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Departament de Biotecnologia
Cuando el objeto de nuestro estudio son las asociaciones celulares de los organismos
clasificados como metafitas y metazoos, las imgenes observadas con el microscopio
(Figuras 2 y 3) las denominamos imgenes histolgicas, dndole el nombre de objetos
histolgicos a los componentes microscpicos de donde las imgenes proceden (rganos,
tejidos y clulas). Para obtener imgenes histolgicas, a partir de objetos histolgicos, es
preciso someter a estos ltimos a un conjunto de procedimientos de laboratorio que
denominaremos tcnica histolgica.
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Entre los mtodos que se ocupan de estudiar a los organismos como individuos, se
distinguen dos formas diferentes (Cuadro 2 y Figura 5), segn recaigan sobre el individuo
ntegro y vivo (Mtodos holsticos o estudios "in vivo") o sobre partes aisladas del
individuo (Mtodos reduccionistas).
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Figura 5: La Biologa estudia los organismos como individuos (A) o como comunidades (B). El
estudio de los individuos puede ser holstico (A) o reduccionista (C). Disciplinas como la ecologa,
la epidemiologa o la biogeografa, estudian comunidades mientras que la anatoma, bioqumica,
fisiologa, histologa, etc. estudian individuos tanto desde el punto de vista holista (A) como
reduccionista (C).
Cuadro 2: Mtodos y tcnicas generales para el estudio de
los organismos (De Juan, 1999)
_______________________________________________
Mtodos holsticos o estudios in vivo
1) Gota pendiente
2) Transiluminacin
3) Cmaras transparentes
4) Injertos blefoblsticos
5) PET (Tomografa por Emisin de Positrones)
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celulares, etc.
- Separacin por maceracin: separacin de componentes tisulares por la accin de
determinados lquidos como el alcohol, el hidrxido de potasio, la solucin de Mller, etc. agua,
micromanipuladores, etc.). Con esta tcnica se pueden aislar estructuras microscpicas
complejas como las nefronas del rin.
- Disociacin o digestin enzimtica: en otras ocasiones la separacin de los
componentes de un tejido u rgano puede ser realizada mediante la utilizacin de enzimas
como la pepsina, la tripsina, la papaina, etc.
Tcnica del frotis ("smear") y de la impronta (Lamina 1, Figuras 12 y 13) la
extensin o frotis, frottis en frances) consiste en extender, sobre un portaobjetos, una gota de
una solucin en la que se encuentran suspendidos elementos celulares (sangre, bacterias,
espermatozoides, etc.), para su observacin con el microscopio. La impronta consiste en poner
en contacto la superficie de corte de un rgano (por ejemplo un ganglio linftico) con la
superficie del portaobjetos, de esta forma una fina capa de clulas queda adherida a la
superficie de este para su observacin al microscopio. Una vez realizadas la extensin o la
impronta, las clulas pueden ser teidas con diferentes tcnicas segn convenga.
Tcnica del aplastamiento ("squash"): consiste en aplastar el objeto de estudio entre
el portaobjetos y el cubreobjetos. De esta forma se realiza a la vez una disociacin y una
extensin. Es una tcnica rudimentaria, pero rpida y til en algunos casos.
Tcnica de los cortes:
Consiste en obtener secciones muy finas del material objeto de estudio, para su
mejor observacin con los microscopios de transmisin, al pasar la luz o los electrones a travs
de ellos. Tambin son importantes el estudio de cortes de rganos ("slices") para analizar su
metabolismo, su composicin o para registrar, electrofisiolgicamente, las caractersticas de
sus clulas.
c) Atendiendo al estado vital de las clulas:
Figura 13: Atendiendo al estado vital de las clulas y tejidos extrados de un organismo tenemos diferentes formas de
estudiar el materia. El material extrado de un organismo vivo, es un material fresco que tiene un periodo de vida
denominado periodo supravital. Este periodo se puede prolongar colocando las muestras en soluciones fisiolgicas
(estudios in vitro) o mediante criopreservacin, congelando adecuadamente el material. Si el tejido ha superado el
periodo supravital, los estudios se denominan postvitales. Otra alternativa es fijar el material.
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Estudio en fresco: estudio del material biolgico, tal y como se obtiene del
organismo (fresco), sin fijar. Podemos distinguir diversas modalidades:
- Estudio supravital: realizado en material fresco, obtenido en el periodo supravital o
perodo de tiempo que media entre el momento que de un tejido deja de recibir aporte
sanguneo hasta su necrosis (Figura 13). Esto ocurre al morir un organismo o en la
separacin, accidental o quirrgica, de alguna de sus partes (extraccin de rganos,
amputaciones, etc.). En el periodo supravital, todava existe actividad metablica que puede
ser prolongada colocando la muestra en soluciones fisiolgicas (Ringer, Tyrode, Krebs, etc.).
Los estudios, en los que el material se mantiene "vivo" de ese modo, reciben el nombre de
estudios "in vitro" (cultivo de tejidos, cortes de rganos vivos, cortes de Warburg, etc.).
- Estudio postvital: Cuando los estudios se realizan sobre muestras en las que se ha
superado el periodo supravital, hablamos de estudios postvitales. Esto ocurre en piezas
anatmicas, separadas del organismo sin fijacin ni conservacin. Tambin en muestras de
organismos muertos recientemente (necropsias) o tras mucho tiempo despus del fallecimiento
(restos de carcter forense, arqueolgico, paleopatolgico o paleontolgico). En todos estos
casos, el material pude ser tratado de diferentes formas segn la informacin que deseemos
obtener de l (Figura 13).
Estudios en material fijado:
En este tipo de tcnicas, que por otra parte son las ms habituales en Histologa, el
material a estudiar es sometido a una serie de agentes qumicos y ocasionalmente fsicos para
detener los procesos de autolisis y putrefaccin, as como permitir la conservacin, lo ms
fidedigna posible, de la estructura real del objeto a estudiar con el microscopio.
2.2. Introduccin a la tcnica histolgica:
En la figura 14, se recogen muchos de los procedimientos o tareas que se pueden
llevar a cabo en la tcnica histolgica. De todos ellos los remarcados en rojos son los ms
habituales en los laboratorios de histologa y de anatoma patolgica y cuyas caractersticas
sern objeto de sta y de las siguientes prcticas.
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consecuencias.
e) Mezclas fijadoras: se da ese nombre a la combinacin de varios fijadores. Las
mezclas de aldehdos dan mejores resultados que los utilizados solos, sobre todo cuando se
selecciona con cuidado las proporciones adecuadas. Una mezcla tpica es la formada por
glutaraldehdo y paraformaldehdo. El ltimo penetra rpidamente y reacciona pronto,
mientras que el primero establece reacciones ms estables y eficientes. Son especialmente
tiles en microscopa electrnica e incluso en inmunocitoqumica electrnica.
Existen mezclas de aldehdos como glutaraldehdo y acroleina y otras no
aldehdicas como imidoesteres, lisina y carbodiimide.
B) Formas de realizar la fijacin qumica
La fijacin puede llevarse a cabo de dos maneras, bien introduciendo las piezas en el
fijador (fijacin por inmersin) o bien introduciendo el fijador dentro del sistema vascular del
animal en cuyo caso hablamos de fijacin por perfusin (Figura 15).
La perfusin vascular del fijador es el mtodo ideal para minimizar el dao fsico de
las piezas y obtener una fijacin uniforme en superficie y en profundidad. En la fijacin por
inmersin esta no es uniforme ya que se fijan primero las estructuras superficiales y luego las
profundas.
Figura 15: Fijacin por perfusin. Consiste en introducir el fijador en el rbol circulatorio del animal vivo y anestesiado.
De esta forma alcanza muy rpidamente hasta el ltimo rincn de sus clulas. Es la mejor tcnica para obtener buenas
imgenes en microscopa electrnica de transmisin.
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biolgicas, se utiliza como un medio para su conservacin durante largos periodos de tiempo
(criopreservacin). En este sentido, la congelacin se comporta como una forma de fijacin
alternativa y como veremos en otra prctica , como un modo de obtener cortes histolgicos.
La aplicacin de bajas temperaturas en el procesamiento de muestras biolgicas para
microscopa, se han desarrollado ampliamente (criometodos) en las ltimas dcadas, con la
finalidad de preservar lo mejor posible la estructura real o nativa del material y para
identificacin de molculas in situ.
Los mtodos histolgicos convencionales empleados para preparar muestras
biolgicas suponen un tratamiento agresivo de clulas y tejidos, en cuanto que son sometidos
a poderosos agentes fijadores qumicos, a deshidratacin con disolventes orgnicos a
temperatura ambiente, a inclusiones en resinas a altas temperaturas, etc. Todos estos
procedimiento, alteran profundamente la estructura de clulas y tejidos y modifican la
reactividad frente a marcadores de molculas.
En contraposicin, los criomtodos actuales conservan la reactividad qumica y
antignica de la muestra, mantiene la ultraestructura y los componentes celulares y tisulares
ms prximos a su estado nativo, lo que facilita el acceso de sondas y anticuerpos a sus
correspondientes substratos.
3.4. Caractersticas de una buena fijacin:
La fijacin debe realizarse siguiendo las siguientes reglas: Rapidez, volumen de
fijador adecuado, tiempo adecuado de fijacin, presin osmtica adecuada, manipulacin
delicada del material y tamao de la pieza:
a) Rapidez:
Consiste en no dejar pasar mucho tiempo desde la obtencin de la muestra o muerte
del organismo y la fijacin, para evitar cambios en la estructura debidos a la autolisis. La
fijacin por perfusin es ideal en este sentido.
b) Volumen de fijador adecuado:
Debe utilizarse una cantidad adecuada de fijador. La proporcin entre el volumen de
la pieza y del fijador debe ser de 1/12 a 1/20. El fijador debe baar toda la superficie de la
pieza y debe usarse tan solo una vez.
c) Tiempo adecuado de fijacin:
Deben evitarse largos tiempos de fijacin sobre todo en microscopa electrnica.
d) Presin osmtica adecuada:
El liquido fijador debe tener una presin osmtica adecuada que se puede calcular
con un osmmetro, mediante ensayo error o bien usando tablas al respecto.
e) Manipulacin delicada del material:
Las piezas deben tallarse y disecarse con finas tijeras o cuchillas de bistur o de
afeitar nuevas y con suaves y firmes movimientos para evitar producir grandes modificaciones
de la estructura microscpica.
f) Tamao de la pieza:
El tamao de la pieza debe ser lo ms pequeo posible sobre todo para microscopa
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electrnica (de 0.5 - 1mm ).
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LAMINA 1
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
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