotando el da en que aparece
crecimiento.
NOTA: Es conveniente hacer una cuenta en placa como se indic para el medio de tioglicolato, para comprobar
que el nmero de microorganismo del inculo es el indicado.

Evaluacin:

Si ambos medios fallan para obtener crecimiento de los microorganismos en una concentracin de 1 a
100 microorganismos por mL, se deben investigar los medios en cuestin y la forma de prepararlos.
Igualmente determinar si los microorganismos estn en las condiciones ptimas y si el procedimiento
se ha seguido correctamente.
REFERENCIA

Manual de laboratorio de produccin y control de biolgicos, 4ta. ed., IPN, Mxico, 1984, 222 pp.

PRCTICA 3.
PRODUCCIN DE ANTICUERPOS EN CONEJOS.
OBJETIVOS.

Obtener dos inmungenos bacterianos, uno de naturaleza protenica (antgeno "H"), y otro de
naturaleza lipopolisacardica (antgeno "O") de Salmonella thyphimurium.
El alumno ensayar las tcnicas de inmunizacin con los animales de uso ms comn en el
laboratorio, practicando algunos de los esquemas de inmunizacin ya establecidos.
Efectuar la purificacin de gamma globulina por precipitacin con sulfato de amonio a una
saturacin final del 33%.
El alumno conocer distintas maneras de poner en evidencia la reaccin de precipitacin que ocurre
cuando un antgeno soluble interacciona con su anticuerpo homlogo.

INTRODUCCIN.
INMUNIZACIN Y SANGRADO DE ANIMALES.
Inmunizacin es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo competente desarrolla
una respuesta inmunolgica al entrar en contacto con un antgeno.
Cuando un inmungeno penetra al organismo, es captado y procesado por las clulas
presentadoras de antgeno (CPA), llevndose a cabo una serie de interacciones celulares que involucran
tambin a los linfocitos T y a los linfocitos B. Como resultado se induce una respuesta inmunolgica
primaria con la consecuente formacin de anticuerpos, los cuales se detectan en el suero a partir del
cuarto da de inmunizacin (fase lag), incrementando su concentracin lentamente (fase log) hasta
llegar aun mximo (meseta) para posteriormente decaer rpidamente. En este tipo de respuesta el
isotipo principal de inmunoglobulina producido es IgM, seguida por una pequea cantidad de IgG de
baja afinidad.
En un segundo contacto con el inmungeno, la fase lag disminuye considerablemente y se
alcanza una concentracin de anticuerpos aproximadamente diez veces mayor que en una respuesta
primaria; el isotipo dominante en este caso es IgG, y presenta una mayor afinidad por el antgeno.
El isotipo de anticuerpo producido puede reflejar la diferencia en la ruta de inmunizacin y la
naturaleza del inmungeno, as como la va por la cual el antgeno es procesado y presentado a
diferentes poblaciones de linfocitos.
Para que un antgeno pueda actuar como un buen inmungeno debe favorecer la cooperacin
entre las clulas T y B. Un mismo antgeno puede no tener la misma inmunogenicidad en diferentes
especies animales, ya que esto depende de las caractersticas gen ticas, as como de la edad y sexo del
individuo inmunizado.
La dosis del inmungeno es un factor importante para lograr una respuesta inmunolgica, ya
que cantidades excesivas o mnimas del antgeno pueden inducir el fenmeno de tolerancia, el cual se
define como un estado de no-respuesta aun antgeno en particular.
El estado fsico del antgeno (particulado o soluble) debe tomarse en cuenta para designar la
ruta de inmunizacin, es decir, los antgenos particulados (bacterias, eritrocitos, clulas)
preferentemente son introducidos dentro del organismo por va intravenosa, mientras que los antgenos
en solucin pueden introducirse por diversas vas, como intramuscular (IM), intraperitoneal (IP),
subcutnea (SC) e intradrmica (ID). En estas dos ltimas, se utiliza preferentemente el antgeno

acompaado de un inmunopotenciador o adyuvante. Estos agentes actan inespecficamente para

incrementar la respuesta inmune especfica aun antgeno dado.
Los adyuvantes se han clasificado arbitrariamente de acuerdo a los mecanismos de accin
propuestos, ya que la mayora de ellos parecen funcionar utilizando ms de un mecanismo. Los
adyuvantes pueden actuar a travs de la retencin y liberacin del antgeno, o por efecto directo en
macrfagos y linfocitos. La formacin de un depsito de antgeno parece ser importante para la
actividad de adyuvantes como aquellos compuestos de almina, emulsiones de aceite, liposomas y
polmeros sintticos. La actividad de los adyuvantes como lipopolisacridos (LPS) y muramil dipptido
(MDP) parece ser mediada principalmente a travs de la activacin de macrfagos, mientras que
Bordetella pertusis acta sobre macrfagos y linfocitos.
Actualmente, el adyuvante de mayor uso en animales de experimentacin es el de Freund. El
adyuvante incompleto de Freund es una mezcla de un aceite mineral (Drakeol, Bayol, Nujol) con un
detergente (Falba, Arlacel, Aquafor) en diferentes proporciones, por ejemplo, Arlacel-Drakeol (1:9);
Arlacel-Bayol (3:17). El adyuvante completo de Freund contiene adems del aceite y el detergente, una
micobacteria (M. tuberculosis, M. bovis, M. phlei u otras) cuya cantidad es variable (de 1 a 5 mg de la
bacteria, peso seco, por cada mililitro de la mezcla incompleta de Freund).
En los humanos no se recomienda el uso de este tipo de adyuvante (Freund completo e
incompleto) ya que frecuentemente su aplicacin conduce al desarrollo de granulomas graves.
No hay esquemas establecidos para la inmunizacin de un animal con un antgeno determinado.
Los esquemas empleados en los diferentes laboratorios se han establecido realizando pruebas de ensayo
y error.
Sangrado.
El sangrado se efecta antes y despus del protocolo de inmunizacin en cada uno de
los animales. El sangrado previo es indispensable para contar con el testigo negativo.
Al suero obtenido despus de la inmunizacin, generalmente despus de 4 a 7 das de
la ltima inoculacin, se le determinar el ttulo de anticuerpos, si ste es alto, los
conejos se sangrarn en blanco por puncin cardiaca.

PREPARACIN DE INMUNGENOS.
El concepto de antgeno ha sido utilizado para denominar aquellas sustancias extraas al organismo que
pueden reaccionar especficamente con los anticuerpos o con receptores celulares. En la actualidad,
adems del concepto de antgeno, cabe mencionar los conceptos de inmungeno y de hapteno. Se
define como inmungeno a aquella sustancia capaz de inducir o estimular una respuesta inmunolgica.
El concepto de hapteno fue introducido por Landstainer para denominar a aquellas sustancias que son,
en general, de bajo peso molecular, capaces de reaccionar con los anticuerpos o los receptores celulares
sin que por s mismos generen una respuesta inmunolgica, a menos que se acoplen con un acarreador,
generalmente una protena.
La importancia de trabajar en la obtencin de antgenos radica en las diferentes aplicaciones que
se les pueden dar a stos. Por ejemplo, se pueden utilizar en pruebas de diagnstico, en la preparacin
de vacunas, con fines epidemiolgicos y de investigacin para estudiar los mecanismos inmunolgicos
que participan en el reconocimiento antignico.
La inmunogenicidad de los antgenos radica en varias de sus caractersticas fisicoqumicas. Su
capacidad inmunognica depende grandemente de su naturaleza qumica, siendo los mejores
inmungenos las protenas, seguidas de los polisacridos, lpidos y por ltimo los cidos nuclicos.
Algunas sustancias de bajo peso molecular, como el dinitroclorobenceno (DNCB), el cloruro de
picrilo y medicamentos como penicilinas y sulfonamidas, son inmunognicas particularmente si se
aplican en la piel, debido a que forman complejos con protenas tisulares

Antgeno "H".
El antgeno "H" se encuentra localizado solamente en los flagelos de la bacteria. Su naturaleza es
protenica, y por lo tanto es lbil a temperaturas mayores de 60C, y al tratamiento con alcohol o cidos
diluidos. Una determinada cepa de Salmonella en cultivo puede generar en distintos momentos dos
diferentes tipos de antgenos H". Los del primer tipo, denominados de fase uno, o especficos, se
comparten entre pocos serotipos de Salmonella. Los del segundo tipo, llamados de fase dos, son menos
especficos. La clasificacin de las enterobacterias se basa en sus caractersticas morfolgicas,
reacciones bioqumicas y propiedades antignicas. Por lo tanto, el trabajar con diferentes antgenos de
un mismo grupo de enterobacterias puede ayudar en la clasificacin.
Antgeno "O".
Los diferentes serotipos de Salmonella estn ntimamente relacionados entre s y ste es el criterio
bsico para su clasificacin. Las especies de Salmonella se clasifican en grupos, de acuerdo con la
estructura qumica del antgeno somtico. Esto es, que dependiendo de su composicin de azcares
diferentes, presencia o ausencia de grupos acetilo sustituidos y enlaces glicosdicos alfa y beta. se ha
observado una gran cantidad de serotipos diferentes. Este antgeno se encuentra en la superficie de la
bacteria formando parte de su membrana externa. A este antgeno tambin se le conoce como la
endotoxina de Salmonella. Debido a que es un lipopolisacrido, este antgeno resiste temperaturas hasta
de 100C durante tiempos prolongados y no se destruye con alcohol ni con cidos diluidos.
PURIFICACIN DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACIN CON SULFATO DE AMONIO.

Tiselius y Kabat demostraron que la actividad de anticuerpos est principalmente presente en la

fraccin gamma de las protenas del suero. Desde entonces se han diseado diferentes mtodos para la
obtencin de esta fraccin srica.
Los anticuerpos pueden purificarse por mtodos especficos e inespecficos. Los mtodos
especficos se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con sus antgenos. As,
los anticuerpos pueden ser precipitados por la adicin del antgeno en estado soluble, o ser adsorbidos
al antgeno previamente insolubilizado. En ambos casos, el complejo resultante puede disociarse por
modificacin del pH a valores entre 2.5 y 4.0 9.5 y 11.0, o bien por aumento en la concentracin de
sales o la concentracin del antgeno soluble. Despus, los anticuerpos se recuperan por alguno de los
mtodos de separacin inespecfica.
Las separaciones inespecficas estn basadas en las propiedades fisicoqumicas de los
anticuerpos. Entre estos mtodos, los ms utilizados son la precipitacin con etanol, con sulfato de
amonio o sulfato de sodio, electroforesis en diversos soportes (papel, acetato de celulosa, gel de
almidn, etc.), cromatografa de intercambio inico y filtracin en tamices moleculares.
Uno de los mtodos inespecficos ms empleados de purificacin de gamma globulina es la
precipitacin con sulfato de amonio a una concentracin final de 33%. Generalmente, se considera que
con tres precipitaciones se obtiene una gamma globulina con un alto grado de pureza.
La precipitacin de la gamma globulina por este mtodo se debe al fenmeno conocido como
"salting out", el cual consiste en que las molculas de agua que solvatan a la molcula de anticuerpo
son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que adems neutralizan los grupos cargados de la
protena, con lo que se insolubiliza y precipita.
REACCIONES DE PRECIPITACIN.
La inmunoprecipitacin se presenta cuando antgenos solubles y polivalentes se combinan con su
anticuerpo especfico (antisuero homlogo) y da lugar a complejos insolubles que son visibles y
cuantificables.

La facilidad de combinacin del antgeno con el anticuerpo depende de varios factores como
son el pH, fuerza inica, temperatura, tiempo, y sobre todo, las concentraciones relativas de antgeno y
anticuerpo.
Los complejos antgeno-anticuerpo insolubles forman una red tridimensional que debe ser
voluminosa para que pueda observarse, y los reactantes han de estar en proporciones adecuadas, ya que
el exceso de cualquiera de ellos conduce a un cierto grado de solubilizacin del agregado molecular;
este hecho se explica ya que la reaccin antgeno-anticuerpo est sujeta a la ley de accin de masas.
Reaccin de precipitacin en medio lquido.
Para llevar a cabo la reaccin, se mezclan cantidades crecientes del antgeno soluble con una cantidad
constante del anticuerpo especfico y se mide el precipitado resultante. En forma semicuantitativa se
estima la cantidad de precipitado formado, expresndolo en milmetros lineales. Cuantitativamente, el
precipitado se puede analizar mediante la determinacin del nitrgeno protenico en el mismo.
Si los resultados se presentan en forma grfica colocando en el eje de las abscisas la cantidad de
antgeno agregado y en el de las ordenadas la cantidad de precipitado, se obtiene una curva en forma de
campana.
No se observa formacin de precipitado a pequeas concentraciones de antgeno, pero conforme
aumenta la concentracin de ste, comienza a formarse un precipitado que va en aumento gradual hasta
llegar aun mximo, despus del cual comienza a disminuir en cantidad an cuando la concentracin de
antgeno siga aumentando. Al analizar el contenido del sobrenadante despus de centrifugar y eliminar
el precipitado, es posible evidenciar la presencia de anticuerpo libre en la regin ascendente de la curva
(zona de exceso de anticuerpo) o de antgeno libre en la regin descendente de la misma (zona de
exceso de antgeno). En la regin central de la curva donde ocurre la mxima precipitacin, no hay ni
anticuerpo ni antgeno libres, ya esta regin se le denomina zona de equivalencia.
Reacciones de precipitacin en medio semislido.
Las reacciones de precipitacin en medios semislidos, llamadas inmunodifusin en gel, han
aumentado una nueva dimensin al poder resolutivo de estos mtodos, ya que permiten identificar
individualmente cada constituyente de una mezcla de antgenos y anticuerpos, as como su
cuantificacin por comparacin con sistemas conocidos. Este poder de resolucin es mayor si se
combina con la electroforesis.
La velocidad de difusin de los reactantes depende de las propiedades fsicas e
inmunoqumicas del sistema, como son la concentracin, el tamao y la forma de las
molculas as como la viscosidad del medio. El nmero de bandas observadas representa
el nmero mnimo de sistemas antgeno-anticuerpo existentes en el medio.

Las tcnicas de difusin en gel pueden clasificarse en difusin simple y difusin doble.
Inmunodifusin simple o radial (Mancini). En este mtodo slo uno de los reactivos
(generalmente el antgeno) difunde radialmente desde un pozo perforado en el agar en el cual ya est
embebido el otro reactivo (generalmente el anticuerpo). En la cercana del pozo, el antgeno est en una
concentracin relativamente alta y forma complejos solubles; conforme el antgeno difunde, la
concentracin va disminuyendo hasta un punto en que ambos reactivos alcanzan concentraciones
equivalentes y entonces se forma un halo de precipitacin. Cuanto ms alta sea la concentracin de
antgeno mayor ser el dimetro del halo. Esta prueba se puede realizar de manera cuantitativa si se
agregan concentraciones conocidas del antgeno de prueba, de tal manera que se pueda construir una
curva de calibracin.
Este mtodo se emplea rutinariamente para cuantificar inmunoglobulinas, complemento,
factores de coagulacin, transferrina, alfafetoprotena, entre muchos otros componentes.

Inmunodifusin doble (Ochterlony). Este mtodo se basa en el principio de que el antgeno

y el anticuerpo difunden a travs de un medio semislido y forman complejos inmunes estables que
pueden ser analizados visualmente.
El mtodo permite identificar sistemas antgeno-anticuerpo mltiples, establecer la posible
relacin inmunolgica entre dos antgenos y hacer estimaciones gruesas sobre la pureza del antgeno o
del anticuerpo. Es posible emplear tambin este mtodo para el anlisis semi cuantitativo de la
concentracin de antgeno, o para conocer el ttulo precipitante de un antisuero. Su principal desventaja
es su relativamente baja sensibilidad (1 mg/l00 mL).

MATERIALES.
Material por grupo:
Adyuvante completo e incompleto de Freund.
Agitador magntico.
Agitador Vrtex.
Antgeno suficiente para inmunizar a los conejos de acuerdo a los protocolos de inmunizacin.
BaCl al 10% (5 mL).
Bao mara a 37C.
Base magntica.
Bote metlico de boca ancha.
Cajas para transporte de animales.
Centrfuga clnica.
Colorante para marcar los animales.
Conejos suficientes para obtener la cantidad de antisuero segn las necesidades del curso.
Charola con solucin de benzal.
Jaulas para ratones.
Matraz Erlenmeyer de 2 L.
Mechero Bunsen.
Solucin de timerosal al 1 % (10 mL)
Solucin salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8.
Tripie.
Material por equipo:
2 tubos
Agar nutritivo.
Agarosa tipo II, medium EEO (Sigma Chemical).
1 fco
Alcohol al 70% con torundas de algodn.
0.5 mL
Antgeno soluble.
0.3 mL
Antisuero.
10 pzas
Aplicadores de madera.
Caja de Petri de 15 x 100 mm.
1 tubo
Caldo nutritivo.
2 tubos
Caldo tioglicolato con aceite mineral.
1 pza
Frasco Gerber.
1 pza
Gradilla con plastilina.
1 pza
Gradilla para tubos de ensaye de 10 x 75 mm.
1 pza
Gradilla para tubos de ensaye de 15 mm de dimetro.

10 cm

1 pza
1 pza
1 pza
1 pza
5.0 mL
1 pza
5 pzas
1 pza
4 pza
2 pza
3 pzas

1 tubo
200 mL
2 mL
50 mL
20 mL
10 mL
10 mL
16 pzas
2 pzas
14 pzas
5 pzas
4 pzas
2 pzas

Hilo grueso.
Horadador de 3 mm de dimetro
Jeringas estriles de 1.0 mL con agujas de 22 x 32 mm.
Jeringas estriles de 1.0 mL con agujas de 25 x 16 mm.
Jeringas estriles de 10 mL con agujas de 20 x 25 mm.
Jeringas estriles de 20 mL con agujas de 20 x 25 mm.
Lmpara.
Matraz Erlenmeyer de 125 mL.
Matraz Erlenmeyer de 25 mL.
Mechero Bunsen.
NaOH 2 N.
Papel absorbente.
Papel indicador de pH.
Pinza de diseccin
Pipeta Pasteur estriles, y bulbo de hule.
Pipeta serolgica de 1.0 mL.
Pipeta serolgica de 10 mL, de punta ancha.
Pipeta serolgica de 5.0 mL.
Pipetas de 5.0 mL, estriles.
Portaobjetos limpios y desengrasados.
Regla graduada en milmetros.
Rejilla de asbesto
Semilla de Salmonella typhimurium.
Solucin de salina al 0.85% (SS), pH 7.8, estril.
Solucin de timerosal al 1 %.
Solucin salina con 0.3% de formaldehdo, estril.
Solucin sobresaturada de sulfato de amonio.
SSRB.
Suero.
Tripi metlico
Tubo capilar.
Tubo cnico de 15 mL, graduados.
Tubo de ensaye de 10 x 75 mm.
Tubo de ensaye de 13 x 100 mm. con tapn de rosca, estriles.
Tubo de ensaye de 15 x 125 mm.
Tubo para dilisis.
Vaso de precipitados de 250 mL.

METODOLOGA:
A. Obtencin del antgeno "H".
Precaucin: trabajar en condiciones de esterilidad.
1. Seleccionar formas mviles de Salmonella typhimurium y sembrarlas en un tubo con caldo
nutritivo. Incubar a 37C durante 18 a 24h.
2. Agregar al cultivo solucin de formaldehdo hasta una concentracin final de 0.3%.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 24 a 48 h.

4. Cosechar el cultivo por centrifugacin a 3000 rpm durante 15 min.

5. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano en solucin salina formalinizada al
0.3%, con el objeto de fijar qumicamente los componentes microbianos, hasta igualar la turbidez
con la del tubo No.3 del nefelmetro de McFarland.
6. Probar la esterilidad del producto sembrando dos gotas en un tubo con agar nutritivo y en un tubo
con caldo tioglicolato, incubando los tubos a 37C durante 24 horas.
7. Mantener la suspensin en refrigeracin hasta su uso.
B. Obtencin del antgeno O".
Precaucin: trabajar en condiciones de esterilidad.
1. Cosechar el crecimiento de Salmonella typhimurium obtenido en un tubo con agar inclinado,
agregando 2.0 mL de SS, y agitar vigorosamente hasta tener una suspensin homognea.
2. Pasar la suspensin a un tubo de ensaye estril con la ayuda de una pipeta Pasteur estril.
3. Colocar el tubo en un bao mara a ebullicin durante 90 min.
4. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min.
5. Desechar el sobrenadante y re suspender el paquete bacteriano en solucin salina formalinizada al
0.3%, hasta igualar con la turbidez del tubo No.3 del nefelmetro de McFarland.
6. Probar la esterilidad del producto sembrando dos gotas en un tubo con agar nutritivo y en un tubo
con caldo tioglicolato, incubando los tubos a 37C durante 24 horas.
7. Mantener la preparacin antignica en refrigeracin hasta su uso.
C. Sangrado de oreja del conejo.
1. Localizar la arteria central de la oreja y limpiar con una torunda con alcohol.
2. Sangrar al conejo con una jeringa de 5 mL con aguja de 20 x 25 mm.
3. Obtener la cantidad necesaria de sangre, retirar la aguja y presionar el sitio de la puncin con un
algodn.
D. Sangrado de corazn.
Esta tcnica se utiliza en conejos y cobayos, fundamentalmente, cuando se pretende
sangrar en blanco al animal.

1. Sujetar al conejo o al cobayo de las cuatro patas, colocndolo con el trax hacia arriba, como lo
indique su profesor.
2. Tocar con la mano la zona del trax para localizar el corazn con el tacto.
3. Limpiar con una torunda la zona del trax.
4. Proceder a hacer la puncin con una jeringa de 20 mL con una aguja de 20 x 32 mm.
Nota: Si una vez que se introdujo la aguja no est en una cavidad del corazn, sacarla y volverla a
introducir nuevamente, ya que si se mueve la aguja en el interior del trax se corre el riesgo de
desgarrar el tejido cardiaco y/o pulmonar ocasionando la muerte del animal.
E. Obtencin de suero.
1. Disgregar el cogulo con un aplicador de madera.
2. Incubar la sangre a 37C durante 30 -60 min. para permitir la retraccin del cogulo.
3. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. y recuperar el suero.
4. Guardar el suero en congelacin hasta su uso.
INMUNIZACIN DE CONEJOS.
F. Inmunizacin va intravenosa.
1. Colocar al conejo en el cepo.

2.
3.
4.
5.

Localizar las venas marginales de la oreja del animal.

Sujetar bien la oreja con los dedos medio y anular.
Limpiar la zona de inmunizacin con alcohol al 70%.
Proceder a inyectar al animal. Si se va a llevar acabo una serie de inmunizaciones, es recomendable
comenzar en el extremo de la oreja ms alejado de la cabeza y se procede a inyectar hacia la base
de la oreja.

G. Inmunizacin va subcutnea.
1. Elegir la zona de inoculacin, cortar el pelo del animal con tijeras y limpiar con una torunda.
2. Levantar ligeramente la piel del conejo e introducir la aguja lateralmente, aproximadamente una
tercera parte de sta, y depositar el antgeno. No debe formarse ppula en el sitio de la inoculacin.
H. Inmunizacin va intradrmica.
1. Rasurar el lomo del animal.
2. Introducir la aguja de 22 x 32 mm en la dermis del animal con el bisel hacia arriba. Una vez dentro
de la piel, girar 180 y depositar el inculo. En el sitio de la inoculacin se debe observar la
formacin de una ppula.
PROTOCOLOS DE INMUNIZACIN.
I. ANTGENOS P ARTICULADOS.
Antgenos bacterianos.
Utilizar antgenos "H" y "O" de Salmonella typhimurium ajustados a una concentracin equivalente al
tubo No.3 del nefelmetro de McFarland (aproximadamente 900 millones de bacterias/mL de
suspensin). Inmunizar de acuerdo al siguiente protocolo:
Protocolo de inmunizacin de antgenos bacterianos particulados
Inyeccin No. Tiempo (das)
Fecha
Dosis
Va
Notas
1
0
0.5 mL
IV
2
4
1.0 mL
IV
3
8
2.0 mL
IV
4
12
3.0 mL
IV
Sangrado
18
Titular los antisueros con los antgenos respectivos. En general, los ttulos de 1:640 o mayores son los
adecuados para el antgeno somtico "O", y para el antgeno "H" de 1:5000 o mayores. En caso de que
se obtengan ttulos menores a los sealados, se recomienda administrar una quinta dosis de 3 mL al
cuarto o sexto da despus del sangrado. Efectuar un nuevo sangrado seis das despus de la
reestimulacin.
J. ANTGENOS SOLUBLES.
Protenas solubles.
Utilizar fracciones sricas como albmina y gamma globulina.
Protocolo de inmunizacin para antgenos solubles.
Inyeccin Tiempo Fecha
Dosis
Disolvente
No.
(das)
1
0
5 mg
1.0 mL de SS, emulsificados con 1.0 mL
de adyuvante completo de Freund

Va
ID en sitios
mltiples

15

3
4
5
Sangrar

30
31
32
39

5 mg

1.0 mL de SS, emulsificados con 1.0 mL

de adyuvante incompleto de Freund
0.25 mg SS
0.50 mg SS
1.0 mg SS

ID en sitios
mltiples
IV
IV
IV

K. Precipitacin de gamma globulina con sulfato de amonio.

1. Ajustar a 7.8 el pH de la solucin saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N.
2. Adicionar a un volumen de suero, contenido en un tubo cnico, medio volumen de la solucin
sobresaturada de sulfato de amonio, LENTAMENTE y CON AGITACIN CONSTANTE. De esta
forma, el sulfato de amonio queda a una saturacin final del 33%.
3. Continuar con la agitacin durante 10-15 min. despus de terminar la adicin del sulfato de amonio.
4. Centrifugar los tubos a temperatura ambiente a 3500 rpm durante 15 min.
5. Disolver el sedimento en SS pH 7.8, hasta alcanzar el volumen original del suero.
6. Repetir los pasos 2, 3, 4 y 5.
7. Repetir nuevamente los pasos 2, 3 y 4.
8. Disolver en SSRB el sedimento despus de la ltima centrifugacin hasta alcanzar la mitad o un
tercio del volumen original del suero.
9. Dializar contra SSRB en fro (4C) y con agitacin, durante 3-5 das, realizando 2 cambios diarios
de solucin de dilisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio. Para saber si
efectivamente se elimin al sulfato de amonio, a 5.0 mL de la solucin de dilisis se le agregan
unas gotas de cloruro de bario al 10%. La dilisis se considera completa si ya no se observa la
formacin de un precipitado blanco de sulfato de bario.
10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en fro a 2500 rpm durante 10 min.
para eliminar el precipitado que se hubiera formado.
11. Determinar la concentracin de protenas por colorimetra o espectrofotometra.
12. Agregar a la preparacin de gamma globulina, timerosal hasta una concentracin final del 0.01 %, y
conservarla en refrigeracin o congelacin.
13. Comprobar la pureza del producto por inmunoelectroforesis.
REACCIN DE PRECIPITACIN EN MEDIO LQUIDO.
L. Precipitacin en capilar.
1. Hacer una serie de diluciones dobles del antgeno en tubos de 10 x 75 mm de la siguiente manera:
depositar 0.2 mL de SS en 10 tubos de ensaye. Al primer tubo agregar 0.2 mL de la solucin
concentrada del antgeno y mezclar. De este tubo tomar 0.2 mL y transferirlos al segundo tubo.
Mezclar y transferir 0.2 mL al tercer tubo, y as sucesivamente hasta el tubo 10.
2. Dividir los tubos capilares en tres partes iguales utilizando un marcador indeleble.
3. Llenar un tubo capilar con antisuero hasta la primera marca y limpiar el exterior del tubo con papel
absorbente para eliminar el antisuero adherido a las paredes externas del mismo.
4. Invertir el tubo capilar para hacer descender el antisuero hasta el borde del extremo contrario.
5. Tomar un volumen de antgeno de tal manera que el lquido dentro del capilar llegue hasta la
segunda marca. No debe haber burbujas en la interfase entre el antgeno y el antisuero. Limpiar la
parte externa del capilar con papel absorbente.
6. Mezclar el contenido por movimientos de rotacin e inversin repetidos del capilar. Centrar el
contenido del capilar, tapar uno de los extremos del mismo con el dedo ndice e introducir el
extremo contrario en una gradilla con plastilina.
7. Repetir los pasos 3, 4, 5 y 6 para cada una de las diluciones del antgeno.

8. Utilizar como testigos un tubo capilar conteniendo antisuero ms SS y otro conteniendo antgeno
sin diluir ms SS.
9. Mantener los tubos capilares a temperatura ambiente durante 24 a 48 h.
REACCIONES DE PRECIPITACIN EN MEDIO SEMISLIDO.
M. Inmunodifusin doble (Mtodo de Ochterlony).
1. Preparar 200 mL de una solucin de agarosa al 0.1% en SS. Disolver la agarosa por calentamiento.
Reponer el volumen perdido por evaporacin con agua destilada caliente. Sumergir los portaobjetos
cuando an est caliente la solucin de agarosa, escurrirlos y dejarlos secar (barnizado).
2. Preparar una solucin de agarosa al 1% en SS. Disolver la agarosa por calentamiento, reponiendo el
volumen perdido con agua destilada; adicionar timerosal hasta una concentracin final del 0.01 %.
Colocar los portaobjetos previamente barnizados y ya secos, en una superficie completamente
horizontal y con una pipeta serolgica de punta ancha depositar 4.0 mL de agarosa al 1% caliente
sobre cada uno de ellos. Dejar gelificar a temperatura ambiente y mantener los portaobjetos dentro
de una cmara hmeda hasta su uso.
3. Perforar la agarosa segn el molde proporcionado ms adelante y remover el gel del interior de las
perforaciones.
4. Llenar con el antisuero el pozo central y con los antgenos los pozos perifricos. Cuidar de que no
se derrame ninguno de los reactivos fuera de los pozos.
5. Incubar los portaobjetos en una cmara hmeda, usando una caja de Petri en cuya tapa se ha
colocado papel absorbente humedecido. Incubar a temperatura ambiente durante 24 a 48 h.

MANEJO DE LOS RESULTADOS.

Medir la cantidad de precipitado con la ayuda de una regla. Con los datos obtenidos completar la
siguiente tabla y hacer una grfica en papel milimtrico, anotando en el eje de las abscisas la
concentracin del antgeno y en las ordenadas la cantidad de precipitado en mm, y localizar las zonas
de exceso de anticuerpo, de antgeno y la de equivalencia.
Hacer un esquema de los resultados obtenidos identificando las bandas de identidad, de
identidad parcial y aquellas de no-identidad.

REFERENCIAS BILIOGRFICAS.

Campbell, D. H.; Garvey, J. S.; Cremer, N. E. y Sussdorf, D. H. 1970. METHODS IN IMMUNOLOGY. 2a.
ed. W. A. Benjamin. Editor.
Davis, B. D.; Dulbecco, R.; Eissen, H. N. y Ginsberg H. S. 1980. MICROBIOLOGY. 3a. ed. Harper & Row
Editores.
Hudson, L. y Hay, F.C. PRACTICAL IMMUNOLOGY. Editorial Blackwell Scientific Publications.
Kabat, E. A. y Mayer. M. M. 1968. INMUNOQUMICA EXPERIMENTAL. 1a. ed. La Prensa Mdica
Mexicana.
K1ein, J. 1991. IMMUNOLOGY. Blackwell Scientific Publications.
Roitt, I. M. 1997. ESSENTIAL IMMUNOLOGY. 9a. ed. Blackwell Scientific Publications.
Williams, C; Curtis, A. y Chase, M. W. 1967. METHODS IN IMMUNOLOGY AND
IMMUNOCHEMISTRY. Editorial Academic Press.

Prctica 5
PROTENAS TERAPUTICAS
Desde hace mucho tiempo se han aislando de la orina, sangre y otros tejidos, humanos y
animales, protenas teraputicas con mtodos bioqumicos tradicionales. As por ejemplo, la
insulina proveniente del pncreas del cerdo regula los niveles de glucosa en sangre de
diabticos tipo l. Sin embargo los tratamientos con protenas animales que presentan
diferencias con respecto a las humanas pueden provocar una importante respuesta
inmunitaria.
La diabetes mellitus es una enfermedad crnica caracterizada por la incapacidad del
individuo de metabolizar la glucosa de manera normal debido a una deficiencia parcial o total
de la hormona insulina, por lo que en algunos casos los pacientes diabticos pueden ser
controlados mediante la aplicacin de la insulina.
En Mxico toda la insulina es importada. Su consumo ha sido calculada en 1989 fue de 56
kg. Y para el ao 2007 se estimo entre 81 y 100 kg de esta hormona.
Extraccin de insulina proveniente de pncreas de cerdo.
1. Pesar 30 9 de pncreas de ( de preferencia neonato) ganado y adicionar 100 m I de
buffer modificado
Buffer modificado. 75 m I de metanol, 25 m I de agua destilada, y 1 m I de cido
clorhdrico concentrado
2. Incubar por tres horas a 35C en agitacin.
3. Eliminar el tejido mediante filtracin con doble capa de gasa. De ser necesario filtrar con
papel filtro.
4. Con el tejido recuperado realizar nuevamente la extraccin con 100 m I de buffer
modificado durante 1 hora en las miasmas condiciones.
5. Juntar los dos extractos.
6. Adicionar hidrxido de sodio concentrado hasta obtener un pH en el lmite del alcalino o
hasta que se forme un precipitado. Centrifugar, eliminar el precipitado y medir el volumen
de sobrenadante.
7. En tubos de centrifuga de 50 m I colocar 100 ml sobrenadante.
8. La insulina se precipita mediante la adicin de 1 m I de metanol y 25 m I de ter.
9. Incubar la mezcla en el refrigerador por 12 h
10. Centrifugar y el precipitado (insulina) ser liofilizado
11. Generalmente se logran obtener en promedio 15 mg