Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Reaccin en Cadena de la
Polimerasa
(RCP)
INTRODUCCION:
Dcada de los 70: Grandes avances en
Biologa Molecular:
Enzimas de restriccin
Clonacin de genes en plsmidos y fagos
Tcnicas de hibridacin en filtro para ADN y ARN
Tcnicas de secuenciacin qumica y enzimtica
ADN
INTRODUCCION
1983: Kary Mullis desarrollo una nueva
tcnica que hizo posible la sntesis de
grandes cantidades de un fragmento de
ADN sin necesidad de clonarlo: PCR
(polymerase chain reaction).
Consigui copiar millones de veces, en un
par de horas, una secuencia predeterminada
dentro de una mezcla de ADN.
PCR: Definicin
PCR: Definicin
Es una tcnica:
Altamente especifica
Muy sensible: en principio, para practicarla
bastara una sola molcula (genoma humano)
~6 picogramos.
Robusta, utiliza como sustrato al ADN de
muestras sin necesidad de ser purificada de su
fuente natural (tejidos embebidos en parafina,
lavados bronquiales, exudados de mucosas, etc)
PCR: Componentes de la
Reaccin
1.
-
PCR: Componentes de la
Reaccin
PCR: Componentes de la
Reaccin
2. DNA molde:
- La concentracin de DNA molde depende de la
fuente utilizada.
- Idealmente: 20 nanogramos a 1 microgramo de
DNA genmico de clulas eucariotas.
- No es necesario purificar el DNA molde.
- Eliminar los inhibidores de la polimerasa.
- Para muestras clnicas: extraccin con fenolcloroformo y posterior precipitacin de cidos
nucleicos con etanol o isopropanol.
PCR: Componentes de la
Reaccin
3. Cebadores o iniciadores (Primers):
-Oligonucletidos sintticos
-Componente mas sensible que determina el xito de
la PCR.
-Se deben seleccionar dos iniciadores que estn
localizados en los extremos de la regin de inters.
- Longitud: 18 a 30 nucletidos ( < especificidad).
- Contenido: G+C entre 40-75%.
- Concentracin: 0.1 a 0,5 uM.
- Deben carecer de estructura secundaria.
PCR: Componentes de la
Reaccin
- No deben ser complementarios entre si.
- Existen programas informticos para el diseo de
cebadores.
- El extremo 3 del nucletido iniciador se fija a un
soporte slido (gel de slice) y un sintetizador de
DNA aade paso a paso cada nucletido en una
serie de etapas.
PCR: Componentes de la
Reaccin
4. Dexosirribonuclesidos trifosfatados
(dNTPs):
- Son los ladrillos con los que se construye las nuevas
cadenas de DNA.
- Cuatro: dATP, dTTP, dCTP y dGTP.
- Concentracin equimolar de los 4 dNTPs
- Concentracin ptima: 20 y 200 uM.
- Bajas concentraciones: < ndice de incorporacin.
- Altas concentracines: < especificidad
PCR: Componentes de la
Reaccin
5. Otros componentes:
- Solucin amortiguadora:
Incluye: HCl, KCl, gelatina y MgCl2.
Mantiene el pH ptimo para que la enzima acte.
- Agua:
RCP: Etapas.
1. Desnaturalizacin DNA
T: 92-98C
30-90 seg
RCP: Etapas.
2. Alineamiento
Enfriamiento de la reaccin
Hibridacin de cadenas desnaturalizadas con
cebadores o iniciadores (Primer: DNA sinttico de
hebras sencilla)
Temperatura optima (T de fusin) depende de
los cebadores (generalmente 50 a 60 C)
Alineamiento
T: 50-60C
RCP: Etapas.
3. Reaccin de extensin:
Reaccin de extensin
T: 72 C
RCP: Etapas.
RCP: Etapas.
RCP: Etapas.
Contaminacin en PCR:
Despus de la amplificacin:
DNA puede colocarse en gel de agarosa
Realizar el corrimiento electrofortico,
Teirlo y observar en luz ultravioleta el producto de
la RCP.
PCR:DESVENTAJAS
La PCR supuso un gran avance y permiti
introducir la biologa molecular de forma
generalizada en los laboratorios asistenciales.
PCR:DESVENTAJAS
De esta manera se tarda entre 2 a 4 das en
poder informar un resultado.
Se necesita disponer de personal altamente
especializado.
Espacio suficiente para poder separar varias
reas de trabajo con la finalidad de evitar la
temible contaminacin por ADN sintetizado
con anterioridad.
Colorantes intercalados
Sondas marcadas.
Sondas Taqman
PCR:DIAGNOSTICO DE LA
GRIPE A
El virus de la gripe A(H1N1) deriva de
diferentes linajes que han circulado en
cerdos en el ltimo tercio del siglo XX.
Se tratara de un ejemplo ms del papel que
se sabe que desempea este mamfero como
mediador en el reagrupamiento gentico del
virus de la gripe A que posteriormente
acaba afectando a humanos.
PCR:DIAGNOSTICO DE LA
GRIPE A
El anlisis filogentico de los diferentes
fragmentos genmicos del virus A(H1N1)
muestra un cudruple origen.
En una fase final parece haberse producido
una modificacin del virus porcino AH1N1
(linaje clsico porcino norteamericano,
linaje aviar norteamericano y linaje
humanoH3N2).
Obtencin, conservacin y
transporte de las muestras
1. Tipos de muestras:
Muestras inadecuadas
moco
saliva
Obtencin, conservacin y
transporte de las muestras
2. Conservacin y transporte
Obtencin, conservacin y
transporte de las muestras
3. Condiciones de bioseguridad
PCR-TR : GRIPE A
Componente del virus que detecta:
Tipo de ensayo:
Tiempo de realizacin:
3-4 horas.
PCR-TR : GRIPE A
Sensibilidad de la prueba:
PCR-TR : GRIPE A
Especificidad de la prueba:
PCR-TR : GRIPE A
Ventajas:
a)
b)
Sensible y especfica.
Rpida, aunque esta depender:
a)Disponibilidad de equipos humanos organizados y
bien entrenados, y
b)Volumen de muestras a procesar.
c)
PCR-TR : GRIPE A
Inconvenientes:
a)
b)
c)
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
Deteccin de antgenos virales:
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
Se han comercializado tcnicas:
Inmuno-cromatografa capilar y
Enzimoinmunoanlisis de membrana
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
Amplia implantacin en la asistencia
urgente y en el mbito peditrico
No obstante, su utilidad se ve limitada
debido a su coste y bajas sensibilidad y
especificidad.
GRACIAS