LABORATRIO CLINICO .....................................................

2
Fase pr-analtica ........................................................ 2
Fase analtica ............................................................... 2
Fase ps-analtica ........................................................ 2
CONTROLE EGARANTIA DA QUALIDADE .......................... 2
Padronizao no laboratrio ....................................... 2
Padronizao dos processos pr-analticos ...................... 2
Padronizao dos processos analticos ............................ 2
Padronizao dos processos ps-analticos ..................... 3

ERROS EM EXAMES .......................................................... 4

Erros na etapa pr-analtica ........................................ 4
Erros na etapa analtica ............................................... 4
Erros na etapa ps-analtica ........................................ 4
COLETA DE SANGUE .......................................................... 4
TUBOS A VCUO............................................................... 5
Anlise bioqumica e sorolgica (tubo amarelo) ......... 5
Anlise hematolgica (tampa roxa) ............................ 5
Anlise glicmica (tampa cinza) .................................. 5
Anlise de coagulao (tampa azul) ............................ 5
HEMOGRAMA ................................................................... 5
Mtodo manual ........................................................... 6
Mtodos automatizados .............................................. 6
Contagem de eritrcitos e plaquetas ............................... 6
Dosagem de hemoglobina ................................................ 6
Contagem global de leucocitos ........................................ 7

ERITROGRAMA ................................................................. 7
ndices eritrocitomtricos ............................................ 7
Volume Corpuscular Mdio (VCM)................................... 8
Hemoglobina corpuscular mdia (HCM) .......................... 8
Concentrao da hemoglobina corpuscular mdica
(ChCM) ............................................................................. 8
RDW (red cell distribution width) ..................................... 8

Hematcrito ................................................................. 8
LEUCOGRAMA .................................................................. 8
Contagem diferencial................................................... 9
Esfregao sanguneo .................................................... 9
Colorao ..................................................................... 9
IMUNOLOGIA .................................................................... 9
TERMOS ......................................................................... 10
Afinidade e avidez...................................................... 10
Anticorpos policlonais e monoclonais ........................ 10
MTODOS SOROLGICOS .............................................. 10
Mtodo de aglutinao ............................................. 10
TESTE DE FLOCULAO .................................................. 11
Aglutinao de cristais de colesterol ......................... 11
ENSAIOS IMUNOENZIMTICOS (ELISA) .......................... 11
Mtodo imunoenzimticos para deteco de
anticorpos .................................................................. 11
Medida da avidez de igG ........................................... 11
Mtodo imunoenzimticos para deteco de
antgenos ................................................................... 12
Reao de Western-Blot ............................................ 12

LABORATRIO CLNICO
A estrutura organizacional de um laboratrio clnico
deve contemplar as necessidades processuais das
fases pr-analticas e ps-analticas, tanto no que
diz respeito aos aspectos arquitetnicos, quanto em
relao aos equipamentos, equipe tcnica e
tecnologia de informao. A tendncia atual a
construo
de
plataformas
laboratoriais
horizontalizadas e flexveis, com o mximo de
integrao processual e metodolgica. Tal
integrao facilitada pela implantao do sistema
de otimizao laboratorial.
Fase pr-analtica
Estudos recentes tm apontado fatores pranalticos como responsveis por at 70% dos erros
registrados num laboratrio clinico. Antes da coleta
de qualquer material biolgico para realizao de
exames laboratoriais, importante conhecer,
controlar e se possvel, eliminar algumas variveis
que possam interferir nos resultados, entre as
causas comuns de variabilidade pr-analtica, tem
se: gravidez, atividade fsica, perodo neonatal e
infncia, idade avanada, postura, dieta, uso de
drogas teraputicas ou de abuso, infuso de
frmacos, hemlise, lipemia, jejum, torniquete e
variao crnobiolgica.
Fase analtica
Na fase analtica, as grandes preocupaes
referem-se aos reagentes, equipamentos gerais, e
especficos e qualidade da gua usada no
laboratrio (gua reagente).
O processo analtico deve ser referenciado nas
instrues de uso do fabricante, em referncias
bibliogrficas ou em pesquisa cientifica valida
conduzida pelo laboratrio. Assim, deve se zelar
pela utilizao de metodologias que renam
sensibilidade, especificidade e custo-efetividade
adequados e estas, quando implantada, devem
seguir rigorosamente as especificaes do
fabricante. A validao interna considerada etapa
essencial e preliminar introduo de qualquer
metodologia analtica no laboratrio.
Fase ps-analtica
O laudo de um exame laboratorial deve conter os
seguintes itens:
Identificao do laboratrio;
Endereo e telefone do laboratrio;
Identificao do responsvel;
Identificao do profissional que liberou o
exame;
Data da coleta da amostra;
Data da emisso do laudo;
Nome do exame, tipo de amostra e mtodo
analtico;
Resultado do exame e unidade de medio;
Valores de referncia, limitaes tcnicas da
metodologia e dados para interpretao.

CONTROLE EGARANTIA DA QUALIDADE

um conjunto de processos que visa obteno
de resultados laboratoriais confiveis. Um programa
de garantia da qualidade adequado deve abranger
as fases pr-analticas, analtica e ps-analtica. O
responsvel tcnico do laboratrio deve elaborar
uma lista abrangendo todos os anlitos e todos os
sistemas analticos que usa. Para cada sistema
analtico, deve haver um plano para controle interno
e para controle externo. O programa de garantia e
controle ou de proficincia que ser usado, a
frequncia de seu uso e os limites e critrios de
aceitabilidade dos resultados. Todas as atividades
referentes garantia da qualidade devem ser
registradas, e analisadas criticamente de forma
regular que possibilite a investigao de causas
reais de problemas que impactem a confiabilidade
das anlises.
Padronizao no laboratrio
Na realizao de um exame laboratorial temos que
considerar as etapas pr-analtica, analticas e psanalticas. Para obtermos qualidade nos exames
at a liberao do laudo. A padronizao no
laboratrio tem a finalidade de prevenir, detectar,
identificar e corrigir erros ou variaes que possam
ocorrer em todas as fases da realizao do teste. A
padronizao tem o objetivo de estabelecer uma
maneira padronizada todas as etapas envolvidas na
realizao de um determinado exame.
Padronizao dos processos pr-analticos
Os processos pr-analticos so difceis de
monitorar e controlar porque grande parte deles
pode ocorrer fora do laboratrio. Considerando os
vrios fatores que podem afetar, os seus
resultados, o laboratrio deve fornecer instrues
escritas aos clientes para evitar provveis erros na
fase pr-analtica. Os principais erros na fase pranaltica so:
Identificao: as amostras biolgicas precisam
estar devidamente identificadas, nome do
paciente, data e hora da coleta, tipo de material;
Coleta da amostra: na coleta da amostra
biolgica importante que os profissionais
responsveis
tenham
conhecimentos
necessrios dos erros e variaes que podem
ocorrer antes, durante e aps a obteno da
mesma.
Padronizao dos processos analticos
As variaes analticas na realizao de um exame
laboratorial devem ser muito bem controladas para
assegurar que os resultados sejam precisos e
exatos. Os mtodos analticos, antes de serem
implantados na rotina laboratorial, devem ser
analisados em relao aos seguintes critrios:
Confiabilidade:
preciso,
exatido,
sensibilidade, especificidade, linearidade;
Praticidade: volume e tipo de amostra,
durao
do
ensaio,
complexidade
metodolgica, estabilidade dos reagentes,

robustez, necessidade de equipamentos, custo

e segurana pessoal.
Padronizao dos processos ps-analticos
Os processos ps-analticos consistem nas etapas
executadas aps a realizao do exame:
Clculo dos resultados;
Anlise de consistncia dos resultados;
Armazenamento de material ou amostra do
paciente;
Transmisso e equipamento de resultados;
Consultoria tcnica.
GRAFICO DE CONTROLE DE LEVEY-JENNING
Os grficos de controle de Levey-Jennin passaram
a ser usados no LC a partir de tcnicas de controle
desenvolvida para a indstria.
Henry e Segalove difundiram aplicao dos grficos
de controle de LJ, analisando simultaneamente
amostras controle (valores desconhecidos).
O grfico confeccionado atravs de linhas
especificando o valor mdio para o analito na linha
central, e os limites de controle estabelecidos (1, 2
e 3 desvio padro) para identificar e mostrar
tendncias dos resultados encontrados.
As fases envolvidas nos grficos de controle de LJ
so:
Adquirir amostras controle no mercado ou
prepara-las no prprio laboratrio;
Amostras controle adquiridos no mercado j
vem com a mdia e os limites aceitveis de
ERRO (LAE) ou limite de controle previamente
determinados.
Quando a amostra controle for do prprio
laboratrio:
Analisar a amostra controle para o analito a ser
controlados no mnimo 20 dias diferentes.
Calcular a mdio e o desvio padro a partir dos
resultados obtidos. Estabelecer os limites
aceitveis de erros (LAE) ou limites de controle.
SISTEMA DE MULTIREGRAS DE WESTGARD
Usa tambm amostras controle e grfico de
controle. As multirregras de Westgard e cols. so
muito boas para descobrir e interpretar alteraes
discretas que ocorrem nos dados de controle.
Assim como no sistema de LJ, as multirregras de
Westgard podem ser trabalhadas atravs de grfico
controle. O grfico de controle de Westgard
traado com vrias linhas de limites especificados
assim: mdia +-1s, mdia +- 2s. mdia +- 3s, que
permite a aplicao de normas adicionas de
controle.
Esse mtodo proporciona uma interpretao mais
estruturada, o que possibilita uma melhor deteco
de erros nos ensaios.
1:3s uma observao exceder a mdia 3: E uma
regra de rejeio de resultados. Quando ocorrer um
resultado da amostra controle excedendo o limite de
+- 3s deve-se rejeitar os resultados e procurar o
erro ao acaso. Diagnosticar, resolver o problema e

repetir as anlises dos testes e das amostras

controle. fazer nova interpretao.
1:2s- uma observao exceder a mdia 2s:
considerada uma regra de alerta. quando ocorrer
um resultado da amostra controle excedendo o
limite de +-2s procurar erro ao acaso e repetir a
bateria de anlises. interpretada como um aviso de
possveis problemas sem a necessidade de
repetio da bateria de exames.
2:2s duas observao consecutivas do controle
excedem a mdia + 2s ou a mdia 2s: uma
regra de rejeio de resultados. quando forem
encontrados 2 resultados da amostra controle
excedendo o limite de +- 2s, deve-se rejeitar os
resultados, repetir a bateria de analises e procurar
erro sistemtico.
R:4s uma observao do controle excede a
media e o seguinte exceder a mdia-2s:
tambm uma regra de rejeio de resultados.
quando for encontrado num dia 1 resultado da
amostra controle excedendo o limite de +2s e no dia
seguinte o resultado exceder tambm o limite de 2s
ou vice-versa, deve-se rejeitar os resultados, repetir
a bateria de anlises e procurar erro ao acaso.
4:1s- quatro observaes consecutivas do
controle excedem a mdia +1s ou a mdia 1s:
regra de rejeio. Quando forem obtidos4
resultados consecutivos da amostra controle
excedendo o limite de +-1s, devem-se rejeitar os
resultados, e procurar erros sistemticos.
10: mdia dez observaes consecutivas do
controle esto do mesmo lado da mdia (acima
ou abaixo): regra de rejeio. quando forem
obtidos 10 resultados consecutivos da amostra
controle de um s lado da mdia (abaixo ou acima)
deve-se rejeitar os resultados, e procurar erros
sistemticos.

1.

2.

ERROS EM EXAMES
Erros na etapa pr-analtica
Erros na solicitao do exame: escrita ilegvel,
interpretao errado do exame, erro na
identificao do paciente, falta de orientao por
parte do mdico ou do laboratrio para
determinados exames;
Erros na coleta da amostra: identificao
errada do paciente, trocas de amostras;
Paciente no preparado corretamente: falta de
jejum, horrio da coleta incorreta, tempo de
coleta de amostra de urina incorreta;
Uso de anticoagulante errado, volume da
amostra, inadequada para os exames;
Hemlise
e
lipemia
intensa
estaro
prolongadas;
Transporte e armazenamento da amostra
incorreta;
Contaminao de tubos, frascos e tampas.

Erros na etapa analtica

Troca das amostras;
Erros de pipetagem: pipetas no aferidas,
milhadas, volume incorreto;
Reagentes e padres: contaminados, mal
conservados, com validade vencida, erros no
preparo dos reagentes, concentrao errada;
Presena
de
interferentes
na
amostra:
medicamentos, lipemia, hemlise, ictercia;
Equipamentos: no calibrados (erros no protocolo
de automao, cubeta, comprimento de onda
errado;
Erros nos clculos de concentraes, nas unidades,
no so considerados diluies.
Erros na etapa ps-analtica
Identificao errada do paciente, transcrio de
dados incorretos, resultado ilegvel, unidades
erradas, no identificao das substncias
interferentes. Especificidade e prescrio do teste
no adequada. Erros na interpretao dos
resultados.

COLETA DE SANGUE
de alto valor para o diagnstico e tratamento de
vrios processos patolgicos. O sangue

constitudo de elementos slidos (clulas

sanguneas), substncias lquidas (soro, plasma)
e elementos gasosos (8O e CO2). Os materiais
usados para a coleta de sangue so importantes,
pois, auxiliam num melhor resultado dos exames ao
reduzir a ocorrncia de erros na coleta e podem ser
fatores de interferncia na fase pr-analtica.
recomendado o uso de sistemas fechados,
composto por um dispositivo que permita a
aspirao, usando agulhas de duas pontas que se
conectam ao tubo de anlise para onde o sangue
drenado. As vantagens do uso do sistema fechado
para coleta so:
Facilidade no manuseio: o tubo para coleta contm
vcuo calibrado, que est relacionado com a
proporo entre a quantidade de volume do sangue
coletado com anticoagulante;
Segurana e conforto do paciente;
Segurana ao profissional da sade: minimizam os
riscos de contaminaes, uma vez que o sangue
entra diretamente no recipiente de coleta.
TUBOS A VCUO
So de uso nico, devem ter seu interior estril e
possuir vcuo calibrado, com quantidade de
anticoagulante proporcional ao volume de sangue a
ser aspirado.
Anlise bioqumica e sorolgica (tubo
amarelo)
Nesse tipo de anlise dever ser colhida uma
amostra de soro. Esta ser obtida atravs da coleta
em tubo sem anticoagulante para que ocorra o
processo de coagulao. Essa coleta deve ser feita
no tubo de tampa amarela com gel. Este tubo
contm ativador de coagulo, e deve-se,
homogeneizar o tubo por inverso de 5 a 8 vezes
para evitar hemlise, manter em repouso na
posio vertical por 30 minutos para retrair o
cogulo e seguir a centrifugao a 3.000 rpm
durante 10 minutos.
Anlise hematolgica (tampa roxa)
Nessa anlise, dever ser colhida uma amostra de
sangue total. Esta ser obtida atravs da coleta em
tubo de EDTA de tampa roxa. Ele contm
anticoagulante especifico para evitar a coagulao.

tampa azul com citrato. Este tubo contm citrato de

sdio, o sangue colhido com anticoagulante deve ser
cuidadosamente
homogeneizado,
para
evitar
hemlise e a coagulao do sangue.
Tabela 1: as cores indicam o tipo de coagulante ou de
tratamento que o tubo recebeu.

Cores

Aditivo

Citrato

Mecanismo
de ao

Amostra

Liga 20Ca

Sangue
total ou
plasma

O ativador
acelera a
coagulao

Soro

O ativador
acelera a
coagulao

Soro

Aplicao
Exame de
coagulao.

T. Azul

T.
Vermelha

T.
Amarela

Com ou
sem
ativador
de
coagulo e
sem gel
separador.
Com ou
sem
ativador
de
coagulo e
sem gel
separador.

Heparina

Inibe
trombina

EDTA

Fluoreto/
EDTA

Exames
sorolgicos,
bioqumicos
e
hormonais.

Exames
sorolgicos,
bioqumicos
e
hormonais.

Sangue
total ou
plasma

Exames
bioqumicos.

Liga 20Ca

Sangue
total ou
plasma

Exames
bioqumicos.

Inibe a
degradao
da glicose

Plasma

T. Verde

T. Roxa

Exames de
glicose e
lactato.

T. Cinza

Tabela 2: tubos a vcuo: (a) EDTA; (b) heparina; (c) fluoreto; (d)
citrato; (e) nenhum.

Anlise glicmica (tampa cinza)

Nessa anlise, dever ser colhida uma amostra de
plasma. Esta ser obtida atravs da coleta em tubo
com a tampa cinza. Este tubo contm fluoreto de
sdio com EDTA, o sangue colhido com
anticoagulante
deve
ser
cuidadosamente
homogeneizado, para evitar hemlise e a
coagulao do sangue. Colhe-se por puno
venosa o frasco a vcuo que punciona a veia com
seringa e coletar 3 ml de sangue.
Anlise de coagulao (tampa azul)
Nessa anlise, deve ser colhida uma amostra de
plasma. Esta ser obtida atravs da coleta em tubo de

HEMOGRAMA
Hemograma um exame que avalia as clulas
sanguneas de um paciente. Ou seja,O hemograma

 o conjunto de anlise de parmetro quantitativo e

morfolgicos das clulas sanguneas, composto de
Eritrograma, Leucograma e contagem de plaquetas.
A determinao dos vrios parmetros que
compem o hemograma pode ser feita de duas
formas:
Manual;
Automatizada.
Mtodo manual
A contagem de clulas realizada diluindo-se o
sangue e depositando-se a diluio num
hemocitometro ou camada de contagem de clulas
(cmara de Neubauer), as contagens so
realizadas num ou mais retculos, especficos para
cada elemento figurado e os resultados expressos
em nmero de clulas mm cbico, em unidades
convencionais, ou litros, no caso de unidade
internacionais.
Dosagem de bilirrubina: o sangue diludo numa
soluo com cianeto de potssio e ferrocianeto de
potssio, que converte a hemoglobina em
cianometahemoglobina. A seguir, a absorbncia da
soluo medida em espectrofotmetro, em
comprimento de onda de 540nm e a dosagem da
hemoglobina obtida pela comparao da absoro
da soluo frente a uma curva de calibrao. O
resultado expresso em g/dl ou d/l.
Hematcrito: medido, manualmente, pela
centrifugao, de um tubo capilar com o sangue
total do paciente. Aps a centrifugao, a altura da
coluna de eritrcitos compactadas medida e
comparada com a altura da coluna do sangue total,
agora separada em trs camadas eritrcitos,
leuccitos, plaquetas e plasma. O percentual do
volume ocupado pela coluna de eritrcitos o valor
do hematcrito expresso em percentual ou em
frao do volume total.

preciso e rapidez para a contagem de clulas, a

impedncia eltrica foi o primeiro mtodo a ser
muito usado, at os dias de hoje. O mtodo
baseado na resistncia que os eritrcitos e
plaquetas impem a conduo de uma corrente
eltrica entre dois eletrodos mergulhados, numa
soluo eletroltica, h um eletrodo no interior de
um tubo com uma pequena abertura que se
comunica com o recipiente onde est a soluo na
qual se pretende contar as clulas.
Se nenhuma clula h na abertura do tubo, a
corrente eltrica se faz sem obstculos entre dois
eletrodos. Entretanto, se h alguma clula na
abertura do tubo, ocorre uma oposio ao fluxo do
corrente eltrica.
Os analisadores hematolgicas contam com um
sistema de tubos internos e cmaras. Para que as
clulas sejam contadas, o sague diludo contidos
nas cmaras aspirado para dentro do tubo, de
forma que se faz um fluxo de um volume prdeterminado da diluio contida na cmara para
dentro do tubo.
Durante esse fluxo, todas as
clulas que passam pela abertura do tubo geram
pulsos de resistncia eltrica, que no s so
contados, permitindo a quantificao das clulas,
mas tambm avaliados pela magnitude, fornecendo
a determinao de volume da clula que passou
pelo tubo de abertura.
Contagem de eritrcitos e plaquetas
Realizados num nico sistema, isto , num mesmo
tubo e cmara do equipamento. O sangue diludo
com soluo isotnica, portanto, incapaz de
promover a lise dos eritrcitos, na cmara de
diluio, e a diluio aspirada. Todas as partculas
com volume de 1 ou 2 a 20 fenolititros Fl. So
contados como plaquetas e aqueles com volume de
35 ou 50 a 200 Fl, como eritrcitos. Esse mtodo
permite, a construo de histogramas, grficos que
demonstram a distribuio da frequncia das
clulas quanto ao tamanho.

Figura 1:representao da centrifugao do sangue total para

obteno de hematcrito. (a) menisco; (b) plasma; (c) plaquetas
e leuccitos; (d) hematcritos.
Figura 2: histograma de eritrcitos e plaquetas, demonstrando
microcitose.

Mtodos automatizados
O hemograma realizado em equipamentos
automatizados, que apresentam grande exatido,

Dosagem de hemoglobina
realizada a partir da diluio feita, para a
contagem de leuccitos, por mtodo colorimtrico,

aps diluio do sangue com soluo que lisa os

eritrcitos e converso da hemoglobina em
cianometaglobina.

Figura 3: histograma de eritrcitos e plaquetas, demonstrando

plaquetas gigantes.

Contagem global de leucocitos

realizada no sangue diludo e hemolisado. A
cmara onde ocorreu hemlise segue-se um tubo
pelo qual a soluo aspirado. Por impedncia
eltrica, as clulas com volume entre 35 e 450fl so
contados como leucocitos alguns equipamentos que
no dispem dicitometro de fluxo usam o volume
dos leucocitos para fazer uma contagem diferencial
em trs grupos:
Linfcitos;
Moncitos;
Eosinfilos;
Basfilos;
Neutrfilos.
Essa contagem de trs partes muito inferior
quela realizada pelos analisadores hematolgicos,
que exigem sempre a contagem manual de
leucocitos pelo exame do esfregao sanguneo. A
contagem diferencial de leucocitos realizada por
um ou mais dos seguintes mtodos, pelos
diferentes equipamentos disponveis.

Figura 4: representao esquemtica da separao dos

leuccitos por citometria de fluxo.

Absoro da luz: alguns analisadores

associam a disperso da luz um segundo canal,
com uma reao citoquimica na qual a
peroxidase de neutrfilos, eosinfilos e
moncitos detectada;
Condutividade eltrica: os granulocitos so
identificados pela condutividade de uma
corrente eltrica de alta frequncia:
Impedncia eltrica;
Radiofrequncia;
Fluorescncia do DNA
ERITROGRAMA
Diante de um ou mais sintomas de anemia, deve-se
avaliar o nmero de glbulos vermelhos, a taxa de
hemoglobina e o hematcrito. Se a taxa de
hemoglobina for inferior a 12g/100ml para o

homem, 11g/100ml para mulher e criana,

indicado um hemograma completo, para avaliar a
srie vermelha e branca, pelo ndice eritrocitrio
podemos determinar a hemoglobina mdia dos
glbulos (relao entre a hemoglobina e o nmero
de glbulos HbCM), o volume mdio dos glbulos
(relao entre o hematcrito e o nmero de glbulos
vermelho VCM) e a concentrao mdia da
hemoglobina nos glbulos (relao entre a
hemoglobina e o hematcrito CHbCM), que
permitem distinguir as anemias hipocrmicas das
normocrmicas.
ndices eritrocitomtricos
A faixa normal da quantidade de eritrcitos para um
homem adulto normal de 4,5 a 6,5 milhes por
mm3, e para a mulher de 3,9 a 5,6 milhes por
mm3. A hemoglobina (Hb) e o hematcrito (Ht)
variam conforme a idade, o sexo, a altitude do local,
etc. A hemoglobina medida em gramas por
decilitro (g/dl) e representa a quantidade da
protena por unidade de volume do sangue. O
hematcrito representa a proporo dos eritrcitos
no total do sangue medido em porcentagem (%).
Com o resultado obtido do nmero de eritrcitos, da
hemoglobina e do hematcrito, podemos calcular
outras
mdias
ou
ndices
chamados
hematimtricos, como:
Volume Corpuscular Mdio (VCM) tamanho da
hemcia:
Hemoglobina Corpuscular mdio (HbCM) cor da
hemcia, e a concentrao da hemoglobina
corpuscular mdia (CHbCM).
O volume corpuscular mdio a relao que existe
entre o volume globular obtida e o nmero de
eritrcitos. O resultado obtido dado em micra
cbicos (3).
A hemoglobina corpuscular mdia dada pela
relao entre o valor da hemoglobina obtida em
gramas por 100dl e a contagem dos eritrcitos. O
resultado em pictogramas (pg) ou micrograma
(g).
A concentrao da hemoglobina corpuscular mdia
calculada pela ao entre a hemoglobina obtida
em glicosdeo volume globular. O resultado obtido
dado em porcentagem (%).
A medida do valor da hemoglobina o exame mais
importante para se avaliar a srie vermelha.
Quando os valores da hemoglobina estiverem
abaixo dos valores normais, pode se diagnosticar
uma anemia.
Os valores da hemoglobina superiores aos normais
quando acompanhadas por aumento de eritrcitos
permitem diagnosticar uma policitemia.
A anlise do nmero de eritrcito, hematcrito e as
vrias relaes entre eles fornecem os chamados
ndices hematimtricos que permitem interpretar
pelos valores encontrados no hemograma as
variaes da srie vermelha.
O VCM importante para definir se a anemia
predominantemente de eritrcitos de pequeno
volume, isto , microcitica ou de grande volume,
macrocitica.

A HbCM se refere quantidade hemoglobina em

cada eritrcito e fornece a informao do tipo de
anemia: hipocrmicas, com pouca hemoglobina, ou
hipercrmica, com muita hemoglobina. A
associao da determinao do volume e
hemoglobina de cada eritrcito fornece elementos
para caracterizao de certas anemias como a
microcistica hipocrmicas das deficincias de ferro
e das talassemias.
Indivduos

Eritrcitos
Hemoglobina
milhes/mm3
(g/100dl)
4-5,4
13,5-18,6
6,5-6,7
9,5-12,5
6,0-6,7
11,0-35
6,5-6,7
11,5-14,5

Hematcrito
(%)
44-12%
32-44%
36-44%
3744%

Recm-nascidos
Crianas(3 meses)
Crianas (2 anos)
Criana (10-12
anos)
Mulheres (gravidas)
3,9-5,6
11,5-16
34-47%
Mulheres (no
6,0-5,6
12-16,5
35-47%
gravidas)
Homem
6,5-6,5
13-3,30
40-54%
Tabela 3: Valores normais para eritrcitos, hemoglobina e
hematcrito.
Indivduos
VCM
HbCM
CHbCM
Crianas (3 meses)
83-110
24-34
27-34.
Crianas (1 ano)
77-101
23-31
38-33.
Crianas (10-12 anos) 77-95
24-30
30-33.
Mulheres
81-101
27-34
31,3-36.
Homem
82-101
27-34
31,5-36.
Tabela 4: Valores normais para VCM; HbCM e CHbCM.

Volume Corpuscular Mdio (VCM)

obtido dividindo-se o volume dos eritrcitos
corpuscular pelo seu nmero num dado volume de
sangue. A frmula usada a seguinte:
10
VCM= / 3

RDW (red cell distribution width)

E uma variao da distribuio dos eritrcitos
quanto ao tamanho e reflete, de forma matemtica,
a diferencia do tamanho dos eritrcitos de uma
determinada amostra (anisocitose). Com resultados
de expressos em valores de referncia de 11,5 a
15,5% apresentam uso na classificao das
anemias e microcitica, j que, maior nas anemias
ferroprivas do que nas talassemias e anemias de
doenas crnicas ferroprivas do que nas
talassemias e anemias de doena crnica sua
eficcia na distino dessa condies
razoavelmente baixa, mesmo quando se usam.
Correlacionam RDW e VCM ou hemoglobina, isto ,
no permite, por si s, classificar uma anemia
microcitica como ferroprivas ou no e no dispensa
a avaliao da cintico do ferro.
Hematcrito
o volume da massa eritrides uma amostra de
sangue, expresso em porcentagem do volume
desta. Quando coletamos o sangue num
anticoagulante e centrifugamos, temos separaes
em duas camadas, uma plasmtica e outra celular.
O volume superior ficam concentradas as plaquetas
e leucocitos que perfazem 1% do volume e so
facilmente diferenciados.

Sendo VC o volume corpuscular e Hm as

hemcias. O VCM do adulto oscila entre 76 a 963.
Aos 3 meses seu valor encontra-se entre 83 e
1103, caindo no fim do primeiro ano para 77 a
1013.
Hemoglobina corpuscular mdia (HCM)
o contedo de hemoglobina existente em cada
glbulo. obtido pela diviso da quantidade de
hemoglobina pelo nmero de clulas em uma
quantidade pr-determinada de sangue.O valor
normal da hemoglobina corpuscular mdia oscila
de 27 a 32.

HCM= / 3
Concentrao da hemoglobina corpuscular
mdica (ChCM)
Exibe a porcentagem eritrocticahemoglobinizado.
O limite superior de 36% nvel de saturao do
glbulo vermelho em hemoglobina. A formula para
calcul-lo dividir a hemoglobina pelo volume
corpuscular numa quantidade conhecida de
sangue.

ChCM= ou
Os valores normais oscilam de 30 a 36%.
LEUCOGRAMA
Os dados quantitativos dos leuccitos variam dentro
de certos limites que devem ser estabelecidos como

padres normais para determinados agrupamentos

humanos.
As modificaes fisiolgicas das frmulas
leucocitrias so discretas e esto relacionadas
com condies como, idade, sexo, condio fsica e
ambiental.
O nmero global dos leuccitos circulantes
determinado pelo sangue colhido na veia. A
amostra de sangue colhida, corada e diluda com
lquido prpria para a contagem em cmara
(Neubauer). O resultado da contagem expresso
em nmero de leuccitos por mm3.
Considera-se normal a quantidade de leuccitos de
4000 a 10000 por mm3. Valores superiores a
10000/mm3 so chamados de leucocitose e
inferiores a 4000/mm3 de leucopenia.
A leucocitose reflete a resposta da medula
sseasgentes estimuladores da granulocitognese
ou da linfocitognese, como, as infeces agudas
bacterianas ou virticas.
As leucopenias quase sempre esto associadas
insuficincia medular, condio em que h reduo
da proliferao e maturao dos granulocitos da
medula ssea.
Quando h leucocitose, ocorrendo aumento de
algum leuccito, so chamados de:
Neutrofilia: corresponde ao aumento dos
neutrfilos;
Eosinofilia: indica o aumento dos eosinfilos;
Basofilia: indica o aumento dos basfilos;
Linfocitose: indica o aumento de linfcitos;
Monocitose: indica o aumento dos moncitos;
Plasmositose:
indica
o
aumento
dos
plasmcito.
As
designaesneutropenia,
eosinopenia,
monocitopenia e linfocitopenia indicam a diminuio
dosneutrfilos, eosinfilos, moncitos e linfcitos,
respectivamente.
As infeces so as causas mais comuns de certas
leucocitoses. De modo geral, as infeces
bacterianas causam neutrofilia acentuada, com
aumento de bastonete e desaparecimento dos
eosinfilos circulantes. Nestas condies podemos
encontrar clulas jovens circulao, como
metamielcitos, mielcitos e promielcito.
Em condies normais estas clulas so restritas a
medula ssea e s aparecem no sangue quando h
um estmulo ou solicitao maior. D-se o nome de
desvio esquerda quando tais clulas so
encontradas na circulao.

Contagem diferencial
executada sobre o esfregao sanguneo,
contando pelo menos 200 clulas nos quatro cantos
do esfregao. Os neutrfilos e os moncitos

ocupam os bordos do esfregao; os linfcitos

situam-se no centro da lmina. A porcentagem dos
diferentes tipos celulares a seguinte, em
condies normais no adulto.
Neutrfilos: 40 75% e 2500 7500/mm3
Linfcitos: 20 45% e 1500 3500/mm3
Moncitos: 2 10% e 200 800/mm3
Eosinfilos: 1 6% e 40 440/mm3
Basfilos: 0 1% e 0 100/mm3
Esfregao sanguneo
Em anlise de rotina de uma amostra de sangue
inclui a determinao de valores fsico-qumicos, e
reconhecimento de clulas na contagem de clulas
e a observao microscpica dos elementos
particulados.
Existem duas tcnicas que comumente se usam
para visualizar amostras de sangue perifrico: a
primeira envolve a observao de sangue fresco e a
segunda envolve a preparao de extenses de
sangue em uma camada delgada. Para preparar
uma amostra de esfregao sanguneo coloca-se
uma gota de 2 a 3mm de dimetros, colocando
outra lmina sobre a amostra movendo-se com o
movimento firme e rpido num ngulo de 45 graus

em relao a primeira lmina. Imediatamente

deixa a lmina secar em temperatura ambiente.

Figura 5: tcnica de preparao de esfregao sanguneo para

leitura. (a) cabea; (a1) zona de linfcito; (b) corpo; (b1)
trajetria; (c) calda; (c1) zona de neutrfilo e moncitos.

Colorao
A colorao de May-Grunwald-Giemsa uma das
coloraes
mais
usadas
para
esfregaos
sanguneos. A tinta bsica contm azul de metileno
e eosina. Este tipo de colorao chamado de
coloraopantica, pois colorem tanto os elementos
bsicos como os cidos que se encontram no
esfregao.
O azul de metileno um componente bsico que
tinge estruturas cidas da clula de uma colorao
azul-violeta; a eosina e o azul de metileno so
compostos cidos que tingem estruturas alcalinas,
tingindo-as de roxo-alaranjado e roxo-violeta,
respectivamente.Uma vez tingida amostra, se pode
observa-las num microscpio com objetivas de
pouco aumento (40X) para ter uma ideia global do
aspecto das clulas.
IMUNOLOGIA
Os testes sorolgicos so todos os ensaios
laboratoriais
que
envolvem
uma
reao
imunoqumica de ligao de molculas de
anticorpos a um ou mais determinantes antignicos,
levando formao de imunocomplexos, isto ,
complexos antigenos-anticorpo.

Na prtica do laboratrio clinico, o teste sorolgico

pode ser usado tanto na procura de antgenos
quanto na procura de anticorpos.
Os diferentes tipos de reaes sorolgicas so
nomeados em funo dos princpios usados na
deteco do imunocomplexo formados. Assim,
temos a precipitao, em que antgenos e
anticorpos solveis so insaturados e ao reagirem
entre si formam um precipitado insolvel que pode
ser visualizado, na aglutinao, outra reao
imunolgica clssica, um ou ambos em suspenso,
que so aglutinadas quando da formao dos
imunocomplexos.
Na floculao, tcnica usada na reao de VDRL,
o antgeno usado, um composto de cardiolipinalectina-colesterol, no se encontra sob a forma de
partculas, mas, por sua composio lipdica,
tambm no solvel. Assim, cunhou0se o termo
floculao para a reao que se forma quando da
combinao de anticorpos sricos com o antgeno
VDRL, uma vez que flocos so visualizados.
Outros mtodos sorolgicos envolvem uma
segunda etapa, na qual um segundo anticorpo, antiimunoglobulina humana, encontra-se conjugado
com algum marcador que pode ser detectado por
diferentes
maneiras.
Nas
tcnicas
de
imunofluorescencia, o marcador usado a molcula
de isotiocianato de fluorescncia que quando
excitada pela luz ultravioleta, emite uma cor
esverdeada, que visualizada num microscpio
apropriado. J nas tcnicas imunoenzimticas,
usam-se compostos enzimticos e seus respectivos
substratos para a pesquisa do imunocomplexo. A
reao
final

mensurada
por
um
espectrofotmetro, que avaliar a mudana de cor
da soluo do substrato.
TERMOS
Afinidade e avidez
Afinidade: medida da fora de ligao entre um
stio de combinao de anticorpos e um
determinante antignico.
Avidez: a somatria das afinidades individuais e
da proporo de cada anticorpo num sistema
policlonal (amostra de soro), que contem anticorpos
de diferentes afinidades para um antgeno. Em
testes imunoenzimaticos, a avidez pode ser aferida
pela eluio dos anticorpos de menor afinidade por
meio de uso de agentes caotrpicos que desfazem
as reaoes antgeno-anticorpo de baixa afinidade.

Anticorpos policlonais e monoclonais

Anticorpos podem ser usados como ferramentas
para o reconhecimento de molculas antignicas
especificas com grande preciso e podem ser
induzidos artificialmente. Dependendo da forma de
obteno, e consequente clonalidade, so
classificados em policlonais ou monoclonais.
Anticorpos policlonais: entende-se por
anticorpos policlonais o conjunto de anticorpos

isolados a partir do soro de animais, obtidos

aps a imunizao com preparao antignica
purificada. Apesar de ser uma mistura de
anticorpos
de
diferente
especificidade
individuais. Provenientes de distintos clones de
linfcitos b responsivos ao mesmo antgeno
apresentam alta especificidade devida aos
processos de purificao realizados aps a sua
obteno. Podem ser produzidos em grande
quantidade e so amplamente usados em
diferentes testes sorolgicos.
Anticorpos monoclonais: so obtidos a partir
da fuso de linfcitos B esplnicos de animais
imunizados com clulas humanas de mieloma
mltiplo, que consistem em plasmcitos
monoclonais com taxa de diviso maior que a de
plasmcitos normais e intensa produo de
imunoglobulinas. O hibridoma resultante
mantido em cultura e seus sobrenadantes
contem anticorpo de um nico tipo, proveniente
de um nico linfcito B, da o nome monoclonal.

MTODOS SOROLGICOS
Mtodo de aglutinao
Pode ser realizados em tubos ou em placas, um ou
dois componentes da reao antgeno-anticorpo
deve estar fixado na superfcie de partculas
insolveis. Aps a formao de agregados, a
intensidade da reao poder ser medida
considerando-se o tamanho final dos agregados
formados, podendo variar desde negativo, na
ausncia de agregados, at fortemente positiva, na
presena de agregados maiores. Vrios fatores
interferem na aglutinao, como a classe a que
pertence o anticorpo pesquisado (a IGM, por sua
estrutura pentamrica e presena de 10 stio de
ligao ao antgeno, 750 vezes mais eficientes em
aglutinar partculas que IgG), concentrao de
eletrlitos, pH (6-8), tempo de incubao antgenoanticorpo e temperatura.

Tabela 5: mtodo de aglutinao em placa: aglutinao das

partculas graduada de negativa a intensa, dependendo da
formao de grumos. (1) antgenos e ou anticorpos particulados
so adicionados e misturados. (a) aglutinao intensa; (b)
aglutinao fraca; (c) ausncia de aglutinao.

Caso os determinantes antignicos sejam

constituintes de estruturas naturalmente insolveis,
como bactrias, protozorios, fungos ou hemcias,
a reao chamada de aglutinao direta.
geralmente
usada
para
a
deteco
de
microrganismo ou de antgenos eritrocitrios, a
partir do uso de anticorpo especfico.
Se o mtodo precisar da fixao artificial de algum
dos dois componentes da reao antgeno-

anticorpo na superfcie de partculas insolveis

(ltex), ele chamado de aglutinao indireta ou
passiva. Os testes de aglutinao so examinados
a olho nu, aps perodo de incubao curto, em
geral menor que cinco minutos.

Figura 6: aglutinao indireta: partculas ou clulas sensibilizadas

so aglutinadas por ao de anticorpos, formando grumos
visveis. (a) partcula carreadora; (b) antgenos solveis; (c)
partculas sensibilizadas; (d) partculas sensibilizadas; (e)
anticorpos; (f) aglutinao visvel.

TESTE DE FLOCULAO
Aglutinao de cristais de colesterol
No caso da reao VDRL Veneral Diase Research
Laboratory,
no
so
usados
partculas
sensibilizadas e sim suspenso antignicas
alcolica de cardiolipina juntamente com cristais de
colesterol com lecitina. Trata-se de um mtodo de
pesquisa de anticorpo anticardiolipina que esto
presentes em diferentes situaes clinicas,
especialmente na sfilis, no lpus eritematoso
sistmico e na sndrome antifosfolipide.
Os anticorpos anticardiolipina presentes no soro
formam imunocomplexos com a cardiolipina que
so precipitados sobre os cristais de colesterol, que
so refringentes. A leitura do teste feita
microscopicamente, sendo positivo quando h
formao de flocos refringentes e negativo quando
se apresenta homogneo e sem agregados.

ENSAIOS IMUNOENZIMTICOS (ELISA)

So usada marcao de anticorpos com enzimas e
a leitura se faz pela medida da ao enzimtica
sobre o substrato cromognico, legando mudana
de cor da soluo. As enzimas mais usadas como
marcadores no ELISA so peroxidase e fosfatase
alcalina. Podem ser qualitativos, quantitativos ou
semiquantitativos. Nos ensaios de quantificao
de antgenos, uma curva-padro traada a partir
de diferentes amostras de referencia contendo
concentraes conhecidas do antgeno. Na

pesquisa de anticorpos, cujas concentraes so

mais
variveis,
a
quantificao
ou
semiquantificao envolve estabelecimento de um
limiar de afinidade ou ponto de corte, acima do qual
os valores sero considerados positivos.
Mtodo imunoenzimticos para deteco de
anticorpos
Os ensaios de deteco de anticorpos solveis
podem ser conduzidos por dois mtodos:
Indireto;
Captura dos anticorpos IgM.
no mtodo indireto, microplacas de poliestireno
contendo vrios pequenos poos so sensibilizadas
com preparaes antignicas. Amostras de soro em
diluies recomendadas pelos fabricantes so
incubadas por perodos preestabelecidos para
permitir a reao dos anticorpos presente na
amostra com o antgeno fixado na microplaca. Aps
lavagem dos poos, um preparado de anticorpos
anti-imunoglobulinas humanas conjugadas com
enzimas adicionado. Esse conjugado antiimunoglobulina reage com o anticorpo capturado
pelo antgeno da gase slida e a reao revelada
com adio do substrato especifico para a enzima
usada. Em casos de reaes positivas, ocorre
mudana de cor na soluo e a intensidade da cor
estimada colorimetricamente, sendo proporcional
concentrao do anticorpo pesquisado.
caso o anticorpo a ser pesquisado seja da classe
IgM, comum ocorrncia de resultados falsonegativos ou falso-positivo. Por isso, usa-se o
mtodo de captura de anticorpos IgM. Nesse teste,
a fase slida sensibilizada com anticorpos
anticadeia pesada da IgM. Os soros em teste so
incubados, capturando todos os IgM da amostra. a
seguir, incuba-se com antgeno solvel e
posteriormente com preparaes de anticorpos
especficos para o antgenos, marcados com
enzima. Como nos demais testes. Aps lavagem
dos poos para retirada dos componentes no
fixadas, o substrato enzimtico adicionado e a
intensidade da cor lida em espectrofotmetro,
sendo diretamente proporcional concentrao do
anticorpo (IgM).

Medida da avidez de igG

Em algumas situaes clnicas, principalmente no
diagnstico de infeces em gestantes, preciso
ser til a medida da avidez das IgGs sricas pelos
antgenos. Sabemos que IgGs mais recentes
apresentam menos avidez que os produzidos a
mais tempo. Assim, a avaliao da avidez das IgGs
circulantes pode contribuir para considerar o
processo infeccioso como agudo ou no. A tcnica
envolvida na medida da avidez envolve a realizao
do teste imunoenzimtico em duplicata. Um teste
realizado de forma convencional, enquanto no

outro, acrescentada uma etapa de adio de

soluo que favorece a dissociao do
imunocomplexo. Quanto maior a estabilidade da
interao antgeno-anticorpo, maior resistncia
ao da soluo dissociante.
A medida do ndice de avidez feita pela razo:
Leitura do teste com soluo dissociante/
leitura do teste convencional.
Se o ndice (razo x 100) for maior que 60%,
admitimos-se alta avidez. Se inferior a 30%
considera-se baixa avidez. Valores intermedirios
so inconclusivos.
Mtodo imunoenzimticos para deteco de
antgenos
Os ensaios imunoenzimticos para pesquisa de
antgenos podem ser conduzidos por mtodos de
captura, de competio com anticorpo marcado e
de competio com antgeno marcado.
O mtodo de captura o mais adotado para
pesquisa de antgeno polivalente. As placas (fase
slida) so sensibilizadas com anticorpo especifico
para o antgeno a ser testado. Aps incubao da
amostra com a fase slida, lava-se o sobrenadante.
A seguir, incuba-se novamente com anticorpo
especifico marcado com uma enzima. Faz-se a
segunda lavagem. A reao revelada com a
adio de um substrato e a atividade enzimtica
final diretamente proporcional concentrao
inicial do antgeno na amostra testada.
No mtodo de competio com anticorpo
marcado, a fase slida sensibilizada com
antgenos. Adiciona-se a amostra teste e anticorpos
marcados com enzima.
Os anticorpos se ligam tanto aos antgenos da
amostra, quanto aos da fase slida. A densidade
ptica encontrada inversamente proporcional
concentrao inicial do antgeno na amostra
testada.
No mtodo de competio com antgeno
marcado, a fase slida tambm sensibilizada com
anticorpo especifico para o antgeno a ser testado.
Adiciona-se a amostra teste e o conjugado
(antgeno-enzima). A densidade ptica encontrada
inversamente proporcional concentrao inicial
do antgeno na amostra.
Vantagens: sensibilidade e especificidade
elevadas, rapidez, preciso, estabilidade dos
reagentes, objetividade da leitura e possibilidade
de automao.
Desvantagens: a atividade enzimtica pode ser
afetada
por
constituintes
plasmticos.
Comparada com os radioimunoensaios, a
mensurao da atividade da enzima pode ser
mais complexa e com menos sensibilidade do
que a mensurao dos radioistopos.
Aplicao: o mtodo de ELISA o mais usado
na prtica da soroimulogia laboratorial. Sua
proliferao pode tambm ser atribuda ao uso
de anticorpos monoclonais e antgenos
recombinantes especficos.

Reao de Western-Blot
um mtodo sorolgico no qual possvel
identificar as fraes do preparado antignico
reconhecidos pelos anticorpos do paciente. Os
anticorpos dos pacientes eram incubados com
homogeneizados
antignicos,
geralmente
complexos, compostos de vrios componentes
proteicos. Para a tcnica de Western-blot, a
preparao antignica previamente submetida
eletroforese em gel de poliacrolamida, de alta
definio, a fim de separ-la em diferentes bandas,
de acordo com seus tamanhos e cargas.
Posteriormente, todo o contedo proteico presente
no gel transferido para a folha de nitrocelulose,
mantendo-se conservado o perfil eletrofortico.
Dessa forma, a folha de nitrocelulose contm o
preparado antignico apresentada sob a forma de
bandas proteicas individualizadas. Essa fita de
nitrocelulose sensibilizada submetida a um
processo semelhante ao da reao de ELISA. Isto
, aps ser incubada com soro diludo do paciente e
lavada, reincubada com anticorpos antiimunoglobulina humana marcados com enzima.
Substrato cromgeno adequado adicionado e, ao
sofrer ao da enzima, muda de cor e colore as
bandas nas quais houve reconhecimento pelos
anticorpos do paciente. A reao de Western-Blot
foi e ainda amplamente usado na confirmao do
diagnstico da infeco pelo HIV.
AIDS