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OBJETIVOS
Determinar la actividad enzimtica de la fosfatasa cida extrada del germen de trigo bajo diferentes condiciones de
reaccin.
Estimar los parmetros cinticos Km, Vmx y KI a partir de los datos experimentales.
Identificar factores experimentales que resultan crticos para la estimacin de los parmetros cinticos de la enzima.
INTRODUCCIN
Cintica enzimtica
Las reacciones metablicas conforman un cuerpo de
reacciones qumicas que ocurren en condiciones muy
particulares y que son necesarias para que los seres
vivos cumplan con sus funciones biolgicas. Estas
condiciones particulares en las que las reacciones
metablicas deben darse son caractersticas de los
organismos, rganos, tejidos o clulas, y en ausencia de
un catalizador, no suelen permitir que se generen los
productos a la velocidad requerida. Ciertas protenas han
evolucionado entonces como catalizadores biolgicos
(enzimas) cuya funcin es aumentar la velocidad de las
reacciones qumicas en los seres vivos. Es importante
recordar que este aumento en la velocidad de reaccin
se logra mediante la disminucin de la energa de
activacin de los reactantes y que nada tiene que ver con
el cambio de energa libre que ocurre al convertirse los
reactantes en productos.
E+ S k 1 k +1 E S k 2 E+ P
k +1 , k1 y k 2 :constantes de velocidad
v=
V max [ S ]
Km+ [ S ]
= velocidad
mxima
alcanzable
a la
+ k2) / k+1
1 Km
1
1
=
+
v V max [ S ] V max
CO P
v
+V
[ S ] max
MATERIALES Y REACTIVOS
10g Germen de trigo
5 Vasos de precipitados
Pipetas
Centrfuga
11 Tubos de ensayo
Vortex
Colormetro
pH-metro
Gradillas
Sobrenadante de
enzimtica
Agua destilada
cido molbdico
PROCEDIMIENTO
Extraccin de la fosfatasa cida
Pesar 10 gramos de germen de trigo y agregar 50 ml de
agua fra. Luego agitar la mezcla hasta que obtener una
suspensin uniforme. Dejar en reposo por 30 min,
decantar por 15 min y filtrar el sobrenadante a travs de
algodn, los residuos se descartan. Esta solucin
constituye el extracto crudo de fosfatasa cida.
(Mantener en hielo). Esta parte es realizada por el
auxiliar de laboratorio.
cido molbdico
(ml)
4.0
3.9
3.8
3.7
3.6
3.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
3.5 ml
0.5 ml
-glicero
fosfato de
sodio (ml)
Agua
(ml)
Blanco buffer
(BB)
5.6
2.4
Blanco sustrato
(BS)
5.6
1.6
0.8
Blanco enzima
(BE)
5.6
1.6
Tiempo
reaccin (TR)
5.6
1.6
Tubo
B
1
2
3
4
5
Agua
(ml)
0.5 ml
Tubo
reaccin
Patrn de
fsforo 0.04
mg/ml (ml)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
la
Extracto
enzimtico
(ml)
0.8
0.8
Temperatura, C
0
18
37
60
92
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
Agua (ml)
0.6
0.2
0.4
Temperatura
18
18
18
0
18
37
60
92
C
Sustrato
(ml)
Buffer
(ml)
pH del
buffer
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
2.0
1.6
1.8
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
5.3
5.3
5.3
3.0
4.0
5.0
5.3
5.6
6.2
0.
2
0.2
0.
2
0.
2
0.2
0.2
Medio
Agua Hielo
Temperatura ambiente
Termostato
Termostato
Agua en ebullicin
Enzima
(ml)
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
Agua
(ml)
BB
1.2
BS
1.2
BE
1.2
1
1.2
2
1.2
3
1.2
4
1.2
5
1.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.8
0.4
0.4
0.35
0.30
0.25
0.10
Enzima
(ml)
400
50
100
150
300
de
0.8
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.8
100
10
20
40
60
80
100
100
0.4
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.0
1.0
Inhibidor
(ml)
0.8
Agua (ml)
1.2
[ S ] mM
Buffer
(ml)
1.2
Sustrato
(ml)
Tubo
1.2
{S} mM
1.2
Sustrato
(ml)
1.2
Buffer (ml)
1.2
Tubo
1.2
1.2
100
0.2
1.2
1.4
80
0.2
1.2
60
0.2
1.2
40
0.2
20
0.2
10
0.2
0.2
0.2
100
0.2
0.4
0.4
BE
0.4
BE
BS
0.4
BS
BB
0.4
BB
0.4
0.4
0.8
0.4
400
0.6
0.8
100
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
ANEXOS
1. Solucin stock de fosfato, 0.2 mg P/ml. Pese 87.9 mg
de KH2PO4 (RA), disuelva en 75 ml de agua,
agregue 1 ml de cido sulfrico 10 N y complete el
volumen a 100 ml con agua.
2. Solucin patrn de fsforo, 0.04 mg P/ml (recin
preparada). Diluya 2 ml de la solucin stock, hasta
10 ml con agua.
3. Solucin de cido molbdico (requerido por prctica
35 ml), Agregue 84 ml de H2SO4 concentrado (grado
analitico, libre de fosfatos y silicatos) sobre 300 ml
de agua, agite y enfre. Aparte disuelva 25 g de
molibdato de amonio en agua, luego mezcle las 2
soluciones y complete a un litro con agua. Es
importante verificar que los reactivos estn libres de
fosfatos.
4. Solucin de cido ascrbico, 1.5 mg/ml (recin
preparada).
5. Solucin de cido tricloroactico (ATA), 10%
6. Solucin de glicerofosfato de sodio, 0.1 M
7. Soluciones de glicerofosfato de sodio, de diversas
concentraciones segn la siguiente Tabla:
0.2
BIBLIOGRAFIA
Concentraci
n, mM
5
10
20
40
60
80
100
glicerofosfat
o 0.1 M , ml
0.1
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
Agua, ml
1.9 ml
1.8
1.6
1.2
0.8
0.4
Jorge Cortzar