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Bioqumica

2013/2014

Protenas
Aminocidos e protenas - propriedades cido-base
Nveis de organizao
Conformao e estabilidade
1. Considere a estrutura geral de um aminocido:

a. Organize os seguintes aminocidos em famlias considerando:


I. a natureza do grupo R (polaridade)
II. os grupos funcionais do grupo R

Glicina

Alanina

O
H2N

CH

OH

O
H2N

CH

OH

CH3

Asparagina

Serina

O
H 2N

CH

OH

H 2N

CH

OH

CH2

CH2
OH

NH2

Treonina
H2N

O
CH

CH

OH

Prolina

H
N
C

OH

OH

CH3

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2013/2014

Valina

Leucina

O
H 2N

CH

CH

CH3

OH

O
H2N

CH

OH

CH2

CH3

CH

CH3

CH3

Metionina

Isoleucina

H 2N

CH

CH2

CH

CH3

CH2

CH2

CH3

CH

H 2N

OH

OH

CH3

Fenilalanina
H 2N

Glutamina

O
CH

OH

H2N

O
CH

OH

CH2

CH2

CH2
C

NH2
O

Triptofano

Tirosina
H 2N

H2N

CH

CH

OH
CH2

CH2

HN
OH

OH

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2013/2014

Histidina

Cistena

H 2N

CH

O
H 2N

OH

CH

OH

CH2

CH 2

SH

N
NH
Lisina

Arginina

O
H 2N

CH

H 2N

OH

O
CH

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

CH 2

NH

NH 2

C
NH 2

NH

OH

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2. Considere os seguintes valores de pKa:

aminocido
Asp
His
Cis
Thr

pKa1
1,9
1,8
2,2
2,6

pKa2
9,6
9,2
10,5
10,4

pKa3
3,6
6,0
9,0
---

Identifique os aminocidos A, B, C e D a partir das curvas de titulao. Justifique.

3. Considere a lisina.
a. Indique os equilbrios cido-base deste aminocido (escreva a estrutura de todas as
formas e depois converta-as na forma LHn x+).
b. Calcule a carga formal a pH = 7. Qual a forma que existe predominantemente a este
pH.
c. Qual a direco de migrao quando sujeito a uma electroforese a pH = 11,5 (calcule
o seu ponto isoelctrico).

4. Os aminocidos podem ser usados como tampes. Uma soluo tampo aquela
em que o pH no varia apreciavelmente quando se lhe adiciona cido ou base. A zona
na qual uma dada soluo tampo efectivo designada por zona tampo e
geralmente definida por pKa 1.
a. Indique a zona tampo da glicina, histidina, aspartato e lisina.
b. Escolha um aminocido para tamponizar a pH = 4, 6, 9 e 12.

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c. Uma protena contendo 110 aminocidos ser melhor ou pior tampo que a soluo
de concentrao equivalente dos seus aminocidos constituintes. Justifique.

5. Considere o tripeptdeo Ala-His-Val.


a. Escreva a estrutura primria do tripeptdeo. Refira as caractersticas desta ligao.
b. Indique os equilbrios cido-base (escreva a estrutura primria e depois converta-a
na forma LHn x+).
c. Calcule a pH = 5 e a pH = 9 a percentagem de cada uma das formas e a respectiva
carga formal.

6. A anlise qualitativa de um peptdeo revelou a sua composio em aminocidos


(Ala, Lis, Glu); o resduo (Ala) foi identificado como sendo o N-terminal e o resduo (Lis)
como sendo o C-terminal. A sequncia de aminocidos foi determinada efectuando-se
uma titulao cido-base.
a. Com base na curva de titulao determine o nmero de aminocidos do peptdeo e
a respectiva sequncia. Justifique.

b. Represente o peptdeo na forma LHnx+ indicando todos os equilbrios e respectivos


valores de pKa.
6

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c. Determine a percentagem do peptdeo desprotonado a pH = 7,0.


d. Se pretendesse separar o peptdeo anterior de um outro com sequncia Lis-Glu-Ala
e p.i. = 6,6 que pH escolheria? Justifique.

7. Considere os seguintes peptdeos:


I. Arg-Ala-Ser-Ala
II. Arg-Ala-Ser-Glu
III. Glu-Arg-Ser-Glu
Uma das seguintes curvas de titulao corresponde a um dos peptdeos anteriores (I, II
ou III). Identifique o peptdeo a que esta curva se refere. Justifique a sua escolha.

8. Embora nem sempre seja possvel predizer a estrutura tridimensional de uma


protena a partir da sequncia de aminocidos, no entanto, possvel em certos casos
fazer previses.
(1)

Gli-Ala-Gli-Ala-Gli-Ser-Gli-Ala-Gli

(2)

Cis-Ser-Val-Cis-Gli-Ala-Ser-Cis-Glu

(3)

Gli-Ser-Gli-Ser-Gli-Ala-Gli-Ser-Gli

(4)

Gli-Ala-Pro-Gli-Glu-HiPro-Gli-Ala-HiPro

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a. Qual a estrutura que lhe parece mais adequada para os peptdeos (1), (2), (3) e (4)?
Justifique.
b. Refira as caractersticas de cada uma das estruturas identificadas. D um exemplo
para cada tipo de estrutura.
9. Considere trs protenas A, B e C em cujas estruturas predominam uma hlice ,
folha e tripla hlice (tipo colagnio). Deduza o tipo de estrutura secundria
predominante nas protenas A, B e C a partir da composio de aminocidos.

Protena
Ala
Asp
Arg
Cis
Glu
Gli
His
HiPro
Ilu
Leu
Lis
Met
Fen
Pro
Ser
Trp
Tir
Val

A
29.4
0.5
1.3
1.0
44.6
0.2
0.7
0.5
0.3
0.5
0.3
12.2
0.2
5.2
2.2

B
5.0
7.2
6.0
11.2
12.1
8.1
0.7
2.8
6.9
2.3
0.5
2.5
7.5
10.2
1.2
4.2
5.1

10. Considere o esquema da seguinte protena:


a. Indique os motivos estruturais presentes.
b. Refira quais as interaces que estabilizam
a estrutura tridimensional das protenas globulares.

C
10.7
5.0
4.5
7.1
33.0
0.4
9.4
0.9
2.4
3.4
0.8
1.2
12.2
4.3
0.4
2.3

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11. Considere o esquema da seguinte protena:

a. Indique os motivos estruturais presentes.


b. Qual o nvel de organizao representado. Justifique.
c. Que aminocidos espera encontrar no exterior e no interior da protena. Justifique.

12. A principal fora motriz no enrolamento das protenas o movimento das


cadeias laterais dos aminocidos hidrofbicos para longe do ambiente aquoso.
Explique.

13. Verificou-se que uma mutao que altera a alanina no interior de uma protena por
valina conduz a uma perda de actividade. No entanto, a actividade recuperada
quando uma segunda mutao, numa posio diferente, altera uma isoleucina por
glicina. Explique os factos.

14. Comente as seguintes afirmaes:


a. A conformao mais estvel de uma protena do ponto de vista termodinmico
aquela que corresponde a um mnimo de energia.
b. Solventes orgnicos desnaturam as protenas por dificultarem a existncia de
interaces inicas.

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Anexo
Aminocidos com cadeia lateral apolar
Nome Smbolo

Frmula
estrutura

de

Massa (Da)

pK1
(-COOH)

pK2
(-NH3)

57

2,35

9,78

71,1

2,35

9,87

99,1

2,29

9,74

113,2

2,33

9,74

113,2

2,32

9,76

131,2

2,13

9,28

97,1

1,95

10,64

147,2

2,20

9,31

Glicina
Gli
G

H 2N

CH

O-

Alanina
Ala
A

H 2N

CH

O-

CH3

Valina
Val
V
Leucina
Leu
L

H2N

O-

CH

CH

CH3

CH3

O
H2N

CH

O-

CH2
CH

CH3

CH3

Isoleucina
Ile
I

O
H2N

O-

CH

CH

CH3

CH2
CH3

Metionina
Met
M

O
H 2N

CH

O-

CH2
CH2
S
CH3

Prolina
Pro
P

H
N
C
O

O
-

Fenilalanina
Fen
F

H 2N

CH

O-

CH2

10

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Triptofano
Trp
W

H 2N

CH

O-

CH2

186,2

2,46

9,41

HN

Aminocidos com cadeia lateral polar sem carga a pH 7


Nome Smbolo
Serina
Ser
S

Frmula
estrutura

de

Massa
(Da)

pK1
(-COOH)

pK2
(-NH3)

pk3
(R)

87,1

2,19

9,21

101,1

2,09

9,10

114,1

2,14

8,72

128,1

2,17

9,13

163,2

2,20

9,21

10,46
(fenol)

103,1

1,92

10,70

8,37
(sulfidril)

O
H 2N

CH

O-

CH2
OH

Treonina
Thr
T

O
H 2N

CH

CH

OH

O-

CH3

Asparagina
Asn
N

O
H 2N

CH

O-

CH2
C

NH2

Glutamina
Gln
Q

O
H 2N

CH

O-

CH2
CH2
C

NH2

Tirosina
Tir
Y

O
H 2N

CH

O-

CH2

OH

Cistena
Cis
C

O
H 2N

CH

O-

CH2
SH

11

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Aminocidos com cadeia lateral polar carregados a pH 7


Nome
Smbolo
Lisina
Lis
K

Frmula
estrutura

pK1
(-COOH)

pK2
(-NH3)

pk3
(R)

128,2

2,16

9,06

10,54
(-NH3)

156,2

1,82

8,99

12,48
(guanidina)

137,1

1,80

9,33

6,04
(imidazol)

115,1

1,99

9,90

3,90
(-COOH)

129,1

2,10

9,47

4,07
(-COOH)

de Massa
(Da)
O

H 2N

CH

O-

CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
NH 2

Arginina
Arg
R

O
H 2N

CH

O-

CH 2
CH 2
CH 2
NH
C

NH

NH 2

Histidina
His
H

O
H 2N

CH

O-

CH 2

N
NH

cido
asprtico
Asp
D

O
H 2N

CH

O-

CH 2
C

OH

cido
Glutmico
Glu
E

O
H 2N

CH

CH 2

O-

CH 2
C

OH

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Aminocidos e protenas - identificao e purificao

1. Supondo que tem uma mistura de Ala, Val, Glu e Lis a pH = 6.


Desenhe a forma de uma tira de papel revelada pela ninidrina (composto que colora a
soluo) aps realizao da electroforese. Indique o nodo e o ctodo, a origem e a
0posio de cada um dos aminocidos (Nota: calcule a carga formal de cada
aminocido)

2. Explique brevemente porque que a maior parte das protenas globulares:


a. Precipitam a pH baixo.
b. A solubilidade aumenta, depois diminui e finalmente precipitam medida que a
fora inica aumenta de zero a um valor elevado.
c. Precipitam por aquecimento.

3. Pretende-se purificar uma soluo contendo uma mistura de duas protenas: um


citocromo c (p.i. = 10,6) e uma ferredoxina (p.i. = 3,2). Sabe-se que a massa molecular
do citocromo c 13.000 e o da ferredoxina de 6.000.
Que tcnicas poderia escolher para separar estas duas protenas? Qual o princpio base
de cada tcnica.

4. Suponha que pretendia separar duas protenas utilizando, exclusivamente, um


mtodo cromatogrfico.

protena
A
B

Massa molecular
(kDa)
220
310

p.i.
5,7
8,5

a. Qual o mtodo mais eficaz para separar as duas protenas. Justifique.


b. Descreva como procederia experimentalmente para obter as duas protenas em
fraces separadas. Apresente o respectivo diagrama de eluio.

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5. A solubilidade de duas protenas em funo de (NH4)2SO4 indicada na figura.


Tendo em conta os dados, como que procederia para separar as protenas A e B?

6. Qual o efeito dos seguintes factores na afinidade da hemoglobina pelo oxignio?


a. Variao do pH de 7,2 para 7,4. Justifique.
b. Variao da concentrao de DPG de 2x10-4 para 8x10-4 M. Justifique.
c. Dissociao de 22 nas respectivas subunidades. Justifique.
Nota: Para cada uma das alneas desenhe a curva de ligao do oxignio para ambas as
situaes.

7. As curvas de ligao do oxignio de duas hemoglobinas so apresentadas na figura:

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Apesar da curva da hemoglobina X ser hiperblica e a da hemoglobina Y ser sigmoidal


ambas esto 50 % saturadas a uma presso parcial de 30 mm Hg.
a. Qual das hemoglobinas tem maior afinidade pelo oxignio a 20 mm Hg. E a 40 mm
Hg. Justifique.
b. Qual das hemoglobinas apresenta maior eficincia em relao libertao de
oxignio do sangue arterial (75 mmHg) para o msculo (20 mmHg)? Justifique.

8. A curva de saturao pelo oxignio diferente para o sangue fetal e sangue


materno.

a. Qual das hemoglobinas tem uma maior afinidade pelo oxignio em condies
fisiolgicas. Explique.
b. Qual o significado fisiolgico desta diferena.
c. Quando todo o 2,3-difosfoglicerato removido as curvas de saturao so
deslocadas para a esquerda. Qual o efeito do DPG na afinidade pelo oxignio da
hemoglobina.
d. Indique uma razo para a diferente afinidade pelo oxignio dos dois sangues.

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Enzimas - cintica enzimtica

1. Para estudar o efeito da concentrao de substrato na velocidade de uma reaco


enzimtica, adicionou-se uma quantidade constante de enzima numa srie de misturas
reaccionais contendo diferentes quantidades de substrato. A velocidade inicial foi
medida pelo nmero de moles de substrato consumidas por minuto. De acordo com a
tabela das velocidades iniciais determinadas:
[S]
(M)
1,3x10-5
1,5x10-4
2,0x10-4
2,0x10-3
2,0x10-2
2,0x10-1

v
(M/min)
12
45
48
60
60
60

a. Calcule a VMax da reaco.


b. Explique porque razo v constante para S 2,0x10-3 M.
c. Qual a concentrao de enzima livre quando S = 2,0x10-2 M?

2. Supondo uma enzima que obedece cintica de Michaelis-Menten:


a. Qual a Vmax em mol/min se v = 35 mol/min quando S = KM?
b. Qual o KM desta enzima se v = 40 mol/min quando S = 2x10-5 M?
c. Se I um inibidor competitivo, com uma constante Ki = 4x10-5 M, qual ser o valor
de v, quando S = 3x10-2 M e I = 3x10-5 M?
d. Se I um inibidor no competitivo, com uma constante K i = 4x10-5 M, qual ser o
valor de v, quando S = 3x10-2 M e I = 3x10-5 M?
e. Represente graficamente como seriam as curvas de v em funo de concentrao de
substrato para esta enzima nas seguintes condies, indicando V Max e KM:
i. na ausncia de inibidor;
ii. na presena de inibidor competitivo;
iii. na presena de inibidor no competitivo.
iv. na presena de inibidor incompetitivo.

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3. A cintica de uma dada enzima foi medida em funo da concentrao de substrato


na presena e ausncia de um inibidor I, de concentrao 2x10-3 M. Os resultados
obtidos encontram-se na tabela:
[S]
(M)
0,3x10-5

v
(M/min)
sem inibidor
10,4

v
(M/min)
com inibidor
4,1

0,5x10-5

14,5

6,4

1,0x10-5

22,5

11,5

3,0x10-5

33,8

22,6

9,0x10-5

40,5

33,8

a. Construa um grfico de Lineweaver-Burk a partir dos dados da tabela. Mostre que se


trata de um inibidor competitivo. Justifique.
b. Calcule os valores de VMax e KM na ausncia e na presena do inibidor.
c. Calcule a constante de ligao do inibidor enzima.

4. Considere os valores das velocidades iniciais de uma reaco enzimtica para vrias
concentraes de substrato e em presena de um inibidor:
[S]
(M)
0,50x10-4

v
(M/min)
sem inibidor
0,42

v
(M/min)
com inibidor
0,17

0,67x10-4

0,50

0,20

1,00x10-4

0,60

0,24

2,70x10-4

0,66

0,27

5,30x10-4

0,88

0,36

a. Construa um grfico de Lineweaver-Burk a partir dos dados da tabela. De que tipo


de inibio se trata. Justifique.
b. Calcule os valores de VMax e KM na ausncia e na presena do inibidor.
c. Que informao adicional seria necessria para calcular Ki?

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d. Explique como pode determinar Ki graficamente.

5. As enzimas so molculas proteicas que actuam como catalisadores biolgicos. De


que modo a temperatura, concentrao de enzima, concentrao de substrato e o pH
influenciam a velocidade de uma reaco enzimtica.

6. Investigou-se o efeito do pH na constante de Michaelis-Menten (KM) da enzima 6fosfogluconato desidrogenase. Utilizando tampes de pH a 7,6 e a 9,0 e mantendo
constante a concentrao total de enzima, a actividade da desidrogenase foi medida
espectrofotometricamente seguindo a reduo do fosfato de nicotinamida adenina
dinucleotdeo ao comprimento de onda 340 nm. As velocidades iniciais, medidas para
diversas concentraes de substrato, encontram-se na tabela seguinte:
[S]
(M)
1,74x10-5

v
(M/min)
pH 7,6
74

v
(M/min)
pH 9,0
34

2,67x10-5

85

47

5,26x10-5

98

75

16,66x10-5

114

128

a. Calcule o valor de KM da enzima para cada valor de pH.


b. A que pH a enzima tem maior afinidade para o substrato. Justifique.
7. Considere os seguintes dados:
Protena

subunidades

Citocromo c
Hemoglobina
Protena
desconhecida

1
4
2

MM
(KDa)
32
64

6000
9000

Vol (ml) Abs 410 Distncia


nm
percorrida
2.5
0.25
1
0.6
1 cm
4 cm

a. Calcule o volume necessrio para colocar no gel de SDS 4 ug de cada uma das
protenas.
b. Desenhe o gel de SDS obtido.
c. Calcule a massa molecular da protena desconhecida considerando os seguintes
valores:
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distncias percorridas pelos padres: 80 KDa (1 cm), 50 KDa (2 cm), 40 KDa (3


cm), 30 KDa (4 cm), 20 KDa (5 cm);
distncia total percorrida pelo sample buffer percorrida 6 cm
d. O que se pode concluir relativamente constituio da protena desconhecida.
e. Suponha agora que tem uma mistura de citocromo c e hemoglobina.
f. Desenhe o gel obtido.

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