ENZIMOLOGIA I

Jhojan Alexis Castro Muelas, Cdigo: 1537443

Gustavo Estrada, Cdigo: 1341850
Oscar David Collazos, Cdigo: 1439420
Mauricio Marn Ospina, Cdigo: 1510348
Universidad del Valle, FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS
FISIOLGICAS, METABOLISMO, Programa de Bacteriologa y
Laboratorio Clnico (3467)
10 de mayo del 2016

RESUMEN
La prctica se centr ms que todo en el estudio de las fosfatasas las
cuales son enzimas catalizadoras de hidrolisis y en el manejo de los
instrumentos de la espectrometra. En esta prctica se hizo una curva de
calibracin para hallar la concentracin de la muestra que fue de .. .
Tambin se determin las variaciones de la catalizacion de la enzima
fosfatasa si se le cambia la temperatura, el tiempo y el pH. Esto se
realiz utilizando el sustrato sinttico p-nitro-fenolfosfato.
RESULTADOS
1. Curva de calibracin
Tabla 1. Absorbancia y transmitancia de la solucin de PNF
Tubo (ml)
Blanc
SOLUCION
1
2
3
4
5
o
H2O destilada
1,5
1,47 1,44 1,41 1,35 Muestr
Buffer Barbital
a
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
pH=9,6
Proble
PNF 2,0mM
0,03 0,06 0,09 0,15
ma
Ex. Enzima
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Transmitancia
51,0 26,8 14,2
8,0
32,4
0,29 0,57 0,85
Absorbancia
1.1
0,440
2
2
0
Concentracin
0,02 0,04 0,06
0,1
(mM)

Las concentraciones finales del PNF se calcularon segn la Ecuacin 1

Tubo 1
( 2,0 mM0,03 mL )
C 2=
3 mL

Tubo 3
2,0 mM0,09 mL
C 2=
3 mL
C 2=0,06 mM

C 2=0,02mM

Tubo 4
2,0 mM0,15 mL
C 2=
3 mL

Tubo 2
2,0 mM0,06 mL
C 2=
3 mL

C 2=0,1mM

C 2=0,04 mM

Con los datos obtenidos de concentracin y absorbancia, se realiz la

curva de calibracin para el pNF (Figura 4) Obteniendo la ecuacin lineal
(Ecuacin 3) con un

R =

0,9994 cercano a 1 , indicando que tanto las preparaciones como los datos

ofrecidos por el colormetro tuvieron de un margen de error mnimo.

y=2,3629 x +0,0835

Ecuacin 3.

Donde y es la Absorbancia y x es la concentracin.

Se realiza el mismo procedimiento anterior, reemplazando el valor de
absorbancia en la ecuacin se obtiene que la concentracin de muestra
problemas es:
0,4400,0835
x=
2,3629
x=0,146 mM

2. Grafica de absorbancia vs concentracin del p-nitro fenol

Se ubic en la grfica la concentracin de la solucin problema
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.1 1.2

FALTA UBICAR LA SOLUCION PROBLEMA PERO NO SE COMO HALLAR LA

CONCENTRACION DE ESO
Efecto de la temperatura
- Se prepararon las soluciones segn los datos que suministra la Tabla
1.
- Antes de adicionar la enzima, se incubaron los tubos con los otros
reactivos por ms de 3 minutos en las diferentes temperaturas.
- Culminado el tiempo de incubacin, se agreg 0.1mL de la enzima a
cada tubo (con una diferencia de 3 minutos entre cada tubo) y
rpidamente se registr su Absorbancia.
3.

Tabla 1. Datos de preparacin de las distintas soluciones y de las

absorbancias registradas, influenciadas por las distintas temperaturas
de tratamiento.
TUBO (ml)
SOLUCIN
Buffer B. pH 9.6

Blanc
o
0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

5
0.3

Agua destilada
p-NF 2.0mM
Temperatura C
Ex Enzima FAL

2.7
------25C
0.1

2.4
0.3
4C
0.1
0,09
3

Absorbancia

2.4
0.3
30C
0.1
0,08
3

2.4
0.3
37C
0.1
0,24
7

2.4
2.4
0.3
0.3
50C 100C
0.1
0.1
0,21 0,03
9
0

Grafica de A vs Temperatura
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

20

40

60

80

100

120

4.Efecto del pH
- Se prepararon las soluciones segn los datos que suministra la Tabla 2.
- Antes de adicionar la enzima, se incubaron los tubos con los otros
reactivos por ms de 3 minutos a 37C.
- Culminado el tiempo de incubacin, se agreg 0.1mL de la enzima a
cada tubo (con una diferencia de 3 minutos entre cada tubo) y
rpidamente se registr su Absorbancia.
Tabla 2. Datos de preparacin de las distintas soluciones y de las
absorbancias registradas, influenciadas por los distintos valores de pH.

SOLUCIN
Buffer 0.3 mL

TUBO (ml)
1
pH
3.4

2
pH
7.0

3
pH
9.2

4
pH 9.6

5
pH
10.4

6
pH
10.8

Agua destilada
p-NF 2.0mM
Enzima FAL

2.4
0.3
0.1
0,15
2

Absorbancia

. 5.

2.4
0.3
0.1
0,18
5

2.4
0.3
0.1
0,27
0

Grafica de A vs pH

0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

10

11

12

2.4
0.3
0.1

2.4
0.3
0.1

0,371

0,304

2.4
0.3
0.1
0,20
5

DISCUSIN DE RESULTADOS

A travs de la experimentacin realizada fue posible determinar que

toda sustancia tiene propiedad ( que es eso? )
CONCLUSIONES

Los procedimientos realizados durante la prctica fueron, en

teora, buenos y certeros.
La grafica No. 1 presenta un comportamiento bastante extrao
que puede deberse a errores personales o de manejo de
instrumentacin. A pesar de ello en la grfica se puede evidenciar
que la temperatura ptima para el funcionamiento de la enzima es
37C, pues a temperaturas extremas como 4C y 100C la enzima
esta desnaturalizada y no puede cumplir su funcin. Por otro lado
se puede analizar que la temperatura optima del funcionamiento
de la enzima corresponde a nuestra temperatura corporal, lo que
tiene mucho sentido cuando se piensa en que la actividad
enzimtica en nuestro cuerpo debe ser optima, de no ser as, el
ser humano puede presentar mltiples fallas en su organismo.
La grafica No. 2 presenta un comportamiento curvilneo
caracterstico de la enzima fosfatasa alcalina, aunque se deben
tener en cuenta posibles errores personales o de manejo de
instrumentacin. Sin embargo, se observ que el pH ptimo en el
cual la enzima desempea de mejor manera sus funciones es pH
9.6, por lo tanto, a valores de pH por debajo o por encima de este
valor, la funcin de la enzima se ve disminuida.
Por otro lado, tiene relacin el pH obtenido con el sitio donde se
encuentra la enzima, ya que al ser una fosfatasa alcalina se
espera que se encuentre en un medio que determine un rango de
pH alcalino considerable. El pH normal para todos los tejidos y
fluidos en el cuerpo, excepto el estmago, es alcalino. Las
secreciones digestivas del hgado y su bilis estn entre 7.1 y 9.0.
La bilis de la vescula est entre 5.0 y 7.7. Si cualquiera de estos
sistemas de pH no est en el rango ptimo, las enzimas digestivas
y metablicas en esas reas y rganos funcionarn bajo nivel
ptimo y se experimentar una baja en la salud. Con la excepcin
de la sangre, todos estos sistemas tienen un vasto rango de pH, en
parte, para que puedan cambiar el pH para mantener el balance
en el pH de la sangre, que debe mantenerse entre 7.35 y 7.45. [1]

Por tal razn, La fosfatasa alcalina es una hidrolasa con muy poca
especificidad de sustrato y se encuentra presente en casi todos los
tejidos del cuerpo, especialmente, en epitelio intestinal, tbulos
renales, hueso, hgado y placenta. Su localizacin celular es la
membrana. Los individuos de los grupos sanguneos B y O
secretores tienen la isoenzima intestinal aumentado en sus sueros.
[2]

ANEXOS
1. Figura 1. Curva de calibracin

Figura 2. Grafca de absorbancia vs concentracin del pnitrofenol

Figura 3. Grafica de absorbancia vs temperatura

Figura 4. Grafica de absorbancia vs pH

Figura 3. Curva de Calibracin KMnO4. Transmitancia vs Concentracin

BIBLIOGRAFIA
[1] http://www.holadoctorfeldman.com.ar/dietaalcalina.html
[2]
http://www.infobioquimica.com/wrapper/CDInterpretacion/te/bc/19
4.htm