Aspectos Básicos Sobre Citometría de Flujo

Fundamentos y aplicaciones analticas
y separativas
de la inmunofluorescencia
y la citometra de flujo
Asignatura de Inmunologa
Universidad de Alcal
Jorge Monserrat Sanz
Unidad mixta
CSIC/UAH
Objetivos
1. Entender la citometra de flujo como herramienta de estudio de la
heterogeneidad celular en el campo del sistema inmune.
2. Conocer los fundamentos de la citometra de flujo.
3. Conocer la aplicaciones tanto clnicas como en investigacin que se
realizan mediante la citometra de flujo.
4. Puesta a punto, familiarizacin y conceptos prcticos de un citometro de
flujo.
5. Obtencin de clulas mononucleares procedentes de sangre perifrica.
6. Realizacin de un staining directo(marcaje) de estas clulas mononucleares
mediante el uso de anticuerpos monoclonales especficos.
Objetivos
7. Adquisicin en un citometro de flujo.
8. Estudio de la viabilidad mediante el uso de sondas intercalantes
del ADN.
9. Anlisis de diferentes tipos de imgenes de citometra de flujo:
Comprender las etapas en el proceso de la informacin obtenida por
citometra
10. Resolucin de diferentes problemas clnicos reales.
11. Estudio de los porcentajes, calculo de cifras absolutas e
interpretacin de intensidades medias de florescencia de clulas
linfocitarias obtenidas de distintos casos patolgicos reales.
12. Interpretacin de los resultados obtenidos.
Qu debe ser el alumno al terminar el curso?
Que despus del curso el alumno sea:
1. Conocedor de los fundamentos y consciente de las aplicaciones de la

citometra de flujo.
2. Eficiente preparando muestras para citometra y diseando experimentos de
citometra analtica y separativa.
3. Usuario competente y autosuficiente del citmetro de flujo analizador capaz de
puesta a punto, adquisicin y capaz de diagnosticar y solucionar situaciones
problemticas (compensacin, flujo)
4. Analizador crtico conocedor de las posibilidades de los software de anlisis y
exportacin de datos.
Prcticas de Inmunologa Clnica

Primer da: Seminarios Interactivos:
1. Fundamentos en Inmunofluorescencia y Citometra de flujo.
2. Aplicaciones de la citometra de flujo.
3. Citmica: Aplicaciones clnicas
Segundo y tercer da:

1. Dos actividades simultneas (2 horas):
- Realizacin de una separacin clular de clulas mononucleares de sangre perifrica.
- Contaje de las clulas.
2. Citmetro de flujo: Fundamentos y utilizacin de un citmetro de flujo (2 horas).

3. Marcaje de superficie e intracelular de linfocitos de sangre perifrica (2 horas):
a. Marcaje de superficie.
b. Viabilidad (7add).
c. Anexina V.
Cuarto da (4 horas):
Anlisis de imgenes de citometra de flujo. Problemas.
Relevancia
1. Estudio directo de las patologas mediante esta tecnologa:
Conocimiento y bsqueda de informacin de carcter
pronstico
2. Interpretacin de vuestra fuente de lectura: la bibliografa
de toda la comunidad cientfica biomdica
Heterogeneidad celular en el sistema inmune

T4
T8
NK
Mono Neu
CD45
CD2
CD19
CD3
CD56
CD4
CD45RA
CD45RO
CD8
CD45RA CD45RO
CD45RA
CD14 CD15
Criterios de caracterizacin de los tipos celulares

Celulares
Morfologa al microscopio.
Moleculares
Genotpico. (Genoma) Recombinaciones somticas

Fenotpico (Proteoma) RNA expresado, protenas.
Citoma: Anlisis estadstico multi-celular.
- Antgenos de diferenciacin linfocitaria

Los antgenos de superficie pueden ser utilizados como marcadores
especficos de lneas, tipos y subtipos celulares.
Para estudiar la heterogeneidad celular

son necesarias tcnicas:
1. Con resolucin a nivel de clula individual
2. Que caractericen la clula en funcin de varias
caractersticas (parmetros). X, Y, Z...
3. Capaces de realizar medidas en nmeros representativos
de clulas. 100 clulas error 10%, 10.000 error 1%
4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y
reducir toda esa informacin sobre clulas individuales en
conclusiones
Jorge
Monserrat Sanztiles acerca de las poblaciones celulares.
Morfologa y antgenos de diferenciacin en el anlisis de

la heterogeneidad celular
Granulocitos
CD15+
FSC-Height ->
Jorge Monserrat
Sanz
4C5144001
256
512
Monocitos
CD14+
768
1024
Linfocitos
CD3+
2
1
CD4+
CD8+
CD56+
CD19+
CD5+
CD5-
Fases de la citometra:
1. Pre-citometra:
1. Anticuerpos monoclonales y sondas:
1. Estudio a nivel tisular
2. Estudio a nivel celular
2. Tcnicas de separacin celular

3. Tcnicas en Inmunofluorescencia
2. Citmetria
(Alternativas: Microscopia de fluorescencia, Confocal, Gentica Molecular)
3. Anlisis cuantitativo
4. Anlisis biolgico.
Anticuerpos como herramientas en

investigacin
Ventaja
Capacidad de reconocimiento muy especfica
Deteccin muy sensible picomolar
Inconveniente
Son invisibles
Conjugacin con molculas reporter
Radioistopos: RIA, Rosalyn Yalow 1977
Enzimas: ELISA, inmunohistoqumica
Molculas fluorescentes: inmunofluorescencia, citometra de
flujo, LSC.
Tcnicas de separacin celular

- Clulas en tejidos:
1. Inmunohistoqumica
2. Procesamiento mcanico
3. Separacin por mallas y filtros
- Clulas en disolucin:
Gradientes de densidad:
Medios de densidad constante
Gradientes continuos o discontinuos
Elutriacin centrifuga
Sorting:
- Magntico
- Sorter
Tcnica de separacin mediante

Ficoll-Hypaque
Tipos de marcajes inmunofluorescentes

Directo
Indirecto
Biotinado
b
b
Microscopia de fluorescencia
FUNDAMENTOS DE LA
CITOMETRA DE FLUJO
Qu es la citometra de flujo?
Amplificacin
digitalizacin
Representacin
y Analisis
Meeting point
FSC
Lser
2- 4
90
uz
l
e
d
es
r
to
c
te
e
D
Columna
de muestra
Flujo
VENTAJAS DE LA CITOMETRA DE FLUJO

- Medidas multiparamtricas (x, y, z) en grandes nmeros de
clulas individuales (miles).
- Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en
la precisin de las medidas.
- A menor tiempo de dedicacin mayor productividad.
DESVENTAJAS
La citometra de flujo no aporta informacin sobre la distribucin
espacial de las clulas estudiadas.
Citmetro de flujo
Cmo funciona un citmetro?
Sistema de flujo
Dispersin de la luz
Fluorescencia
Separacin y deteccin de la luz
Amplificacin
Correccin de errores: solapamiento espectral y formacin
de dobletes
Digitalizacin y almacenamiento de la informacin
SISTEMA DE ABSORCION DE
MUESTRA
AIRE
MUESTRA
FLUJO
MUESTRA
Luz incidente
FSC
Luz dispersada hacia delante, =2- 4
90
Luz dispersada lateralmente
y luz fluorescente, = 90
90
Cmara
de flujo
Columna
de muestra
Fluido envolvente
INFORMACIN QUE SE OBTIENE: LUZ

- PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:
- LUZ REFLEJADA O DIFRACTADA
- PROPIEDADES FLUORESCENTES:
- FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC)
Luz dispersada a 90 grados
Laser
Detector
Detector de 90
DETECCION DE LUZ DISPERSADA

HACIA DELANTE (FORWARD
SCATTERED LIGHT, FSC)
SSC
FSC
El detector de FSC convierte luz dispersada hacia

delante en un pulso de voltaje proporcional al tamao
de la clula/particula
DETECCION DE LUZ DISPERSADA

LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT,
SSC)
SSC
FSC
El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente

en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en
orgnulos membranosos (granularidad)
Morfologa y antgenos de diferenciacin en el anlisis de

la heterogeneidad celular
Granulocitos
CD15+
FSC-Height ->
Jorge Monserrat
Sanz
4C5144001
256
512
Monocitos
CD14+
768
1024
Linfocitos
CD3+
2
1
CD4+
CD8+
CD56+
CD19+
CD5+
CD5-
Detectores de fluorescencia
Laser
Freq
Detector
Fluorescencia
Detector de fluorescencia
(PMT3, PMT4 etc.)
Fluorescencia
FL-2
FL-1
FSC
Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y CD3 Percp
Fluorescencia
Proceso por el que una molcula absorbe luz, aumenta su

energa y vuelve al estado basal emitiendo un fotn.
Parte de la energa se pierde en las transiciones entre los
distintos estados por tanto el fotn emitido tiene menos
energa (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.
2
1<2
t (s)
Espectros
Espectro de Absorcin
Representacin de la intensidad de absorcin de luz de distintas
las longitudes de onda por una sustancia.
Espectro de Emisin
Intensidad de
fluorescencia
Representacin de la intensidad de emisin de una sustancia

excitada con luz de una determinada longitud de onda.
excitacin
medida
(nm)
Fluoresceina (FITC)
Excitacin Emisin
300 nm
400 nm
500 nm
500 nm
Relat vi e I nt ensit y
400 nm
Wavelength
Proteinas
600 nm
600 nm
700 nm
700 nm
Laseres
comunes
350
300 nm
457 488 514

400 nm
500 nm
610 632
600 nm
700 nm
PE-TR Conj.
Texas Red
PI
Etidio
PE
FITC
Acido Parinrico
Fluorocromos
Sondas
Proceso de seales
1. Separacin de seales luminosas
2. Deteccin de seales luminosas
3. Amplificacin de seales elctricas
4. Correccin de errores
Compensacin de seales
Discriminacin de seales debidas a dobletes (proceso de pulsos).
6. Transformacin de seales elctricas analgicas en digitales

7. Almacenamiento matricial (list mode) de la informacin
resultante
Optica en los citmetros de flujo

PMT
4
Flujo Celular
Filtros
Dicroicos
PMT
3
PMT
2
Bandpass
Filtros
PMT
1
Laser
DETECCIN DE FLUORESCENCIA
TC
PerCP
QR
Fluorocromos
Detectores
FL-1
FL-2
FL-3
Cy5
APC
FL-4
Amplificacin de seales
Lineal
(intervalos regulares)
apropiada para:
Seales que oscilan en un
rango limitado (0-1.000)
Con distribuciones con
picos estrechos como el
contenido en DNA.
10
100
200
10
20
Logartmica
(intervalos crecientes)
Cubre un rango ms amplio
de variacin de la seal (010.000).
10
100 200 1000
10
100 200 1000
Escalas
FSC Ej: Lineal
FL-1 Ej: Logartmica
Compensacin de seales
FL-2 - %FL1
excitacin
Intensidad de fluorescencia
Fundamento Superposicin de
espectros de emisin. Parte de
la seal de emitida por un
fluorocromo es leda por el
detector de otro color
Concepto sustraccin de una
parte de la seal medida en un
color a la seal medida en otro
color
medida
FL-1
FL-2
Discriminacin de seales debidas a

dobletes (proceso de pulsos)
Seal analgica (V)

Altura de seal (H)
Anchura de seal (W)
rea de seal (A)
En base a la informacin de rea

y anchura se pueden detectar
dobletes (dos clulas que pasan
juntas).
V
A
W
t
2 xW
DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO
DE INFORMACIN
N
1
2
3
4
5
6
7
8
.
.
.
10000
FSC SSC FL-1

2
2
3
4
3
4
2
2
.
.
.
1
1
2
2
1
2
3
8
.
.
.
1
1
3
4
1
1
2
1
.
.
.
FL-2 FL-3 FL-4 TIEMPO

1
2
3
1
2
3
1
2
.
.
.
1
3
3
4
1
1
3
4
.
.
.
2
2
3
3
5
5
1
2
.
.
.
1
1
1
1
2
2
2
2
.
.
.
Los pulsos deVoltaje(seales analgicas) son transformadas en seales digitales

Las seales digitales almacenan en un soporte informtico en modo listado
(almacenamiento multiparamtrico).
PROCESO DE INFORMACION
Histogramas
Diagramas biparamtricos
Proceso de la informacin generada

Representacin de la informacin
Seleccin de la informacin
Reduccin de la informacin
De la clula a la poblacin celular
Representacin monoparamtrica de datos.

Histogramas. Se representa en cada valor de x
(intensidad de fluorescencia) el nmero de
clulas que emiten esa intensidad.
M1
Histogramas
FL-1
SSC
FL-2
FSC
FL-3
Representacin biparamtrica en 2D
Diagrama de puntos / dot plot
X representa el valor de la
seal de un parmetro.
Y representa el valor de la
seal del otro.
FL-2
Representacin simultnea
de dos parmetros X e Y.
-+
--
++
+FL-1
Representacin 3D
Countour plot / Diagramas de contornos
X, Y ms una tercera dimensin.
Una superficie tridimensional
La altura representa el nmero de
clulas con una determinada
combinacin de ambos
parmetros.
Diagrama de dot plot density
Seleccin de la informacin
Gates (Puertas) / ventanas (windows)
Seleccin
de
subpoblaciones
definidas
en
diagramas
monoparamtricos
Sitan los valores lmite superior e
inferior de un parmetro que
definen a las clulas de inters.
M2
M1
Gates biparamtricos.
Se
pueden
utilizar
puertas
biparamtricas definidas en base a la
combinacin de los valores de dos
parmetros
Se
emplean
para
estudiar
las
caractersticas de subpoblaciones
celulares
R1
R3
R2
R4
Gates lgicos / Puertas lgicas

Pueden combinarse distintas puertas y emplearse simultneamente como
criterio para seleccionar las clulas de inters.
NK
R1
COMPLEJIDAD CELULAR
GRANULOCITOS
R3
R7
TK
R2
LINFOCITOS
MONOCITOS
R6
R5

TAMAO
R4
R5 and R1
Qu significa la realizacin de un gate electrnico?

N
FSC
1
2
2
2
3
3
4
4
5
3
6
4
7
2
8
2
.
.
.
.
.
.
10000
Jorge
Monserrat Sanz
SSC
FL-1
FL-2
FL-3
FL-4
TIEMPO
1
1
2
2
1
2
1
8
.
.
.
1
1
3
4
1
1
2
1
.
.
.
1
2
3
1
2
3
1
2
.
.
.
1
3
3
4
1
1
3
4
.
.
.
2
2
3
3
5
5
1
2
.
.
.
1
2
3
4
5
6
7
8
.
.
.
Anlisis de la informacin.
Estadisticas
monoparamtricas
M2
M1
Histogram Statistics
File: ap-24h.011
Tube:
Acquisition Date: 26-Apr-99
Gated Events: 9917
X Parameter: FL3-H FL3-IP (Log)
Marker
All
M1
M2
Left, Right
1, 9910
685, 9910
14, 685
Log Data Units: Linear Values

Panel:
Gate: G3
Total Events: 10000
Events
9917
8725
1192
% Gated
100.00
87.98
12.02
% Total
99.17
87.25
11.92
Mean
1027.48
1153.33
106.29
Geo Mean
827.78
1139.97
79.55
CV
37.34
16.01
95.61
Median
1113.97
1144.44
66.12
Peak
Estadisticas biparamtricas
+-
++
--
+-
Cuadrantes Combinacin de dos

umbrales de positividad para dos
parmetros
Nmero de clulas
% de clulas
MFI mean, geo mean
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007
Sample ID:
Tube: tube #7
Acquisition Date: 5-Jun-98
Gated Events: 5000
X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log)
Quad Location: 15, 17

Patient ID:
Panel: Bronquiris
Gate: No Gate
Total Events: 5000
Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)
Quad Events
% Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UL
785
15.70
15.70
5.42
4.50 1553.17
1274.92
UR
877
17.54
17.54
62.04
52.73 1159.04
700.05
LL
951
19.02
19.02
2.81
2.37
3.67
3.17
LR
2387
47.74
47.74
70.94
63.08
6.30
5.43
Estadstica por regiones

Seleccin libre de un conjunto
R2
Microbeads
de combinaciones de valores
correspondientes a dos
Linfocitos
R1
parmetros.
Informacin generada de una muestra

marcada en triple color
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007
Sample ID:
Tube: tube #7
Gated Events: 5000

Patient ID:
Panel: Bronquiris
Gate: No Gate
Total Events: 5000
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UL
785
15.70
15.70
5.42
4.50 1553.17
1274.92
UR
877
17.54
17.54
62.04
52.73 1159.04
700.05
LL
951
19.02
19.02
2.81
2.37
3.67
3.17
LR
2387
47.74
47.74
70.94
63.08
6.30
5.43
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007
Sample ID:
Tube: tube #7
Gated Events: 5000
Quad Events
% Gated
UL
785
15.70
UR
877
17.54
LL
951
19.02
LR
2387
47.74

Patient ID:
Panel: Bronquiris
Gate: No Gate
Total Events: 5000
% Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean

15.70
5.42
4.50 1553.17
1274.92
17.54
62.04
52.73 1159.04
700.05
19.02
2.81
2.37
3.67
3.17
47.74
70.94
63.08
6.30
5.43
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007
Sample ID:
Tube: tube #7
Gated Events: 5000
Quad
UL
UR
LL
LR
Events
% Gated
785
15.70
877
17.54
951
19.02
2387
47.74
% Total
15.70
17.54
19.02
47.74

Patient ID:
Panel: Bronquiris
Gate: No Gate
Total Events: 5000
X Mean
5.42
62.04
2.81
70.94
X Geo Mean
4.50
52.73
2.37
63.08
Y Mean
1553.17
1159.04
3.67
6.30
Y Geo Mean
1274.92
700.05
3.17
5.43
Jorge
DelMonserrat
anlisis deSanz
cada matriz (9x20.000) nos quedamos con 12-24 nmeros
Estadsticas/Reduccin de la informacin
parmetros
clulas
Anlisis
grfico
ofrece
9x
informacin numrica sobre las
20000
poblaciones estudiadas.
Esta informacin numrica de
una muestra se representar en
variables
una fila de una matriz de datos
caso
Con la matriz de datos se
obtendr informacin estadstica
y representaciones grficas
sobre poblaciones de individuos.
Poblacin casos
Poblacin control

Aspectos Básicos Sobre Citometría de Flujo

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Aspectos Básicos Sobre Citometría de Flujo

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Fundamentos y aplicaciones analticas

Jorge Monserrat Sanz

Qu debe ser el alumno al terminar el curso?

Que despus del curso el alumno sea:

1. Conocedor de los fundamentos y consciente de las aplicaciones de la

Jorge Monserrat Sanz

Prcticas de Inmunologa Clnica

Segundo y tercer da:

2. Citmetro de flujo: Fundamentos y utilizacin de un citmetro de flujo (2 horas).

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Heterogeneidad celular en el sistema inmune

Jorge Monserrat Sanz

Criterios de caracterizacin de los tipos celulares

Genotpico. (Genoma) Recombinaciones somticas

- Antgenos de diferenciacin linfocitaria

Para estudiar la heterogeneidad celular

Morfologa y antgenos de diferenciacin en el anlisis de

2. Tcnicas de separacin celular

Anticuerpos como herramientas en

Jorge Monserrat Sanz

Tcnicas de separacin celular

Tcnica de separacin mediante

Jorge Monserrat Sanz

Tipos de marcajes inmunofluorescentes

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

VENTAJAS DE LA CITOMETRA DE FLUJO

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Cmo funciona un citmetro?

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

INFORMACIN QUE SE OBTIENE: LUZ

Jorge Monserrat Sanz

Luz dispersada a 90 grados

Jorge Monserrat Sanz

DETECCION DE LUZ DISPERSADA

Jorge Monserrat Sanz

El detector de FSC convierte luz dispersada hacia

DETECCION DE LUZ DISPERSADA

Jorge Monserrat Sanz

El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente

Morfologa y antgenos de diferenciacin en el anlisis de

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y CD3 Percp

Jorge Monserrat Sanz

Proceso por el que una molcula absorbe luz, aumenta su

Jorge Monserrat Sanz

Representacin de la intensidad de emisin de una sustancia

Jorge Monserrat Sanz

457 488 514

Jorge Monserrat Sanz

Jorge Monserrat Sanz

6. Transformacin de seales elctricas analgicas en digitales

Jorge Monserrat Sanz

Optica en los citmetros de flujo

Jorge Monserrat Sanz

100 200 1000

100 200 1000