Identificacin de una clave de unin colesterol, mejora

el motivo de una protena traslocadora de 18 kDa.

Fei Li, Jian Liu, Lance Valls, Carrie Hiser, and Shelagh Ferguson-Miller*
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University,
East Lansing, Michigan 48824, United States

RESUMEN: protena Translocator 18 kDa (TSPO) en la membrana externa

mitocondrial se ha implicado en el transporte de colesterol regulacin de la
esteroidognesis. Un polimorfismo de un solo ser humano asociado con
trastornos de ansiedad (A147T) y reduccin de la produccin de pregnenolona
es adyacente al motivo de unin de colesterol TSPO. En un mutante imitando
este polimorfismo, se observa un nivel ms bajo de la unin de colesterol.
Adems, tres residuos precedentes A147 son ms hidrfilos en un TSPO
bacteriana que tiene una afinidad para el colesterol 1000 veces menor que la
de la forma humana. La conversin de estos residuos a la forma humana en el
homlogo bacteriano sorprendentemente aumenta la afinidad para el
colesterol. Un papel importante de este motivo extendido se ve apoyada por el
anlisis de covarianza.

Protena

Translocator 18 kDa (TSPO) es una protena integral de membrana

ampliamente distribuida descubierto inicialmente como un sitio de unin para
los medicamentos de benzodiazepina ansiolticos en los tejidos perifricos y
por lo tanto conocido como el receptor de benzodiazepina perifrico (PBR).
Recientemente, se cambi el nombre para reflejar la evidencia de su
participacin en una serie de complejos procesos celulares, incluyendo el
transporte de colesterol, el transporte de porfirina, la inflamacin, la evolucin
del tumor, la enfermedad de Alzheimer, y la regulacin de la apoptosis. Los
ligandos de TSPO tambin son ampliamente utilizados para formacin de
imgenes de dao cerebral por tomografa por emisin de positrones (PET), as
como para el tratamiento.
Un reconocimiento colesterol conservada / interaccin amino secuencia de
consenso del cido [CRAC, L / Vx (1-5) -Yx (1-5) -R / K] cerca de la C-terminal de
hlice transmembrana V (TM-V) se identific como un sitio de unin de
colesterol en TSPO mamfero. A pesar de compartir la mayor parte de esta
secuencia de CRAC [Lx (1) -Fx (3) -R] (Figura S1 de la informacin de apoyo), el
homlogo de Rhodobacter sphaeroides (RsTSPO) muestra una afinidad por el
colesterol> 1000-veces menor que la TSPO de mamferos. Una pista sobre la
disparidad en la unin fue proporcionado por publicaciones recientes informes

de un polimorfismo de un solo espontnea humana, dando lugar a una

secuencia de aminocidos alterada, A147T, en la regin inmediatamente
anterior al sitio CRAC. Esta nica mutacin en correlacin con trastornos de
ansiedad y reduccin de la produccin de pregnenolona, as como una menor
afinidad por ligandos TSPO utilizados en formacin de imgenes PET. Hemos
observado que los tres residuos que preceden al sitio A147T son muy variables
en las bacterias, pero conservado y mucho ms hidrfobo en las protenas de
mamferos, lo que sugiere que esta regin adyacente al sitio de CRAC tambin
podra contribuir a determinar la afinidad de colesterol. Inicialmente se dise
un mutante imitando A147T (RsTSPO-A139T) y mostraron que este mutante
tiene una afinidad por el colesterol y otros ligandos significativamente ms
bajos que el del tipo salvaje (WT), consistente con el fenotipo exhibido por
A147T. Aqu mostramos un mutante en el que los tres residuos precedentes
(A136-A138-T137) fueron sustituidos por la secuencia humana, LAF, creando
RsTSPO-LAF. El mutante triple era bien expresada y se purific mediante el
mismo procedimiento que se utiliz para el WT, pero tena una tendencia a
agregarse cuando se concentra, una tendencia que pudiera ser controlado por
mantenimiento de la misma a una concentracin baja o mediante la adicin de
hemisuccinato de colesterol (CHS) (Figura S2 y discusin complementaria de la
informacin de apoyo). La Figura 1A muestra que la introduccin del motivo
LAF hace que la afinidad por el colesterol para ser mejorada en gran medida, a
partir de una Kd de ~ 80 M a ~ 20 nM, similar a la afinidad de ratn y humano
TSPO se inform anteriormente.

Figura 1. LAF aumenta significativamente la afinidad para el colesterol (A),

pero disminuye ligeramente para PpIX y PK 11195 (B).

Adems, las muestras purificadas en presencia de CHS, que fue retenida por la
protena mutante (Figura S2A de la informacin de apoyo), muestran una
afinidad mucho ms baja aparente para el colesterol, similar a la de la WT, lo

que indica que CHS est ocupando el mismo sitio que el colesterol (Figura 1A).
Estos resultados apoyan fuertemente un papel del motivo LAF en la
determinacin de la afinidad nanomolar para el colesterol observada en TSPO
mamfero.
Tambin probamos la unin de PK 11195 y protoporfirina IX (PpIX) con RsTSPOLAF. La Figura 1B muestra que el mutante RsTSPO-LAF tiene alguna influencia
sobre la unin de PK 11195 (10 1 M para el WT vs 15 4 M durante LAF) y
PpIX (0,31 0,01 mM para el WT vs 1,1 0,1 M durante LAF ), una
disminucin ~1.5-3 veces en la afinidad, a diferencia del aumento dramtico
en la afinidad de colesterol. En particular, el espectro de emisin caracterstico
anteriormente visto en las curvas de enfriamiento PK11195 con la protena
RsTSPO-WT tambin se observ en la extincin de la fluorescencia de los
mutantes, lo que sugiere que el sitio de unin de PK 11195 no fue fuertemente
influenciado por la mutacin. Es importante destacar que los efectos modestos
de la sustitucin de cido amino-tres en RsTSPO-LAF tras la unin de ligandos
distintos de colesterol indican que est causando un efecto muy especfico en
el sitio de unin del colesterol. Para mejorar nuestra comprensin de las bases
estructurales de la unin de colesterol, se analizaron las secuencias de ~ 2000
TSPO con el mtodo de covarianza, una prueba independiente de los residuos
de importancia estructural y funcional, complementarias a las pruebas de
conservacin de la secuencia (discusin adicional, en la informacin de apoyo).
Nuestro anlisis identific una serie de interacciones de alta puntuacin entre
TM-IV y V-TM, mientras que hubo muy pocos entre otras hlices (Figura 2), lo
que sugiere que estas dos hlices pueden ser crticos para la estabilidad y la
funcin de TSPO.

Figura 2. Los residuos que interaccionan se predijeron mediante anlisis de

covarianza (A) y estn de acuerdo con la estructura cristalina (B).

De hecho, en un esfuerzo temprano para obtener estructuras de resonancia

magntica nuclear de fragmentos TSPO, Jamin y sus colegas mostraron que la

propia TM-IV no poda formar una hlice estable excepto cuando estabilizado
por fuertes interacciones con TM-V. Curiosamente, las dos interacciones de
mayor puntuacin predichas por anlisis de covarianza son exactamente
dentro de la regin ATA / LAF (Rs A136 y T137), que proporciona una fuerte
evidencia que apoya la importancia de esta regin. Independientemente, el
anlisis de cambio de hidrgeno / deuterio con TSPO ratn muestra que estos
residuos sobre MT-V combina con TM-IV son el ncleo ms estable de la
protena completa. En nuestro mutante RsTSPO-LAF, hemos creado un sitio de
unin mejor para el colesterol, pero tal vez a expensas de debilitar algunas de
estas interacciones crticas, lo que puede explicar la estabilidad algo menor.
Sorprendentemente, las interacciones predicho por el anlisis de covarianza
completamente de acuerdo con la estructura cristalina de RsTSPO (Figura 2B y
la Figura S3 de la informacin de apoyo). En particular, las cadenas laterales
del T137 y W108, la pareja con la puntuacin ms alta covarianza, forman un
enlace de hidrgeno. La pareja segundo ms fuerte predicho, A136 y V111,
tambin est cerca de la estructura cristalina (4,1 ), como son N143 y L101
(3,5 ). El acuerdo destaca entre el anlisis de covarianza, el anlisis
mutacional y la estructura cristalina da mucha credibilidad a la importancia de
este motivo extendida en el colesterol vinculante. Debido a que el colesterol es
un componente principal de las membranas de los animales superiores y juega
un papel fundamental en la estructura de la membrana y como la fuente de
todas las hormonas esteroides, la conservacin de alta afinidad para el
colesterol podra esperarse en los animales superiores para una protena tal
como TSPO, en la medida en est implicado en la regulacin del transporte del
colesterol. Para abordar la cuestin de la conservacin, se analizaron las
secuencias de protenas de diferentes especies TSPO han descrito
previamente. El anlisis muestra que el motivo mejora la unin del colesterol
asociado a CRAC est muy bien conservada dentro de los mamferos como LeuAla-Phe [LAF (Figura 3A y figuras S1 y S4 de la informacin de apoyo)],
incluidas las formas humanas y de ratn para el cual extensos estudios han
demostrado que TSPO podra desempear un papel importante, pero todava
controvertidos en el transporte del colesterol en las mitocondrias y la
esteroidognesis.

Figura 3. El colesterol motivo mejora, LAF, (A) bien conservada en TSPO

mamfero y variable en las bacterias, la unin a adaptarse a diferentes colas de
ligandos similares a los esteroides (B).

Mientras que las bacterias y arqueas tienen una secuencia similar con el CRAC
Y el centro reemplazados por F, sus motivos LAF son muy diversas.
Hopanoides, que tienen una estructura de anillo similar a la del colesterol, se
han identificado en bacterias como servir una funcin anloga a la de
colesterol en los animales superiores. Sin embargo, pueden tener muy
diferentes colas como se muestra por dos hopanoides representativos en la
Figura 3B. La secuencia ms variable en las bacterias y otros rdenes inferiores
puede reflejar la necesidad de acomodar las colas distintivas de los hopanoides
en diferentes bacterias o para dar cabida a ligandos alternativos. De hecho,
una estructura cristalina de alta resolucin determinado recientemente por
nuestro grupo confirma que los ligandos lipdicas de hecho se unen en esta
regin (Figura S5 de la informacin de apoyo). Tomados en conjunto con la
evidencia de covarianza que TM-IV y TM-V co-evolucionan, nuestros resultados
son consistentes con la importancia funcional creciente de colesterol y sus
productos metablicos en los animales superiores, el suministro de una presin

de seleccin para la evolucin de colesterol de alta afinidad de unin que

implica el motivo de mejora.

Tambin se abord la cuestin de si existe alguna importancia general de este

motivo de alta afinidad que confiere en otras protenas de membrana humana
mediante encuestas a 5.183 protenas de membrana humanos de la base de
datos. Un total de 28627 sitios CRAC se identificaron en 4684 protenas de
membrana humanos (~ 6 por protenas), mientras que slo se identificaron 66
sitios CRAC LAF (1 una protena), incluidos los miembros de las principales
familias de protenas de membrana (Tabla S1 de la informacin de apoyo).
Sitios de unin de colesterol con el motivo de mejora son por lo tanto bastante
extendida y podra ser crtico para su participacin en el transporte o la
regulacin. Los resultados indican relativamente baja capacidad predictiva del
motivo CRAC solo, como concluye Song et al., Pero en contraste, el subconjunto
mucho ms pequeo encontrado con el motivo extendida sugiere ms valor
predictivo. Tambin parece probable que representan modos de unin con
importancia funcional ms all de la conferida por el colesterol como
disolvente. La ubicacin de TSPO en las mitocondrias, que son bajos en
colesterol, y la funcin propuesta de TSPO como parte de un sistema de
transporte de colesterol son consistentes con el requisito de que el motivo de
la mejora que hemos identificado para proporcionar un aumento
significativamente afinidad por el colesterol. De hecho, una secuencia LAFCRAC
es identificado en varias protenas de membrana que estn relacionadas con el
transporte de colesterol y el metabolismo (discusin adicional, en la
informacin de apoyo). En resumen, los estudios bioqumicos y mutacional del
RsTSPO purificada identifican una unin colesterol motivo de mejora que est
altamente conservada en TSPO bacteriana en mamferos, pero no. estructuras
cristalinas de alta resolucin tambin confirman que los ligandos se unen
lipdicos en este sitio. Este motivo es adyacente a la secuencia CRAC
previamente identificado en el C-terminal de TMV y a un polimorfismo de una
solo humana asociada con trastornos de ansiedad. Las mutaciones en
cualquiera de las ubicaciones afectan en gran medida la unin de colesterol.
Las propiedades alteradas de una forma mutante purificada RsTSPO-LAF son
consistentes con el anlisis de covarianza gentica que muestra esta regin a
ser crticamente importante para la estructura y la funcin de TSPO. La unin
del colesterol motivo de mejora tambin se identifica en una serie de protenas
de membrana humanos, lo que sugiere que este motivo puede ser til para la
identificacin de alta afinidad de unin a regiones con importancia funcional y
normativo colesterol.