UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

ESCUELA DE POST GRADO

ESPECIALIDAD DE TECNOLOGA DE ALIMENTOS
CURSO TOXICOLOGIA DE ALIMENTOS AVANZADA
2009-I
PRACTICA: IDENTIFICACION DE COMPUESTOS CARCINOGENOS COMO MUTAGENICOS
MEDIANTE EL MPF
I. OBJETIVOS

Evaluacin de compuestos carcinognicos como mutagnicos en mediante el test

MPF.

II. JUSTIFICACIN
El test de Ames es comnmente usado como una prueba eficiente y barata para la
determinacin de sustancias mutagnicas. Las bacterias que son deficientes en la
biosntesis de histidina (His-) se extienden en un slido de agar que contiene
azcares y sales inorgnicas (medio mnimo). El medio mnimo no contiene el
aminocido histidina o cualquier otro suplemento de aminocidos. Entonces la
bacteria no crece a menos que sea objeto de una reversin de mutacin. En el test
de Ames, las bacterias se mezclan con la sustancia (posible mutagnico) en el medio
mnimo. Si la sustancia es mutagnica, algunas de las bacterias se someten a una
reversin de mutacin y sern capaces de crecer en ausencia de histidina. Si el
producto qumico no es mutagnico entonces las bacterias no crecern. Lander, E.
et al. (2004).
Esta tradicional prueba de Ames de incorporacin sobre placa, es uno de los ms
comnmente realizados ensayos de genotoxicidad en el mundo, cuyos ensayos han
sido reglamentados. Sin embargo, con el proceso de desarrollo aparecen ms
qumicos y con ello la creciente demanda de los primeros indicios de la mutacin y
potencial de carcinognesis. Entonces el tradicional formato de este test no puede
servir a este mercado actualmente, ya que requiere demasiados anlisis qumicos, el
trabajo y el tiempo son muy largos. El ensayo de Ames MPF Mutagenicidad, se basa
en el mismo principio del test de Ames, sino que establece un nuevo estndar para
este tipo de pruebas, ofrecen varias ventajas sobre el mtodo tradicional test de
Ames. Los anlisis de este ensayo se citan en las directrices de la FDA.

III. FUNDAMENTO
III.1

Mutaciones, mutgenos.

Los agentes qumicos carcinognicos pueden producir mutaciones, originando

cambios ocasionales de unas bases por otras, eliminacin o el intercalamiento en
una secuencia dada de ADN. La informacin del ADN es alterada de manera que
la secuencia que se transmite a la siguiente generacin es diferente dando como
resultado modificaciones en el ADN. Estas alteraciones son mutaciones y aunque
algunas de ellas son letales otras son compatibles con la vida. Sin embargo
dichos cambios pueden quedar restaurados eficazmente o con un fallo en la
reparacin que se le conoce como mutagnesis (Trossero, 2005).
Mutagenesis: Este mecanismo, tambin denominado reparacin tendente
al error, es el ltimo recurso de la clula para asegurar su supervivencia
frente a una lesin que no ha podido ser resuelta por otros procesos de
reparacin. Esto es debido a que el DNA polimerasa detecta la lesin y
ante la imposibilidad de repararla, esta se detiene hasta que una
polimerasa capaz de insertar un nucletido incorrecto frente a la lesin
lleva a cabo una reparacin tendente al error, producindose de esta
manera la mutacin, pero permitiendo que contine la sntesis normal de
las funciones del ADN. (Friedberg et al. 1995).
III.2

Reparacin de las clulas ante una alteracin:

Las clulas tienen un mecanismo de reparacin de lesiones (escisin), este

mecanismo consiste en una reparacin de alta fidelidad por daos fsicos o
qumicos en la cadena de ADN, para que esta reparacin se lleve a cabo se
necesita los genes de uvrA, uvrB, uvrC y uvrD de la DNA polimerasa I y de la DNA
ligasa., siguiendo una secuencia, reconocimiento del dao, escisin de la cadena
lesionada y sntesis de la nueva cadena, conocido como Short part repair
(Friedberg et al. 1995).
Las cepas usadas en el test de Ames contienen mutaciones en el opern histidina
que es un requisito para la sntesis de histidina. Esta reversin de la cepa mutada
por el compuesto toxico se analiza en los resultados de la prueba. Para ello las
cepas han sufrido la eliminacin de la regin de uvrB,

por lo tanto el

cromosoma elimina el sistema de reparacin por escisin de ADN. Siendo

eliminados el gal y rfa (eliminan las mutaciones en diversos grados de la cadena

de polisacridos) Legator y Mailing, (1971).
III.3

Activacin de compuestos a su forma activa carcinognica

Las formas activas de carcingenos

policclicos,

como la aflatoxina, hidrocarburos

y varias aminas aromticas Se forman en el metabolismo de los

mamferos, esto debido a un complejo de CPYs fase I y GTPs en la fase II quienes

activan muchos compuestos carcinognicos, entonces esta es una limitacin de
cualquier sistema bacterial de deteccin de carcingenos como mutagnicos ya
que las bacterias no duplican metabolismo de los mamferos en la activacin de
carcingenos (Ames, 1971).

Sin embargo. Garner et al. (1972) uso los

homogenatos de hgado para activar compuestos carcinognicos como aflatoxina

B1, dimetilnitrosamina. Haciendo posible la determinacin de compuestos
carcingenos como mutagnicos mediante el Test de ames.
III.4

Salmonella Thypimurium:

El conjunto TA1535 (TA1535, TA1536, TA1537, TA1538) no tienen urvB y rfa por
ende tienen diferentes secuencias de DNA en el sitio de mutacin de histidina y
cada tipo es revertiente para cada compuesto toxico por ejemplo para
compuestos como los hidrocarburos policclicos aromticos es recomendable el
TA1538 y TA1537. Para la aflatoxina es recomendable usar el TA1538 (Ames,
1971).

IV. MATERIALES Y MTODOS

A. Kit MPF

Medios
Medio GM
Medio de crecimiento (liquido)
Medio de exposicin (liquido) 6 concentraciones
Control positivo
Control negativo
Medio indicador de pH
*Los medios deben estar entre 20 25C, protegidos de la
luz

Cultivos
S. typhimurium (TA100)

B. Reactivos
Agua destilada.
2-Aminoanthracene (2-AA)
Qumico a analizar
4.1.

4.2.

Materiales
-

Tubos criognicos de polipropileno cap. 2mL

Pipetas de plstico

Micropipetas volmenes de 10 -100 L, y 100 - 1,000 L

Beakers capacidad de 200 mL

Tubos de 50mL con tapas filtro

Fiolas de 50mL

24 microplacas

384 posos, o microplacas

Caja de luz

Equipos
-

Agitador

Balanza Analtica

Centrfuga

Microcontador de colonias

4.3.

Estufa

Metodologa experimental de desarrollo

Primero:
Sacar las cepas del congelador y dejarlo a temperatura ambiente por
5min., extraer 200ul y aadirlo al medio GM. Agitar suavemente por 5min.
Aadir 10ml del medio de crecimiento a dos tubos de 50ml previamente
etiquetados indicando TA 100 y control negativo
Pipetear 50ul de la dispersin (medio GM y cepas) al tubo TA 100
Colocar las tapas en los 2 tubos TA100 y control negativo, asegrese con
cintas adhesivas llevar a 37C x 250RPM durante toda la noche.
Segundo:
Despus de la incubacin medir la D.O. (densidad ptica del cultivo) a
600nm en un espectrofotmetro usando una cubeta de cuarzo.
Aadir 900ul del tubo TA100 y control negativo a una cubeta de cuarzo.
Leer la DO del TA 100 y el control negativo
Verificar que el valor del tubo TA100 es al menos 2,0 y el control negativo
es < 0,05.
Si TA100 es < 2 entonces no hubo suficiente crecimiento de UFC (10 7), esto
es probable porque no hubo buen almacenamiento a -70C, no hubo
aireacin suficiente o el tiempo de incubacin no fue suficiente. Si el
control negativo es >0,05 nos dice que hay contaminacin en el medio y no
es recomendable usar las cepas para el ensayo.
Tercero:
Preparar las dosis que se van evaluar del producto toxico posible
carcinognico: 5, 10, 100, 200, 400 y 800 ug/ml
Aadir 6 ml del medio de exposicin en 8 microplacas etiquetandolas (1 6)
y controles positivos (C+) y control negativo (C-)
Aadir 200ul del tubo TA100 en cada micro placa (1 6) incluido los tubos
con controles positivos (C+) y negativos (C-).
(C-): tiene 0 dosis de evaluacin
(C+): Tiene 4ug/ml de 2-Aminoanthracene (2-AA)

*4ug/ml de 2-Aminoanthracene (2-AA) son suficientes para conseguir reversin

de histidina en todas las clulas viables.
* Las concentraciones del medio de exposicin contienen 15ug/ml de
aminoacridina. Y la fraccin S-9 30%.

Aadir 10ul de cada una de las dosis preparadas de la sustancia toxica a

evaluar a cada uno de las microplacas (1 6).

Colocar las placas en una incubadora a 37C x 250rpm por un tiempo de

90min.
* La aminoacridina presente en los medios de exposicin nos promover una
preincubacin y una mayor sensibilidad de la cepa al medio de exposicin.

Cuarto:
Despus de los 90min aadir 2,8ml del
indicador de medio en cada placa, este
reacciona y se torna de color prpura.
Tenga cuidado de no contaminar el medio
indicador.
* El indicador reacciona con el medio libre de
histidina, ya que las bacterias consumieron
todo el aminocido en los 90min de incubacin
para promover una preincubacin.

Quinto:
De cada placa se toman 50ul en 48 alcuotas y son llevados al contador caja
de luz donde hay 348 pozos.
Siendo 48 espacios para cada una de las dosis a evaluar incluido controles
positivos y negativos.
Se deja incubando por 48 horas a 37C

 Dentro de 48 horas las clulas que han logrado favorecer la reversin de

histidina crecen. El metabolismo de las colonias bacterianas disminuye el pH
del medio, cambiando el color del medio de prpura a amarillo. Este cambio
de color se puede detectar visualmente o por el lector de microplacas. Este

fenmeno se debe a que el pH desciende (5,2) por actividad catablica de

las clulas revertientes que crecen en la ausencia de histidina.
Se cuenta el nmero de compartimientos que cambiaron de color
(revertientes inducidos) para cada dosis y se compara con el control
negativo (revertientes espontneos). Un aumento relativo a la dosis en el
nmero de colonias revertientes sobre la exposicin a un producto indica
que el producto qumico es mutgeno.
Se calculara la respuesta de mutagenecidad para determinar a que
concentracin el qumico es mutagnico. El esquema de la prctica se
detalla en la siguiente figura:

V. RESULTADO Y DISCUSIONES
Graficar el numero de celdas positivas (eje y) Vs cada dosis evaluada del
compuesto en estudio.

 Los resultados sern expresados a travs de la respuesta de mutagenicidad

(RM) que es una razn entre el nmero de pozos posititvos de cada dosis
evaluada (revertantes inducidos) y el nmero de pozos positivos del control
negativo (revertantes espontneos). Sandoval M. (2007)

Donde:
RM = Respuesta de mutagenicidad
RI = Revertantes inducidos (diferentes dosis)
RE = Revertantes espontneos (cero dosis, control negativo)
La respuesta de mutagenecidad ser positiva si (RM) es mayor o igual a 3. A
fin de asegurar una significanca de la prueba.
VI. CONCLUSIONES
VII.CUESTIONARIO
Cules son las ventajas y desventajas del Test de Ames y del Test MPF, para
la deteccin de carcingenos como mutagnicos?
Por qu se prefiere trabajar con cepas de Salmonella typhymurium y no con
cepas de E. coli?
Qu otras tcnicas de deteccin de compuestos carcingenos in Vitro
conoce?
VIII.

REFERENCIAS
Lander, E. et al. 2004. Introductory Biology - Fall. Biology Department
200443:123-143.
Legator, M. S. y Malling, H. V. (1971) in Chemical Mutagens, ed. Hollaender,
A. (Plenum Press, New York), Vol. II, chap. 22.

 Ames, N. et al. 1973. Carcinogens are Mutagens: A Simple Test System

Combining Liver Homogenates for Activation and Bacteria for Detection
-Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 70, No. 8, pp. 2281-2285.
Ames, N. 1973. An Improved Bacterial Test System for the Detection and
Classification of Mutagens and Carcinogens Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 70,
No. 3, pp. 782-786.
Trossero, C. 2005. Deteccin de Mutagenicidad en Compuestos N-Nitroso con
el Test de Ames Acta Farm. Bonaerense 25 (1): 139-44
S. Flckiger I. et al., 2004. Assessment of the performance of the Ames II
assay a collaborative study with 19 coded compounds. Mutation Research
558: 181197