ENZIMOLOGA I

MARA CRISTINA LUNA LPEZ (1541236)

DIANA YURLEY BRAVO LPEZ (1543171)
LUISA FERNANDA RIVERA FORERO (1543556)
ANGLICA MARA ROJAS MAYOR (1543378)

PRESENTADO A:
NGELA MARA ESCUDERO R. MD.

FACULTAD DE SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLGICAS

PROGRAMA DE BACTERIOLOGA Y LABORATORIO CLNICO

METABOLISMO

SANTIAGO DE CALI, VALLE.

MAYO 19 DE 2016

Resumen. En esta prctica realizamos procedimientos experimentales para la determinacin del efecto sobre la actividad
enzimtica en la variacin del pH y la temperatura en la enzima fosfatasa, utilizando el sustrato p-nitro-fenilfosfato (PNFP),
obteniendo la mayor absorbancia para una temperatura de 37 C y pH de 9.6.Adems se utiliz la ley de Beer-Lambert para
establecer la concentracin de una muestra realizando una curva de calibracin con un resultado de 0.11 mM en la muestra
problema.
Palabras clave: Enzimas, fosfatasas, pH, temperatura, tiempo.

INTRODUCCIN
Las fosfatasas son un conjunto de enzimas capaces de
hidrolizar los esteres fosfato de diversos fosfolpidos. Si
son activadas a un nivel de pH inferior a 7 se denominan
fosfatasas cidas mientras que si son activadas a un pH
superior a 7 se denominan fosfatasas alcalinas. Son
enzimas con actividad fosfomonoesterasa que se
encuentra en las membranas celulares de diferentes
rganos, entre ellos, en el hueso, placenta, intestino,
leucocitos y otros [1]. En el proceso de clasificacin de las
fosfatasas se han sealado cuatro diferentes tipos de esta
enzima:

PROCEDIMIENTO
1.

Fosfomonoesterasas: catalizan la hidrlisis de

monoesteres de cido fosfrico.
Fosfoesterasas: que tienen accin sobre disteres del
mismo cido.
Pirofosfatasas: las cuales hidrolizan esteres de cido
pirofosfotico
Metafosfatasas: quienes hidrolizan esteres de cido
metafosfrico y (HPO3)n [2]
Existen diferentes factores que influyen en la
determinacin de la actividad enzimtica entre ellos
encontramos:
La Temperatura: que en general aumenta la velocidad
de la reaccin del mismo modo que la actividad enzimtica
aumenta sin embargo al alcanzar determinadas
temperaturas aparecen fenmenos de desnaturalizacin de
la protena enzimtica y la enzima se inactiva.
Tampn y pH: existe el valor de pH optimo que es
cuando la efectividad de la enzima es mxima.
Presencia de cofactores: las coenzimas son sustancias
que aumentan la actividad de la enzima y por tanto la
sensibilidad del mtodo analtico.
Concentracin del substrato: si se mantienen constantes
el resto de las variables, la velocidad de la reaccin
enzimtica aumentar hasta un punto determinado con
concentraciones crecientes del substrato. [1]
OBJETIVOS

Conocer y adquirir experiencia en el manejo de

los instrumentos empleados en el laboratorio, en
especial el espectrofotmetro.
Conocer la naturaleza, caractersticas generales y
mecanismos de la regulacin de las enzimas para
entender su gran incidencia en los procesos
metablicos que tienen lugar en el organismo.

Determinar el efecto sobre la actividad

enzimtica de la variacin del tiempo, pH,
temperatura, en la enzima fosfatasa, utilizando el
sustrato sinttico p-nitro-fenilfosfato.
Observar el comportamiento de la enzima
fosfatasa que es tan abundante en animales,
vegetales y microorganismos.
Identificar cual es la temperatura y PH ptimo
para la fosfatasa alcalina.

Curva de calibracin de p-nitrofenol

Con una longitud de onda de 405 se determin la
relacin entre absorbancia y concentracin y
entre transmitancia y concentracin.
En cinco tubos de ensayo se realizaron las
siguientes soluciones y se obtuvieron los
resultados contenidos en la Tabla 1.

Solucin
Agua
Buffer
pH 9.6
Barbital
PNFP 2.0
nM
Absorba
ncia
Transmit
ancia

blanco
1.5
1.5

1
1.47
1.5

TUBO (mL)
2
3
1.44
1.41
1.5
1.5

4
1.35
1.5

Soluc
in
Probl
ema

--------

0.03

0.06

0.09

0.15

0.25

0.66

1.2

1.27

0.83

0.04

0.08

0.12

0.2

26.6

Tabla 1. Datos para la curva de calibracin de pnitrofenol.

Concentracin de la muestra problema:
=
Donde:
A= Absorbancia
= Coeficiente de extincin molar
c= Concentracin

[1]

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Fig 1. Absorbancia vs concentracin

2.

TUBO (mL)
blanc
o
2.7

Agua

2.4

2.4

2.4

2.4

2.4

2.4

Efecto de la temperatura.

Buffer
0.3 mL

0.3

pH
3.4

pH
8.8

pH
9.2

pH
9.6

pH
10.4

pH
10.8

Se prepararon las siguientes soluciones

realizando una preincubacin de cada tubo de
ensayo durante tres minutos. Cumplidos los tres
minutos de preincubacin con diferencias de 1
minuto entre tubo y tubo se agreg 0.1 ml de la
enzima FAL, se dej incubar nuevamente por tres
minutos, los datos obtenidos se muestran en la
Tabla 2.

PNFP
2.0 nM

--------

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

Enzima
FAL
Absorb
ancia

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

---

0.16
5

0.32
1

0.32
8

0.43
8

0.23
9

0.12
5

Solucin

Tabla 3. Datos del efecto del pH.

TUBO (mL)
blanco

Agua

2.7

2.4

2.4

2.4

2.4

2.4

Buffer
pH 9.6
PNFP 2.0
nM

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

--------

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

25C

4C

30C

37C

50C

100C

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

---

0.08

0.204

0.279

0.189

0.112

Tempera
tura
Ex.
Enzima
FAL
Absorba
ncia
405nm

0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

10

15

pH
Fig 2. Grafica de A vs pH

Tabla 2. Datos obtenidos sobre el efecto de la

Temperatura.
0,3

ABSORBANCIA

Efecto del pH
Se prepararon las soluciones indicadas realizando
preincubacin a cada tubo durante tres minutos
a 37C. Cumplidos los tres minutos con una
diferencia de tiempo de un minuto entre cada
tubo se agreg 0.1 mL de la enzima FAL y se dej
incubando por otros tres minutos, Seguidamente
se anexaron los datos obtenidos en la Tabla 3.

Soluci
n

CONCENTRACIN

ABSORBANCIA

ABSORBANCIA

3.

1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0

RESULTADOS
Tomando los valores obtenidos para la curva de
calibracin del p-nitrofenol (Tab. 1) y la ec. 1. se obtienen
los siguientes valores para la concentracin:

0,25
0,2
0,15

BLANCO

0,1

0,05

50

100

TEMPERATURA
Fig 1. Grafica de A Vs Temperatura

150

CONCENTRACIN

ABSORBANCIA

0.04

0.25

0.08

0.66

0.12

1.2

0.2

1.27

Tabla 4. Concentracin de las muestras segn

absorbancia.

Para la Muestra Problema, se obtuvo una absorbancia de

0.83. Calculando con la le Beer-Lambert, se obtiene una
concentracin aproximada de 0.11 mM.
Para determinar la mxima actividad con variaciones del
pH, se midi la absorbancia de cada tubo con pH distintos,
consignados en la siguiente tabla.
ABSORBANCIA

pH

BLANCO

0,3

0,165

3,4

0,321

8,8

0,328

9,2

0,438

9,6

0,239

10,4

0,125

10,8

Tab 5. Absorbancia de p-nitrofenol en diferentes pH.

Se concluye que el pH ptimo para la fosfatasa es de 9.6,
evidenciando la actividad alcalina de la enzima.
Al evaluar la actividad enzimtica al variar la temperatura,
se obtuvo una mxima absorbancia de 0.279 a una
temperatura de 37 C, valor aproximado a la temperatura
corporal normal.

BLANCO

ABSORBANCIA

TEMPERATURA

25

0,08

0,204

30

0,279

37

0,189

50

0,112

100

Tab 6. Absorbancia de p-nitrofenol en diferentes

temperaturas.
CONCLUSIN
Con los resultados obtenidos durante la prctica, se
observa que son satisfactorios al cumplir parcialmente con
los valores aceptados de absorbancia para cada
concentracin de p-nitrofenol, y por variar al cambio de
pH al reflejar una mxima absorbancia en un pH de 9.6.
Los valores de temperatura del medio en el que se
encuentra la enzima y la absorbancia reflejan una
actividad enzimtica alta a los 37 C, valor cercano a la
temperatura corporal.

DISCUSIN DE RESULTADOS
Los resultados de la prctica experimental pese a que
fueron precisos, son susceptibles a errores; esto se debe
principalmente a errores humanos, dados por un inexperto
manejo de los equipos y mala calibracin de los mismos
por parte de los estudiantes, posibles fallas en el
espectrofotmetro debido a su tiempo de uso, posibles
errores debido a la prdida de calor al llevar el tubo del
bao de mara al instrumento y la falta de control sobre el
tiempo que pasaron las soluciones expuestas al calor. No
obstante, la prctica fue considerada como satisfactoria, ya
que permiti relacionar el pH y la temperatura con la
actividad de la fosfatasa alcalina, as como relacionarlo
con su efecto en el cuerpo humano.
En el cuerpo humano, la fosfatasa alcalina est presente
principalmente en las membranas plasmticas de
osteoblastos, clulas del hgado, rin, bazo y placenta y
su papel principal est asociado a la desfosforilacin de
nucletidos y protenas. Mediante la prctica experimental
su pudo determinar que la temperatura ptima para la
fosfatasa alcalina corresponde a 37 C, lo que en el
organismo del hombre se considera la temperatura normal.
Cuando dicha temperatura aumenta los niveles de esta
enzima aumentan y con ello su actividad, lo que a largo
plazo puede indicar infeccin de la va biliar, neoplasia
heptica, tuberculosis miliar, linfoma, hipernefroma,
mononucleosis o citomagalovirus.
El pH ptimo para la fosfatasa alcalina es de 9.6, ya que es
el punto donde existe la mayor absorbancia esto debido a
que la enzima funciona mejor en medios alcalinos, esto se
debe a la influencia del pH en el estado de ionizacin de
los grupos funcionales en la molcula de enzima y el
sustrato. El pH tiene una relacin intrnseca con el lugar
donde se encuentra la fosfatasa alcalina en el cuerpo ya
que como su nombre lo dice acta en un medio alcalino
(pH ptimo 8,6 a 9,1), est normalmente presente en la
sangre y los tejidos con cantidades ms altas de FA
abarcan el hgado, las vas biliares y los huesos.
REFERENCIAS
[1] J. Diaz, Portillo. M.T, Fernandez del barrio. F. P,
Salido.Aspectos bsicos de bioqumica clnica. Madrid
Estaa. 1997.
[2] Solrzano Martha. Prcticas de laboratorio
Metabolismo. Universidad del Valle. Facultad de salud.
Departamento de Ciencias fisiolgicas. Cali, 2016.
[3] Lehninger,A. Principios de bioquimica- Enzimas.
Ediciones Omega, S.L., 2014