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Departamento de Microbiologia

Instituto de Cincias Biolgicas


Universidade Federal de Minas Gerais
http://www.icb.ufmg.br/mic/diaadia

Diagnstico Laboratorial das Infeces Virais


Introduo

A anlise do histrico e dos sintomas apresentados pelos pacientes fornece as primeiras


indicaes para o diagnstico de uma infeco viral. Os exames laboratoriais so realizados
para confirmar o diagnstico pela identificao do agente viral da infeco, determinar a
terapia antiviral mais adequada, definir a evoluo da doena e monitorla
epidemiologicamente.
Existem diferentes mtodos que permitem o estudo dos vrus, dentre eles os mais comuns so
os que utilizam culturas celulares para observar os efeitos citopticos (ECPs), a purificao de
partculas virais, a observao da morfologia viral e de seus componentes (protenas e cidos
nuclicos) e os testes sorolgicos. Podem tambm ser utilizadas tcnicas moleculares para a
deteco do agente viral. A escolha do mtodo depende do tipo do espcime, do custo para
sua realizao, da rapidez necessria do diagnstico e do tempo de evoluo da doena.
Coleta de Material

No caso das infeces virais agudas, quando se deseja detectar elementos da partcula viral,
as amostras destinadas ao exame devem ser colhidas precocemente, antes que o vrus deixe
de ser liberado. Alm disso, os anticorpos produzidos em resposta a infeco podem bloquear
a deteco do vrus. De modo geral, os espcimes clnicos de quadros respiratrios devem ser
colhidos nos primeiros dias aps o incio dos sintomas. Nas infeces intestinais, onde a
excreo de vrus pelas fezes em geral mais prolongada, a coleta pode ser feita nas trs
semanas que se seguem ao aparecimento da diarria.
As amostras dos vrus da herpes simples (HHV1) e da varicelazoster (HHV3) devem ser
isoladas, a partir das leses, antes de se completarem cinco dias do incio dos
sintomas.Quanto menor o tempo entre a coleta da amostra e seu envio ao laboratrio, maiores
as chances de isolamento dos vrus. Os vrus podem ser cultivados em cultura celulares, ovos
embrionados e animais experimentais. Na tabela 1 esto listados alguns exemplos de
materiais comumente analisados em laboratrios.
Purificao de Partculas Virais

O material a ser estudado geralmente consiste em grandes volumes de meio de cultura de


tecido, lquidos orgnicos ou clulas infectadas. A purificao consiste na eliminao de
material de natureza no viral e pode ser obtida por vrios mtodos. A primeira etapa de
purificao envolve a concentrao de partculas virais por precipitao com sulfato de amnio,
etanol ou polietilenoglicol ou ainda por ultrafiltrao.

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Depois de concentrados, os vrus podem ser separados do material do hospedeiro por meio de
centrifugao diferencial, centrifugao com gradiente de densidade, cromatografia em coluna
ou eletroforese. Podese tambm utilizar antisoros especficos para remover partculas virais
do material do hospedeiro.
Tabela 1 Materiais analisados em laboratrios

Local de retirada
do material

Patgenos virais mais comuns

Amostras para cultura

Trato respiratrio

Adenovirus,Influenza,Enterovirus,Rinovi Lavado nasal, swab farngeo,


rus, Paramixovirus, Vrus da Rubola e swab nasal e escarro
HHV1

Trato
gastrintestinal

Reovirus,
Rotavirus,
Norwalk virus e Calcivirus

Exantema
maculopapular

Enterovirus (Picornavirus) e Adenovirus Swab da garganta e swab retal


Urina
HHV1, HHV3, Vrus da Caxumba e
vrus do sarampo

Exantema
vesicular

Adenovirus e HHV5

Liquidos
de
vesiculas,
raspados ou swabs

Sistema nervoso
central (meningite
assptica e
encefalite)
Trato urinrio
Sangue

Arbovirus
Enterovirus (Picornavirus)
Vrus da Raiva
Coxsackievirus, Ecovirus, HHV1
Vrus da Rubola e Vrus do Sarampo
HIV, Vrus da Leucemia de clulas T
humana e Vrus da hepatite B, C e D.

Lquido cefalorraquidiano
Fezes
Tecido, saliva. Bipsia cerebral
Lquido cefaloraquidiano
Urina
Sangue

Adenovirus, Fezes e swab retal

Isolamento e Cultivo de Vrus


1. Ovo Embrionado

O isolamento do vrus se faz, normalmente, em culturas celulares e o diagnstico pode ser


caracterizado pelo efeito citoptico observado nessas culturas. Os ECPs incluem alteraes
na morfologia celular, lise celular, formao de vacolos, sinccios e corpsculos de incluso.
Um dos problemas no uso de culturas celulares para o isolamento de vrus a escolha do tipo
de clula que melhor atenda a essa finalidade. importante conhecer o tecido ou hospedeiro
do qual o vrus foi isolado, para que seja cultivado em clulas semelhantes.
Existem mtodos de deteco de vrus em cultura que no so utilizados para a observao
de ECPs, visto que enzimas e outras protenas que so produzidas durante a replicao,
podem ser detectadas por meios bioqumicos (Imunohistoqumica), imunolgicos
(Imunofluorescencia) e de biologia molecular (PCR).
2. Ovo Embrionado

O uso de ovos embrionados para cultivo de vrus se aplica ao desenvolvimento de algumas


vacina, como a do Influenza vrus, mas em laboratrios clnicos essa tcnica vem sendo
substituda por culturas de clulas.
.
3. Animais de Laboratrio

A utilizao desta tcnica, atualmente, est direcionada principalmente para o estudo da


oncognese viral, e para o isolamento dos vrus Coxsackie A e B.
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O camundongo recmnascido o animal utilizado no estudo desses vrus, podendo a


inoculao do espcime clnico ser feita por via subcutnea ou intracerebral.
Tcnicas de Identificao Viral
1. Microscopia Eletrnica

Havendo partculas virais suficientes, a microscopia eletrnica pode ser usada em laboratrios
clnicos, embora no seja uma tcnica padro. Tem sido utilizada tambm para localizar
antgenos virais em culturas celulares (microscopia imunoeletrnica), empregando anticorpos
marcados por substncias de alta opacidade aos eltrons. A ferritina foi a primeira substncia a
ser utilizada por possuir devidas qualidades de opacidade e no alterar a atividade imunolgica
das globulinas. Sua aplicao virologia humana permite a identificao, em culturas
celulares, de poliovrus, adenovrus, vrus da influenza A e B, herpesvrus, vrus da caxumba e
parainfluenza. Outras substncias tambm podem ser utilizadas, como os metais pesados e
algumas enzimas (peroxidase e fosfatase cida).
2. Testes Sorolgicos

Os estudos sorolgicos so usados para identificao, deteco e quantificao de antgenos


virais difceis de serem isolados e cultivados em culturas de clulas, bem como para avaliar a
resposta do anticorpo infeco.
A sorologia pode ser utilizada para: identificao de vrus e sua cepa ou sorotipo diferenciar
doenas agudas de crnicas determinar se uma doena primria ou uma reinfeco.
Os complexos antgenoanticorpo podem ser diretamente detectados por tcnicas de
precipitao ou marcandose o anticorpo com uma sonda radioativa, fluorescente ou de
enzima ou podem ser detectadas indiretamente atravs da medio de uma reao dirigida ao
anticorpo, tal como a fixao do complemento.
2.1. Pesquisa de Anticorpos Sricos

o mtodo mais utilizado no diagnstico virolgico, mas seus resultados apenas so aceitos
quando se baseiam em ttulos de IgG no soro convalescente, os quais devem ser, pelo menos,
quatro vezes superiores aos ttulos dos soros da fase aguda da doena. Podese tambm
recorrer pesquisa de anticorpos de classe IgM, que normalmente esto presentes em
infeces recentes.
2.2. Teste de Fixao do Complemento (FC)

O teste de fixao do complemento um teste tradicional para a demonstrao de antgenos


infecciosos e anticorpos. Requer vrios reagentes e numerosas etapas preparatrias.
Nesse teste a amostra do soro do paciente reage com um antgeno sinttico e com um
complemento extra. Os complexos antgenoanticorpo se ligam, ativam e fixam o complemento.
O complemento residual ento medido atravs da lise dos eritrcitos cobertos com anticorpo.
2.3. Reaes de Inibio de Hemaglutinao (HAI)

Esse teste pesquisa anticorpos com base no seu reconhecimento e ligao ao vrus. O HAI
usado para identificao de vrus que podem aglutinar seletivamente eritrcitos de diversas
espcies animais. Podese determinar a identidade do vrus ou dos anticorpos no soro de um
paciente por inibio especfica dessa hemaglutinao.

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A reao de hemaglutininas virais com hemcias ocasiona um retculo de clulas aglutinadas


que se depositam de maneira irregular num tubo ou poo de microtitulao. As clulas no
aglutinadas se depositam num boto compacto. Essa reao mais comumente utilizada para
o diagnstico de infeces produzidas por ortomixovrus, paramixovrus e arbovrustogavrus
(incluindo rubola), flavivrus e bunyavrus.
2.4. Neutralizao

Assim como o HAI, o teste de neutralizao pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos com
base em seu reconhecimento e ligao ao vrus. O revestimento do vrus por anticorpos
bloqueia sua ligao as clulas indicadoras. A neutralizao envolve a inibio, pelo anticorpo,
da infeco e dos efeitos citopatolgicos do vrus em clulas de cultura e de tecidos.
Uma resposta de neutralizao por anticorpos especfica para o vrus e a cepa, sendo
frequentemente desenvolvida com o incio dos sintomas e persistindo por longos perodos.
Algumas das desvantagens dessa reao so o tempo prolongado para se obter os resultados,
as reaes cruzadas existentes entre vrus antigenicamente relacionados, e a necessidade de
grande nmero de culturas celulares para proceder titulao dos soros a testar, uma vez que
deve ser feita em duplicata ou triplicata.
2.5. Hemadsoro (HAD)

O teste de hemadsoro o mtodo mais simples para identificao de ortomixovrus ou


paramixovrus. Entre os vrus que provocam a aglutinao de hemcias, os ortomixovrus e os
paramixovrus maturam na membrana plasmtica das clulas infectadas. Como brotam da
clula, inseremse na membrana hemaglutininas virais especficas.
A presena de clulas infectadas em uma monocamada pode ser detectada pela aderncia das
hemaglutininas. importante incluirse como controles monocamadas noinfectadas.
2.6. Ensaio Imunoenzimtico (EIE)

O Ensaio Imunoenzimtico permite quantificar os nveis de anticorpos pela intensidade da


colorao resultante da reao do conjugado enzimtico, feito com uma antimunoglobulina
ligada a uma enzima, com um substrato especfico. A intensidade de cor obtida, em termos de
densidade ptica (DO) proporcional ao ttulo de anticorpos. Essa reao de alta
sensibilidade, permitindo a titulao do IgM e IgG, separadamente, desde que se use
conjugados especficos. Usase o EIE para dosagem de anticorpos no sarampo, caxumba,
diarria por rotavrus, infeces por citomegalovrus, adenovrus, e nas hepatites A, B e C,
Rubola, HTLV e HIV1
.
2.7. Radioimunensaio (RIE)

O Radioimunensaio baseiase num princpio semelhante ao do EIE, com a diferena de que o


conjugado no enzimtico, mas preparado com o composto radioativo Iodo125. Dessa
forma, o anticorpo e o antgeno radiomarcado so utilizados para quantificar complexos
antgenoanticorpo. O RIE pode ser realizado por ensaio de captura ou de competio. No
ensaio de competio, o anticorpo no soro do paciente quantificado de acordo com sua
capacidade de competir com um anticorpo marcado e formar complexos antgeno anticorpo.
Estes complexos so precipitados e separados do anticorpo livre e a radioatividade das duas
fraes medida. Inicialmente foi utilizado na titulao de anticorpos nas hepatites A e B, e
hoje, tem aplicao no diagnstico de diversas infeces.

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Tabela 2 Tcnicas de Identificao e respectivos patgenos

Tcnicas
Patgenos Usualmente Identificados
Microscopia eletronica e Poliovirus, Parainfluenza, Vrus Respiratrio Sincicial, Vrus do
imunoeletromicroscopia
herpes simples.
Imunofluorescencia

Rinovirus, Influenza, Parainfluenza, Vrus do herpes simples,


Vrus do Sarampo

Ensaio imunoenzimtico

Rotavirus, Vrus Respiratrio Sincicial, Vrus da Hepatite A, Vrus


da Hepatite C, Rubola, HTLV, HIV1.

Radioimunoensaio

Rotavirus

2.8. Imunoabsorvente ligado a enzimas (ELIZA)

A tcnica utiliza antgeno imobilizado em uma superfcie plstica, prolas ou filtro para capturar
e separar o anticorpo especfico de outros anticorpos no soro do paciente. Um anticorpo
humano covalentemente ligado a uma enzima (por exemplo, peroxidase, fosfatase alcalina)
detecta anticorpo do paciente que se ligou ao antgeno. Esta reao quantificada no
espectrofotmetro de acordo com a intensidade da cor produzida pela ao da enzima sobre o
substrato apropriado. As diversas variaes do ELISA nos mecanismos de captura ou
deteco do antgeno.
3. Tcnicas Moleculares
3.1. Reao em Cadeia de Polimerase (PCR)

Atravs da PCR possvel amplificar uma seqncia especfica de DNA, obtendose


quantidade suficiente que permita detectar e analisar a seqncia alvo do estudo. Anlises
baseadas na PCR possibilitaram aos profissionais de laboratrio detectar microrganismos que
no podiam ser cultivados, assim como aqueles que eram fastidiosos e/ou de crescimento
lento. A PCR com transcriptase reversa permite detectar vrus de RNA e medir resposta
gentica (isto , o RNAm) de microrganismos e clulas eucariotas a diversos estmulos.
3.2. Eletroforese em Gel

Eletroforese em gel uma tcnica que envolve a migrao de molculas em um determinado


gel durante a aplicao de uma diferena de potencial. As molculas so separadas de acordo
com o seu tamanho, pois as de menor massa iro migrar mais rapidamente que as de maior
massa. Em alguns casos, o formato das molculas tambm influi, pois algumas tero maior
facilidade para migrar pelo gel. As protenas virais podem ser separadas por eletroforese, e
seus padres podem ser usados para identificar e distinguir diferentes vrus.
3.3. Sequenciamento Genmico

um mtodo que vem sendo bastante utilizado j que permite uma identificao precisa do
organismo em estudo, atravs da elucidao de seu genoma. Entretanto, sua utilizao no
muito difundida, uma vez que os custos da tcnica so altos e so necessrios profissionais
qualificados.

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Referncias Bibliogrficas

KONEMAN, Elmer W. Diagnstico microbiolgico: texto e atlas colorido. 6. ed. Rio de Janeiro.
Editora Guanabara Koogan. 2008.
MURRAY, Patrick R ROSENTHAL, Ken S PFALLER, Michael A. Microbiologia mdica. 6. ed.
Rio de Janeiro. Edotira Elsevier. 2008.
TRABULSI, Luiz Rachid ALTERTHUM, Flvio. Microbiologia. 5 ed. So Paulo. Editora:
Atheneu. 2008.

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