Electroforese em Gel de Agarose por Campo Pulsado

(Adaptado de L. Norton, 2004. Relatrio de Tese de Licenciatura)

Mtodo
Adaptado de Chung et al. (2000)
Propagao das culturas
1. Propagar os isolados (a partir de stocks conservados a -80oC Ver mtodo) em meio Columbia
com 5% de sangue de carneiro, durante 18-24h para isolamento de colnias.
2. Inocular em 6 ml de meio lquido Todd-Hewitt e incubar, sem agitao, a 37C durante a noite (no
mnimo 17 horas).
Lavagem celular e ajuste da concentrao celular
1. Centrifugao em microcentrifuga: Distribuir 2ml de cada cultura por dois tubos eppendorf de
2,2ml, e centrifugar durante 20 minutos a 13000 rpm temperatura ambiente.
Centrifugao em centrifuga de bancada: Pipetar 4ml de cultura para tubos Falcon de 15ml e
durante 20 minutos a 8000 rpm temperatura ambiente.
Nota: Usar a restante cultura se necessrio para preparar stock a -80 oC ou para outros ensaios.
(Podem ser congelados os pellets a -80 oC depois das culturas serem centrifugadas em tubo
eppendorf e decantados os sobrenadantes).
2. Remover o sobrenadante e a um dos dos tubos adicionar 1ml de PIV.
3. Ressuspender muito bem as clulas e transferir a suspenso para o segundo tubo, voltando-se a
ressuspender o material celular.
4. Centrifugada a suspenso durante 25 minutos a 13000 rpm. Ao fim deste tempo remover o
sobrenadante e ressuspender de novo as clulas em 200l de PIV.
5. Ajustar a concentrao celular de cada cultura:
Em cada cuvette com 1ml de PIV, adicionar 5l de suspenso celular. Ler a absorvncia no
espectrofotmetro a um comprimento de onda de 620nm. Os valores de absorvncia aceitveis devem
variar entre 0,025cm-1 e 0,15cm-1. O ajuste da concentrao celular feito adicionado PIV num volume
tal que a densidade ptica da suspenso celular seja de 5,0. O volume de PIV a adicionar obtido pela
frmula:
Vadd(l)=(DOx40x210)-210
Vadd- Volume em (l) de PIV a adicionar suspenso celular.
DO- Densidade ptica a 620nm.
A quantidade de PIV a adicionar aferida tendo em considerao que o volume de suspenso celular no
tubo eppendorf de aproximadamente 210l e tendo em ateno que o valor de absorvncia registado
corresponde a uma diluio de 5 l de suspenso em 1ml de PIV.
Preparao dos discos de agarose
1. Preparar a soluo de agarose Seaplaque a 1,5% em tampo PIV (necessrio 150l de agarose
por isolado).
2. Pipetar 150l de cada suspenso celular para um novo eppendorf, mantido a 42C durante 10
minutos. Passado este tempo pipetar 150 l da soluo de agarose previamente preparada, para
a suspenso celular. A mistura deve ser bem ressuspendida.
3. Da mistura da suspenso celular em soluo de agarose, retirar amostras de 20 l, pipetar para
uma placa de vidro (forrada com Parafilm e pr-lavada com etanol a 70oC) formando-se gotas.
4. Por cada isolado so pipetadas 12 gotas que eram cobertas com uma lmina de vidro (prlavada com etanol a 70oC) de modo a que as gotas fiquem achatadas em forma de disco, com 12 mm de espessura.
5. Os discos devem arrefecidos a -20C durante 5 minutos.
Lise celular
1. Megulhar os discos em 1ml de soluo de lise (tampo EC) em tubo Falcon de 15ml e incubar a
37C durante 5 horas (transferir os discos colocados na placa de vidro para o tubo com auxilio de
uma ansa descartvel de 10l.

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Desproteinizao
1. Decantar a soluo de lise e substituir por 1ml da ESP (decantar com auxilio de gase
esterilizada). Incubar os discos a 50C durante 17 horas.
Lavagem para remoo da proteinase K
1. Decantar a soluo ESP e lavar oito vezes os discos com 12 ml de tampo TE 1X, durante 30
minutos em agitao constante suave (decantar o liquido de cada vez com auxilio de gase
esterilizada).
2. Armazenar os discos eram a 4C em tampo TE 1X. Identificar os tubos com a designao da
amostra e data de preparao.
Nesta altura, as clulas devem estar lisadas, as protenas e RNA degradados, encontrando-se o DNA cromossmico
puro, imobilizado nas malhas da agarose. A conservao a 4C permite a viabilidade dos discos durante meses.

Restrio do DNA com as enzimas SmaI ou SfiI

1. Equilibrar os discos em tampo da enzima: incubar um disco por isolado em 150 l de soluo
tampo pr-SmaI ou pr-SfiI (para outras enzimas, consultar especificaes do tampo de
reaso do fabricante). Equilibrar durante 40 minutos temperatura ambiente.
2. Decantar o tampo de equilbrio, substituir por 50l do mesmo tampo e adicionar 20U (1l) da
respectiva enzima, por isolado.
Para a restrio com SmaI, incubar os tubos a 25C durante a noite
Para a restrio com SfiI, incubar os tubos a 50C durante a noite
3. Paragem da restrio: Remover a soluo de restrio e substituir por 5l de tampo de
arrastamento (com azul de bromofenol).
4. Armazenar os discos a 4C durante a preparao do gel.
Preparao do gel e insero dos discos no gel
1. Preparar 200 ml de agarose Seakem LE a 1% em TBE 0,5X. Depois de cozida no microondas e
arrefecida verter a soluo de agarose para o suporte do gel, tendo a ateno de conservar 2ml
a 50C para posterior utilizao (selar os poos).
2. Lavagem do aparelho de PFGE (CHEF-DRIII, Chiller System, Bio-Rad). Enquanto o gel
solidifica, o aparelho deve lavado, com 2L de gua desmineralizada, durante 3 minutos, sendo
este processo repetido trs vezes. Por fim a gua de lavagem deve substituda por tampo TBE
0,5X, que fica a circular no aparelho de modo a arrefecer at a sua temperatura atingir os
11,3C.
3.

Colocao dos discos. Aps o gel solidificar, so colocados os discos nos poos, com o auxlio
de uma lamela e ansa azul, com ateno para que os discos no se danifiquem e para que
fiquem bem aderentes parede frontal do poo e a meio do poo. Colocar discos do padro de
pesos moleculares (DNA lambda), geralmente nos dois poos terminais.

4.

Selar os poos com com a mesma agarose usada para preparar o gel, mantida a 50C. Colocar
o ge no aparelho e inicar o programa de electroforese pr-definido.

Condies de corrida: Temperatura: 11,3oC. Voltagem: de 200V (6V/cm).Tempo inicial de pulso: 5

segundos; Tempo final: 35 segundos; Tempo de corrida: 23 horas.
5. Colorao do gel e digitalizao da imagem
Retirar o gel e cor, em 300 ml de gua com 25l de soluo de brometo de etdio (a 10mg/ml),
durante 40 minutos. Aps este tempo lavar em gua durante 15 minutos.
Registar a imagem aps colocao do gel num transiluminador e captao da imagem (ver
instrues de uso de GelDoc, BioRad)

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Materiais
Meio de cultura Todd-Hewitt (Oxoid), preparado em frascos Shott, de acordo com instrues do
fabricante, esterilizado a 120C durante 20 minutos em autoclave.
Tampes e Solues
PIV: 10mM Tris pH 8.0; 1.0 M NaCl (Chung et al. 2000). Para preparar 500ml de PIV:
1.0 M Tris pH 8.0
5 ml
NaCl (Merck)
29.2g
Adicionar gua bidestilada de modo a perfazer 500 ml e autoclavar a soluo.
TE 1X (Sambrook et al, 1989). Para preparar 1000ml de TE:
Concentrao final
Soluo Stock (10X)
10mM Tris pH 7.5
10ml, 1M Tris pH 7.5
1 mM EDTA pH 8.0
2ml, 0.5M EDTA pH 8.0
Adicionar 988ml de gua bidestilada e autoclavar a soluo.
Soluo de Lise (Soluo EC) com Lisozima; mutanolisina e RNase
Soluo EC (Chung et al. 2000). Para preparar 500ml de EC:
Concentrao final
Stock
6mM Tris pH 8.0
3ml, 1M Tris pH8.0
1M NaCl
(Merck)
29,2g NaCl
100 mM EDTA pH 8.0
100ml, 0.5 M EDTA pH 8.0
0.2% Na desoxicolato (Sigma-Aldrich)
1g, Na desoxicolato
0.5% Na laurilsarcosina (Sigma-Aldrich)
2.5g, Na laurilsarcosina
0.5% Brij 58 (Sigma-Aldrich)
2.5g, Brij 58
Adicionar gua bidestilada de modo a perfazer 500 ml e autoclavar a soluo.
Adicionar ao volume de tampo EC a usar: lisozima a 1 mg/ml em TE; mutanolisina 5U/l em TE;
RNase 50 g/ml)
Lisozima, 1mg/ml em TE
Concentrao final
Soluo Stock
1mg/ml
10mg/ml
A soluo de Lisozima (Sigma-Aldrich) preparada em TE 1X, esterilizada por filtrao (filtro Millipore
0,45m) e armazenada em alquotas -20C.
Mutanolisina 5U/l
Concentrao final
Stock
5U/l
Mutanolisina em p, 10000U
A Mutanolisina (Sigma-Aldrich) ressuspendida em tampo fosfato de potssio a 0,1M (Sambrook et al,
1989) distribuda em alquotas e armazenada a -20C.
RNAse 50 g/ml
Concentrao final
Soluo Stock
50 g/ml
10mg/ml
A RNase (RNase A, tipo I-AS, Sigma-Aldrich) preparada em gua bidestilada, aquecida a 100C
durante 15min e arrefecida temperatura ambiente. Distribuda em alquotas e armazenada a -20C.
Soluo de Desproteinizao ESP: Soluo ES+ Protenase K
Soluo ES (Chung M. et al. 2000). Para preparar 500ml de ES:
Adicionar 5g de sarcosil ( sdio lauroil-sarcosinato, Sigma- Aldrich) a 500 ml de 0.5M EDTA Na 2 pH 9.0.
Ajustar o volume com gua bidestilada e autoclavar a soluo.
A protenase K (Boehringer) misturada ao tampo EC. Esta soluo preparada apenas no dia
de uso.
Proteinase K
Concentrao final
1mg/ml

Stock
Protenase K em p

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Tampo pr-SmaI
Para preparar 500ml de Tampo pr-SmaI:
Concentrao final
Stock
6 mM Tris pH 8.0
3ml, 1M Tris pH 8.0
20 mM KCl (BDH)
0.7456g
6 mM MgCl26H2O (Merck)
0.61g
Adicionar gua bidestilada de modo a perfazer 500 ml e autoclavar a soluo. Conservar temperatura
ambiente.
Para o equilbrio dos discos de DNA utilizado o tampo pr-SmaI ao qual adicionado mercaptoetanol (Sigma- Aldrich) na proporo de 6.3l deste composto para 15 ml de tampo.)
Tampo pr-SfiI
50 mM NaCl, 10 mM Tris, 10 mM MgCl 2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9 a 25C). Suplementar com 100 g/ml
BSA. J includo com a enzima no sistema comercial. (New England BioLabs). Mantido congelado a
-20C.
Tampo TBE 0,5X
A 100ml de TBE 10X (BioRad) adicionar 2000ml de gua bidestilada e autoclavar a soluo.
Soluo de Brometo de Etdeo
Preparada com 25 l de uma soluo stock a10mg/ml (BioRad) em 300ml de gua desmineralizada
autoclavada. A soluo deve ser conservada na ausncia de luz e a -4 oC.
Soluo de Azul de Bromofenol
0.25% de azul de bromofenol (xxx)
40% (w/v) sacarose (Merck) em gua bidestilada.
Endonucleases de Restrio
SmaI- 20000 U/ml. (New England BioLabs)
SfiI- 20000 U/ml. (New England BioLabs)
Agaroses
Agarose SeaPlaque GTG, (FMC BioProducts).
Agarose Seakem LE, (FMC BioProducts) .
Marcador de pesos moleculares
Lambda Ladder PFG Marker, 50g/ml (New England BioLabs).
Equipamentos
Aparelho de PFGE, CHEF-DRIII- Chiller System. Pulsed Field Electrophoresis Systems, BioRad.
Sistema Fotogrfico-GelDoc (BioRad Software) Quantity One Version 4.5.0. ou Sistema
Fotogrfico-Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System 120.
Microcentrfuga: Biofuge Pico, Heraeus Instruments.
Plataforma de agitao: Standard Rocking Platform WT 15, Biometra.
Balana de preciso electronica: Kern.
Estufas: Laboratory Incubators, Heraeus Instruments.
Banho seco: Unitek, Dry Block Heat Bath, USA/ Scientific Plastics.
Elaborao de Dendrogramas
BioNumerics, Verso 2.0.

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(PFGE de Pulsed-Field Gel Electrophoresis)

Princpio do mtodo:
uma tcnica de tipagem molecular que assenta no princpio do corte de DNA cromossomal com
enzimas de restrio de corte raro.
O DNA fragmentado de elevado peso molecular (superior a 50 Kb) sujeito a uma electroforese de
campo pulsado de modo a separar os fragmentos de DNA produzidos pela restrio.
Interpretao e classificao dos padres
Tenover et al. (1995) props critrios para a interpretao de padres de restrio de DNA cromossomal
bacteriano, produzidos por PFGE.
Critrios para interpretao de padres PFGE, quando o nmero de fragmentos produzidos pela
restrio igual ao superior a 10
N
fragmentos
diferentes

Interpretao
Epidemiolgica

Indistinguveis

A mesma estirpe

Relacionadas

2--3

Provavelmente a
mesma estirpe

Possivelmente
Relacionadas

4--6

Possivelmente a
mesma estirpe

Categoria das estirpes

Diferentes

Adaptado de Tenover et al.(1995).

Enzimas de corte raro:

SmaI 5-CCC/GGG-3
SfiI 5-GGCCNNNN/NGGC-3

Estirpes
diferentes