Pruebas de identificacin bioqumica de bacterias

Recibido el 27 de setiembre del 2013

Abstract
Existen diversas pruebas que permiten determinar la capacidad para degradar el perxido de hidrgeno, detectar la enzima citocromo
oxidasa, confirmar la produccin de cido lctico, actico o frmico a partir de glucosa, confirmar la presencia de la enzima
triptofanasa, detectar enterobacterias o comprobar si los organismos son fermentadores. Se trabaj con la bacteria Serratia dando
como resultado catalasa positiva, oxidasa negativa, indol negativo, rojo de metilo negativo, Vogue Proskauer positivo, urea positivo,
fermentador de glucosa, sacarosa y lactosa y productor de gas y SH 2 negativo. En el campo clnico, la identificacin de las bacterias es
importante para tratar infecciones causadas en las personas, mientras que en el campo alimenticio se necesita comprobar la ausencia
de ciertos microorganismos para cumplir con las normas de calidad establecidas.
Marco terico
La catalasa se encuentra presente en la mayora de bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromos, con
excepcin de especies como Sterptococcus, que carecen de catalasa y la mayora de las bacterias anaerobias poseen peroxidasa en
lugar de catalasa como por ejemplo las especies de Clostridiun (2). A continuacin se presenta la reaccin que se lleva a cabo en las
catalasas:
2H2O2

2H2O + O2(g)

Ec 1 (2)

La prueba de la catalasa da positiva si se observa la aparicin de burbujas luego de agregar agua oxigenada sobre las bacterias (6).
La prueba de oxidasa se basa en la produccin bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. La reaccin se debe a un sistema de
citocromo oxidasa que activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno molecular y que tambin acta como un aceptor de
electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones. Un resultado positivo de oxidasa consiste en una serie de
reacciones, con un componente auto oxidable del sistema citocromo como catalizador final. Los sustratos artificiales pueden ser
sustituidos por los aceptores de electrones en cualquier parte dentro de la cadena de transporte de electrones donde estos pueden
reducir el sistema c-citocromo oxidasa. Esta prueba se considera positiva si la tira de oxidasa se torna morada al entrar en contacto con
la bacteria en estudio (2,6).
Para determinar el pH cuando el microorganismo fermenta la glucosa, se utiliza la prueba de rojo de metilo. La concentracin de iones
hidrgeno depende de la relacin entre el dixido de carbono y el hidrgeno molecular. Los diferentes patrones de fermentacin se
deben a la variacin de las enzimas relacionadas con el metabolismo del cido pirvico en cada organismo. La validez de la prueba
radica en el tiempo de incubacin que permita que se d una diferencia en el metabolismo de la glucosa, es por ello que se
recomienda la incubacin de por lo menos 2 das a 35-37C. La prueba dar positiva si luego de la incubacin, al agregar el rojo de
metilo, se desarrolla un color rojo estable en la superficie del medio; si el color es amarillo, indica que no hubo cambio de pH (2,6).
La prueba de Voges- Proskauer determina la presencia de acetona, la cual proviene de la degradacin de glucosa en las bacterias
como producto de una de las vas metablicas. La acetona se forma por la descarboxilacin de dos molculas de cido pirvico,
siendo esta el estado intermedio para la formacin del 2,3-butanodiol. El principal producto final en la degradacin del piruvato en los
grupos Serratia, Klebsiella-Enterobacter y especies de Bacillus es el 2,3-butanodiol (2). La reaccin involucrada se muestra a
continuacin:
2 Piruvato

Acetona + 2 CO2

Ec 2 (2)

La prueba dar positiva si se desarrolla un color rojo estable en la superficie del medio, en la figura 1 se muestra el resultado positivo
y negativo para esta prueba (6).

Figura 1. Color del medio obtenido en los resultados positivo y negativo para la prueba Voges- Proskauer (7).

La prueba de indol detecta el indol liberado de la molcula de triptfano. El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por
bacterias produciendo indol, cido pirvico, amonaco y energa. La combinacin entre el reactivo utilizado y el indol, genera un color
fucsia en la interface, lo que indica un resultado positivo de la pruba (2,6). A continuacin se muestra la oxidacin del trptfano:

Figura 2. Produccin de indol a partir del L-Triptfano (2).

La prueba en azcar triple y hierro determina la fermentacin de carbohidratos y la produccin de H 2S. Como producto del
metabolismo de glucosa se genera CO2 y H2, el cual se refleja en la aparicin de burbujas en la parte inferior del medio, generando
grietas en su interior. Adems la presencia de sulfhdrico se refleja por el ennegrecimiento del medio en la lnea de inoculacin o sobre
la capa de inoculacin. La produccin de cido a partir de sacarosa se refleja en el cambio de color del medio, que puede pasar de rojo
a amarillo (cido) (2,6).
La prueba de urea determina la capacidad del microorganismo para hidrolizar la urea en dos molculas de amonaco por la accin de
la enzima ureasa, la cual se considera como constitutiva debido a que las bacterias la sintetizan sin tomar en cuenta la presencia o
usencia de la urea, que es el sustrato de la enzima (2,6). A continuacin se presenta la reaccin involucrada:

Figura 3. Hidrlisis de la urea para formar dos molculas de amonaco (2).

La prueba dar positiva si luego de la incubacin de la bacteria en un caldo urea se da un cambio de color a fucsia (6).

Simbologa: +: positivo, -: negativo, +/-: especies positivas y negativas, +(-): especies predominantemente positivas, -(+): especies
predominantemente negativas, ADH: arginina dihidrolasa, FDA: fenilalanina- desaminasa, LDC: lisina descarboxilasa, ODC: ornitina
descarboxilasa, ONPG: ortonitrofenil--D-galactopiransido.
Figura 4. Resultados obtenidos de diferentes pruebas de identificacin bioqumica para diferentes bacterias, entre ellas Serratia,
ubicada en la posicin 4 de la tabla (9).
El gnero Serratia contiene 5 especies. Estos bacilos gramnegativos se pueden encontrar en el suelo, aguas estancadas, animales y
vegetales. Tambin se pueden hallar en el intestino sin producir patologa, pero con la posibilidad de infectar otros tejidos produciendo
inflamacin. Se caracterizan por ser catalasa positiva, fermentadores positivos, en ocasiones pueden producir gases, positivos para la
prueba de Vogue Proskaver y oxidasa negativos (8).
El otro gnero con caractersticas similares es el Enterobacter, el cual lo conforman bacilos gramnegativos, aerobios o anaerobios
facultativos, catalasa positivos, fermentadores positivos, producen gas, VP positivos y oxidasa negativos. Forma parte de la flora
nativa del intestino, pero pueden producir infecciones severas en otros rganos y tejidos (8).
Seccin experimental
El procedimiento fue tomado del manual del Laboratorio de Biotecnologa Industrial.
Para la prueba de la catalasa, sobre un portaobjetos se deposit una muestra de la bacteria a analizar y luego se le agreg perxido de
hidrgeno, dando positiva ala aparecer burbujas. En la prueba de la oxidasa, sobre un portaobjetos se coloc una tira de oxidasa
humedecida, en la cual se le aadi la muestra a analizar, dando positivo si la tira se torn morada. En la prueba de rojo de metilo, se
inocul en un caldo RMVP un cultivo del organismo a analizar, se incub por 24 horas, luego se agreg 0,6mL de alfa-naftol al 5% en
alcohol etlico, despus se agreg 0,2mL de hidrxido de potasio al 40% y se agit la mezcla, finalmente se dej reposar por 30
minutos. La prueba es positiva si se desarrolla un color rojo estable en la superficie del medio. En la prueba de Indol se inocul en un
caldo de triptona el microorganismo y se dej incubar por 48 horas, luego se agregaron 10 gotas de xilol y se agit fuertemente,
despus se deslizaron 10 gotas del reactivo de Kovacs por la pared del tubo para que estratifique, dando positiva la prueba si se
desarrolla un color fucsia en la inter fase. Para la prueba de la urea, se inocul en un caldo urea el microorganismo a analizar y se dej
incubar 48 horas a 37 C, si se observa el cambio de color a fucsia, la prueba es positiva. Por ltimo en la prueba del TSI, se inocul
en un tubo con TSI el microorganismo, dejndolo inocular 24 horas a 37C, luego se observaron los resultados:

Fermentadores
a.
b.

Microorganismos que solo fermentan glucosa: Pico rojo- fondo amarillo (K-A)
Microorganismos que fermentan glucosa, sacarosa y lactosa: Pico amarillo-Fondo amarillo (A-A)

No Fermentadores
a.
b.
c.

Microorganismos que no fermentan azcar: Pico rojo- Fondo no cambia (K-NC)

Productores de gas: Presencia de burbujas o ruptura del medio (G)
Productores de SH2: Ennegrecimiento del medio.

Datos experimentales
El nmero de la incgnita asignada fue la nmero seis y los resultados obtenidos se muestran en el cuadro 1, por lo que se trabaj con
Serratia.
Cuadro 1. Resultados obtenidos de las pruebas de identificacin bacteriana con respecto a una cepa incgnita de microorganismos.
Incgnit
a

Catalasa

Oxidasa

Indol

RM

VP

Urea

TSI

Gas

SH2

1
2
3
4
5

+
+
+
+
+

+
-

+
+

+
+
+

+
+
+
+

A-A
K-A
K-A
K-A
A-A

+
+
+
-

+
-

Tincin
Diferencial
de Gram
+
+

A-A

Nombre de la
bacteria
E. Coli
Pseudomona
Bacillus
Proteus
Staphylococu
s
Serratia

Discusin de resultados
Para llevar a cabo una perfecta identificacin bacteriana, hay que realizar una serie de pruebas, entre ellas se encuentran las enzimas
vinculadas con la respiracin; la prueba de la oxidasa y la prueba de catalasa son las que se emplean para esta prueba (1). Las bacterias
del gnero Staphylococcus son aerobias por lo tanto contienen la enzima catalasa para degradar el perxido de hidrgeno (1). La
prueba de la catalasa realizada en la prctica dio positiva, lo que genera que la presencia del enzima catalasa se encuentra en la
mayora de las bacterias (aerobias y anaerobias) facultativas que contienen citocromo; cabe destacar que esta prueba es negativa
solamente para Streptococcus spp. (1), que se encontraba ausente entre el grupo de bacterias a identificar. Esta prueba bioqumica
permite determinar solamente si la cepa utilizada es aerobia (estricta o facultativa) o anaerobia (estricta, aerotolerante o microaerfila),
pero no permite distinguir entre gneros, ni especies (3).
La muestra incgnita es fermentadora, ya que es oxidasa negativa (4). Esto indica que puede haber presencia de enterobacter (3), Las
bacterias en cuestin pueden ser Enterobacter spp. y Salmonella spp. porque estas son indol negativas (3), la liberacin de indol se
debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante el enzima triptofanasa (1); las ms convenientes son Escherichia coli (indol
positiva) y todas las especies de Klebsiella spp. (indol negativo) (1) sin embargo esta ltima especie se encuentra ausente en el grupo
de microorganismos a identificar; por lo tanto, la bacteria E. Coli se encuentra ausente en la cepa en estudio.
Las pruebas tanto de Rojo de Metilo (RM) y Voges-Proskauer (VP) constan del viraje de color, y permiten la diferenciacin dentro de
las enterobacterias del grupo coli y Enterobacter (1); de este modo, se realiza una fermentacin cido mixta por las bacterias del grupo
de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso
del pH inicial del medio, puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y
rojo por debajo de 4,4 (1); mientras que la fermentacin butilngliclica la realizan las bacterias del grupo Klebsiella spp. y
Enterobacter spp., donde los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como
intermediario que podr ser detectada aadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de VogesProskauer) que reaccionarn con este compuesto produciendo un color rojo caracterstico (1). La prueba de RM result negativa,
mientras que la VP positiva; de esta forma se concreta la presencia de Enterobacter spp. y la ausencia de E. Coli.
La prueba de la Urea determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas de amoniaco por accin
del enzima ureasa; esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este
gnero de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado (5), esta degradacin produce amoniaco que har variar el color
del indicador de amarillo a rojo, ponindose as de manifiesto la actividad ureasa (1); para la prueba realizada, la cepa de estudio da
positivo, de esta forma afirmando la presencia del microorganismo Proteus en esta. La presencia de Bacillus se descarta por medio de
esta prueba, ya que no posee la capacidad de hidrolizar a la urea (2).

Los gneros clnicamente ms importantes de la familia Enterobacterias son: Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter y
Enterobacter (5). El gnero Escherichia, Enterobacter y Citrobacter fermentan la lactosa con produccin de cido y gas, a diferencia
de los gneros Salmonella y Shigella que no fermentan la lactosa (5); por ende, en la prueba de Agar Azcar Triple Hierro (TSI), la
presencia de Pseudomonas se descarta por este medio ya que se debi de obtener N-N en vez de K-A (4), mientras que para Serratia
debi dar A-A (2), confirmando as la presencia de Salmonella (5).
Para descartar la presencia de Staphylococcus, la tincin de Gram debe ser positiva y prueba de la oxidasa es positiva, contrario a las
obtenidas (2).
De la figura 4 se observa los resultados para diferentes pruebas realizadas a la bacteria Serratia. Estos datos se compararon con los
obtenidos en el cuadro 1 y se corrobora los resultados de oxidasa negativa, indol negativo aunque se puede dar la posibilidad de un
resultado positivo para algunas especies de Serratia, produccin de SH2 negativo y el resultado obtenido experimentalmente de la
ureasa para Serratia fue positivo y se observa como en la literatura el resultado de la ureasa para Serratia es por lo general negativo
pero con posibilidad de resultados positivos.
Conclusiones
La bacteria incgnita con la que se trabaj fue Serratia, que comnmente se halla en el intestino, animales o vegetales.
Hay gran importancia en la identificacin microbiana dentro del campo del ejercicio profesional farmacutico, cosmtica y de
alimentos donde las normas de control de calidad exigen la ausencia de ciertos microorganismos.
Las pruebas de identificacin de bacterias se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azcares, la
presencia de enzimas, la degradacin de compuestos, la produccin de compuestos coloreados, etc.; de esta manera, bacterias
fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con base a pruebas bioqumicas.
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