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Seminrio em Biotecnologia I

Docente: Benildo Cavada


Junho - 2015

Victor Teixeira Noronha

Introduo

Aumento da viabilidade
econmica: fermentao
de hexoses e pentoses

Microrganismos

Problemas de aplicao
escala industrial

Desvantagens da
modificao gentica

Composio da
biomassa de materiais
lignocelulsicos

celulose

hemicelulose

lignina

outros

Introduo

Glicose

Fermentao
industrial:
pH 4-5
T 30-35C

Isomerase(EC.5.3.1.5)

Aplicaes

Caractersticas

Estrutura de raios-X em temperatura ambiente de D-xilose


isomerase em complexo com ins 2Mg2 + xilitol e a pH 7,7.
Kovalevsky, et al., 2012,

Deslocamento
do
GI:

5:1

pH 7-8
T 70C

equilbrio

D-xilose

Xylose SIF: pH~temperatura~taxa enzima/levedura

D-xilulose

Introduo

Imobilizao

Recuperao e
reutilizao

Quitosana

Glutaraldedo

Aumento da estabilidade
trmica

Estrutura da quitosana. Disponivel em: http://quitosana.zip.net/images/Chitosan-chemie.jpg

Sistema imobilizao-estabilizao: ligao covalente amino (enzima)-aldedo (suporte). Vieira, 2009.

Imobilizao estvel:
altas taxas de enzima no

reator

Estrutura qumica de quitosana reticulada com


glutaraldedo. Vieira, 2009.

Objetivo

Imobilizar GI em quitosana, utilizando glutaraldedo

como ativador, caraterizando este derivado no que diz


respeito s suas propriedades catalticas e potencial
para ser utilizados no processo de SIF da xilose, bem
como co-imobilizar o derivado com S. cerevisiae em gel
de alginato de clcio, a fim de avaliar a produo de

etanol a partir de xilose em uma isomerizao


simultnea com um processo de fermentao.

Mtodos

Preparao de grnulos de quitosana-glutaraldedo

1)

Soluo

Quitosana em p (2%) + sol. c. Actico 2% (v/v)

Soluo

a 50C

Sol. +
Quitosana
coagulada

+
Glutaraldedo
0,8% (v/v);
Agitao a
50C por
30min

+ KOH
0,5M
(3:2) em
agitao
por 30min

Suporte

Filtrao sob
vcuo e
lavagem

Imobilizao de glicose-isomerase

Extrato de enzima +
tampo

Retirada de amostra
para controle

Adio de suporte na
proporo m/v 1:10,
sob agitao a 150
rpm

Testes: Tempo de
imobilizao 3, 24
e 43h; Carga de
enzimas 30, 50 e
70 mgenzimag-1suporte

Determinao da
atividade enzimtica
e concentrao
proteica

Adio de hidroborato
de sdio (1 mgmL-1)
por 30min

Filtrao vcuo e
lavagem dos derivados

Armazenagem dos
derivados em tampo
TRIS-maleato 50mM,
pH 7

Eletroforese

O extrato enzimtico de glicose isomerase (GENSWEET


SGI) foi analisada por SDS-PAGE

Isomerizao de xilose

Xilose (60 g L-1)


Nveis de xilose e xilulose
determinados

Catalisada por GI solvel e


imobilizada a 30 C e pH 5.0

Co-imobilizao de derivado IGI-Ch e levedura


em gel de alginato
Levedura comercial +
sol. 20 gglicoseL-1 +
nutrientes =
LEVEDURA DE
INCULO

Centrifugao;
filtrao;
determinao do teor
de umidade

Sol. 1% Alginato
de sdio
Levedura +
quitosanaglutaraldedo
contendo glicose
isomerase
imobilizada (IGI-Ch)

Sol. 5% Alginato
de sdio
Sol. 13%
Alginato de
sdio

Suspenso + 0.25 M
CaCl2/0.25 M MgCl2

Partculas esfricas
(=1-1,5mm)

Partculas curadas em
refrigerador por 18-20h

Isomerizao e fermentao
simultnea da xilose

1 g catalisador ml-1 meio, a 35 C, o pH inicial


de 5,3 e 150 rpm.

Atividade da glicose isomerase:

Concentrao de protena:

Medio da Vo da isomerizao da frutose em glicose;

Abumina de soro bovino (BSA) como padro;

Anlise do substrato e dos produtos do ensaio SIF:

Xilose, xilulose, xilitol, glicerol, etanol e cido actico;

Refratometria e HPLC;

Imobilizao da glicose isomerase


Cintica da GI imobilizada em quitosana ativada com
glutaraldedo

Extrato apresenta outras enzimas.

30 mg

protena/g suporte

50 mg

protena/g suporte

70 mg

protena/g suporte

Imobilizao da glicose isomerase


SDS - PAGE

Protenas de menor
peso molecular

Imobilizao da glicose isomerase

Concentrao mxima de protena aps 20h: 47 mg prot/gder.


Concentrao mxima de protena aps 43h: 68 mg prot/gder.

Atividade recuperada > 90%


Atividade da enzima imobilizada da melhor variao do
experimento: 1700 IU/gder.

Influncia do pH e da temperatura sobre a atividade de GI:

SGI e IGI-Ch;

Para pH fixo de 7,0 T de 30 a 90 C;

Para T fixo de 60 C pH de 5 a 9;

% de atividade mxima obtida.

Estabilidade da GI:

SGI e IGI-Ch a 80 C;

Determinao da atividade enzimtica residual.

Influncia da concentrao de etanol na atividade GI:

SGI e IGI-Ch em diferentes concentraes de etanol;

0 a 70 g/L.

pH 5, 35 C, 150 rpm

Determinao da atividade: ensaios de reciclagem de IGI-Ch:

IGI-Gh avaliada em 3 bateladas;

Estabilidade de GI em condies de operao da SIF de xilose:

GI solvel e imobilizada;

pH 5, composio do ensaio da isomerizao da xilose;

Condies padres a diferentes tempos de incubao;

% de atividade inicial.

Influencia do pH e da temperatura na actividade da


glicose isomerase

Temperatura

pH 5, temperatura ~ 30C
Alta carga de enzimas.
Suporte extremamente ativado.

pH

Inativao trmica

Imobilizao confere estabilidade.


Imobilizao branda.

Influncia da concentrao de etanol sobre a


actividade da glicose isomerase (GI), nas condies
de operao da SIF da xilose

Etanol: deslocamento do equilbrio.


Baixa atividade em pH 5 a 30C.

Estabilidade da GI nas condies de operao do


processo de SIF da xilose

Dessociao das subunidades.


Etanol e outros nutrientes no interferem na atividade enzimtica.

Ensaio de reciclagem utilizando GI imobilizada

Confirmar a existncia de ligaes covalentes entre


enzima e suporte baixa perda de atividade.

Avaliao da atividade residual depois de cada batelada


de isomerizao de frutose.

Isomerizao de xilose a xilulose em pH 5 a 30C

GI imobilizada
com levedura
GI imobilizada

GI solvel

Processo conduzido nas condies de fermentao.


4 h: equilbrio qumico

Isomerizao e fermentao simultnea da xilose

etanol
xilitol

xilulose

Produtividade = 0,25 getanol /L x h


Converso de xilose = 75,4 %
Seletividade etanol/xilitol = 1,26

Isomerizao e fermentao simultnea da


xilose

Processo SIF controlado pela isomerizao.

Inibio da isomerizao por xilitol, glicerol e cido actico.

Baixo pH: desativao da GI.

pH <= 5: dissocio de subunidades de GI e agregao


irreversvel de enzimas

Optimizao do processo

Aumento da concentrao de enzimas no biocatalisador


final.

Controle de pH.

Utilizao de tetraborato de sdio (deslocamento do


equilbrio).

Concluses

Derivado
de
IGI-Ch
catalisa
a
isomerizao
xilose/xilulose (pH=5, T= 30-35C) ao contrrio da GI
solvel.

Sucesso no processo simultneo de isomerizao e


fermentao alcolica de xilose.(pH=5,3 , T=35C)

Alta atividade enzimtica = beads (pequenas) de


quitosana.

Concluses

Viabilidade industrial:

Elevado potencial para produo continua de etanol a


partir de xilose por S. cerevisiae.

Necessita de estudos para otimizar o processo da SIF


xilose.

Obrigado.